KR20140012099A - 카다베린의 생산을 위한 방법 및 재조합 미생물 - Google Patents

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Abstract

카다베린 또는 N-아세틸카다베린의 생산을 향상시키는 탈조절된 형태의 DNA 분자를 포함하는 재조합 미생물, 뿐만 아니라 상기 미생물을 생산하는 데에 사용되는 재조합 DNA 분자 및 폴리펩티드를 제공한다. 상기 미생물은 세포내 리신 데카르복실라제 활성 및 탈조절된 카다베린 외수송 활성을 포함하거나, 또는 감소된 카다베린 외수송 활성 및 증강된 N-아세틸카다베린 형성 활성을 포함한다. 재조합 미생물을 사용하여 카다베린 또는 N-아세틸카다베린을 생산하는 방법이 또한 제공한다.

Description

카다베린의 생산을 위한 방법 및 재조합 미생물 {PROCESSES AND RECOMBINANT MICROORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF CADAVERINE}
본 발명은 카다베린(cadaverine) 또는 N-아세틸카다베린의 생산을 향상시키는 탈조절된 형태의 DNA 분자를 포함하는 재조합 미생물의 용도, 뿐만 아니라 상기 미생물을 생산하는 데에 사용되는 재조합 DNA 분자 및 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 미생물은 세포내 리신 데카르복실라제 활성 및 탈조절된 카다베린 외수송(export) 활성을 포함하거나, 또는 감소된 카다베린 외수송 활성 및 증강된 N-아세틸카다베린 형성 활성을 포함한다. 본 발명은 또한 재조합 미생물을 사용하여 카다베린 또는 N-아세틸카다베린을 생산하는 방법에 관한 것이다.
JP 2002223770은 리신을 생산하는 미생물에 리신 탈카르복실화 유전자 및/또는 리신-카다베린 역수송체(antiporter) 유전자를 도입함으로써 카다베린을 생산하는 방법에 대해 개시하고 있다.
JP 2004222569는 L-리신 데카르복실라제 활성 및 호모세린 영양요구성을 가지는 재조합 코리네형 박테리아(coryneform bacteria)를 배양함으로써 카다베린을 생산하는 방법에 대해 개시하고 있다.
WO 2007113127은 탈조절된 L-리신 데카르복실라제 활성을 가지는 재조합 코리네형 박테리아를 배양함으로써 카다베린을 생산하는 방법, 카다베린 아세틸트랜스퍼라제의 검출, 및 카다베린 생산을 향상시키기 위한 그의 결실에 대해 개시하고 있다.
US 7,435,584는 lysE (리신 외수송 운반체) 유전자가 고도로 발현되는 코리네박테리아를 배양함으로써 L-리신 생산을 증강시키는 방법에 대해 개시하고 있다.
WO 2008092720은 세포내 발현 데카르복실라제를 발현하는 고도의 리신을 생산하는 미생물을 발효시켜, 상기 미생물의 리신/카다베린 역수송체의 발현이 감소되거나, 제거될 수 있도록 하는 카다베린의 생산 방법에 대해 개시하고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 탈조절된 카다베린 외수송 활성을 가지는 미생물을 제공한다. 바람직하게, 탈조절된 카다베린 외수송체(exporter) 활성은 적어도 부분적으로는, 서열 번호 1과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 카다베린 외수송체 폴리펩티드의 탈조절에 기인하는 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 미생물은 증강된 카다베린 외수송체 활성을 가지고, 한편, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 미생물은 감소된 카다베린 외수송체 활성을 가진다. 바람직하게, 미생물은 증강된 리신 데카르복실라제 활성을 가지며, 더욱더 바람직하게, 증강된 리신 데카르복실라제 활성은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 리신 데카르복실라제 폴리펩티드의 발현에 기인하는 것이다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 상기 기술된 미생물은 또한 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데히드 데히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라히드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프룩토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데히드로게나제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제, 디아민 아세틸트랜스퍼라제의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 탈조절된 유전자를 가진다. 바람직하게, 상기 기술된 미생물은 증강된 리신 내수송(import) 활성을 가진다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 미생물은 적어도 부분적으로는 감소된 리신 외수송체 활성 또는 증강된 리신 퍼미아제 활성 또는 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성 또는 이들의 임의의 조합에 기인하는 증강된 리신 내수송 활성을 가진다. 증강된 리신 내수송 활성은 바람직하게 서열 번호 5와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1개 이상의 리신 외수송체 폴리펩티드의 감소된 활성에 기인한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 기술된 미생물은 적어도 부분적으로는 증강된 리신 퍼미아제 활성에 기인하거나, 또는 적어도 부분적으로는 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성에 기인하거나, 또는 상기 둘 모두의 조합에 기인하는 증강된 리신 내수송 활성을 가진다. 본 발명은 추가로 탈조절된 N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지는 상기 기술된 바와 같은 추가의 미생물을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 탈조절된 N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지는 미생물은 N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지지 않거나, 또는 감소된 N-아세틸카다베린-형성 활성을 가진다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 탈조절된 N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지는 미생물은 증강된 N-아세틸카다베린-형성 활성 및 감소된 카다베린 외수송체 활성을 가진다. 바람직하게, 상기 기술된 미생물의 탈조절된 N-아세틸카다베린-형성 활성은 적어도 부분적으로는 서열 번호 13과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N-아세틸카다베린-형성 폴리펩티드의 탈조절에 기인하는 것이다. 바람직하게, 상기 기술된 미생물 중 어느 하나는 유박테리아(Eubacteria) 분기군에 속하고, 더욱더 바람직하게는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하고, 상기 기술된 미생물 중 가장 바람직한 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종에 속한다.
본 발명은 추가로 상기 기술된 미생물 중 어느 하나를 사용하여 카다베린을 생산하는 방법, 및 상기 기술된 미생물 중 어느 하나를 사용하여 N-아세틸카다베린을 생산하는 방법을 포함한다. 추가의 본 발명은 카다베린 또는 N-아세틸카다베린의 생산을 위한 상기 기술된 미생물 중 어느 하나의 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 기술된 미생물 중 어느 하나를 발효시켜 생산되는 카다베린, 및 상기 기술된 미생물 중 어느 하나를 발효시켜 생산되는 카다베린을 사용하여 생산되는 폴리아민의 용도이다.
도 1: 디아미노펜탄을 생산하는 C. 글루타미쿰 DAP-3c에서의 존재하는 디아미노펜탄에 대한 리신 데카르복실라제 비활성의 의존도. 데이터는 2개의 복제물로부터 얻은 값의 평균값을 나타낸다.
도 2: 서열 번호 1의 카다베린 외수송체 폴리펩티드 (디아미노펜탄 외수송체)가 결실되어 있는 C. 글루타미쿰ΔdapE, 및 sod 프로모터의 제어하에 서열 번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 서열 번호 2의 카다베린 외수송체 유전자를 과다발현하는 PsoddapE, 및 그의 모체 균주 DAP-3c의 성장 (A), 바이오매스 수율 (B), 디아미노펜탄 (C) 및 N-아세틸-디아미노펜탄 수율 (D) 비교. 데이터는 단일 탄소 공급원으로서 10 g/L 글루코스를 포함하는 최소 배지 중에서 배양된 3개의 생물학적 복제물로부터의 지수 성장기의 값을 나타낸다.
하기의 상세한 설명에서는, 수많은 용어들이 광범위하게 사용된다. 본원에서는 본 발명이 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해 정의를 제공한다.
카다베린이라는 용어는 1,5-디아미노펜탄 (CAS-번호: 462-94-2)을 의미한다.
N-아세틸카다베린이라는 용어는 N-아세틸디아미노펜탄 (CAS-번호: 102029-76-5)을 의미한다.
본 발명의 방법론은 바람직하게는 본원에서 기술되는 바와 같은 벡터 또는 유전자 (예컨대 야생형 및/또는 돌연변이화된 유전자)를 포함하고/거나, 카다베린 및/또는 N-아세틸카다베린이 생산될 수 있도록 하는 방식으로 배양된 재조합 미생물을 특징으로 한다.
"재조합" 미생물이란 그의 유래 기점이 된 천연적으로 발생된 미생물과 비교하였을 때 변경되거나, 변형되거나, 상이한 유전형 및/또는 표현형 (예컨대 유전적 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 주는 경우)을 나타내도록, 유전자적으로 변경, 변형 또는 조작된 (예컨대 유전자 조작된) 미생물 (예컨대 박테리아, 효모 세포, 진균 세포 등)을 포함한다.
프로모터. 구조 유전자의 전사를 유도하여 mRNA를 생성시키는 DNA 서열. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 출발 코돈에 가까운 유전자의 5' 영역에 위치한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도는 증가하게 되는 반면, 프로모터가 구성적 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다.
인핸서. 프로모터 요소. 인핸서는 전사 출발 부위에 대해 상대적인 인핸서의 거리 또는 방향에 관계없이 특정 유전자가 mRNA로 전사되는 효율을 증가시킬 수 있다.
클로닝 벡터. 숙주 세포에서 자율적으로 복제되는 능력을 가지고 있으며, 유전자 조작을 위하여 세포를 형질전환시키는 데에 사용되는, DNA 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 박테리오파지. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 손실 없이 확정적인 방식으로 외래 DNA 서열은 물론, 클로닝 벡터에 의해 형질전환된 세포의 식별 및 선별에 사용하기에 적합한 마커 유전자가 삽입될 수 있는 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 함유하고 있다. 마커 유전자로는 전형적으로 테트라시클린 저항성 또는 암피실린 저항성을 제공하는 유전자를 포함한다.
발현 벡터. 재조합 숙주에서 외래 단백질의 발현을 제공하는, 외래 단백질을 코딩하는 클로닝된 구조 유전자를 포함하는 DNA 분자. 전형적으로, 클로닝된 유전자의 발현은 특정 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 서열의 제어하에 있다 (즉, 그에 작동가능하게 연결되어 있다). 프로모터 서열은 구성적 또는 유도성 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.
재조합 숙주. 재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 중 어느 것을 함유하는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 용어는 또한 숙주 세포의 염색체 또는 게놈에 클로닝된 유전자(들)를 함유하도록 유전자적으로 조작된 원핵 또는 진핵 세포를 포함하는 것을 의미하기도 한다. 적합한 숙주의 예에 대해서는, 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ["Sambrook"]]을 참조할 수 있다.
"발현하다," "발현하는," "발현된" 및 "발현"이라는 용어는 코딩된 상기 단백질의 생성된 효소 활성 또는 그것이 관련되는 경로 또는 반응이 상기 유전자/경로가 발현되는 유기체에서의 상기 경로 또는 반응을 통한 대사 흐름을 가능하게 하는 수준에서의, 유전자 생성물 (예컨대 본 출원에서 정의 및 기술된 경로 또는 반응의 유전자의 생합성 효소)의 발현을 의미한다. 발현은 출발 유기체로서 사용되는 미생물의 유전적 변경에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 출발 미생물에 의해, 또는 변경되지 않은 비교가능 미생물에서 생산되는 것에 비해 증가된 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 미생물을 유전자적으로 변경시킬 수 있다 (예컨대 유전자 조작할 수 있다). 유전적 변경으로는 (예컨대 강력한 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 첨가하거나, 또는 발현이 구성적으로 일어나도록 조절 서열을 제거함으로써) 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 변경하거나 변형시키는 것, 특정 유전자의 염색체상 위치를 변형시키는 것, 특정 유전자, 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 인자에 인접한 핵산 서열을 변경시키는 것, 특정 유전자의 카피수를 증가시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예컨대 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성 인자 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 특정 유전자 발현을 탈조절시키는 임의의 다른 종래 수단 (예를 들어 리프레서 단백질의 발현을 차단시키기 위해, 안티센스 핵산 분자를 사용하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 미생물은 출발 미생물에 의한 유전자 생성물의 발현 수준에 비해 증가되거나 또는 더 낮은 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 물리적 또는 환경적으로 변경될 수 있다. 예를 들어 미생물은 전사 및/또는 번역이 증강 또는 증가되도록, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역을 증가시키는 것으로 알려져 있거나, 그러한 것으로 추정되는 작용제로 처리되거나, 그의 존재하에 배양될 수 있다. 별법으로, 미생물은 전사 및/또는 번역이 증강 또는 증가되도록, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역을 증가시키도록 선택된 온도에서 배양될 수 있다.
"탈조절시키다," "탈조절된" 및 "탈조절"이라는 용어는 변경 또는 변형되지 않은 카다베린 또는 N-아세틸카다베린 생산에 비해 미생물에서의 카다베린 또는 N-아세틸카다베린의 생산율을 증가시키는, 미생물 중 1개 이상의 유전자의 변경 또는 변형을 의미한다. 일부 실시양태에서, 변경 또는 변형된 유전자는 생합성 경로 중 효소 또는 수송 단백질을 코딩하며, 이로써, 미생물에서 생합성 효소의 수준 또는 활성은 변경 또는 변형되거나, 또는 수송 특이성 또는 효율이 변경 또는 변형된다. 일부 실시양태에서, 변경되지 않았거나, 야생형인 유전자 존재하에서의 수준에 비해 효소의 수준 또는 활성이 증강 또는 증가되도록 생합성 경로에서 효소를 코딩하는 1개 이상의 유전자가 변경 또는 변형된다. 탈조절은 또한 하나 이상의 유전자의 코딩 영역을 변경함으로써, 예를 들어 피드백 저항성이거나, 또는 더 높거나 낮은 비활성을 가지는 효소를 수득하는 것도 포함한다. 또한, 탈조절은 추가로 효소 또는 수송 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자 (예컨대 활성 인자, 리프레서)를 코딩하는 유전자의 유전적 변경을 포함한다.
"과다발현하다," "과다발현하는," "과다발현된" 및 "과다발현"이라는 용어는 유전자 생성물의 발현을 의미하는데, 특히 출발 미생물의 유전적 변경 이전에 나타나던 것에 비해 더 높은 수준으로 유전자 생성물 (예컨대 리신 생합성 효소 또는 술페이트 환원 경로 효소 또는 시스테인 생합성 효소, 또는 본 출원에서 정의 및 기술된 유전자 또는 경로 또는 반응)의 발현을 증강시키는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 출발 미생물에 의해 생산되는 것에 비해 증가된 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 미생물을 유전자적으로 변경시킬 수 있다 (예컨대 유전자 조작할 수 있다). 유전적 변경으로는 (예컨대 강력한 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 첨가하거나, 또는 발현이 구성적으로 일어나도록 조절 서열을 제거함으로써) 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 변경하거나 변형시키는 것, 특정 유전자의 염색체상 위치를 변형시키는 것, 특정 유전자, 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 인자에 인접한 핵산 서열을 변경시키는 것, 특정 유전자의 카피수를 증가시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예컨대 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성 인자 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 특정 유전자 발현을 탈조절시키는 임의의 다른 종래 수단 (예를 들어 리프레서 단백질의 발현을 차단시키기 위해 안티센스 핵산 분자를 사용하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 유전자 생성물을 과다발현시키는 또 다른 방법은 유전자 생성물의 안정성을 증강시켜 그의 수명을 연장시키는 것이다. 유기체, 예컨대 C. 글루타미쿰에서의 유전자 과다발현에 대한 예는 문헌 [Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93-8)]에서 살펴볼 수 있다.
"탈조절된"이라는 용어는 미생물의 조작 이전에, 또는 조작되지 않은 비교가능 미생물에서 발현되는 것에 비해 더 낮거나 더 높은 수준으로 유전자 생성물 (예컨대 리신 데카르복실라제)이 발현되는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물의 조작 이전에, 또는 조작되지 않은 비교가능 미생물에서 발현되는 것에 비해 더 낮거나, 더 높은 수준의 수준으로 유전자 생성물이 발현되도록 미생물을 유전자적으로 조작할 수 있다 (예컨대 유전자 조작할 수 있다). 유전적 조작은 (예컨대 강력한 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 제거함으로써) 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 변경하거나 변형시키는 것, 특정 유전자의 염색체상 위치를 변형시키는 것, 특정 유전자, 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 인자에 인접한 핵산 서열을 변경시키는 것, 특정 유전자의 카피수를 감소시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예컨대 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성 인자 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계에 통상적인, 특정 유전자 발현을 탈조절시키는 임의의 다른 종래 수단 (안티센스 핵산 분자의 사용, 또는 표적 단백질의 발현을 넉 아웃시키거나 차단시키는 다른 방법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"탈조절된 유전자 활성," 예컨대 탈조절된 리신 데카르복실라제라는 용어는 또한 예컨대 바람직하게는 유전자 조작에 의해 미생물 내로 이종성 유전자, 예컨대 리신 데카르복실라제 유전자를 하나 이상의 카피로 도입함으로써, 각 유전자 활성, 예컨대 리신 데카르복실라제 활성이 이전에는 관찰되지 않았던 미생물에 유전자 활성, 예컨대 리신 데카르복실라제 활성이 도입된 것을 의미한다.
"탈조절된 경로 또는 반응"이라는 어구는 1개 이상의 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변경 또는 변형되도록 생합성 경로 또는 반응에서 효소를 코딩하는 1개 이상의 유전자가 변경 또는 변형되어 있는 생합성 경로 또는 반응을 의미한다. "탈조절된 경로"라는 어구는 1개 초과의 유전자가 변경 또는 변형됨으로써 상응하는 유전자 생성물/효소의 수준 및/또는 활성이 변경되는 생합성 경로를 포함한다. 일부 경우에서, 미생물의 경로를 "탈조절시킬 수 있는" (예컨대 주어진 생합성 경로에서 1개 초과의 유전자를 동시에 탈조절시킬 수 있는) 능력은 1개 초과의 효소 (예컨대 2 또는 3개의 생합성 효소)가 "오페론"으로 지칭되는 연속된 유전 물질 조각 상에 서로 인접하여 존재하는 유전자들에 의해 코딩되는 것인, 미생물의 특별한 현상으로부터 야기된다. 다른 경우에, 경로를 탈조절시키기 위해서는, 일련의 순차적인 조작 단계들에서 수많은 유전자들이 탈조절되어야 한다.
본 발명에 따른 탈조절된 유전자를 발현하기 위해서는, 효소를 코딩하는 DNA 서열이 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 후, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 중 어느 것에 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 이외에도, 발현 벡터는 번역 조절 서열, 및 발현 벡터를 보유하는 세포 선별에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
원핵 숙주에서의 발현에 적합한 프로모터는 억제성, 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터는 당업자에게 주지되어 있으며, WO2005059144, WO2007011939, WO2007012078, WO2005059093, WO2008049782, WO2006069711, WO2007020295에 기술되어 있는 바와 같이, T4, T3, T5, Sp6 및 T7 폴리머라제를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, E. 콜라이(E. coli)의 trp, recA, 열 쇼크, lacUV5, tac, lpp - lac pr, phoA, gal, trc 및 lacZ 프로모터, B. 섭틸리스(B. subtilis)의 알파-아밀라제 및 시그마 28-특이적 프로모터, 바실러스(Bacillus)의 박테리오파지의 프로모터, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 β-락타마제 유전자의 bla 프로모터, 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터, 뿐만 아니라 코리네박테리움의 PGRO, PSOD, PEFTU, PEFTS 및 이들 프로모터의 조합을 포함한다. 원핵 프로모터는 문헌 [Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)]; [Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987)]; [Ausubel et al., 상기 문헌 동일]; [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]에 리뷰되어 있다.
E. 콜라이 리신 데카르복실라제의 발현에 바람직한 프로모터는 WO2005059144, WO2007011939, WO2007012078, WO2005059093, WO2008049782, WO2006069711, WO2007020295에 기술되어 있는, C. 글루타미쿰의 PsodA, PGRO 및 PEFTU 프로모터이다.
원핵 숙주에서 단백질을 발현시키는 방법에 대해서는 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 15-58 (Oxford University Press 1995)]를 참조할 수 있다. 또한, 문헌 [Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]; 및 [Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," in PROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Cleland et al. (eds.), pages 101-127 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]도 참조할 수 있다. 유전자 발현 및 단백질 생산을 증가 또는 감소시키는 추가의 방법은 WO2008049782에서 살펴볼 수 있다.
발현 벡터는 염화 칼슘 형질전환, 전기천공 등을 비롯한 다양한 기법을 사용하여 박테리아 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 1-1 to 1-24 (John Wiley & Sons, Inc. 1995]를 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 실질적으로 순수한 단백질이란 폴리아크릴아미드-나트륨 도데실 술페이트 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 따른 단일 밴드로 입증되는 바와 같이, 원하는 정제된 단백질에 오염성 세포 성분이 본질적으로 존재하지 않는다는 것을 의미한다. "실질적으로 순수한"이라는 용어는 추가로 당업자에 의해 사용되는 하나 이상의 순도 또는 균질도 특징으로 볼 때, 균질한 분자를 기술하는 것으로 의도된다. 예를 들어 실질적으로 순수한 리신 데카르복실라제는 하기와 같은 파라미터들: 예컨대 분자량, 크로마토그래피 이동, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 차단 또는 비차단된 N-말단, HPLC 용리 프로파일, 생물학적 활성, 및 다른 상기 파라미터에 대해 표준 실험 편차 이내의 일정하고 재현가능한 특징들을 보일 것이다. 그러나, 상기 용어가 리신 데카르복실라제와 다른 화합물과의 인공 또는 합성 혼합물을 배제하는 것을 의미하지는 않는다. 추가로, 상기 용어가 재조합 숙주로부터 단리된 리신 데카르복실라제 융합 단백질을 배제하는 것을 의미하지는 않는다.
제1 측면에서, 본 발명은 세포내 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 가지거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성을 포함하거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 포함하는 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 임의의 원핵 또는 진핵 미생물, 특히 박테리아, 고세균, 효모 및 진균일 수 있다. 바람직한 것은 특히 코리네박테리움 글루타미쿰을 중심으로 하는 코리네박테리움 속, 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 중심으로 하는 에스케리키아(Escherichia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 특히 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터 선택되는 미생물이 바람직하다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시양태는 코리네형 박테리아, 예컨대 코리네박테리움 속 박테리아로부터 선택되는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens) 종이 특히 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 브레비박테리아(Brevibacteria), 및 특히 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) 및 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) 종의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC13870, 코리네박테리움 암모니아게네스 FERMBP-1539, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44547, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44549, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC13869, 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608, 뿐만 아니라 예컨대 전통적인 돌연변이유발법 및 선택에 의해, 또는 지정 돌연변이유발법에 의해 그로부터 유도되는 균주들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 특히 바람직한 다른 균주는 ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL B8183, NRRL W8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 및 NRRLB11476을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
KFCC라는 약어는 코리안 페더레이션 오브 컬쳐 콜렉션(Korean Federation of Culture Collection)을 나타내고, ATCC는 아메리칸 타입 스트레인 컬쳐 콜렉션(American-Type Strain Culture Collection)을 나타내고, DSM이라는 약어는 도이체 잠룽 본 미크로오르가니스멘(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)을 나타낸다. NRRL이라는 용어는 ARS 컬쳐 콜렉션(ARS cultures collection) 노던 리저널 리서치 라보라토리즈(Northern Regional Research Laboratory: 미국 일리노이주 페오레어)를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 "캠벨 인(Campbell in)" 또는 "캠벨 아웃(Campbell out)" 미생물 (또는 세포 또는 형질전환체)이다. 본원에서 사용되는 바, "캠벨 인" 형질전환체라는 어구는 전체 환형 이중 가닥 DNA 분자 (예를 들어 플라스미드)가 단일의 상동성 재조합 이벤트 (크로스 인(cross in) 이벤트)에 의해 세포의 염색체 내로 통합됨으로써, 환형 DNA 분자의 선형화된 버전이, 환형 DNA 분자의 제1 DNA 서열과 상동성인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입되어져 있는, 원래 숙주 세포의 형질전환체를 의미할 것이다. "캠벨드 인(Campbelled in)" 이라는 어구는 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 통합된 선형화된 DNA 서열을 의미한다. "캠벨 인" 형질전환체는 상동성 재조합 교차점을 포함하고 둘러싸고 있는 제1 상동성 DNA 서열의 중복을 함유한다.
"캠벨 아웃"은 "캠벨드 인" DNA의 선형화된 삽입된 DNA에 함유되어 있는 제2 DNA 서열과 선형화된 삽입체의 제2 DNA 서열과 상동성인 염색체 기원의 제2 DNA 서열 사이에 제2 상동성 재조합 이벤트 (크로스 아웃(cross out) 이벤트)가 발생되고, 상기 제2 재조합 이벤트를 통해 통합된 DNA 서열의 일부가 결실 (폐기 (jettisoning))되지만, 중요하게도 또한 통합된 DNA 서열의 일부 (이것은 단일 염기만큼 작을 수 있다)가 염색체에 남게 되고, 이로써, "캠벨 아웃" 세포는 원 숙주 세포와 비교할 때, 염색체에 하나 이상의 의도적인 변화 (예를 들어 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 이종성 유전자 또는 DNA 서열의 삽입, 이종성 유전자 또는 변형된 상동성 유전자의 추가 카피 또는 카피들의 삽입, 또는 이와 같이 상기에 열거된 상기 언급된 예들 중 1개 초과를 포함하는 DNA 서열의 삽입)를 함유하는 것인, "캠벨 인" 형질전환체의 자손인 세포를 의미한다.
반드시 그러한 것은 아니지만, "캠벨드 아웃" 세포 또는 균주는 보통 "캠벨드 인" DNA 서열, 예를 들어 바실러스 섭틸리스 sacB 유전자의 일부 (폐기되기를 원하는 부분)에 함유되어 있으며, 약 5% 내지 10% 수크로스의 존재하에 성장되는 세포에서 발현될 경우 치사되는 유전자에 대한 역선택(counter selection)에 의해 수득된다. 원하는 "캠벨 아웃" 세포는, 역선택을 사용하여, 또는 사용하지 않고, 임의의 스크리닝가능한 표현형, 예컨대 제한없이, 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 저항성의 존재 또는 부재, 중합효소 연쇄 반응에 의한 주어진 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 콜로니 핵산 하이브리드화 등을 사용하여 원하는 세포를 스크리닝함으로써 수득 또는 확인할 수 있다.
"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 일으키는 상동성 재조합 이벤트는 상동성 DNA 서열 내의 일정 범위의 DNA 염기 상에서 일어날 수 있는데, 상동성 서열은 이와 같은 범위의 적어도 일부에서 서로 동일할 것이기 때문에, 정확하게 교차 이벤트가 발생하는 곳이 정확하게 어디인지를 명시하는 것은 보통 불가능하다. 다시 말해, 어느 서열이 원래 삽입된 DNA로부터 유래된 것인지, 및 어느 것이 원래 염색체 DNA 로부터 유래된 것인지를 정밀하게 명시하는 것은 불가능하다. 또한, 제1 상동성 DNA 서열과 제2 상동성 DNA 서열은 보통 부분적으로 비-상동성인 영역에 의해 분리되는데, "캠벨 아웃" 세포의 염색체에 잔존하는 것은 비-상동성인 이 영역이다.
실제적으로, C. 글루타미쿰에서, 전형적인 제1 및 제2 상동성 DNA 서열의 길이는 약 200개 염기쌍 이상의 길이이며, 이 길이는 최대 수천개 염기쌍까지의 길이일 수 있으나, 상기 절차는 더 짧거나 더 긴 서열에 적용될 수 있다. 제1 및 제2 상동성 서열의 바람직한 길이는 약 500 내지 2,000개 염기 길이이며, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 수득하는 것은 제1 및 제2 상동성 서열이 대략 동일한 길이가 되도록, 바람직하게는 200개 염기쌍 미만의 차이, 가장 바람직하게는 둘 중 더 짧은 것이 더 긴 것의 염기쌍 길이의 70% 이상이 되도록 배열함으로써 의해 촉진된다.
리신 데카르복실라제 활성은 리신 데카르복실라제에 의해 촉매화되는 L-리신의 카다베린으로의 탈카르복실화를 의미한다. 상기 효소는 E.C. 4.1.1.18로 분류되어 있다. 예를 들어 리신 데카르복실라제 활성을 가지는 에스케리키아 콜라이로부터 단리된 효소는 cadA 유전자 생성물 (교토 인사이클러피디어 오브 진스 앤드 게놈스(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), 엔트리 b4131, 서열 번호 4) 및 IdcC 유전자 생성물 (교토 인사이클러피디어 오브 진스 앤드 게놈스, 엔트리 JW0181, 서열 번호 3)이다.
효소 활성을 측정하고 비교하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 ["Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling", Borth eds. CRC Press Boca Raton USA] 및 그의 참고문헌, 또는 문헌 [Methods in Enzymology Volume 17, Part 1 pp. 3-1098 (1970), Volume 17, Part 2, pp. 3-961 (1971) Volume 41, pp. 3-564 (1975), Volume 42 pp. 3-537 (1975), Volume 63, pp. 3-547 (1979), Volume 64, pp. 3-418 (1980), Volume 89, pp. 3-656 (1982), Volume 90 pp. 3-602 (1982), Volume 142, pp. 3-732 (1987), Volume 143 pp. 3-582 (1987)] 및 그의 참고문헌에 기술되어 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 비교에 사용되는 표준 균주는 ATCC13032 (문헌 [Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling, Borth eds. CRC Press Boca Raton USA])이다.
E. 콜라이 IdcC의 아미노산 서열은 수탁 번호 서열 번호 3에 개시되어 있으며, E. 콜라이 cadA의 것은 서열 번호 4에 개시되어 있다.
E. 콜라이 리신 데카르복실라제 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열로부터 역번역된 뉴클레오티드 서열을 가지는 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 스크리닝함으로써 수득될 수 있다.
별법으로, E. 콜라이 리신 데카르복실라제 유전자 또는 본원에 기술된 임의의 유전자는 상호 프라이밍(mutually priming) 장쇄 올리고뉴클레오티드를 사용하여 DNA 분자를 합성함으로써 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990) ["Ausubel"]]을 참조할 수 있다. 또한, 문헌 [Wosnick et al., Gene 60:115 (1987)]; 및 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]도 참조할 수 있다. 중합효소 연쇄 반응을 사용하는 확립된 기법은 길이가 2 킬로베이스 이상인 DNA 분자를 합성할 수 있는 능력을 제공한다 (문헌 [Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)]; [Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993)]; [Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993)]; [Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)]).
모체 효소와 비교하였을 때, 보존성인 아미노산 변화를 함유하는 폴리펩티드, 예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드의 변이체 또는 본원에 기술된 임의의 유전자의 변이체가 생산될 수 있다. 즉, 폴리펩티드 서열 중 알킬 아미노산이 알킬 아미노산으로 치환되고, 예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드 아미노산 서열 중 방향족 아미노산이 방향족 아미노산으로 치환되고, 예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드 아미노산 서열 중 황-함유 아미노산이 황-함유 아미노산으로 치환되고, 예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드 아미노산 서열 중 히드록시-함유 아미노산이 히드록시-함유 아미노산으로 치환되고, 예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드 아미노산 서열 중 산성 아미노산이 산성 아미노산으로 치환되고, 예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드 아미노산 서열 중 염기성 아미노산이 염기성 아미노산으로 치환된, 예컨대 서열 번호 1의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변이체가 수득될 수 있다.
예를 들어 공통 아미노산들 중 "보존적 아미노산 치환"은 하기의 군들 각각 내에서의 아미노산 간의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 시스테인 및 메티오닌, (4) 세린 및 트레오닌, (5) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (6) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (7) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드에서의 보존적 아미노산 변화는 서열 번호 1에 열거되어 있는 뉴클레오티드를 뉴클레오티드로 치환함으로써 도입될 수 있다. 그러한 "보존적 아미노산" 변이체는 예를 들어 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 링커-스캐닝 돌연변이유발, 중합효소 연쇄 반응을 사용한 돌연변이유발 등에 의해 수득될 수 있다 (문헌 [Ausubel et al., 상기 문헌 동일, at pages 8.0.3-8.5.9; Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-10 to 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]). 또한 일반적으로는, 문헌 [McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)]을 참조할 수 있다. 카다베린을 외수송하는 카다베린 외수송체 폴리펩티드 변이체의 능력은 세포외 카다베린에 대한 HPLC 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 카다베린 외수송체 폴리펩티드는 상응하는 "원래의" 유전자 생성물과 최대 80%, 바람직하게, 90% 및 가장 바람직하게, 95% 내지 98%의 서열 동일성 (아미노산 서열 기준)을 가지며, 여전히 카다베린 외수송체 폴리펩티드의 생물학적 활성을 가지는, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 카다베린 외수송체 폴리펩티드 (dapE) 및 그의 등가인 유전자이다. 이러한 등가인 유전자는 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입을 도입함으로써, 또는 당업계에 주지되어 있는 방법, 예컨대 데이터베이스 검색, 라이브러리 스크리닝, 상보성 검정 또는 효소 활성 시험에 따라 확인 및 클로닝될 수 있는 다른 유기체의 상동체 유전자를 클로닝함으로써 쉽게 구축될 수 있다. 바람직하게는, 클로닝된 상동체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 에스케리키아 콜라이의 코돈 용법에 적합화됨으로써, 원하는 숙주 미생물에서의 발현에 최적화된다.
서열 번호 1의 서열과 상동성인 서열을 살펴볼 수 있다. 그 예는 하기와 같이 제시된다: 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 R TX= 40322로부터의 A4QH10_CORGB 단백질, 서열 번호 25, 코리네박테리움 에피시엔스로부터의 Q8FMK8_COREF 단백질, 서열 번호 26, 코리네박테리움 마트루초티이(Corynebacterium matruchotii) ATCC 33806으로부터의 ZP_03711358 단백질, 서열 번호 27, 코리네박테리움 아미콜라툼(Corynebacterium amycolatum) SK46으로부터의 ZP_03392764 단백질, 서열 번호 28, 아르카노박테리움 헤몰리티쿰(Arcanobacterium haemolyticum) DSM 20595로부터의 YP_003696648 단백질, 서열 번호 29, 코리네박테리움 아우리무코숨(Corynebacterium aurimucosum) ATCC 700975로부터의 ZP_06042915 단백질, 서열 번호 30, 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum) ATCC 6940으로부터의 ZP_03936401 단백질, 서열 번호 31, 코리네박테리움 암모니아게네스 DSM 20306으로부터의 ZP_06837496 단백질, 서열 번호 32.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 세포내 또는 카다베린 외수송체 활성은 서열 번호 1과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 카다베린 외수송체 활성을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드에 기인하여, 적어도 부분적으로는 바람직하게, 30% 초과, 또는 50% 초과, 또는 60% 초과, 또는 70% 초과, 또는 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 98%, 99% 초과까지이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 예컨대 E. 콜라이와 같이, 카다베린 외수송체 폴리펩티드를 발현하도록, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 발현을 위해 코돈 용법을 최적화하도록 의도된 미생물의 코돈 용법을 적용시킴으로써 DNA로 재번역될 수 있는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 카다베린 외수송체 폴리펩티드 (서열 번호 1)를 이용한다.
본 발명의 바람직한 미생물은 세포내 리신 데카르복실라제 활성, 바람직하게, 고도한 세포내 데카르복실라제 활성을 포함한다. 세포내 리신 데카르복실라제 활성은 미생물에 의해 발현시키고자 하는 하나 이상의 리신 데카르복실라제 유전자를 사용하여 미생물을 형질전환시킴으로써 생성되거나, 증강될 수 있다. 추가적으로 또는 별법으로, 코딩된 리신 데카르복실라제의 발현 또는 효소 활성을 증강시키기 위해 리신 데카르복실라제 유전자를 돌연변이화시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 세포내 리신 데카르복실라제 활성을 세포외 리신 데카르복실라제 활성과 조합한다. 세포내 또는 세포외 리신 데카르복실라제 활성 중 어느 것이 결핍된 미생물은 세포내 또는 세포외 중 어느 하나의 리신 데카르복실라제를 발현하도록 형질전환될 수 있다. 세포외 발현은 세포외 발현을 위한 신호 서열, 예컨대 형질전환되는 미생물에서 기능을 하는 분비 신호 또는 분자 앵커 신호를 포함하도록 리신 데카르복실라제 유전자를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 세포외 발현의 예는 문헌 [Choi and Lee Appl Microbiol Biotechnol 2004 64: 625-635], [Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:538-545, Trends in Biotechnology 2007 1673-79]에서 살펴볼 수 있다.
세포내 또는 세포외 리신 데카르복실라제 활성이 리신 데카르복실라제 활성을 가지는 상이한 폴리펩티드들을 코딩하는 1개 초과의 리신 데카르복실라제 유전자의 발현에 기인하는 것인 경우, 전체 세포내 또는 세포외 리신 데카르복실라제 활성은 상기 상이한 리신 데카르복실라제 활성들의 결과가 될 것이다. 전체 리신 데카르복실라제 활성에 대한 특정 리신 데카르복실라제 유전자의 기여도는 특정 미생물에서의 상이한 리신 데카르복실라제 유전자들의 발현 수준을 비교하고, 상기 유전자로부터 발현되는 리신 데카르복실라제의 효소 비활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. 상이한 유전자들의 발현 수준은 당업계에 주지되어 있는 방법에 따라 측정될 수 있고, 바람직하게, 발현 수준은 예컨대 웨스턴 블롯 또는 ELISA 검정에 의해, 단백질 수준으로 측정된다. 리신 데카르복실라제의 효소 비활성을 측정하는 방법 또한 당업계에 주지되어 있다. 바람직한 방법은 WO2007113127에 개시되어 있다.
내인성 리신 데카르복실라제 활성이 리신 데카르복실라제 활성을 가지는 1개 이상의 추가의 폴리펩티드의 트랜스제닉 발현에 의해 증강되는 경우, 추가 폴리펩티드 또는 추가 폴리펩티드들의 기여도는 형질전환된 미생물과 형질전환되지 않은 미생물의 전체 리신 데카르복실라제 활성을 비교함으로써 측정될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 세포내 또는 세포외 데카르복실라제 활성, 또는 두 활성은 모두 서열 번호 3과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 데카르복실라제 활성을 가지는, 바람직하게, 고도한 리신 데카르복실라제 활성을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드에 기인하여, 적어도 부분적으로는 바람직하게, 30% 초과, 또는 50% 초과, 또는 60% 초과, 또는 70% 초과, 또는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 초과까지이다.
한 실시양태에서, 세포내 또는 세포외 데카르복실라제 활성, 또는 두 활성은 모두 서열 번호 3과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 데카르복실라제 활성을 가지는, 바람직하게, 고도한 리신 데카르복실라제 활성을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드에 기인하여, 98% 초과 또는 99% 초과까지이다.
한 실시양태에서 세포내 또는 세포외 데카르복실라제 활성, 또는 두 활성은 모두 서열 번호 4와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 데카르복실라제 활성을 가지는, 바람직하게, 고도한 리신 데카르복실라제 활성을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드에 기인하여, 98% 초과 또는 99% 초과까지이다.
한 실시양태에서, 카다베린 외수송체 활성을 포함하는 미생물은 또한 증강된 리신 내수송능도 포함한다.
향상된 리신 내수송능은 발효 배지로부터 미생물로의 리신의 흐름을 증강시키는 임의의 수단에 의해, 또는 미생물로부터 발효 배지로의 리신의 흐름을 감소시킴으로써 달성될 수 있다.
리신 외수송 및 내수송 활성을 측정하는 방법은 문헌 [Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M, et al. MICROBIOLOGY-SGM 147 pp. 1765-1774, 2001] 및 [Burkovski, A, Kramer, R. APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58 pp. 265-274. 2002], 및 상기 문헌에서 인용된 참고 문헌에서 살펴볼 수 있다.
예를 들어 리신 내수송능은 리신 외수송체 활성을 감소 또는 제거하거나, 또는 리신 퍼미아제 활성을 증가시키거나, 또는 리신/카다베린 역수송체 활성을 증가시키거나, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 향상될 수 있다.
리신 외수송체 활성은 배지로부터 세포로 리신을 수송할 수 있는 임의의 폴리펩티드, 예컨대 리신-외수송체, 리신-공수송체, 또는 리신-역수송체 폴리펩티드에 기인하는 것일 수 있다.
미생물이 세포외 리신 데카르복실라제 활성을 가지고, 리신 생산능이 높은 경우, 리신 내수송능을 증강시키는 것에 대하여 기술된 것과 반대되는 수단을 취함으로써, 예를 들어 특정 유전자의 발현을 감소시키는 대신 특정 유전자 발현을 증강시킴으로써 리신 외수송능을 증강시키는 것이 유리할 수 있다. 리신 생산능이 높고, 리신 외수송체 폴리펩티드의 발현은 감소 또는 제거되어 있지만, 세포외 리신 데카르복실라제 활성이 결핍된 미생물에 대한 예는, 아미노산 외수송 단백질의 발현 또는 활성이 증강되어 있는 미생물을 배양함으로써 아미노산 생산을 증강시키는 방법을 개시하고 있는 WO 97/23597 및 WO2005073390, 및 lysE (리신 외수송 운반체) 유전자가 고도로 발현되는 코리네박테리아를 배양함으로써 L-리신 생산을 증강시키는 방법을 개시하고 있는 US 7,435,584에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 1개 이상의 리신 외수송체 폴리펩티드의 활성은 감소되며, 여기서, 리신 외수송체 폴리펩티드는 서열 번호 5와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 외수송 활성을 가지거나, 또는 여기서, 리신 외수송체 폴리펩티드는 서열 번호 5와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 외수송 활성을 가지거나, 또는 여기서, 2종 이상의 리신 외수송체 폴리펩티드의 활성이 감소될 경우, 1개 이상은 서열 번호 5와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 외수송 활성을 가지고, 1개 이상은 서열 번호 5와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 외수송 활성을 가진다.
lysE 유전자는 문헌 [Eggeling, L, Sahm, H JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 92, 3 201-213], [Eggeling, L, Sahm, H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180, 3 155-160 2003]에 기술되어 있다 (또한 독일 특허 출원 DE 95-01048222도 참조할 수 있다).
YbjE 유전자 생성물 (서열 번호 6) 및 그의 돌연변이체는 예를 들어 WO2005073390에 기술되어 있다.
"감소된 활성"이라는 용어는 미생물의 조작 이전에, 또는 조작되지 않은 비교가능 미생물에서 발현되는 것에 비해 더 낮은 수준으로 유전자 생성물, 예컨대 카다베린 외수송체 폴리펩티드, 또는 리신 외수송체 폴리펩티드가 발현되는 것을 포함하며, 바람직하게, 유전자 생성물의 발현은 동일한 조건하에서 성장되는 특정 미생물 종의 주지된 균주와 비교되는데, 예컨대 코리네박테리움인 경우, 유전자 발현은 바람직하게는 균주 ATCC13032에서의 발현 수준과 비교된다. E. 콜라이인 경우, 유전자 발현은 바람직하게는, 균주 콜렉션 ATCC에 기탁된 균주 MG1665에서의 발현 수준과 비교되고, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)인 경우, 발현 수준은 균주 콜렉션 ATCC에 기탁된 균주 W303과 비교된다. 한 실시양태에서, 미생물은 미생물의 조작 이전에, 또는 조작되지 않은 비교가능 미생물에서 발현되는 것에 비해 더 적은 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 유전자적으로 조작 (예컨대 유전자 조작)될 수 있다. 유전적 조작은 (예컨대 강력한 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 제거함으로써) 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 변경하거나 변형시키는 것, 특정 유전자의 염색체상 위치를 변형시키는 것, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 인자와 같은 특정 유전자에 인접한 핵산 서열을 변경하는 것, 특정 유전자의 카피수를 감소시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예컨대 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성 인자 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계에 통상적인, 특정 유전자 발현을 감소시키는 임의의 다른 종래 수단 (안티센스 핵산 분자의 사용, 또는 표적 단백질의 발현을 넉 아웃시키거나 차단시키는 다른 방법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 특히 유전자는 숙주 유기체의 염색체로부터 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실되도록 조작될 수 있다. 유전자 생성물, 예컨대 리신 외수송체 폴리펩티드의 감소된 활성은 또한 유전자 생성물의 활성을 감소시키는 하나 이상의 유전자 돌연변이를 도입시킴으로써 수득될 수 있다. 추가로, 유전자 생성물의 활성은 또한 상기 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 조절하는 조절 단백질에 영향을 줌으로써, 예컨대 상기 유전자의 전사에 영향을 줌으로써 감소될 수 있다. 그 예로는 전사 리프레서 및 전사 활성 인자가 있다. 예를 들어 lysE 유전자 발현은 lysG 유전자 생성물에 의해 부정적인 영향을 받는다. lysG 유전자의 서열 (본원에서 서열 번호 7로 개시) 및 LysG 유전자 생성물의 서열 (본원에서 서열 번호 8로 개시)은 또한 하기 수탁 번호: P94632, X96471 하에서 살펴볼 수 있다.
또 다른 실시양태에서 리신 내수송능은 증강된 리신 퍼미아제 활성에 의해, 또는 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성에 의해, 또는 이 둘의 조합에 의해 증강된다.
주어진 미생물의 리신 퍼미아제 활성은 예컨대 미생물의 무작위 돌연변이유발법에 의해, 또는 미생물을 하나 이상의 리신 퍼미아제 유전자로 형질전환시킴으로써, 또는 이들의 임의의 조합에 의해, 예를 들어 서열 번호 9에 개시되어 있는 것과 같은 하나 이상의 내인성 리신 퍼미아제 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 또는 예를 들어 서열 번호 10에 개시되어 있는 것과 같은 리신 퍼미아제 폴리펩티드의 퍼미아제 활성을 증가시킴으로써 증강될 수 있다.
한 실시양태에서, 미생물의 리신 퍼미아제 활성은 서열 번호 10과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신 퍼미아제 활성을 가지는 하나 이상의 리신 퍼미아제 폴리펩티드, 예컨대 리신 퍼미아제 활성을 가지는 상동체 또는 돌연변이체의 재조합 발현에 의해 증강된다. 리신 퍼미아제 활성을 측정하는 방법은 문헌 [Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M, et al. MICROBIOLOGY-SGM 147 pp. 1765-1774 2001], 및 [Burkovski, A, Kramer, R APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58 pp. 265-274 2002], [Fujii, T, eta I.], 뿐만 아니라 [BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66, pp1981-1984, 2002] 및 상기 문헌에서 인용된 참고 문헌에서 살펴볼 수 있다.
재조합 발현은 예를 들어 하나 이상의 리신 퍼미아제 유전자의 형질전환에 의해, 발현 활성이 더 높은 탈조절된 프로모터를 내인성 리신 퍼미아제 유전자에 제공함으로써, 또는 리신 퍼미아제 유전자 발현 또는 유전자 생성물 활성의 음성 조절 인자를 감소시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 리신 내수송능은 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성에 의해 증강된다. 리신/카다베린 역수송체는 리신과 카다베린을 동시에 세포의 막을 가로질러 서로 다른 방향으로 수송하는 단백질이다. 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성은 하나 이상의 내인성 리신/카다베린 역수송체 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 미생물을 하나 이상의 리신/카다베린 역수송체 유전자로 형질전환시키는 미생물의 무작위 돌연변이화에 의해, 또는 예컨대 리신을 내수송하고 카다베린을 외수송하는 성향으로 리신/카다베린 역수송체 폴리펩티드의 리신/카다베린 역수송체 활성을 최적화시킴으로써, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 미생물의 리신/카다베린 역수송체 활성은 서열 번호 11과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 리신/카다베린 역수송체 활성을 가지는 하나 이상의 리신/카다베린 역수송체 폴리펩티드, 예컨대 리신/카다베린 역수송체 활성을 가지는 상동체 또는 돌연변이체의 재조합 발현에 의해 증강된다.
재조합 발현은 예를 들어 하나 이상의 리신/카다베린 역수송체 유전자의 형질전환에 의해, 발현 활성이 더 높은 탈조절된 프로모터를 내인성 리신/카다베린 역수송체 유전자에 제공함으로써, 또는 리신/카다베린 역수송체 유전자 발현 또는 유전자 생성물 활성의 음성 조절 인자를 감소시킴으로써 달성될 수 있다.
본원에서 서열 번호 11로 개시되는 cadB 유전자 생성물의 내수송 또는 외수송 활성은 세포 및 발효 배지 중의 리신 및 카다베린 농도에 따라 달라지는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 기능적 cadB 유전자 생성물을 발현하는 특정 미생물의 리신 내수송능은 발효 배지 중의 리신 농도를 증가시킴으로써, 발효 배지의 낮은 pH 값을 막음으로써, 또는 발효 배지 중의 주어진 리신의 농도 또는 pH 값에서 리신 내수송을 촉진시키는 돌연변이를 삽입함으로써, 또는 이들의 조합에 의해 향상될 수 있다 (문헌 [Soksawatmaekhin W. et al.; Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli; Molecular Microbiology; 2004,; volume 51,5; pages 1401 to 1412]).
발효 배지 중의 주어진 리신의 농도 또는 pH 값에서 에스케리키아 콜라이 cadB 유전자 생성물의 리신 내수송을 촉진시키는 여러 돌연변이가 기술되어 있다 (문헌 [Soksawatmaekhin W. et al.; Identification of the Cadaverine Recognition Site on the Cadaverine-Lysine Antiporter CadB; The Journal of Biological Chemistry; 2006; volume 281, 39; pages 29213 to 29220]). 당업자는 다른 cadB 단백질, 예컨대 cadB의 상동체 또는 돌연변이체에서 유사한 돌연변이를 확인할 수 있을 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, 리신/카다베린 역수송체 폴리펩티드는 서열 번호 11과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 하기 돌연변이: C12S, W41L, W43L, Y55L, Y57L, Y73L, Y73F, Y73W, Y89L, Y89F, Y89W, Y90L, Y90F, Y90W, Y107L, Y174L, C125S, D185N, E204Q, E204D, Y235L, Y235F, Y235W,W289L, D303N, D303E, Y310L, Y366L, Y368L, D372N, E377Q, E408Q, Y423L, Y423F 및 Y423W 중 하나 이상을 포함한다. 상기 언급된 돌연변이들은 cadB 유전자 생성물의 아미노산 서열에 따라 명명된다. 당업자는 서열 비교 도구를 사용함으로써, 예컨대 서열 정렬을 사용함으로써, 상기 돌연변이들을 다른 유전자 생성물, 예컨대 cadB 유전자 생성물과 상동성인 유전자 생성물로 전달할 수 있을 것이다.
바람직하게, 서열 번호 11과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 리신/카다베린 역수송체 폴리펩티드는 하기 돌연변이: W41L, W43L, Y57L, Y89L, Y107L, Y174L, D185N, E204Q, Y235L, W289L, D303N, Y366L, Y368L, D372N 및 E408Q 중 하나 이상을 포함한다.
서열 번호 11과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 더욱 바람직한 리신/카다베린 역수송체 폴리펩티드는 하기 돌연변이: W41L, W43L, Y57L, Y107L, Y174L, D185N, Y366L, Y368L 및 E408Q 중 하나 이상을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 세포내 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 포함하거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성을 포함하거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 포함하고, 리신 생산능이 높은 미생물을 제공한다. 리신이 예컨대 카다베린으로 더 이상 대사되지 않는 경우, 리신 생산능이 높은 미생물은 예컨대 세포 내부에서 또는 주변 배지 중에서 리신을 강화시킬 수 있다.
바람직하게, 리신 생산능이 높은 미생물은 (i) 군으로부터 선택되는 1개 이상의 탈조절된 유전자를 가진다. (i) 군은 리신의 생합성에서 중요한 역할을 하는 유전자로 이루어진 군이며, 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데히드 데히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라히드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프룩토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데히드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제, 디아민-아세틸트랜스퍼라제의 유전자로 구성된다.
(i) 군 중 1개 이상의 유전자는 본 발명의 방법에 따라 탈조절되어야 한다. 바람직하게, (i) 군 중 1개 초과의 유전자, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 유전자가 본 발명에 따른 미생물에서 탈조절된다.
탈조절시키고자 하는 (i) 군의 바람직한 유전자는 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데히드 데히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프룩토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데히드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 디아민-아세틸트랜스퍼라제이다.
(i) 군의 유전자 및 유전자 생성물은 당업계에 공지되어 있다. EP 1108790에는 리신 생산에서 재조합 코리네박테리아의 생산성에 대해 유익한 영향을 미치는 호모세린데히드로게나제 및 피루베이트 카르복실라제의 유전자에서의 돌연변이가 개시되어 있다. WO 00/63388에는 리신 생산에서 재조합 코리네박테리아의 생산성에 대해 유익한 영향을 미치는 아스파르토키나제의 유전자에서의 돌연변이가 개시되어 있다. EP 1108790 및 WO 00/63388은 상기 기술된 유전자 중의 돌연변이와 관련하여 참고로 포함된다.
하기의 표에 모든 유전자/유전자 생성물에 관한 각 유전자의 가능한 탈조절 방법들이 언급되어 있다. 표의 "탈조절" 열에 인용되어 있는 문헌 및 문서들은 유전자 탈조절과 관련하여 본원에 참고로 포함된다. 표에 언급되어 있는 방법들은 각 유전자의 탈조절의 바람직한 실시양태이다.
효소 (유전자 생성물) 유전자 탈조절
아스파르토키나제 ask 점 돌연변이에 의한 피드백 억제의 해제 (문헌 [Eggeling et al., (eds.), Handbook of Corynebacterium glutamicum, pages 20.2,2 (CRC press, 2005)]) 및 증폭
아스파르테이트세미알데히드 데히드로게나제 asd 증폭
디히드로디피콜리네이트 신타제 dapA 증폭
디히드로디피콜리네이트 리덕타제 dapB 증폭
테트라히드로디피콜리네이트 숙시닐라제 dapD 증폭
숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제 dapC 증폭
숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제 dapE 증폭
디아미노피멜레이트 데히드로게나제 ddh 증폭
디아미노피멜레이트 에피머라제 dapF 증폭
아르기닐-tRNA 신테타제 argS 증폭
디아미노피멜레이트 데카르복실라제 lysA 증폭
피루베이트 카르복실라제 pycA 점 돌연변이에 의한 피드백 억제의 해제 (EP1108790) 및 증폭
포스포에놀피루베이트 카르복실라제 ppc 증폭
글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 G6PDH
zwf 		점 돌연변이에 의한 피드백 억제의 해제 (US2003/0175911) 및 증폭
트랜스케톨라제 tkt 증폭
트랜스알돌라제 tal 증폭
6-포스포글루코노락토나제 pgl 증폭
6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 점 돌연변이 및 증폭
프룩토스 1,6-비포스파타제 fbp 증폭
호모세린 데히드로게나제 hom 점 돌연변이에 의해 감쇠 (EP1108790), 유전자 활성의 감소,
돌연변이에 의한 넉 아웃 또는 침묵화
포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 pck 돌연변이에 의한 넉 아웃 또는 침묵화, 유전자 활성의 감소 등
숙시닐-CoA 신테타제 sucC 점 돌연변이에 의해 감쇠 (WO 05/58945), 유전자 활성의 감소,
돌연변이에 의한 침묵화
메틸말로닐-CoA 뮤타제 MMCM 점 돌연변이에 의해 감쇠 (WO 05/58945), 유전자 활성의 감소,
돌연변이에 의한 넉 아웃 또는 침묵화
디아민 아세틸트랜스퍼라제 RXA2240 유전자 활성의 감소에 의한 약화, 돌연변이에 의한 넉 아웃 또는 침묵화, 결실
아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데히드 데히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라히드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프룩토스 1,6-비포스파타제의 유전자를 탈조절시키는 바람직한 방법은 예컨대 강력한 발현 신호를 사용한 유전자 증폭, 및/또는 효소 활성을 증강시키는 점 돌연변이에 의해 유전자 활성을 증가시키는 "상향"-돌연변이이다.
호모세린 데히드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제 아세틸트랜스퍼라제의 유전자를 탈조절시키는 바람직한 방법은 예컨대 약한 발현 신호 및/또는 효소 활성을 파괴 또는 감소시키는 점 돌연변이를 사용하는 유전자 결실 또는 파괴에 의해 유전자 활성을 감소시키는 "하향" 돌변변이이다.
아스파르토키나제가 유전자 (i) 군의 구성원으로서 탈조절되는 경우에는, 적어도 제2 유전자 (i) 구성원 -아스파르토키나제가 아닌 다른 것- 또한 탈조절되어야 한다.
본 발명 방법에 따른 미생물에서 생산되는 카다베린의 상당 부분이 추후에 아세틸화될 수 있다는 것이 관찰된 바 있다 (WO 2007/113127). N-아세틸카다베린을 생산할 수 있는 효소 활성 폴리펩티드로 정의되는 N-아세틸카다베린-형성 폴리펩티드에 기인하는 아세틸화 반응을 차단하여, 카다베린의 수율을 증가시키기 위해서는, 특히 예컨대 유전자의 결실 또는 파괴에 의해 그의 활성이 감소되도록 생산 미생물의 디아민 아세틸트랜스퍼라제를 탈조절시키는 것이 본 발명의 바람직한 실시양태이다.
N-아세틸카다베린-형성 폴리펩티드의 일례는 예를 들어 서열 번호 12 및 서열 번호 13에 개시되어 있는 바와 코리네박테리움 글루타미쿰의 아세틸-CoA 의존성 디아민 아세틸트랜스퍼라제 (NP_600742 단백질)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, N-아세틸카다베린-형성 활성은 서열 번호 3과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지는 1개 이상의 N-아세틸카다베린-형성 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 감소된다. N-아세틸카다베린-형성 활성은 WO 2007/113127에 기술되어 있는 바와 같이 시험될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 미생물에서 생산되는 카다베린의 상당 부분이 아미노프로필카다베린-형성 폴리펩티드에 의해 아미노프로필카다베린으로 전환될 수 있다는 것이 관찰된 바 있다. 이와 같은 반응을 차단하여 카다베린의 수율을 증가시키기 위해서는, 특히 예컨대 유전자의 결실 또는 파괴에 의해 그의 활성이 감소되도록, 생산 미생물의 아미노프로필카다베린-형성 폴리펩티드를 탈조절시키는 것이 본 발명의 바람직한 실시양태이다.
아미노프로필카다베린-형성 폴리펩티드의 일례는 문헌 [Soksawatmaekhin W. et al; Molecular Microbiology; (2004) Vol. 51,5; pages 1401 to 1412]에 기술되어 있는 바와 같은 에스케리키아 콜라이의 스페르미딘 신타제, 서열 번호 14이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 아미노프로필카다베린-형성 활성은 서열 번호 14와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1개 이상의 아미노프로필카다베린-형성 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 감소된다.
JP2004222569에 기술되어 있는 바와 같이 카다베린을 생산하는 미생물의 호모세린 데히드로게나제 폴리펩티드 활성을 탈조절시킴으로써, 바람직하게는 호모세린 데히드로게나제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 결실 또는 파괴를 통한 그의 활성 감소에 의해 미생물의 리신 생산 능력이 향상될 수 있다는 것이 관찰된 바 있다.
호모세린 데히드로게나제 폴리펩티드의 일례는 본원에서 서열 15로 개시되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰의 호모세린 데히드로게나제, 또는 본원에서 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 개시되어 있는 에스케리키아 콜라이의 호모세린 데히드로게나제이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 호모세린 데히드로게나제 활성은 서열 번호 15, 16 또는 17과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 호모세린 데히드로게나제 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 감소된다.
호모세린 데히드로게나제 활성의 측정 방법은 문헌 [M. B. Jenkins, V. W. Woodward, Biochimica et Biophysica Acta, 1970, 212, 21-32]에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 미생물은 탈카르복실화에 의해서가 아닌, 예컨대 감소된 리신 히드록실라제 활성을 가지는 것에 의해, 감소된 리신 분해 능력을 가진다.
리신 히드록실라제 폴리펩티드는 리신 N6-히드록실라제 [EC: 1.14.13.59]로도 기술되기도 하는 리신 히드록실라제 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 리신 히드록실라제 활성을 가지는 것에 대한 시험에 대해서는 문헌 [Meneely KM, and Lamb AL BIOCHEMISTRY 46 Pages: 11930-11937 2007] 및 [IJ, Hsueh LC, Baldwin JE, et al. EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 268 Pages: 6625-6636]에서 살펴볼 수 있다.
일례는 에스케리키아 콜라이 CFT073의 리신 히드록실라제 iucD 이다 (서열 번호 18).
본 발명의 추가의 실시양태에서, 리신 분해 활성은 서열 번호 18인 리신 히드록실라제와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 리신 히드록실라제 활성을 가지는 1개 이상의 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 감소된다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 미생물은 탈조절된 스페르미딘 형성 또는 흡수 활성, 또는 푸트레신 형성 또는 흡수 활성, 또는 이들의 조합을 가진다.
스페르미딘 형성 활성은 스페르미딘을 합성할 수 있는 폴리펩티드에 의해 이루어진다다. 스페르미딘 형성 폴리펩티드의 일례는 서열 14의 스페르미딘 신타제이다.
푸트레신 형성 활성은 푸트레신을 합성할 수 있는 폴리펩티드에 의해 이루어진다. 푸트레신 형성 폴리펩티드의 일례는 E. 콜라이의 푸트레신 신타제 speE (예컨대 서열 19에 개시되어 있는 것과 같은 것), 또는 E. 콜라이의 오르니틴 데카르복실라제 speF (예컨대 서열 20에 개시되어 있는 것과 같은 것)이다.
스페르미딘 또는 푸트레신 흡수 활성을 가지는 폴리펩티드는 스페르미딘 또는 푸트레신, 또는 이 둘 모두를 세포 내로 수송할 수 있는 폴리펩티드이다. 스페르미딘 및/또는 푸트레신 흡수 폴리펩티드의 일례는 푸트레신/오르니틴 역수송체로서의 작용을 하는 E. 콜라이의 potE (예컨대 서열 21에 개시되어 있는 것과 같은 것)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 미생물은 감소된 스페르미딘 형성 또는 흡수 활성, 또는 푸트레신 형성 또는 흡수 활성을 가지며, 여기서,
a) 스페르미딘 형성 활성은 서열 번호 14와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 스페르미딘 형성 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 탈조절되거나,
b) 푸트레신 형성 활성은 서열 번호 19와 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 푸트레신 형성 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 탈조절되거나,
c) 푸트레신 형성 활성은 서열 번호 20과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 오르니틴 데카르복실라제 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 탈조절되거나,
d) 스페르미딘 또는 푸트레신, 또는 스페르미딘 및 푸트레신 흡수 활성은 서열 번호 21과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 스페르미딘 또는 푸트레신, 또는 스페르미딘 및 푸트레신 흡수 폴리펩티드의 활성을 감소시킴으로써 탈조절되거나,
e) 스페르미딘 형성 또는 흡수 활성, 또는 푸트레신 형성 또는 흡수 활성, 또는 이들의 조합은 a), b), c) 또는 d)의 조합의 활성을 감소시키는 것에 의해 감소된다.
본 발명의 중요한 측면은 원하는 화합물인 카다베린이 생산되도록, 본원에서 기술되는 재조합 미생물을 배양(cultivating) 또는 배양(culturing)하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 세포내 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 포함하거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성을 포함하거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 배양하는 데 적합한 발효 배지, 바람직하게, 리신을 포함하는 발효 배지를 포함하는 카다베린 생산 시스템이다.
카다베린 생산 시스템은 카다베린의 생산을 위한 기술적 시스템, 예를 들어 카다베린을 생산하는 미생물 또는 리신 포함 용액 또는 배양 배지 및 리신 데카르복실라제를 생산하는 미생물을 포함하는 배양 배지이다. 보통, 카다베린 생산 시스템은 카다베린의 생산을 지지하기 위한 기술적 시스템, 예컨대 발효기를 포함한다.
"배양하는"이라는 용어는 본 발명의 살아있는 미생물을 유지하는 것 및/또는 성장시키는 것 (예컨대 배양물 또는 균주를 유지하는 것 및/또는 성장시키는 것)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 액체 배지에서 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 고체 배지 또는 반-고체 배지 상에서 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 미생물의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유익한 영양소를 포함하는 배지 (예컨대 멸균 액체 배지)에서 배양된다.
사용될 수 있는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예를 들어 대두유, 해바라기 오일, 땅콩유, 및 코코넛 오일, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜, 예를 들어 글리세롤 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어 아세트산을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 글루코스, 프룩토스 또는 수크로스가 탄소 공급원으로 사용된다. 이러한 물질들은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에서 기술되는 미생물은 크실로스, 아라비노스, 셀로비오스 또는 그의 혼합물을 포함하는 액체, 고체 또는 반-고체 배지에서 배양되며, 상기와 같은 배지는 상기한 것들과 같은 다른 탄소 공급원을 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 미생물을 배양하기 위한 배지는 제한된 수의 상이한 탄소 공급원들, 예컨대 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 이상의 탄소 공급원들만을 포함할 수 있거나, 또는 매우 복합적인 탄소 공급원 혼합물인 리그노셀룰로스 기질 또는 농업 부산물의 가수분해물, 예컨대 제한하는 것은 아니지만, 옥수수, 밀, 호밀, 보리, 벼, 카사바와 같은 공급원 유래 전분의 가수분해물, 또는 짚, 목재, 종이, 또는 식물 기원의 다른 물질의 가수분해물을 포함할 수 있다. 바람직한 탄소 공급원 조합은 고함량의 글루코스 및 크실로스, 프룩토스 및 크실로스, 수크로스 및 크실로스, 또는 수크로스 및 글루코스, 또는 수크로스 및 프룩토스, 또는 수크로스, 글루코스 및 프룩토스 및 수크로스, 글루코스, 프룩토스 및 크실로스, 또는 글루코스, 프룩토스 및 크실로스 또는 글루코스, 프룩토스, 크실로스 및 아라비노스 또는 수크로스, 크실로스 및 아라비노스, 또는 글루코스, 크실로스 및 아라비노스, 및 언급된 당들의 다른 조합을 포함하는 배지이다.
배지가 크실로스를 포함하는 경우, 크실로스 대사의 유전자를 발현 또는 과다발현하는 본 발명의 미생물을 사용하는 것이 유리하다. 크실로스 대사의 유전자로는 예를 들어 크실로스 수송 시스템을 위한 유전자 (xylE, xylT 및 xylFGH 유전자), 크실로스 이용을 위한 유전자 (xylA 및 xylB 유전자) 및 크실로스 전사 활성 인자를 위한 유전자 (xylR 유전자)를 포함하는 E. 콜라이 xylABFGHR 유전자좌의 유전자이다. xylABFGHR 유전자좌의 유전자를 과다발현하는 미생물은 EP1577396 및 EP1577369에 기술되어 있다. xylA의 유전자를 단독으로, 또는 크실로스 이소머라제를 코딩하는 E. 콜라이의 xylB 유전자 및 크실룰로키나제를 코딩하는 xylB와 함께 과다발현하는 코리네박테리아가 기술된 바 있다 (문헌 [Kawaguchi, et al. Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium gutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2006, Vol. 72, 5, pages 3418 to 3428]). 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 적어도 xylA 또는 xylB 유전자, 더욱더 바람직하게는 xylA 및 xylB 유전자를 발현 또는 과다발현한다.
배지가 아라비노스를 포함하는 경우, 아라비노스 대사의 유전자를 발현 또는 과다발현하는 본 발명의 미생물을 사용하는 것이 유리하다. 아라비노스 대사의 유전자로는 예를 들어 L-아라비노스 이소머라제 (araA), L-리볼로키나제 (araB) 및 L-리불로스-5-포스페이트-4-에피머라제 (araD)를 코딩하는 E. 콜라이의 araBAD 오페론 유전자, 예컨대 araA, araB, araD 및 araE 유전자, 또는 araA, araB 및 araD 유전자의 상동체를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 araBDA 오페론 유전자, 및 L-아라비노스 이소머라제를 코딩하는 araE, 전사 조절 인자를 코딩하는 araR 유전자, 및 추정 알도스 1-에피머라제를 코딩하는 galM 유전자이다. 바람직하게, 본 발명의 미생물은 적어도 araA, araB 및 araD 유전자, 더욱 바람직하게는 적어도 araA, araB, araD 및 araE 유전자를 발현 또는 과다발현한다 (문헌 [Kawaguchi et al. Identification and Functional Analysis of the Gene Cluster for L-Arabinose Utilization in Corynebacterium glutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75, Vol. 1 1, pages 3419-3429]).
아라비노스 대사 유전자의 E. 콜라이 상동체는 또한 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 이종성 미생물에서 사용될 수도 있다 (문헌 [Kawaguchi et al. Engineering of an L-Arabinose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 77, Vol, 5, pages 1053 to 1062]).
배지가 셀로비오스를 포함하는 경우, 셀로비오스 대사의 유전자를 발현 또는 과다발현하는 본 발명의 미생물을 사용하는 것이 유리하다. 셀로비오스 대사의 유전자로는 예를 들어 포스포에놀피루베이트:카르보히드레이트 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS) 베타-글루코시드-특이적 효소 IIBCA 구성요소 및 포스포르-베타 -글루코시다제를 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 bglA 유전자로서, 코리네박테리움 R 균주로부터의 이러한 유전자 및 각 단백질의 예는 수탁 번호 AF508972 하에 살펴볼 수 있다.
배지가 크실로스, 아라비노스, 셀로비오스 또는 다른 탄소 공급원의 조합을 포함하는 경우, 크실로스 대사, 아라비노스 대사 또는 셀로비오스 대사의 유전자를 발현 또는 과다발현하는 본 발명의 미생물을 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어 배지가 고함량의 크실로스- 및 아라비노스를 가지는 경우, 크실로스- 및 아라비노스 대사의 유전자를 발현 또는 과다발현하는 미생물, 예를 들어 xylA 및 xylB 유전자 및 araA, araB, araD 유전자, 바람직하게는 xylA 및 xylB, araA, araB, araD 및 araE 유전자를 발현하는 미생물을 사용하는 것이 유리하다.
배지가 고함량의 크실로스 및 셀로비오스를 가지는 경우, 크실로스- 및 셀로비오스 대사의 유전자를 발현 또는 과다발현하는 미생물, 예를 들어 xylA 및 xylB 및 bglA 유전자를 발현하는 미생물을 사용하는 것이 유리하다 (문헌 [Sasaki et al. Simultaneous utilization of D-cellobiose, D-glucose, and D-xylose by recombinant Corynebacterium glutamicum under oxygen-deprived conditions, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, Vol. 81, 4, pages 691 to 699])
사용될 수 있는 질소 공급원에는 질소를 함유하는 유기 화합물, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침출액, 대두분 및 우레아 또는 무기 화합물, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 포함한다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수있는 인 공급원은 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 나트륨을 함유하는 상응 염이다. 배양 배지는 추가로 성장에 필요한 금속염, 예를 들어 황산마그네슘 또는 황산철을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 언급된 물질들 이외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질이 사용될 수도 있다. 적합한 전구체는 추가로 배양 배지에 첨가될 수 있다. 언급된 공급 물질들은 단일 배치로서 배양물에 첨가되거나, 배양 동안 적절하게 공급될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 미생물은 pH 조절하에서 배양된다. "pH 조절"이라는 용어는 원하는 정밀 화학물질, 예컨대 카다베린이 생산되도록 하는 임의의 pH를 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물은 약 pH 7에서 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 미생물은 pH 6.0 내지 8.5에서 배양된다. 원하는 pH는 당업자에게 알려져 있는 임의 개수의 방법들에 의해 유지될 수 있다. 예를 들어 배양물의 pH를 적절하게 조절하는 데 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물이 사용된다.
또한 바람직하게, 본 발명의 미생물은 통기 조절하에서 배양된다. "통기 조절"라는 용어는 원하는 정밀 화학물질, 예컨대 카다베린을 생산하는 데 충분한 통기 (예컨대 산소)를 포함한다. 한 실시양태에서, 통기는 예를 들어 배양 배지에 용해되는 산소의 양을 조절하는 것에 의해 배양물 중 산소 수준을 조절함으로써 조절된다. 바람직하게는, 배양물의 통기는 배양물을 교반함으로써 조절된다. 프로펠러 또는 유사한 기계식 교반 장비에 의해, 성장 베쓸 (예컨대 발효기)을 회전시키거나 진탕시킴으로써, 또는 다양한 펌핑 장비에 의해 교반될 수 있다. 통기는 추가로 배지를 통한 (예컨대 발효 혼합물을 통한) 멸균 대기 또는 산소의 통과에 의해 조절될 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 과도한 기포형성 없이 (예컨대 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제의 첨가를 통해) 배양된다.
또한, 본 발명의 미생물은 온도 조절하에서 배양될 수 있다. "온도 조절"이라는 용어는 원하는 정밀 화학물질, 예컨대 카다베린이 생산되도록 하는 임의의 온도를 포함한다. 한 실시양태에서, 조절되는 온도로는 15℃ 내지 95℃의 온도를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조절되는 온도로는 15℃ 내지 70℃의 온도를 포함한다. 바람직한 온도는 20℃ 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 45℃ 또는 30℃ 내지 50℃이다.
바람직하게, 미생물은 액체 배지에서 배양 (예컨대 유지 및/또는 성장)될 수 있으며, 바람직하게는 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양 (예컨대 회전식 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 통기 스피너 배양, 또는 발효와 같은 종래의 배양 방법에 의해 연속식 또는 간헐식 중 어느 한 방식으로 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 미생물은 진탕 플라스크에서 배양된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 미생물은 발효기에서 배양된다 (예컨대 발효 공정). 본 발명의 발효 공정은 배치, 공급 배치 및 연속식 발효 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "배치 공정" 또는 "배치 발효"라는 어구는 배지, 영양소, 보충 첨가제 등의 조성이 발효 개시시에 설정되며, 발효 동안 변경되지 않지만, 과도한 배지 산성화 및/또는 미생물 사멸을 방지하기 위하여, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 조절하기 위한 시도는 이루어질 수 있는 폐쇄된 시스템을 의미한다. "공급-배치 공정" 또는 "공급-배치" 발효라는 어구는 발효가 진행될 때 하나 이상의 기질 또는 보충물질이 첨가된다는 (예컨대 증분식으로 또는 연속식으로 첨가) 것을 제외한, 배치 발효를 의미한다. "연속식 공정" 또는 "연속식 발효"라는 어구는 정해진 발효 배지가 연속식으로 발효기에 첨가되며, 동일한 양의 사용된, 또는 "조절된" 배지가 바람직하게는 원하는 카다베린의 회수를 위하여 동시에 제거되는 시스템을 의미한다. 그와 같은 다양한 공정들이 개발되어 있으며, 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 방법론은 추가로 카다베린을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 카다베린을 "회수하는"이라는 용어는 배양 배지로부터 화합물을 추출, 수확, 단리 또는 정제하는 것을 포함한다. 화합물을 회수하는 것은 종래 수지 (예컨대 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비-이온계 흡착 수지 등)를 사용한 처리, 종래의 흡착제 (예컨대 활성탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로스, 알루미나 등)를 사용한 처리, pH 의 변경, (예컨대 알콜, 에틸 아세테이트, 헥산 등과 같은 종래의 용매를 사용한) 용매 추출, 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정, 동결건조 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 종래의 단리 또는 정제 방법론에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 카다베린은 먼저 미생물을 제거함으로써 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 이어서, 바이오매스가 제거된 브로쓰를 양이온 교환 수지를 통해 또는 그 위로 통과시킴으로써 원치않는 양이온들을 제거한 후, 음이온 교환 수지를 통해 또는 그 위로 통과시킴으로써 원치않는 무기 음이온 및 카다베린보다 더 강한 산도를 가지는 유기산들을 제거한다. 또한, 브로쓰를 가성제로 처리한 후, 유기 용매, 예컨대 알콜을 사용하여 상 분리에 의해 카다베린을 추출할 수 있다. 추출된 상으로부터, 증류에 의해 다양한 적용 분야에 충분한 순도로 카다베린을 회수할 수 있다. 가능한 적용 분야로는 디카르복실 유기산과의 중축합에 의한 폴리아미드의 제조를 포함한다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 카다베린의 생산에 대하여 상기에 언급된 바와 같은 단계를 포함하는 폴리아미드 (예컨대 나일론™)의 제조 방법을 제공한다. 폴리아미드를 수득하기 위하여, 카다베린을 공지된 방식으로 디-, 트리- 또는 폴리카르복실산과 반응시킨다. 바람직하게, 카다베린을 4 내지 10개의 탄소를 함유하는 디카르복실산, 예컨대 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산 등과 반응시킨다. 상기 디카르복실산은 바람직하게는 유리 산이다.
본 발명의 미생물은 미생물을 배양물 중에서 성장시키는, 바람직하게는 상기 기술된 바와 같은 배양 조건하에서 미생물을 성장시키는 것인 상기 미생물을 발효시킴으로써 카다베린을 생산하는 데 유용하다.
따라서, 본 발명은 세포내 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 포함하거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성을 포함하거나, 세포내 및 세포외 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신 내수송 활성을 포함하는 미생물을 발효시키는 것을 포함하는, 카다베린의 생산 방법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 배양 배지로부터 카다베린을 회수하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 미생물은 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성을 포함하며, 예컨대 서열 번호 11과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 폴리펩티드를 과다발현하고, 리신/카다베린 역수송체 활성을 가지는 미생물, 예컨대 리신/카다베린 역수송체 활성을 가지는 상동체 또는 돌연변이체를 포함하고, 본 방법은 리신을 포함하는 배지 중에서 상기 미생물을 발효시키는 것을 포함한다. 바람직하게, 배양 배지는 0.1 mM 초과, 또는 0.5 mM 초과, 또는 1 mM 초과, 또는 3 mM 초과, 또는 5 mM 초과, 또는 7 mM 초과, 또는 8 mM 초과, 또는 9 mM 초과, 또는 10 mM 초과의 리신을 포함한다. 더욱 바람직한 배양 배지는 15 mM 초과의 리신을 포함한다. 더욱더 바람직한 배양 배지는 20 mM 초과의 리신을 포함한다. 가장 바람직한 배양 배지는 30 mM 초과의 리신을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 미생물은 세포외 리신 데카르복실라제 활성을 포함하거나, 세포외 리신 데카르복실라제 활성 및 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 배양 배지 중 카다베린의 농도 (mol/ℓ)가 N-아세틸카다베린 또는 아미노프로필카다베린의 농도 (mol/ℓ), 또는 이 둘 모두의 농도보다 1.2배 이상 더 높거나, 또는 1.3배 초과로 더 높거나, 1.4배 초과로 더 높거나, 1.5배 초과로 더 높거나, 1.6배 초과로 더 높거나, 1.7배 초과로 더 높거나, 1.8배 초과로 더 높거나, 1.9배 초과로 더 높거나, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 초과로 더 높은 것인, 카다베린의 생산 방법이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 방법에서 생산된 배양 배지이다.
상기 기술된 방법에 의해 생산된 카다베린은 카다베린의 생산 방법이 끝나거나, 또는 종료된 후에, 카다베린 (DAP)을 포함하는 발효 브로쓰, 즉, 그 상태 그대로의 배양 배지의 후처리에 의해 회수 또는 정제될 수 있다.
하기 배지에서 기술되는 바와 같은 발효 브로쓰로부터 카다베린을 회수 또는 정제하는 방법은 예시 목적만을 위한 것이다. 당업자라면, 역시 성공적으로 적용될 수 있는 하기 기술되는 방법의 대안 방법 또는 변형법들에 대해 알고 있을 것이다.
생산된 카다베린을 회수하기 위해서는, 발효 브로쓰를 농후화 또는 농축시키는 것이 유리하다. 발효 브로쓰는 공지의 방법에 의해, 예를 들어 회전식 증발기, 박막 증발기, 강하 막 증발기의 도움으로, 역삼투에 의해, 또는 나노여과에 의해 농후화 또는 농축될 수 있다. 필요에 따라서는, 농축 절차로 인하여 침전되었을 수 있는 염은 예컨대 여과 또는 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 이어서, 이와 같은 농축 발효 브로쓰를 본 발명의 방식으로 후처리함으로써 카다베린을 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 후처리를 위해서, 상기와 같은 농축 절차가 적절하지만, 절대적으로 필요한 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 카다베린은 유기 추출제의 도움으로 발효 브로쓰로부터 추출된다. 더욱 구체적으로, 물과 혼화성 갭을 가지며, 가능한 한 극성이고, 알칼리성 pH에서 안정한 유기 용매, 예컨대 특히 극성의 쌍극자 양성자성인 유기 용매가 사용된다. 적합한 용매는 특히 3 내지 8 개의 탄소 원자를 가지는 시클릭 또는 개방-쇄의, 임의적으로 분지형인 알칸올, 특히 n- 및 이소-프로판올, n-, sec-및 이소-부탄올, 또는 시클로헥산올, 및 또한 n-펜탄올, n-헥산올, n-헵탄올, n-옥탄올, 2-옥탄올 및 그의 단일- 또는 다분지형 이성질체 형태이다. 특히 n-부탄올을 언급할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 추출 및/또는 이어지는 상 분리는 물 및 추출제 또는 가능하게는 형성될 수도 있는 공비 혼합물의 비등점에 의해 제한되는 승온에서 배치식으로 수행된다. n-부탄올을 추출제로 사용하는 경우, 추출 및 상 분리는 예를 들어 약 25-90℃, 또는 바람직하게는 40-70℃에서 수행될 수 있다. 추출을 위해서는, 분배 평형이 확립될 때까지, 예를 들어 10초 내지 2시간, 바람직하게는 5 내지 15 min의 기간 동안에 걸쳐 2개의 상을 교반한다. 이어서, 상들이 완전하게 분리될 때까지 상을 침강되도록 방치되는데; 이는 바람직하게는 특히 n-부탄올의 경우에도 또한 약 25-90℃ 또는 40-70℃ 범위의 온도에서, 10초 내지 5시간, 예를 들어 15 내지 120분 또는 30 내지 90분이 소요된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 카다베린은 연속식으로 다단계 공정으로 (예컨대 믹서-침강기 조합으로), 또는 연속식으로 추출 칼럼에서 발효 브로쓰로부터 추출된다.
본 발명에 따라 매 경우 통상의 최적화 작업의 일부로서 상을 분리하는 데 사용될 수 있는 추출 칼럼의 구성은 숙련된 작업에 의해 확립될 수 있다. 적합한 추출 칼럼은 원칙적으로 전력이 투입되지 않은 것 또는 전력이 투입된 것, 예를 들어 펄스형 칼럼 또는 회전형 내장장치가 구비된 칼럼이다. 숙련자는 또한 통상의 일상적인 작업의 일부로서 상 분리를 최적화시키기 위해 예컨대 시브 트레이 및 칼럼 트레이와 같은 내장장치의 유형 및 재료를 적합한 방식으로 선택할 수 있다. 소형 분자의 액체-액체 추출의 기본 이론에 대해서는 주지되어 있다 (예컨대 문헌 [H.-J. Rehm and G. Reed, Eds., (1993), Biotechology, Volume 3 Bioprocessing, Chapter 21, VCH, Weinheim] 참조). 산업상 적용가능한 추출 칼럼의 구성에 대해서는 예를 들어 문헌 [Lo et al., Eds., (1983) Handbook of Solvent Extraction, JohnWiley& Sons, New York]에 기술되어 있다. 상기 교재의 개시내용을 명시적으로 참조한다.
상 분리 후, 카다베린을 그 자체가 공지되어 있는 방식으로 카다베린 포함 추출물 상으로부터 단리 및 정제시킨다. 가능한 카다베린 회수 수단은 특히 제한없이, 증류, 적합한 유기산 또는 무기산을 사용한 염으로서의 침전, 또는 상기와 같은 적합한 수단들의 조합이다.
증류는 연속식으로 또는 배치식으로 수행될 수 있다. 단일 증류 칼럼 또는 서로 연계된 복수 개의 증류 칼럼이 사용될 수 있다. 증류 칼럼 장치를 배치하고, 가동 파라미터를 확립하는 것은 숙련가의 책임이다. 각 경우에 사용되는 증류 칼럼은 그 자체가 공지되어 있는 방식으로 디자인될 수 있다 (예컨대 문헌 [Sattler, Thermische Trennverfahren [Thermal separation methods], 2nd Edition 1995, Weinheim, p. 135ff]; [Perry's Chemical Engineers Handbook, 7th Edition 1997, New York, Section 13] 참조). 따라서, 사용되는 증류 칼럼은 분리에 효과적인 내장장치, 예컨대 분리 트레이, 예컨대 천공 트레이, 버블-캡 트레이 또는 밸브 트레이, 정렬된 패킹, 예컨대 시트-금속 또는 직물 패킹, 또는 무작위 패킹 상을 포함할 수 있다. 사용되는 칼럼(들)에서 필요한 플레이트의 개수 및 환류비는 본질적으로 순도 요건, 및 분리시키고자 하는 액체들의 상대적인 비등 위치에 의해 좌우되며, 숙련가는 공지의 방법에 의해 구체적인 디자인 및 가동 데이터를 확인할 수 있다.
염으로서의 침전은 적합한 유기 또는 무기산, 예를 들어 황산, 염산, 인산, 아세트산, 포름산, 탄산, 옥살산 등을 첨가하는 것에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 유기 디카르복실산을 사용함으로써, 폴리아미드를 수득하기 위한 후속의 중축합에 바로, 또는 정제, 예컨대 재결정화에 의한 정제 후에 사용될 수 있는 염을 형성한다. 더욱 구체적으로, 상기와 같은 디카르복실산은 C 4-C12-디카르복실산이다.
추출 절차에서 생산된 유기 카다베린 상은 또한 크로마토그래피에 의해 후처리될 수도 있다. 크로마토그래피를 위하여, 카다베린 상을 적합한 수지, 예를 들어 강산성 또는 약산성 이온 교환기 (예컨대 레와티트(Lewatit) 1468 S, 도웩스 마라톤(Dowex Marathon) C, 앰버리스트(Amberlyst) 119 웨트(Wet) 등)에 적용시키며, 원하는 생성물 또는 오염물은 부분적으로 또는 완전하게 크로마토그래피 수지에 남게 된다. 이러한 크로마토그래피 단계는 필요에 따라, 동일하거나 다른 크로마토그래피 수지를 사용하여 반복될 수 있다. 숙련가는 적절한 크로마토그래피 수지를 선택하고, 그를 가장 효과적으로 적용하는 데에 익숙하다. 정제된 생성물을 여과 또는 한외여과에 의해 농축시킨 후, 적절한 온도에서 보관할 수 있다.
단리된 화합물(들)의 정체 및 순도는 선행 기술의 기술에 의해 측정될 수 있다. 이는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피 (GC), 분광분석법, 염색법, 박층 크로마토그래피, NIRS, 효소 검정 또는 미생물 검정을 포함한다. 이러한 분석법들에 대해서는 하기의 문헌들에 요약되어 있다: 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140]; [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32]; 및 [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Uilmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587]; [Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons]; [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17].
상기한 방법에 의해 생산되고, 회수 또는 정제된 카다베린을 사용하여 공지된 기법에 의해 폴리아미드를 생산할 수 있는 바, 상기 폴리아미드는 본 발명의 또 다른 실시양태를 나타낸다.
이제, 하기의 비제한적인 실시예를 바탕으로 첨부 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 기술할 것이다.
실시예
균주 및 플라스미드. 디아미노펜탄을 생산하는자인 코리네박테리움 글루타미쿰 DAP-3c는 리신 데카르복실라제의 코돈 최적화된 발현에 의해 C. 글루타미쿰 11424로부터 추리로 유래된 것이다 (문헌 [Kind, S., Jeong, W. K., Schroeder, H. and Wittmann, C. (Kind et al., 2010a) "Systems-wide metabolic pathway engineering in Corynebacterium glutamicum for bio-based production of diaminopentane." Metab Eng.]; 및 [Kind, S., Jeong, W. K., Schroeder, H., Zelder, O. and Wittmann, C. (Kind et al. 2010b). "Identification and elimination of the competing N-acetyldiaminopentane "Systems-wide metabolic pathway engineering in for improved production of diaminopentane by Corynebacterium glutamicum." Appl Environ Microbiol 76(15), 5175-80.). 본 연구에서는 상기 균주 둘 모두를 사용하였다. 균주 구축을 위해, 에스케리키아 콜라이 균주 DH5α 및 NM522 (인비트로겐(Invitrogen: 독일 카를스루에)) 및 플라스미드 pTc 및 pClik int sacB를 앞서 기술된 바와 같이 적용시켰다 (문헌 [Kind et al., 2010a]).
배지. 1차 사전 배양물을 복합 배지 중에서 성장시켰다 (문헌 [Kind et al., 2010a]). 2차 사전 배양 및 후속 본 배양을 위해, 최소 배지를 적용시켰다 (문헌 [Becker, J., Kiopprogge, C. and Wittmann, C. (2008) (Becker et al., 2008), "Metabolic responses to pyruvate kinase deletion in lysine producing Corynebacterium glutamicum." Microb Cell Fact 7, 8.]).
배양. 모든 배양은 회전식 진탕기 (진탕 직경 5 cm, 멀티트론(Multitron) (인포르스 아게(Infors AG: 스위스 보트민겐))) 상에서 30℃에서 230 rpm으로 수행하였다. 1차 사전 배양을 위해, 단일 콜로니를 접종물로서 사용하였다. 약 8 h 동안 인큐베이션시킨 후, 원심분리 (8,800 x g, 2 min, 4℃)에 의해 세포를 수거하고, 5% NaCl 멸균 용액으로 2회에 걸쳐 세척한 후, 2차 사전 배양을 위한 접종물로서 사용하였다 (500 mL 배플형 플라스크 중 50 mL). 상기 기술된 것과 동일한 조건하에 지수 성장기에서 세포를 수거하고, 3중으로 수행되는 본 배양을 위한 접종물로서 사용하였다 (500 mL 배플형 플라스크 중 50 mL). 배양하는 동안 pH는 7.0 ± 0.2로 일정하게 유지되었다.
화학물질. 트립톤, 우육 추출물, 효모 추출물 및 아가는 디프코 라보라토리즈(Difco Laboratories: 미국 디트로이트)로부터 입수하였다. 다른 모든 화학물질은 분석 등급의 것이며, 알드리치(Aldrich: 독일 슈타인하임), 머크(Merck: 독일 다름슈타트) 또는 플루카(Fluka: 스위스 북스)로부터 입수하였다.
C. 글루타미쿰의 유전자 조작. 플라스미드 DNA의 구축, 정제, 및 분석, 및 E. 콜라이 및 C. 글루타미쿰의 형질전환을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Kind et al., 2010a]). 유전자의 표적화된 결실 및 천연 C. 글루타미쿰 프로모터의 교환을 최근 기술된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Bolten, C. J., Schr, H., Dickschat, J. and Wittmann, C. (2010) (Bolten et al., 2010). "Towards methionine overproduction in Corynebacterium glutamicum - methanethiol and dimethyldisulfide as reduced sulfur sources." J Microbiol Biotechnol 20(8), 1196-203.]; [Dickschat, J. S., Wickel, S., Bolten, C. J., Nawrath, T., Schulz, S. and Wittmann, C. (2010) (Dickschat et. 2010). "Pyrazine Biosynthesis in Corynebacterium glutamicum." European Journal of Organic Chemistry 2010(14), 2687-2695. al.]). 간단히 말하면, 코딩 영역을 단축형 유전자 단편으로 치환함으로써 유전자를 결실시켰다. 게놈 기반의 발현 증폭을 위해, 상응하는 것의 천연 프로모터를 sod 유전자 (NCgl2826)의 강력한 프로모터로 치환하였다 (문헌 [Becker, J., Klopprogge, C, Herold, A., Zelder, O., Bolten, C. J. and Wittmann, C. (2007) (Becker et al., 2007). "Metabolic flux engineering of L-lysine production in Corynebacterium glutamicum-over expression and modification of G6P dehydrogenase." J Biotechnol.]). 이러한 목적으로, C. 글루타미쿰에서는 복제가 불가능한 통합 플라스미드 pClik int sacB를 사용하였다 (문헌 [Becker, J., Klopprogge, C, Zelder, O., Heinzle, E. and Wittmann, C. (2005) (Becker et al., 2005). "Amplified Expression of Fructose 1,6-bisphosphatase in Corynebacterium glutamicum increases in vivo flux through the pentose phosphate pathway and lysine production on different carbon sources." Appl Environ Microbiol 71 (12), 8587-8596]). C. 글루타미쿰에서 복제되는 플라스미드 pClik 5a MCS는 tuf 유전자 (NCgl0480)의 프로모터와 조합하여 유전자의 플라스미드 기반 과다발현을 위해 사용하였다 (문헌 [Kind et al., 20 10a]). PCR에 의해 유전자 변형을 입증하였다. 유전자 변이의 구축 및 입증을 위해 사용된 프라이머는 하기 표 2에 열거되어 있다.
Figure pct00001
기질 및 생성물 분석. 글루코스 분석기 (2300 STAT 플러스(2300 STAT Plus) (엘로우 스프링스 인스투루먼트(Yellow Springs Instrument: 미국 오하이오))에 의해 1:10으로 희석된 배양 상청액 중의 글루코스 농도를 정량화하였다. 0.5 mL/min으로 및 40℃에서 정지상으로서 아미넥스(Aminex) HPX-87H 칼럼 (300 x 7.8 mm; 바이오-래드(Bio-Rad: 미국 캘리포니아주 허큘리스))을, 및 이동상으로서 12.5 mM H2SO4를 사용하여 HPLC (라크롬 엘리트(LaChrom Elite) (VWR 히트치(VWR Hitachi: 미국 펜실베니아주 웨스트체스터)))에 의해 1:10으로 희석된 배양 상청액 중에서 트레할로스 및 유기산을 정량화하였다. 각각 220 nm의 UV 광 (유기산) 및 굴절률 (트레할로스)을 사용하여 검출을 수행하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 660 nm에서의 광학 밀도로서, 및 세포 건조 질량으로서 세포의 농도를 측정하였다 (문헌 [Kiefer, P., Heinzle, E., Zelder, O. and Wittmann, C. (2004) (Kiefer et al., 2004). "Comparative metabolic flux analysis of iysine-producing Corynebacterium glutamicum cultured on glucose or fructose." Appl Environ Microbiol 70(1), 229-39.]). HPLC에 의해, (1:10으로 희석된) 배양 상청액 중, 및 세포 추출물 중의 아미노산 정량화를 수행하였다 (문헌 [Kroemer, J. O., Fritz, M., Heinzle, E. and Wittmann, C. (2005). (Kroemer et al., 2005) "In vivo quantification of intracellular amino acids and intermediates of the methionine pathway in Corynebacterium glutamicum."]). 동일한 방법을 변형된 용리 구배에 의해 1,5-디아미노펜탄 및 N-아세틸-1,5-디아미노펜탄을 포함하는, 생물학적 폴리아민의 정량화에 맞게 적합화시켰다 (문헌 [Kind et al., 2010a]).
세포내 대사산물 분석. 고속 여과 및 비등수 중 추출을 통해 세포내 대사산물 샘플링을 수행하였다 (문헌 [Wittmann, C, Kroemer, J. O., Kiefer, P., Binz, T. and Heinzle, E. (2004) (Wittmann et al., 2004). "Impact of the cold shock phenomenon on quantification of intracellular metabolites in bacteria." Anal Biochem 327(1), 135-9.]; [Bolten et al., 2007]). 이는 대사산물의 누출을 막기 위해 배양 배지의 이동 강도를 매칭시키면서, 필터 상에서 세포를 15 ml 5% NaCl 용액으로 세척하는 단계를 포함하였다 (문헌 [Bolten et al., 2007]).
RNA 추출 및 유전자 발현 분석. 앞서 기술된 바와 같이, 지수적으로 성장하는 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다 (문헌 [Kind et al., 2010b]). 유전자 발현에 대한 비교 분석을 위해, 온라인 소프트웨어 애질런트 e어레이(Agilent eArray)를 사용하여 C. 글루타미쿰 게놈 NC_006958로부터 주문 제작형 DNA 마이크로어레이를 디자인하였다. 관심의 대상이 되는 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 디자인, 형광 표지화, 하이브리드화, 스캐닝 및 데이터 프로세싱을 문헌 [Kind et al. (2010b)]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 본 실험에서 사용된 주문 제작형 DNA 마이크로어레이는 14,363개의 프로브를 포함하였으며, 3,057개의 오픈 리딩 프레임 각각에 대해 최대 5개씩의 복제물이 있었다.
리신 데카르복실라제 활성. 리신 데카르복실라제의 활성은 조 세포 추출물에서 측정하였다. 세포 추출물 제조, 단백질 농도 측정, 및 리신 데카르복실라제 활성 측정은 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Kind et al., 2010a]). 효소 동역학적 성질에 관한 실험을 위해, 디아미노펜탄을 반응 혼합물에 각각 10, 15, 20, 30 및 35 mmol/L의 최종 농도로 첨가하였다.
C. 글루타미쿰에서 발현된 리신 데카르복실라제의 동역학적 특성. 1차로 중요한 연구를 통해 생산에 대한 잠재적인 장애물로서의 생성물 외수송의 일반적인 관련성을 해명하였다. 상기 연구는 리신 데카르복실라제의 동역학적 특성, 특히 그의 최종 생성물인 디아미노펜탄에 의한 억제 측면에 중점을 두었다. 이러한 목적으로, C. 글루타미쿰 DAP 3-c가 지수 성장하는 동안 조 세포 추출물을 수득하고, 이러한 디아미노펜탄을 생산하는자에서 발현된 리신 데카르복실라제 활성에 대하여 검정하였다. 리신 데카르복실라제의 시험관내 비활성은 97.0 ± 3.5 mmol/g/h였다. 이는 배양 배지 중 디아미노펜탄 및 N-아세틸 디아미노펜탄의 축적으로부터 측정된 비(specific) 생체내 생성물 플럭스 1.07 ± 0.02 mmol/g/h보다 거의 100배 더 높은 값이다. 리신 데카르복실라제의 이용가능한 촉매력 중 단지 작은 일부분만이 생성물 형성에 동원되었다는 점이 명백해졌다.
효소의 최종 생성물 억제에 어느 정도로 관여하는지를 분석하기 위하여, 디아미노펜탄을 다양한 농도로 하여 리신 데카르복실라제의 비활성을 추가로 측정하였다. 리신 데카르복실라제 비활성은 디아미노펜탄의 농도가 증가함에 따라 강력하게 감소하는 것으로 뚜렷이 나타났다 (도 1). 이어서, 생산 균주에서 상응하는 세포내 디아미노펜탄 수준을 정량화함으로써 상기 억제에 관한 관련성을 평가하였다. 적절한 고속 여과 접근법을 사용하여 주변 배지를 완전하게 제거하였을 때, 3개의 생물학적 복제물로부터 측정된 디아미노펜탄의 세포내 풀 크기는 20.3 ± 1.6 mM이었다. 상기 조건하에서, 시험관내 LdcC 활성은 약 40%만큼 감소하였다 (도 1). 이는 생합성 경로의 최종 단계는 상승된 세포내 생성물 수준에 의해서 생체내에서 유의적으로 감소된다는 것을 제안하는 것이었고, 이를 통해 가치가 큰 대사산물 조작 표적으로서의 생성물 외수송의 관련성이 밝혀졌다. 아직까지 알려지지 않은 하나 또는 수개의 외수송 단백질을 포함하는 능동 수송 과정은 가능하게는, 세포질의 중성 pH, 즉, 그의 높은 양전하에서의 디아미노펜탄의 화학적 특성에 기인하는 것으로 보였다.
디아미노펜탄 외수송에 대한 유력한 후보물질의 확인. 잠재적으로 코딩하는 유전자를 확인하기 위해, 게놈-와이드 전사 프로파일링을 수행하였다. 이러한 목적으로, 디아미노펜탄을 생산하는 균주 C. 글루타미쿰 DAP-3c와, 리신은 생산하지만, 디아미노펜탄은 생산하지 못하는 그의 모체 균주 C. 글루타미쿰 11424 사이의 전반적인 유전자 발현 패턴을 비교하였다. 본 분석을 위해, RNA를 세포로부터 추출하고, 지수 성장기 동안 즉, 광학 밀도가 3일때 수거하였다. 각각, 참고 RNA는 4개의 생물학적 복제물로부터 입수하였고, DAP-3c RNA는 7개의 생물학적 복제물로부터 입수하였다. 표지화, 및 게놈-와이드 마이크로어레이에의 경쟁적 하이브리드화에 앞서 참조 RNA를 풀링하였다.
분석되고, 통계학적으로 처리된 3,000개의 유전자 중, 약 35개의 유전자가 디아미노펜탄 생산자에서 통계학상 유의적인 상향 조절을 보였다 (표 2). 이는 상이한 기능 카테고리에 속하였고, 가장 흥미롭게도, 상이한 수송체를 포함하였다. 상향 조절된 수송체 중 4개는 철 및 당 수송에 기인한다고 볼 수 있었고, 따라서, 관심의 대상이 되는 기능과는 관련이 없었다.
그러나, 5개의 오페론에 속하는 7개의 유전자는 아직까지 특징 규명이 되지 않는 수송 시스템을 나타내었다. 이는 디아미노펜탄 외수송에 대해 유력한 후보물질임을 보였다. 관련된 수송체는 ABC 수송체 (cg2181 및 cg2184) 및 퍼미아제 (cg2893) 및 그의 조절 인자 (cg2894)를 포함하였다. 또한, LysE형 전이체 (cg2941)의 조절 인자인 수송 조절 인자 AsnC 패밀리 조절 단백질 (cg2942)을 상향 조절하였다. 모든 후보 물질 중에서 최고 발현 증가는 퍼미아제에 대해 발견되었다 (하기 표 3). 상기 유전자는 촉진 인자의 슈퍼패밀리에 속하는 바, 이를 디아미노펜탄의 외수송에 대해 시험하고자 하는 제1 후보 물질로서 선택하였다. 리신 외수송체 lysE의 발현이 약 3.8배 감소하였다는 것을 언급하여야 한다. 상기 언급한 유전자 이외에도, 5개의 유전자가 단백질을 코딩하였는데, 이제까지 그 기능에 대해서는 알려진 바 없다.
Figure pct00002
추정 디아미노펜탄 외수송체 cg2893 의 표적화된 결실. 먼저 유력한 후보물질로서 주요 촉진 인자 슈퍼패밀리 퍼미아제를 코딩하는 유전자인 cg2893을 결실시켰다. 이러한 목적으로, 659 bp의 코딩 영역이 결실되어 있는, 표적 유전자의 단축형 단편으로의 마커 무함유 치환을 허용하는 재조합 플라스미드를 구축하였다. 2차 재조합으로부터 얻은 클론을 프라이머 cg2893 -1 및 cg2893 -4 (표 1)를 사용하여 부위 특이적 PCR에 의해 원하는 결실에 대하여 입증하였다. 야생형의 결과인 단편 길이가 1,329 bp인 것과는 뚜렷이 다른 670 bp의 단축형 PCR 생성물에 의해 양성 클론을 확인하였다. 퍼미아제가 결실되어 있는 결실 돌연변이체를 모체 균주와 비교하였다. 본 연구는 최소 배지 중 글루코스 상에서 배양한 후, 브로쓰 중에서 생성물의 스펙트럼을 분석하는 것을 포함하였다. 퍼미아제가 결실되어 있는 균주에서는 디아미노펜탄 분비가 유의적으로 감소되어 있는 것으로 나타났다 (도 2, 표 4). 200 mmol (mol-1 글루코스)로부터 32 mmol (mol-1 글루코스)로의 디아미노펜탄의 수율 감소는 84% 감소에 상응하였다. C. 글루타미쿰에서 퍼미아제 cg2893이 디아미노펜탄에 대한 주요 외수송체인 것으로 분명하게 드러났다. 그의 기능상 역할을 근거로 하여, 디아미노펜탄 외수송체 dapE로 주석을 달았다. 흥미롭게도, dapE 결실이 N-아세틸-디아미노펜탄의 외수송에 미치는 효과에는 상당한 차이가 있었다. 지정된 C. 글루타미쿰·dapE에서, 생성물의 아세틸화된 변이체는 여전히 유의적으로 외수송되었다 (도 2, 표 3). 이는 확인된 외수송 단백질이 N-아세틸 디아미노펜탄보다는 디아미노펜탄에 대해 훨씬 특이적이라는 것을 분명히 보여주는 것이다. 모체 균주에서와 같이, 리신 분비는 무시해도 될 정도로 아주 작았다. 디아미노펜탄 외수송이 퍼미아제 결실로 인해 완전하게 불가능해진 것은 아니라는 점에 주의하여야 한다. 이는 상기 효소가 주요 외수송 시스템이지, 독점적인 외수송 시스템은 아니라는 것을 시사하는 것이다.
Figure pct00003
디아미노펜탄 외수송에 대한 리신 외수송체 LysE 의 기능상의 역할. 주요 디아미노펜탄 외수송체가 결실되어 있는 C. 글루타미쿰 Δ dapE는 여전히 디아미노펜탄을 배지로 분비하는 것으로 나타났다. 이는 또 다른 디아미노펜탄 외수송 단백질이 존재한다는 것을 시사하는 것이다. 디아미노펜탄과 그의 전구체 리신은 구조상 유사하기 때문에, 리신 외수송체 LysE를 가능한 후보물질로서 추가로 조사하였다. C. 글루타미쿰 Δ dapE에서 코딩 유전자 lysE를 결실시켰다. 그러나, 최소 배지 중에서의 이중 결실 돌연변이체 C. 글루타미쿰 Δ dapE Δ lysE의 성장 및 생산 특징은 그의 모체 균주와 비교하였을 때 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다 (표 4). 이는 LysE가 디아미노펜탄의 외수송에 관여하지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
dapE 의 증폭에 의한 디아미노펜탄 생산의 대사 조작. 디아미노펜탄 생산을 증가시키는 유망한 대사 조작 표적으로서 신규한 외수송체 dapE가 부상하였다. 이를, 생산을 가장 잘하는 균주 C. 글루타미쿰 DAP-3c에서 증폭시켰다. 게놈-기반 과다발현에 의해 달성하였다. 이러한 목적으로, 천연 dapE 프로모터를 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (sod)의 강력한 프로모터로 치환시켰다. 프라이머 P sod 2893-1 내지 P sod 2893-6 (표 3)을 사용하여 dapE의 출발 코돈 바로 앞으로의 sod 프로모터의 마커 무함유 통합을 허용하는 플라스미드를 구축하였다. 야생형과 비교하여 200 bp 연장된 PCR 단편에 기초하여, 유전자의 상류 서열과 출발 코돈 사이에 sod 프로모터를 보유하는 양성 클론을 입증하였다. 수득된 돌연변이체를 C. 글루타미쿰 P sod dapE로 지정하였다.
도 2는 조작된 외수송의 영향을 보여주는 것이다. 전반적으로, dapE를 증폭시킨 결과, 생성물 분비는 유의적으로 증강되었다. DAP-3c와 비교하였을 때, P sod dapE에서 디아미노펜탄 수율은 240 mmol (mol 글루코스)-1로 20% 증가하였다. 비생산 속도 (qDAP)도 1.1 mmol/g/h로 40% 만큼 증강되었다. 유익한 부수적인 효과로서, N-아세틸-디아미노펜탄 형성은 75% 초과만큼 감소하였는데, 이는 생성물의 바람직하지 못한 아세틸화가 최적화된 외수송을 통해 감소된다는 것을 시사하는 것이다. 추가로, 외수송체 돌연변이체는 더 높은 비성장 속도 (0.25 h-1인 것과 비교하여 0.30), 및 높은 비글루코스 흡수 속도 (4.2 mmol/g/h인 것과 비교하여 4.5)로 반영되는 바, 생존력이 더 높은 것으로 나타났다 (도 2, 표 4). 바이오매스 수율은 두 균주 모두에서 매우 유사하였다. 이는 또한 다른 부산물에 대해서도 유지되었다. 트레할로스, 락테이트, 글리신, 알라닌, 글루타메이트, 및 α-케토글루타레이트는 모두 상당히 낮은 양으로 존재하였지만, 별 영향은 없었다. 전반적으로, dapE 발현이 증가된 조작된 돌연변이체는 중요한 생산 특성이 현저하게 향상된 것으로 나타났다. tuf 프로모터의 제어하에서의 dapE의 플라스미드 기반 과다발현을 추가로 시험한 결과, 세포 성장이 유의적으로 지연되었고 (μ= 0.18 h-1), 디아미노펜탄 수율은 약간 감소하였다 (YDap /s = 192 mmol (mol 글루코스)-1)는 것은 언급되어야 한다.
dapE의 유전자 서열 및 폴리펩티드 서열은 하기에 개시되어 있다:
dapE 유전자 서열:
Figure pct00004
dapE 단백질 서열:
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> BASF Plant Science Company GmbH <120> Processes and Recombinant Microorganisms for the Production of Cadaverine <130> PF 0000071390 <150> US 61/445098 <151> 22 February 2011 <150> EP 11155432.5 <151> 22 February 2011 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 494 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Thr Ser Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Pro Thr Lys Thr Gln Arg 1 5 10 15 Trp Ala Phe Leu Ala Val Ile Ser Gly Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val 20 25 30 Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg Glu Gln Leu 35 40 45 Ala Ala Thr Glu Thr Gln Ala Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu 50 55 60 Leu Met Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile 65 70 75 80 Gly His Arg Arg Met Phe Leu Met Gly Leu Ser Ile Phe Gly Ile Ala 85 90 95 Ser Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Thr Ala Trp Ala Leu Val Ala Ala 100 105 110 Arg Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu 115 120 125 Ala Leu Ile Arg Ile Thr Phe Glu Asp Glu Arg Glu Arg Asn Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro 145 150 155 160 Ile Ile Gly Gly Ala Leu Leu Glu Phe Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe 165 170 175 Leu Ile Asn Val Pro Val Ala Val Ile Ala Leu Ile Ala Thr Leu Phe 180 185 190 Val Ala Pro Ala Asn Ile Ala Asn Pro Ser Lys His Trp Asp Phe Leu 195 200 205 Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ile Ile Thr Ile 210 215 220 Lys Glu Ser Val Asn Thr Ala Arg His Met Pro Leu Leu Leu Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Leu Ile Ile Gly Ala Val Leu Phe Ser Ser Arg Gln Lys 245 250 255 Lys Ile Glu Glu Pro Leu Leu Asp Leu Ser Leu Phe Arg Asn Arg Leu 260 265 270 Phe Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Gly Met Ala Met Phe Thr Val Ser 275 280 285 Gly Leu Glu Met Thr Thr Ser Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe 290 295 300 Thr Pro Leu Glu Ala Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser 305 310 315 320 Phe Pro Met Ser Ile Ile Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp Gly Phe 325 330 335 Lys Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ala Ala Thr Ala Val Gly Ile Ala 340 345 350 Leu Cys Ile Trp Gly Ala Thr His Thr Asp Gly Leu Pro Phe Phe Ile 355 360 365 Ala Gly Leu Phe Phe Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Met Ser Val 370 375 380 Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Val Arg Lys Ala Gly Met 385 390 395 400 Ala Ser Ser Ile Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser 405 410 415 Val Ala Ile Leu Gly Ser Leu Phe Pro Phe Phe Tyr Ser Leu His Ala 420 425 430 Pro Ala Glu Val Ala Asp Asn Phe Ser Ala Gly Val His His Ala Ile 435 440 445 Asp Gly Asp Ala Ala Arg Ala Ser Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Asn Val 450 455 460 Leu Ile Ile Ala Leu Val Cys Ala Val Ala Ala Ala Leu Ile Ser Ser 465 470 475 480 Tyr Leu Phe Arg Gly Asn Pro Lys Gly Ala Asn Asn Ala His 485 490 <210> 2 <211> 1485 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 atgacttcag aaaccttaca ggcgcaagcg cctacgaaaa cccaacgttg ggctttcctc 60 gccgttatca gcggtggtct ctttctgatc ggtgtagaca actcgattct ctacaccgca 120 ctccctctgc tgcgtgaaca gctcgcagcc accgaaaccc aagcgttgtg gatcatcaac 180 gcatatcccc tgctcatggc gggccttctt ttgggtaccg gcactttggg tgacaaaatc 240 ggccaccgcc ggatgttcct catgggcttg agcattttcg gaatcgcttc acttggtgct 300 gcgtttgctc caactgcgtg ggctcttgtt gctgcgagag ctttccttgg catcggtgcg 360 gcaacgatga tgcctgcaac cttggctctg atccgcatta cgtttgagga tgagcgtgag 420 cgcaacactg caattggtat ttggggttcc gtggcaattc ttggcgctgc ggcaggcccg 480 atcattggtg gtgcgctgtt ggaattcttc tggtggggtt cggttttcct cattaacgtt 540 ccggtggctg ttatcgcgtt gatcgctacg ctttttgtgg cgccggccaa tatcgcgaat 600 ccgtctaagc attgggattt cttgtcgtcg ttctatgcgc tgctcacact tgctgggttg 660 atcatcacga tcaaggaatc tgtgaatact gcacgccata tgcctcttct tttgggtgca 720 gtcatcatgt tgatcattgg tgcggtgttg tttagcagtc gtcagaagaa gatcgaggag 780 ccacttctag atctgtcgtt gttccgtaat cgccttttct taggcggtgt ggttgctgcg 840 ggcatggcga tgtttactgt gtccggtttg gaaatgacta cctcgcagcg tttccagttg 900 tctgtgggtt tcactccact tgaggctggt ttgctcatga tcccagctgc attgggtagc 960 ttcccgatgt ctattatcgg tggtgcaaac ctgcatcgtt ggggcttcaa accgctgatc 1020 agtggtggtt ttgctgccac tgccgttggc atcgccctgt gtatttgggg cgcgactcat 1080 actgatggtt tgccgttttt catcgcgggt ctattcttca tgggcgcggg tgctggttcg 1140 gtaatgtctg tgtcttccac tgcgattatc ggttccgcgc cggtgcgtaa ggctggcatg 1200 gcgtcgtcga tcgaagaggt ctcttatgag ttcggcacgc tgttgtctgt cgcgattttg 1260 ggtagcttgt tcccattctt ctactcgctg catgccccgg cagaggttgc ggataacttc 1320 tcggcgggtg ttcaccacgc gattgatggc gatgcggcgc gtgcatcttt ggacaccgca 1380 tacattaacg tgttgatcat tgccctagta tgcgcagtag cggctgctct gatcagcagt 1440 taccttttcc gcggaaatcc gaagggagcc aataatgcgc actag 1485 <210> 3 <211> 713 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln 20 25 30 Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His 35 40 45 Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu 50 55 60 Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met 85 90 95 Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile 115 120 125 Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu 165 170 175 Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe 195 200 205 Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp 245 250 255 Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys 275 280 285 Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile 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95 Ala Phe Ala Pro Asn Pro Glu Ile Leu Ile Ala Ala Arg Ala Leu Phe 100 105 110 Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu Ser Leu Leu Arg 115 120 125 Thr Thr Phe Thr Asp Val Gln Glu Arg Asn Thr Ala Ile Gly Ile Trp 130 135 140 Gly Ala Thr Ala Thr Leu Gly Ala Ala Ser Gly Pro Val Ile Gly Gly 145 150 155 160 Leu Leu Leu Glu His Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe Leu Ile Asn Leu 165 170 175 Pro Val Val Ile Ile Ala Val Ile Gly Thr Thr Thr Ile Ala Pro Pro 180 185 190 Asn Ala Pro Asn Pro Lys Arg Gln Trp Asp Phe Leu Ser Ser Phe Trp 195 200 205 Ala Met Ala Ala Met Met Gly Leu Val Met Ile Ile Lys Glu Ala Thr 210 215 220 His Ser Pro Ile Asp Leu Gly Ile Ile Gly Gly Ala Thr Ala Ala Leu 225 230 235 240 Ile Gly Gly Gly Trp Leu Phe Ala Arg Arg Gln Arg Phe Leu Thr Glu 245 250 255 Pro Leu Leu Val Leu Thr Val Phe Gln Asn Lys Val Phe Thr Ala Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Gly Phe Ala Met Phe Ala Leu Ser Gly Thr Glu Leu 275 280 285 Leu Thr Thr Gln Arg Phe Gln Leu Gly Glu Gly Phe Thr Pro Leu Ala 290 295 300 Ala Gly Leu Val Thr Ala Ala Gly Ala Ile Ala Ala Ile Pro Thr Ser 305 310 315 320 Val Leu Gly Gly Ile Met Leu Ser Arg Ile Gly Phe Arg Pro Leu Ile 325 330 335 Ser Gly Gly Phe Ala Ile Ile Ala Ala Gly Ala Ala Leu Cys Met Trp 340 345 350 Ala Ile Gly Thr Asp Ser Leu Gly Leu Phe Ile Gly Ser Leu Ile Ala 355 360 365 Ala Gly Ala Gly Ala Gly Leu Val Met Ser Val Ser Ser Thr Ala Ile 370 375 380 Ile Gly Ser Ala His Pro Arg Tyr Ser Gly Met Ala Ser Ala Met Glu 385 390 395 400 Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser Val Ala Val Leu Gly 405 410 415 Ser Leu Met Gln Leu Phe Tyr Ser Trp Phe Ala Pro Ala Gln Val Ala 420 425 430 Asp Ser Phe Glu Ser Gly Leu Ala Asn Pro Gln Leu Phe Asp Ala Ala 435 440 445 Tyr Ala Ala Phe Asn Ser Gly Phe Thr Leu Val Met Leu Val Val Ala 450 455 460 Ala Val Ser Ala Thr Val Ala Gly Ile Thr Ala Trp Leu Leu His Asn 465 470 475 480 Asn Pro Lys Glu Thr Asp Tyr Ala His Glu 485 490 <210> 28 <211> 498 <212> PRT <213> Corynebacterium amycolatum <400> 28 Met Ser Ser Thr Asp His Ala Ala Ser Thr Arg Ala Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr His Arg Trp Val Phe Leu Ala Ile Ile Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Leu Leu Ile Gly Ile Asp Asn Ser Val Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Val 35 40 45 Leu Arg Glu Gln Leu His Thr Thr Glu Leu Glu Gly Leu Trp Ile Ile 50 55 60 Asn Ala Tyr Pro Leu Val Ile Ser Ala Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr 65 70 75 80 Leu Gly Asp Arg Ile Gly His Arg Lys Met Phe Leu Val Gly Leu Thr 85 90 95 Ile Phe Gly Phe Ser Ser Leu Ala Ala Ala Phe Ala Pro His Ala Trp 100 105 110 Ala Leu Val Ile Ala Arg Gly Cys Leu Gly Leu Gly Ala Ala Thr Met 115 120 125 Met Pro Ala Thr Leu Ala Leu Leu Arg Glu Thr Phe His His Pro Arg 130 135 140 Glu Leu Ala Thr Ala Ile Gly Ile Trp Ser Ala Thr Ala Thr Leu Gly 145 150 155 160 Ala Ala Ala Gly Pro Val Val Gly Gly Phe Leu Leu Glu His Phe Trp 165 170 175 Trp Gly Ser Ile Phe Leu Ile Asn Ile Pro Val Ala Val Phe Ala Ile 180 185 190 Ile Gly Thr Leu Ile Phe Ala Pro Pro Asn Gln Pro Asn Ala Ala Lys 195 200 205 Arg Trp Asp Phe Leu Thr Ser Leu Tyr Ala Met Leu Ala Met Leu Gly 210 215 220 Leu Val Ser Leu Ile Lys Glu Leu Ala Gly His Arg Ser Ser Thr Val 225 230 235 240 Ile Val Ala Ala Ile Ala Cys Gly Leu Val Gly Ala Val Leu Phe Gln 245 250 255 Arg Arg Gln Ala Arg Leu Thr Glu Pro Leu Ile Asp Phe Ser Val Phe 260 265 270 Arg Ser Pro Met Phe Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Ala Leu Ala Met 275 280 285 Phe Val Leu Ala Gly Ala Glu Leu Met Thr Thr Gln Arg Phe Gln Ile 290 295 300 Ser Val Gly Tyr Ala Pro Leu Asp Ala Gly Leu Leu Val Ala Thr Ala 305 310 315 320 Ala Leu Ala Ser Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Gly Met Val Leu His 325 330 335 Arg Val Gly Phe Arg Thr Leu Ile Thr Gly Gly Phe Leu Leu Asn Ala 340 345 350 Val Gly Leu Ala Gly Met Tyr Tyr Gly Val Ser Ser Gly Asn Phe Pro 355 360 365 Leu Met Ile Ala Gly Leu Ile Leu Leu Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val 370 375 380 Met Ser Val Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Arg Ser Lys 385 390 395 400 Ala Gly Met Ala Ala Ala Met Glu Ser Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr 405 410 415 Leu Ile Thr Val Ala Ile Thr Gly Ser Leu Leu Pro Met Phe Tyr Ala 420 425 430 Leu Phe Thr Pro Val Asp Ala Thr Ile Ser Leu Thr Asp Ala Leu His 435 440 445 Thr Pro Ala Leu Asn Asp Gly Ala Arg Ala Gly Leu Asp Ser Ser Tyr 450 455 460 Leu Ala Ile Leu Ile Ile Leu Ala Ile Val Ala Val Ile Ala Ala Ile 465 470 475 480 Ala Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Asn Pro Lys Glu Thr Glu Tyr Ala 485 490 495 His Glu <210> 29 <211> 506 <212> PRT <213> Arcanobacterium haemolyticum DSM 20595 <400> 29 Met Pro Asp Val Ser Ser Ser Pro Val Ser Gly Val Val Pro Ala Pro 1 5 10 15 His Pro Ala Pro Ser Ser Ala Met Ser Ala Arg Arg Lys Trp Leu Phe 20 25 30 Leu Gly Val Leu Ser Ser Gly Leu Phe Leu Val Gly Val Asp Asn Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Glu Leu Arg Arg Val Leu His Thr Thr 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu Val Leu Ala 65 70 75 80 Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile Gly His Arg 85 90 95 Arg Met Trp Met Ile Gly Leu Val Val Phe Met Phe Ala Ser Leu Gly 100 105 110 Ala Ala Phe Ala Pro Gly Pro Trp Trp Leu Ile Ala Ala Arg Ala Phe 115 120 125 Leu Gly Phe Gly Ala Ala Thr Leu Met Pro Ala Thr Leu Ala Leu Ile 130 135 140 Arg Thr Thr Phe Arg Asp Pro Arg Gln Leu Ala Thr Ala Ile Gly Ile 145 150 155 160 Trp Ala Ala Thr Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro Val Ile Gly 165 170 175 Gly Phe Leu Leu Glu His Phe Trp Trp Gly Ser Ile Phe Leu Ile Asn 180 185 190 Ile Pro Ile Ala Val Gly Ala Phe Val Ala Thr Leu Met Ile Ala Pro 195 200 205 Pro Asn Glu Ala Asn Pro Ala Lys His Trp Asp Val Val Ser Ser Val 210 215 220 Tyr Ala Met Leu Ala Met Leu Gly Met Val Met Phe Ile Lys Glu Ile 225 230 235 240 Ser Ser Tyr Gln Asn Leu Trp Val Val Cys Gly Ser Leu Ala Ala Ala 245 250 255 Val Cys Gly Gly Val Ala Phe Lys Leu Arg Gln Asp Lys Leu Arg Glu 260 265 270 Pro Leu Leu Glu Phe Asp Ile Phe Arg Ser Trp Met Phe Thr Ala Gly 275 280 285 Val Ile Ala Ala Gly Met Thr Leu Phe Ile Ile Gly Gly Ala Glu Leu 290 295 300 Met Thr Thr Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe Thr Pro Leu Gln 305 310 315 320 Ala Gly Met Leu Val Ala Val Ala Ala Ile Ser Ser Phe Phe Met Ser 325 330 335 Ala Ile Gly Gly Ala Ile Val His Ile Val Gly Phe Arg Thr Leu Ile 340 345 350 Ser Gly Gly Leu Ile Thr Ser Thr Val Gly Leu Ser Ala Met Tyr Val 355 360 365 Gly Val Ala Asn His Ala Leu Trp Val Thr Ile Thr Gly Leu Ala Phe 370 375 380 Thr Gly Ala Gly Val Gly Leu Val Met Ser Val Ser Ser Thr Ala Ile 385 390 395 400 Ile Gly Ser Ala Pro Arg Ser Arg Ala Gly Met Ala Ala Ala Val Glu 405 410 415 Glu Val Ser Tyr Glu Leu Gly Thr Val Ile Ser Val Ala Ile Val Gly 420 425 430 Ser Leu Leu Pro Phe Phe Tyr Arg Leu Asn Val Pro Ser Glu Ile Gly 435 440 445 Gly Ser Ile His Asp Ala Leu Ala His Pro Thr Leu Ser Asn Val Ala 450 455 460 Lys Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Tyr Leu Asp Met Ile Leu Leu Met Ile 465 470 475 480 Ala Val Thr Ile Phe Ala Thr Ala Val Thr Ala Tyr Ala Leu Arg Gly 485 490 495 Asn Pro Lys Glu Thr Ala Tyr Ala His Glu 500 505 <210> 30 <211> 499 <212> PRT <213> Corynebacterium aurimucosum ATCC 700975 <400> 30 Met Thr Asp Val His Thr Lys Ala Ser Ala Glu Ala Leu Ser Thr Ser 1 5 10 15 Ala Ala Arg Arg Trp Thr Phe Phe Gly Val Val Ser Leu Gly Leu Leu 20 25 30 Met Ile Gly Leu Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Glu Leu 35 40 45 Ser Glu Gln Leu His Ala Ser Ser Leu Gln Gln Leu Trp Ile Ile Asn 50 55 60 Ala Tyr Ala Leu Met Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu 65 70 75 80 Gly Asp Lys Ile Gly His Arg Arg Met Phe Val Ile Gly Leu Trp Val 85 90 95 Phe Gly Ile Ala Ser Leu Ala Ala Ala Leu Ala Pro Gly Ala Trp Glu 100 105 110 Leu Val Ala Ala Arg Ala Phe Leu Gly Leu Gly Ala Ser Ile Met Met 115 120 125 Pro Ala Thr Leu Ala Leu Ile Arg Leu Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu 130 135 140 Arg Asn Thr Ala Ile Gly Ile Trp Gly Ser Ile Ala Val Val Gly Ala 145 150 155 160 Ala Ala Gly Pro Thr Val Gly Gly Phe Leu Leu Glu His Phe Trp Trp 165 170 175 Gly Ser Val Phe Leu Val Asn Val Pro Ile Val Ile Ile Ala Leu Ile 180 185 190 Leu Thr Ala Phe Leu Ala Pro Pro Asn Val Ala Asn Pro Ala Lys His 195 200 205 Trp Asp Phe Leu Ser Ser Leu Tyr Ala Leu Ile Thr Leu Ala Ser Leu 210 215 220 Val Leu Val Ile Lys Ser Val Ala Ser Ser His Leu Asn Ala Met Leu 225 230 235 240 Ile Gly Gly Ala Leu Ala Ala Cys Leu Ile Gly Ala Val Leu Phe Thr 245 250 255 Arg Arg Gln His Lys Leu Glu Glu Pro Leu Leu Thr Phe Asp Ile Phe 260 265 270 Arg Ser Pro Ile Phe Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Ala Gly Ala Met 275 280 285 Phe Gly Met Ala Gly Leu Glu Met Thr Thr Thr Gln Lys Leu Gln Leu 290 295 300 Val Asp Leu Tyr Ser Pro Leu His Ala Gly Leu Ile Ile Ser Leu Ile 305 310 315 320 Ala Ile Ala Ala Leu Pro Met Ser Ala Leu Gly Gly Ala Asn Leu His 325 330 335 Arg Trp Gly Phe Leu Pro Ile Ile Ala Gly Gly Phe Leu Ala Met Ala 340 345 350 Ala Gly Ile Gly Cys Val Val Trp Gly Gly Thr His Glu Val Phe Pro 355 360 365 Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Phe Ile Thr Gly Leu Gly Ala Gly Phe Val 370 375 380 Met Ser Val Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ala Ala Pro Ala Ser Arg 385 390 395 400 Ser Gly Met Ala Ala Gly Val Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Val Leu Pro Met Leu Tyr Lys 420 425 430 Ala Gly Leu Pro Glu Asp Ile Arg Asp Leu Gly Met Asp Ala Leu His 435 440 445 Asp Pro Ala Leu Ala Glu Ala Ala Gly Pro Ala Tyr Ala Asp Ala Tyr 450 455 460 Leu Ala Thr Ala Ala Gly Leu Gly Val Val Met Leu Ile Phe Ala Ala 465 470 475 480 Val Thr Gly Trp Cys Phe Arg Ser Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ala Asp 485 490 495 Ala Thr His <210> 31 <211> 495 <212> PRT <213> from Corynebacterium striatum ATCC 6940 <400> 31 Met Phe Thr Leu Asp Ser Glu His Asn His Ala Ala Thr Gln Ser Thr 1 5 10 15 Lys Ala Gln Arg Trp Thr Phe Phe Ala Val Val Ser Leu Gly Leu Leu 20 25 30 Met Ile Gly Leu Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Ala Leu 35 40 45 Ala Glu Gln Leu His Thr Thr Ser Thr Gln Gln Leu Trp Ile Ile Asn 50 55 60 Ala Tyr Ala Leu Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu 65 70 75 80 Gly Asp Arg Ile Gly His Arg Arg Met Phe Val Ile Gly Leu Phe Leu 85 90 95 Phe Gly Gly Ala Ser Leu Ala Ala Ala Leu Ala Pro Ser Ala Trp Phe 100 105 110 Leu Val Gly Ala Arg Ala Leu Leu Gly Leu Gly Ala Ala Val Met Met 115 120 125 Pro Ala Thr Leu Ala Leu Ile Arg Leu Thr Phe Asp Asp Glu Ile Glu 130 135 140 Arg Asn Thr Ala Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Val Val Gly Ala 145 150 155 160 Ala Val Gly Pro Thr Val Gly Gly Phe Leu Leu Glu His Phe Trp Trp 165 170 175 Gly Ser Val Phe Leu Ile Asn Val Pro Ile Val Leu Ile Ala Leu Thr 180 185 190 Leu Thr Tyr Phe Leu Ala Pro Pro Asn Gln Pro Asn Pro Glu Lys His 195 200 205 Trp Asp Phe Ile Ser Ser Leu Phe Ala Leu Val Thr Leu Ser Ser Leu 210 215 220 Val Leu Ser Ile Lys Ser Phe Ala Gly Ser Gln Phe Ser Leu Ala Gly 225 230 235 240 Gly Ala Leu Leu Val Phe Leu Val Gly Ala Phe Leu Phe Ala Arg Arg 245 250 255 Gln Asn Gln Leu Thr Asp Pro Leu Leu Thr Phe Asp Ile Phe Arg Ser 260 265 270 Pro Val Phe Ser Gly Gly Val Ile Thr Ala Gly Gly Ala Met Phe Gly 275 280 285 Met Ser Gly Leu Glu Met Leu Thr Thr Gln Lys Leu Gln Leu Val Asp 290 295 300 Gly Phe Ser Pro Leu His Ala Gly Leu Thr Ile Ser Ala Val Ala Ile 305 310 315 320 Ala Ala Leu Pro Met Ser Thr Leu Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp 325 330 335 Gly Phe Leu Pro Ile Ile Ala Gly Gly Phe Leu Phe Met Ala Ala Gly 340 345 350 Ile Gly Ile Ala Met Trp Ala Gly His His Gly Ile Phe Trp Leu Phe 355 360 365 Val Ala Gly Met Leu Thr Met Gly Ile Gly Ala Gly Leu Thr Met Ser 370 375 380 Val Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ala Ala Pro Ala His Arg Ser Gly 385 390 395 400 Met Ala Ala Gly Val Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu 405 410 415 Ser Ile Ala Ile Thr Gly Ser Ile Leu Pro Leu Leu Tyr Ala Arg Asn 420 425 430 Leu Pro Glu Gly Ile Ser Gly Met Gln Ala Leu Tyr Asp Ala Ala Thr 435 440 445 His Asp Thr Ala Ala Ser Ala Tyr Asn Glu Ala Tyr Leu Thr Thr Leu 450 455 460 Gly Gly Leu Met Ala Phe Met Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly Trp 465 470 475 480 Cys Phe Lys His Asn Pro Lys Ser Gly Gly Asn Asn Ala Ala His 485 490 495 <210> 32 <211> 468 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes DSM20306 <400> 32 Met Ile Gly Leu Asp Asn Ser Ile Leu Phe Thr Ala Leu Pro Thr Leu 1 5 10 15 Thr Glu Glu Leu His Ala Gly Glu Thr Gln Gln Leu Trp Ile Ile Asn 20 25 30 Ala Tyr Pro Leu Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu 35 40 45 Gly Asp Lys Ile Gly His Arg Arg Met Phe Thr Thr Gly Leu Val Ile 50 55 60 Phe Gly Val Ala Ser Leu Ala Ala Ala Phe Ser Pro Thr Pro Ala Phe 65 70 75 80 Leu Ile Gly Ala Arg Ala Val Leu Gly Leu Gly Ala Ala Val Met Met 85 90 95 Pro Ala Thr Leu Ala Leu Ile Arg Leu Thr Phe Thr Asn Glu Gln Glu 100 105 110 Arg Asn Thr Ala Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Val Val Gly Ala 115 120 125 Ala Ala Gly Pro Val Val Gly Gly Ala Leu Leu Glu Met Trp Trp Trp 130 135 140 Gly Ser Val Phe Leu Ile Asn Val Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Ile 145 150 155 160 Ala Thr Ala Leu Leu Ala Pro Pro Asn Met Pro Asn Pro Thr Lys His 165 170 175 Trp Asp Phe Ser Ser Ser Val Tyr Ala Leu Ile Ala Leu Ala Gly Leu 180 185 190 Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ile Ala Asn Pro Asn Arg Ser Trp Val Leu 195 200 205 Val Ala Ala Ala Phe Phe Ala Cys Ile Ile Gly Gly Phe Leu Phe Val 210 215 220 Arg Arg Gln Asn Lys Leu Glu Glu Pro Leu Leu Thr Phe Asp Ile Phe 225 230 235 240 Arg Asn Arg Leu Phe Ile Gly Gly Val Ile Ala Ala Ser Gly Ala Met 245 250 255 Phe Ile Met Ala Gly Leu Glu Met Ile Thr Ala Gln Lys Leu Gln Leu 260 265 270 Ala Asp Asp Phe Ser Pro Phe His Ala Gly Val Ile Val Ala Val Ala 275 280 285 Ala Ile Ala Ala Leu Pro Thr Ser Ala Leu Gly Gly Ala Asn Leu His 290 295 300 Arg Ile Gly Phe Ile Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Leu Leu Ser Thr 305 310 315 320 Leu Gly Thr Val Leu Ala Met Trp Ser Ala His Ala Asp Ser Val Ala 325 330 335 Val Leu Ile Thr Gly Leu Ile Phe Leu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr 340 345 350 Met Ser Val Ser Ser Ile Ala Ile Ile Gly Ser Val Pro Met His Arg 355 360 365 Ser Gly Met Ala Ala Gly Val Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr 370 375 380 Leu Leu Ser Val Ala Phe Val Gly Ser Leu Thr Pro Ala Leu Tyr Leu 385 390 395 400 Ser Asn Leu Pro Ala Asn Leu Lys His Met Gly Thr Glu Ala Leu His 405 410 415 Gly Gly Leu Gly His Ala Asp Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr 420 425 430 Gly Thr Thr Val Gly Cys Val Ala Val Phe Ala Phe Ile Phe Thr Leu 435 440 445 Ala Thr Leu Trp Cys Phe Arg Gly Asn Pro Lys Ser Gly Gly Asn Gly 450 455 460 Gly Ala Asp Glu 465 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Cg2893 <400> 33 gatcggatcc tttctgatcg gtgtagacaa 30 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer cg2893-2 <400> 34 caaaccatca gtatgagtcg tcatcctcaa acgtaatgc 39 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer cg2893-3 <400> 35 gcattacgtt tgaggatgac gactcatact gatggtttg 39 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer cg2893-4 <400> 36 gatcctcgag tactagggca atgatcaaca 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysE-1 <400> 37 gatcactagt gcagcaagga taatgtgtgc 30 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ysE-2 <400> 38 cacgacgacg ttgatccagc ggtccgatgg acagtaaaag 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysE-3 <400> 39 cttttactgt ccatcggacc gctggatcaa cgtcgtcgtg 40 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysE-4 <400> 40 gatctctaga gctgccaaca atggtcttgg 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Psod2893-1 <400> 41 gatcctcgag taattgttct gcgtagctgt 30 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Psod2893-2 <400> 42 cccggaataa ttggcagcta ggatcgtaac tgtaacgaat 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Psod2893-3 <400> 43 attcgttaca gttacgatcc tagctgccaa ttattccggg 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Psod2893-4 <400> 44 tgtaaggttt ctgaagtcat gggtaaaaaa tcctttcgta 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Psod2893-5 <400> 45 tacgaaagga ttttttaccc atgacttcag aaaccttaca 40 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Psod2893-6 <400> 46 gatcggatcc gttaatgagg aaaaccgaac 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Ptuf2893-1 <400> 47 gatcctcgag tggccgttac cctgcgaatg 30 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Ptuf2893-2 <400> 48 tgtaaggttt ctgaagtcat tgtatgtcct cctggacttc 40 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Ptuf2893-3 <400> 49 gaagtccagg aggacataca atgacttcag aaaccttaca 40 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Ptuf2893-4 <400> 50 ctagcctagg ctagtgcgca ttattggctc cctt 34

Claims (20)

  1. 탈조절된 카다베린(cadaverine) 외수송체(exporter) 활성을 포함하는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 탈조절된 카다베린 외수송체 활성이 적어도 부분적으로는 서열 번호 1과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 카다베린 외수송체 폴리펩티드의 탈조절에 기인하는 것인 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카다베린 외수송체 활성이 증강되는 것인 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리신 데카르복실라제 활성이 증강되는 것인 미생물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 리신 데카르복실라제 활성이 서열 번호 3 또는 4와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 리신 데카르복실라제 폴리펩티드의 발현에 기인하는 것인 미생물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데히드 데히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트 신타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라히드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프룩토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데히드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제, 디아민 아세틸트랜스퍼라제의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 탈조절된 유전자를 가지는 미생물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 증강된 리신 내수송(import) 활성을 가지는 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 증강된 리신 내수송 활성이 감소된 리신 외수송체 활성 또는 증강된 리신 퍼미아제 활성 또는 증강된 리신/카다베린 역수송체(antiporter) 활성 또는 이들의 임의의 조합에 기인하는 것인 미생물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 증강된 리신 내수송 활성이 서열 번호 5와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1개 이상의 리신 외수송체 폴리펩티드의 감소된 활성에 기인하는 것인 미생물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 증강된 리신 내수송 활성이 증강된 리신 퍼미아제 활성에 기인하거나, 또는 증강된 리신/카다베린 역수송체 활성에 기인하거나, 또는 이 둘 모두의 조합에 기인하는 것인 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지는 미생물.
  12. 제11항에 있어서, N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지지 않거나, 또는 감소된 N-아세틸카다베린-형성 활성을 가지는 미생물.
  13. 제11항에 있어서, 증강된 N-아세틸카다베린-형성 활성 및 감소된 카다베린 외수송체 활성을 가지는 미생물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, N-아세틸카다베린-형성 활성이 서열 번호 13과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N-아세틸카다베린-형성 폴리펩티드의 활성을 탈조절시킴으로써 탈조절되는 것인 미생물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유박테리아(Eubacteria) 분기군에 속하는 미생물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 미생물.
  17. 제1항 내지 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 미생물을 발효시키는 것을 포함하는, 카다베린의 생산 방법.
  18. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 미생물을 발효시키는 것을 포함하는, 아세틸-카다베린의 생산 방법.
  19. 카다베린의 생산을 위한, 제1항 내지 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 미생물의 용도.
  20. 카다베린의 생산을 위한, 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 미생물의 용도.
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