JP6067588B2 - カダベリンの生産のための方法及び組換え微生物 - Google Patents

Description

本発明は、カダベリン又はN-アセチルカダベリンの生産を改善する脱調節形態のDNA分子を含む組換え微生物の使用、並びに該微生物の作製に使用される組換えDNA分子及びポリペプチドに関し、該微生物は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び脱調節されたカダベリンエクスポート活性を含むか又は低減されたカダベリンエクスポート活性及び増強されたN-アセチルカダベリン形成活性を含む。本発明はまた、組換え微生物を用いたカダベリン又はN-アセチルカダベリンの生産方法に関する。

JP 2002223770は、リシン脱炭酸遺伝子及び／又はリシン-カダベリンアンチポーター遺伝子をリシン生産微生物に導入することによるカダベリンの生産方法を開示している。

JP 2004222569は、L-リシンデカルボキシラーゼ活性及びホモセリン要求性を有する組換えコリネ型細菌を培養することによるカダベリンの生産方法を開示している。

WO 2007113127は、L-リシンデカルボキシラーゼ活性が脱調節された組換えコリネ型細菌を培養することによるカダベリンの生産方法、カダベリンアセチルトランスフェラーゼの検出、及びカダベリン生産を改善するためのその欠失を開示している。

US 7,435,584は、lysE（リシンエクスポートキャリア）遺伝子が高発現しているコリネバクテリアを培養することによる増強されたL-リシンの生産方法を開示している。

WO 2008092720は、細胞内で発現されるデカルボキシラーゼを発現し、それによりリシン／カダベリンアンチポーターの発現が低減又は排除されている高リシン生産微生物を発酵させることによるカダベリンの生産方法を開示している。

JP 2002223770 JP 2004222569 WO 2007113127 US 7,435,584 WO 2008092720

一側面において、本発明は、脱調節されたカダベリンエクスポート活性を有する微生物を提供する。好適には、脱調節されたカダベリンエクスポーター活性は、少なくとも部分的に、配列番号1と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む一以上のカダベリンエクスポーターポリペプチドの脱調節による。本発明の一実施形態において、微生物は増強されたカダベリンエクスポーター活性を有するが、一方で本発明の別の態様において、微生物は低減されたカダベリンエクスポーター活性を有する。好適には、微生物は増強されたリシンデカルボキシラーゼ活性を有し、さらにより好適には、増強されたリシンデカルボキシラーゼ活性は、配列番号3又は配列番号4と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む一以上のリシンデカルボキシラーゼポリペプチドの発現による。本発明のさらなる実施形態において、上記微生物は、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニル-アミノ-ケトピメレートトランスアミナーゼ、スクシニル-ジアミノ-ピメレートデスクシニラーゼ、ジアミノピメレートエピメラーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、ジアミンアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、少なくとも一つの脱調節された遺伝子もまた有する。好適には、上記微生物は増強されたリシンインポート活性を有する。さらにより好適な実施形態において、微生物は、少なくとも部分的に、低減されたリシンエクスポーター活性若しくは増強されたリシンパーミアーゼ活性若しくは増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性又はそれらの任意の組み合わせによる増強されたリシンインポート活性を有する。増強されたリシンインポート活性は、好適には、配列番号5と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一つのリシンエクスポーターポリペプチドの低減された活性による。本発明の別の実施形態において、上記微生物は、少なくとも部分的に、増強されたリシンパーミアーゼ活性、若しくは増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性、又はそれらの両方の組み合わせによる増強されたリシンインポート活性を有する。

本発明は、脱調節されたN-アセチルカダベリン形成活性をさらに有する上記微生物をさらに含む。本発明の一実施形態において、脱調節されたN-アセチルカダベリン形成活性を有する微生物は、N-アセチルカダベリン形成活性が全くないか又は低減されている。本発明の別の実施形態において、脱調節されたN-アセチルカダベリン形成活性を有する微生物は、増強されたN-アセチルカダベリン形成活性を有し、低減されたカダベリンエクスポーター活性を有する。好適には、上記微生物の脱調節されたN-アセチルカダベリン形成活性は、少なくとも部分的に、配列番号13と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むN-アセチルカダベリン形成ポリペプチドの脱調節による。好適には、任意の上記微生物は、真正細菌（Eubacteria）のクレードに、さらにより好適には、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）に属し、最も好適には上記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の種に属する。

本発明は、上記微生物のいずれか一つを用いるカダベリンの生産方法、及び上記微生物のいずれか一つを用いるN-アセチルカダベリンの生産方法をさらに含む。さらに本発明は、カダベリン又はN-アセチルカダベリンの生産のための上記微生物のいずれか一つの使用を含む。

本発明の他の実施形態は、上記微生物のいずれか一つを発酵させることにより生産されたカダベリン、並びに上記微生物のいずれか一つを発酵させることにより生産されたカダベリンを用いて生産されたポリアミンの使用である。

ジアミノペンタンを生産するC. glutamicum DAP-3cにおける、リシンデカルボキシラーゼ比活性の、存在するジアミノペンタンへの依存性。データは二つの複製物の平均値を表す。 配列番号1（ジアミノペンタンエクスポーター）のカダベリンエクスポーターポリペプチドの欠失を有するC. glutamicum _deltadapE、sodプロモーターの下で配列番号1のポリペプチドをコードする配列番号2のカダベリンエクスポーター遺伝子を過剰発現するP_soddapE、並びにそれらの親株であるDAP-3cの、増殖（A）、バイオマス収量（B）、ジアミノペンタン収量（C）、及びN-アセチルジアミノペンタン収量（D）の比較。データは、10g L^-1のグルコースを唯一の炭素源として含む最小培地で培養された三つの生物学的複製物における対数増殖期の値を表す。

以下の説明では、多数の用語を広く使用する。本発明の理解を容易にするため、ここに定義を提供する。

「カダベリン」という用語は、1,5-ジアミノペンタン（CAS番号：462-94-2）を意味する。「N-アセチルカダベリン」という用語は、N-アセチルジアミノペンタン（CAS番号：102029-76-5）を意味する。

本発明の方法は、好ましくは本明細書中に記載されるベクター又は遺伝子（例えば、野生型遺伝子及び/若しくは変異遺伝子）を含み、並びに/又はカダベリン及び／若しくはN-アセチルカダベリンの生産を生じさせる方法で培養される、組換え微生物を特徴とする。

「組換え」微生物という用語は、この微生物の起源となる天然の微生物と比較して、該微生物が、改変された、修飾された又は異なった遺伝子型及び/又は表現型を示す（例えば、遺伝子改変が該微生物のコード核酸配列に影響を及ぼすとき）ように遺伝子が改変、修飾又は組換えされた（例えば、遺伝子組換えされた）微生物（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞等）を含む。

プロモーター：mRNAを生成するよう構造遺伝子の転写を指令するDNA配列。典型的に、プロモーターは遺伝子の5'領域に位置し、構造遺伝子の開始コドンの近位にある。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤に応答して増大する。対照的に、転写速度は、プロモーターが構成的プロモーターである場合、誘導剤によっては調節されない。

エンハンサー：プロモーターエレメント。エンハンサーは、転写開始部位に対する該エンハンサーの距離又は配向と関係なく、特定の遺伝子をmRNAに転写する効率を増大させ得る。

クローニングベクター：宿主細胞中で自己複製する能力を有し、遺伝子操作用の細胞を形質転換するために使用されるDNA分子（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、又はバクテリオファージ）。クローニングベクターは、典型的に、特定可能な方法で、該ベクターの必須の生物学的機能を喪失することなく外来DNA配列を挿入し得る1つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びに該クローニングベクターで形質転換された細胞の同定及び選択における使用に好適なマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子は、典型的に、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。

発現ベクター：組換え宿主中で外来タンパク質の発現を生じる、外来タンパク質をコードするクローニングされた構造遺伝子を含むDNA分子。典型的に、クローニングされた遺伝子の発現は、プロモーター配列及びエンハンサー配列などの特定の調節配列の制御下に置かれる（すなわち、機能的に連結される）。プロモーター配列は、構成的又は誘導性のいずれであってもよい。

組換え宿主：組換え宿主は、クローニングベクター又は発現ベクターのいずれかを含む任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。この用語は、宿主細胞の染色体又はゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子操作されている原核細胞又は真核細胞も包含して意味する。好適な宿主の例としては、Sambrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ["Sambrook"]を参照されたい。

「発現する」、「発現している」、「発現された」及び「発現」という用語は、コードされているタンパク質又はそれが関係する経路若しくは反応の得られる酵素活性により、この遺伝子／経路が発現される生物におけるこの経路若しくは反応を介した代謝フラックスが可能になるようなレベルでの、遺伝子産物（例えば、本出願において定義及び記載される経路又は反応の遺伝子の生合成酵素）の発現を意味する。発現は、出発生物として用いられる微生物の遺伝子改変によって行われ得る。いくつかの実施形態において、微生物は、出発微生物によって、又は改変されていない同等微生物において生産されるレベルと比較して増加したレベルで遺伝子産物を発現するように遺伝子改変(例えば遺伝子組み換え）され得る。遺伝子改変には、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関係した調節配列又は部位を（例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーター若しくは複数のプロモーターの付加により、又は発現が構成的となるように調節配列を除去することにより）改変又は修飾すること、特定の遺伝子の染色体位置を修飾すること、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の特定の遺伝子に隣接する核酸配列を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を増加させること、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）を修飾すること、あるいは当技術分野における慣用技術を用いる特定の遺伝子の発現を脱調節させる任意の他の慣用的な手段（限定されるものではないが、例えばリプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用）が挙げられる。

いくつかの実施形態において、微生物は、出発微生物による遺伝子産物の発現レベルと比較して増加した又は低いレベルで遺伝子産物を発現するように、物理的又は環境的に改変し得る。例えば、微生物を、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳を増加させることが知られているか又はその可能性がある作用物質で処理するか又はその作用物質の存在下で培養して、転写及び／又は翻訳を増強又は増加させ得る。あるいは、微生物を、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳を増大させるために選択される温度で培養して、 転写及び／又は翻訳を増強又は増加させうる。

「脱調節する」、「脱調節された」及び「脱調節」という用語は、微生物における少なくとも1つの遺伝子の改変又は修飾であって、かかる改変又は修飾のないときのカダベリン又はN-アセチルカダベリン生産と比較して微生物におけるカダベリン又はN-アセチルカダベリン生産の効率の増加が生じる改変又は修飾を意味する。いくつかの実施形態において、改変又は修飾される遺伝子は、生合成経路における酵素又は輸送タンパク質をコードし、それにより、微生物における生合成酵素のレベル若しくは活性が改変若しくは修飾されるか、又は輸送特異性若しくは効率が改変若しくは修飾される。いくつかの実施形態において、生合成経路における酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子は、該酵素のレベル又は活性が、非改変型又は野生型遺伝子の存在下におけるレベルと比較して増強又は増大するように、改変又は修飾される。脱調節はまた、例えば、フィードバック抵抗性であるか又は高い若しくは低い比活性を有する酵素をもたらすように、1以上の遺伝子のコード領域を改変することも含む。また脱調節は、酵素又は輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する転写因子（例えば、アクチベーター、リプレッサー）をコードする遺伝子の遺伝子改変をさらに包含する。

「過剰発現する」、「過剰発現している」、「過剰発現された」及び「過剰発現」という用語は、出発微生物の遺伝子改変前に存在するよりも高いレベルにおける遺伝子産物の発現、特に遺伝子産物（例えば、リシン生合成酵素若しくは硫酸還元経路酵素若しくはシステイン生合成酵素、又は本出願において定義及び記載される遺伝子若しくは経路若しくは反応）の発現の増強を意味する。いくつかの実施形態において、微生物は、出発微生物によって生産されるレベルと比較して増加したレベルで遺伝子産物を発現するように遺伝子改変(例えば遺伝子組み換え）され得る。遺伝子改変には、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関係した調節配列又は部位を（例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーター若しくは複数のプロモーターの付加により、又は発現が構成的となるように調節配列を除去することにより）改変又は修飾すること、特定の遺伝子の染色体位置を修飾すること、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の特定の遺伝子に隣接する核酸配列を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を増加させること、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）を修飾すること、あるいは当技術分野における慣用技術を用いる特定の遺伝子の発現を脱調節させる任意の他の慣用的な手段（限定されるものではないが、例えばリプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用）が挙げられる。遺伝子産物を過剰発現させる別の方法は、遺伝子産物の安定性を増強させ、その寿命を増大させることである。C. glutamicumなどの生物における遺伝子の過剰発現の例は、Eikmannsら（Gene. (1991) 102, 93-8）に見出すことができる。

「脱調節された」という用語は、微生物の操作の前に発現されるレベル又は操作されていない同等微生物において発現されるレベルより低い若しくは高いレベルでの遺伝子産物（例えば、リシンデカルボキシラーゼ）の発現を包含する。一実施形態において、微生物を遺伝的に操作して（例えば、遺伝子組換えして）、微生物の操作の前に発現されるレベル又は操作されていない同等微生物において発現されるレベルより低い又は高いレベルで遺伝子産物を発現させ得る。遺伝子操作としては、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列又は部位を（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター又は多重プロモーターを除去することによって）改変又は修飾すること、特定の遺伝子の染色体位置を修飾すること、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の特定の遺伝子に隣接する核酸配列を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を減少させること、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーター等）を修飾すること、又は当技術分野においては慣用的な、特定の遺伝子の発現を脱調節するための任意の他の慣用手法（例えば、限定されるものではないが、アンチセンス核酸分子の使用、又は標的タンパク質の発現をノックアウト若しくは阻止するための他の方法）が挙げられる。

「脱調節された遺伝子活性」、例えば「脱調節されたリシンデカルボキシラーゼ」という用語はまた、各遺伝子活性（例えば、リシンデカルボキシラーゼ活性）が以前には観察されていなかった場合に、好ましくは遺伝子工学の方法により、例えば異種遺伝子（例えば、リシンデカルボキシラーゼ遺伝子）を1コピー以上導入することによって、遺伝子活性（例えば、リシンデカルボキシラーゼ活性）を微生物に導入することも意味する。

「脱調節された経路又は反応」という表現は、生合成経路又は反応における酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が、少なくとも1つの生合成酵素のレベル又は活性が改変又は修飾されるように、改変又は修飾されている生合成経路又は反応を意味する。「脱調節された経路」という表現には、2以上の遺伝子が改変又は修飾されて、対応する遺伝子産物／酵素のレベル及び／又は活性が変化している生合成経路が含まれる。いくつかの場合には、微生物における経路を「脱調節」する能力（例えば、所定の生合成経路における2以上の遺伝子を同時に脱調節する能力）は、2以上の酵素（例えば、2又は3種の生合成酵素）が、「オペロン」と呼ばれる遺伝物質の近接する部分において互いに隣接して存在する遺伝子によってコードされているという微生物の特定の事象から生じる。他の場合には、経路を脱調節するために、一連の連続操作ステップにおいていくつかの遺伝子を脱調節する必要がある。

本発明において脱調節された遺伝子を発現させるには、発現ベクター中で、酵素をコードするDNA配列を、転写発現を制御する調節配列に機能的に連結し、次いで原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかに導入しなければならない。プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列及び、発現ベクターを保有する細胞の選択に好適なマーカー遺伝子を含み得る。

原核宿主における発現に好適なプロモーターは、抑制性、構成的、又は誘導性であってよい。好適なプロモーターは当業者に周知であり、T4、T3、T5、Sp6及びT7ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、λバクテリオファージのP_R及びP_Lプロモーター、大腸菌のtrp、recA、ヒートショック、lacUV5、tac、lpp-lac pr、phoA、gal、trc及びlacZプロモーター、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）のα-アミラーゼ及びσ²⁸-特異的プロモーター、バチルス（Bacillus）属のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセス（Streptomyces）属のプロモーター、λバクテリオファージのintプロモーター、pBR322のβ-ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーター、並びにコリネバクテリウム（Corynebacterium）由来のPGRO、PSOD、PEFTU、PEFTS、並びにこれらのプロモーターの組み合わせ、例えばWO2005059144、WO2007011939、WO2007012078、WO2005059093、WO2008049782、WO2006069711、WO2007020295に記載のものが挙げられる。原核プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)；Watsonら, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987)；Ausubelら（上掲）、及びSambrookら（上掲）に概略されている。

大腸菌リシンデカルボキシラーゼの発現に好適なプロモーターは、WO2005059144、WO2007011939、WO2007012078、WO2005059093、WO2008049782、WO2006069711、WO2007020295に記載されているC. glutamicumのPsodA、PGRO及びPEFTUプロモーターである。

原核宿主中でタンパク質を発現させる方法は当業者に周知である。例えば、DNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 第2版, Gloverら(編), 15-58頁（Oxford University Press 1995）中の、Williamsら, "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,"を参照のこと。同様に、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, 137-185頁（Wiley-Liss, Inc. 1995）中のWardら, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,"；及びPROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Clelandら(編), 101-127頁（John Wiley & Sons, Inc. 1996）中のGeorgiou, "Expression of Proteins in Bacteria,"も参照されたい。遺伝子発現及びタンパク質産生を増大又は低減させる他の方法はWO2008049782に見出すことができる。

発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション等をはじめとする多様な技法を用いて細菌宿主細胞中に導入し得る。例えば、Ausubelら(編), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第3版, 1-1〜1-24頁（John Wiley & Sons, Inc. 1995）を参照のこと。

本明細書において用いられる「実質的に純粋なタンパク質」とは、所望の精製タンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）後の単一のバンドによって証明されるとおり、実質的に混入細胞成分を含まないことを意味する。「実質的に純粋な」という用語は、当業者に用いられるように、1つ以上の純度又は均一性に関する特性が均一な分子も表す。例えば、実質的に純粋なリシンデカルボキシラーゼは、例えば以下のパラメータ：分子量、クロマトグラフィー泳動、アミノ酸組成、アミノ酸配列、ブロッキングされている又はブロッキングされていないN末端、HPLCの溶出プロファイル、生物学的活性、及び他のこのようなパラメータについて、標準実験偏差内で、一定の、再現性のある特性を示す。しかしこの用語は、他の化合物を含む、リシンデカルボキシラーゼの人工の又は合成の混合物を除外することを意味するものではない。さらにこの用語は、組換え宿主から単離されたリシンデカルボキシラーゼ融合タンパク質を除外することを意味するものでもない。

第1の側面において、本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を有するか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含む微生物を提供する。

微生物は、原核微生物又は真核微生物、特に細菌、古細菌、酵母及び真菌のいずれであってもよい。好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、エッシェリヒア属（Escherichia）、特に大腸菌（Escherichia coli）、バチルス属（Bacillus）、特にバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、及びストレプトマイセス属（Streptomyces）から選択される微生物である。

上述したように、本発明の好ましい実施形態は、コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム属の細菌から選択される宿主細胞の使用に関する。特に好ましくは、以下の種：コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）、及びコリネバクテリウム・エフィジエンス（Corynebacterium effiziens）である。本発明の他の好ましい実施形態は、ブレビバクテリア、特にブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、及びブレビバクテリウム・ジバレカタム（Brevibacterium divarecatum）の種の使用に関する。

本発明の他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムATCC15806、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC13870、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスFERMBP-1539、コリネバクテリウム・メラセコラATCC17965、コリネバクテリウム・エフィジエンスDSM 44547、コリネバクテリウム・エフィジエンスDSM 44549、ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・ジバレカタムATCC 14020, コリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10065及びコリネバクテリウム・グルタミカムATCC21608、並びに例えば古典的な突然変異誘発及び選択により又は定方向突然変異誘発によりそれらから誘導される株を含む群より選択され得る。

コリネバクテリウム・グルタミカムの他の特に好ましい菌株は、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC21492、ATCC21513、ATCC21526、ATCC21543、ATCC13287、ATCC21851、ATCC21253、ATCC21514、ATCC21516、ATCC21299、ATCC21300、ATCC39684、ATCC21488、ATCC21649、ATCC21650、ATCC19223、ATCC13869、ATCC21157、ATCC21158、ATCC21159、ATCC21355、ATCC31808、ATCC21674、ATCC21562、ATCC21563、ATCC21564、ATCC21565、ATCC21566、ATCC21567、ATCC21568、ATCC21569、ATCC21570、ATCC21571、ATCC21572、ATCC21573、ATCC21579、ATCC19049、ATCC19050、ATCC19051、ATCC19052、ATCC19053、ATCC19054、ATCC19055、ATCC19056、ATCC19057、ATCC19058、ATCC19059、ATCC19060、ATCC19185、ATCC13286、ATCC21515、ATCC21527、ATCC21544、ATCC21492、NRRL B8183、NRRL W8182、B12NRRLB12416、NRRLB12417、NRRLB12418及びNRRLB11476を含む群から選択され得る。

略称KFCCはKorean Federation of Culture Collectionを表し、ATCCはAmerican-Type Strain Culture Collectionを表し、略称DSMはDeutsche Sammlung von Mikroorganismenを表す。略称NRRLは、ARS cultures collection Northern Regional Research Laboratory（Peorea, IL, USA）を表す。

特定の実施形態において、本発明の微生物は、「キャンベルイン（Campbell in）」又は「キャンベルアウト（Campbell out）」微生物（又は細胞若しくは形質転換体）である。本明細書において用いられる「キャンベルイン」形質転換体という表現は、環状二本鎖DNA分子（例えばプラスミド）全体が単一の相同組換え事象（事象中1回の交差）により細胞の染色体に組み込まれ、環状DNA分子の直鎖形態の、該環状DNA分子の第1のDNA配列に相同な染色体の第1のDNA配列への挿入を効率的に生じる、元の宿主細胞の形質転換体を意味する。「キャンベルインされた（Campbelled in）」という表現は、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれた直鎖状DNA配列を意味する。「キャンベルイン」形質転換体は、相同組換え交差点を含みかつそれを取り囲む第1相同DNA配列の重複を含む。

「キャンベルアウト」とは、「キャンベルイン」形質転換体の子孫である細胞を意味し、該細胞では、「キャンベルインされた」DNAの直鎖状の挿入されたDNAに含まれる第2のDNA配列と、該直鎖状挿入物の第2のDNA配列に相同的な染色体起源の第2のDNA配列との間で第2の相同組換え事象（切り出し（cross out）事象）が起こり、その第2の組換え事象が組み込まれたDNA配列の一部の欠失（放出）を生じるが、重要な点では組み込まれたDNA配列の一部（一塩基ほど小さくともよい）が染色体中に残ることとなり、結果として、元の宿主細胞と比較して、「キャンベルアウト」細胞は染色体中に1以上の意図的な変化（例えば、一塩基置換、複数塩基置換、異種遺伝子若しくはDNA配列の挿入、相同遺伝子若しくは修飾型相同遺伝子の1以上の追加コピーの挿入、又は上記列挙した例の2以上を含むDNA配列の挿入）を含む。

「キャンベルアウト」細胞又は菌株は通常、必ずしもそうでなくてもよいが、「キャンベルインされた」DNA配列の一部（放出することが望まれる部分）に含まれる遺伝子（例えば、約5％〜10％スクロースの存在下で増殖させた細胞において発現された場合に致死性となるバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）sacB遺伝子）に対するカウンターセレクションによって得られる。カウンターセレクションを行う場合又は行わない場合のいずれでも、所望の「キャンベルアウト」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型、例えば限定されるものではないが、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の有無、ポリメラーゼ連鎖反応による所与のDNA配列の有無、栄養要求性の有無、酵素の有無、コロニー核酸ハイブリダイゼーションなど、を用いて、所望の細胞についてスクリーニングすることにより取得又は同定され得る。

「キャンベルイン」又は「キャンベルアウト」に至る相同組換え事象は、相同DNA配列内である範囲のDNA塩基において起こり得、相同配列はこの範囲の少なくとも一部について互いに同一であるため、交差事象がどこで起こるかを正確に特定することは通常不可能である。言い換えると、どの配列が挿入されたDNAに由来するのか、どの配列が染色体DNAに由来するのかを正確に特定することは不可能である。さらに、第1の相同DNA配列及び第2の相同DNA配列は通常、部分的に非相同性の領域で隔てられ、「キャンベルアウト」細胞の染色体に残るのは、非相同性のこの領域である。

実用性のため、C. glutamicumでは、典型的に第1及び第2の相同DNA配列は、少なくとも約200塩基対長であり、数千塩基対長までとなることもあるが、より短い又はより長い配列を用いて実施する手順も可能である。第1及び第2の相同配列の好適な長さは約500〜2000塩基であり、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」の取得は、第1及び第2の相同配列をおよそ同じ長さに、好適には200塩基対未満の差で、最も好適には2つのうち短いものが塩基対長の長いものの少なくとも70％の長さとなるように設計することにより促進される。

リシンデカルボキシラーゼ活性とは、リシンデカルボキシラーゼにより触媒される、L-リシンのカダベリンへの脱炭酸を意味する。この酵素は、E.C. 4.1.1.18に分類されている。例えば、大腸菌（Escherichia coli）から単離される、リシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、cadA遺伝子産物（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry b4131、配列番号4）及びldcC遺伝子産物（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry JW0181、配列番号3）である。

酵素活性を測定し比較する方法は当技術分野で公知であり、例えばHandbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling, Borth(編) CRC Press Boca Raton USA及びその参照文献、又はMethods in Enzymology Volume 17, Part 1 pp. 3-1098 (1970)、Volume 17, Part 2, pp.3-961 (1971)、Volume 41, pp.3-564 (1975)、Volume 42 pp.3-537 (1975)、Volume 63, pp.3-547 (1979)、Volume 64, pp.3-418 (1980)、Volume 89, pp.3-656 (1982)、Volume 90 pp.3-602 (1982)、Volume 142, pp.3-732 (1987)、Volume 143 pp.3-582 (1987)及びその参照文献に記載されている。コリネバクテリウム・グルタミカムの菌株の比較に使用される標準株はATCC13032（Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling, Borth(編) CRC Press Boca Raton USA）である。

大腸菌ldcCのアミノ酸配列は配列番号3に開示されており、大腸菌cadAのアミノ酸配列は配列番号4に開示されている。

大腸菌リシンデカルボキシラーゼ遺伝子をコードするDNA分子は、配列番号3又は4のアミノ酸配列から逆翻訳されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブを用いて、cDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られ得る。

あるいは、大腸菌リシンデカルボキシラーゼ遺伝子又は本明細書に開示する遺伝子は、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドを用いてDNA分子を合成することにより、得られ得る。例えば、Ausubelら(編), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,8.2.8〜8.2.13頁 (1990) ["Ausubel"]を参照されたい。Wosnickら, Gene 60:115 (1987)；及びAusubelら(編), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第3版, 8-8〜8-9頁（John Wiley & Sons, Inc. 1995）も参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技法は、少なくとも2キロベース長のDNA分子を合成する能力を提供する。Adangら, Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)；Bambotら, PCR Methods and Applications 2:266 (1993)；Dillonら, "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White(編), 263-268頁, （Humana Press, Inc. 1993）に記載；Holowachukら, PCR Methods Appl. 4:299 (1995)。

親酵素と比較して保存的アミノ酸変化を含むポリペプチド、例えばカダベリンエクスポーターポリペプチドの変異体又は本明細書に記載する任意の遺伝子の変異体が作製され得る。すなわち、例えば配列番号1の1つ以上のアミノ酸置換を含み、アルキルアミノ酸がポリペプチドの配列中でアルキルアミノ酸に置換されており、芳香族アミノ酸が、例えばカダベリンエクスポーターポリペプチドのアミノ酸配列中で芳香族アミノ酸に置換されており、硫黄含有アミノ酸が、例えばカダベリンエクスポーターポリペプチドのアミノ酸配列中で硫黄含有アミノ酸に置換されており、水酸基含有アミノ酸が、例えばカダベリンエクスポーターポリペプチドのアミノ酸配列中で水酸基含有アミノ酸に置換されており、酸性アミノ酸が、例えばカダベリンエクスポーターポリペプチドのアミノ酸配列中で酸性アミノ酸に置換されており、塩基性アミノ酸が、例えば例えばカダベリンエクスポーターポリペプチドのアミノ酸配列中で塩基性アミノ酸と置換されている、変異体が得られ得る。

共通アミノ酸のうち、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の各群内のアミノ酸間の置換によって説明される。（1）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（2）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（3）システイン及びメチオニン、（4）セリン及びトレオニン、（5）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（6）グルタミン及びアスパラギン、並びに（7）リシン、アルギニン及びヒスチジン。

例えば、カダベリンエクスポーターポリペプチド中の保存的アミノ酸変化は、ヌクレオチドを配列番号1に示されるヌクレオチドと置換することによって導入され得る。このような「保存的アミノ酸」変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発等によって得られ得る。Ausubelら, 上掲, 8.0.3-8.5.9頁；Ausubelら(編), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第3版, 8-10〜8-22頁（John Wiley & Sons, Inc. 1995）。また、一般にMcPherson(編), DIRECTED MUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)も参照のこと。カダベリンを排出するカダベリンエクスポーターポリペプチドの変異体の能力は、細胞外のカダベリンのHPLCアッセイを用いて測定され得る。

本発明において好適なカダベリンエクスポーターポリペプチドは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のカダベリンエクスポーターポリペプチド（dapE）、並びに対応する「元の」遺伝子産物と80％、好ましくは90％また最も好ましくは95％及び98％以下の（アミノ酸配列に基づく）配列同一性を有し、且つ依然としてカダベリンエクスポーターポリペプチドの生物学的活性を有する同等の遺伝子である。これらの同等の遺伝子は、当技術分野で公知の方法によってヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を導入することにより、あるいは、当技術分野で周知の方法（例えばデータベース検索、ライブラリスクリーニング、相補性アッセイ又は酵素活性試験）に従って同定及びクローニングし得る他の生物のホモログ遺伝子をクローニングすることにより、容易に構築し得る。好ましくは、クローニングされたホモログ遺伝子のヌクレオチド配列は、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）又は大腸菌のコドン使用頻度に適合化させることにより、目的の宿主微生物における発現のために最適化される。

配列番号1の配列と相同の配列が見出され得る。例として、以下のもの：コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R TX= 40322株由来のA4QH10_CORGBタンパク質（配列番号25）、コリネバクテリウム・エフィジエンス（Corynebacterium effiziens）由来のQ8FMK8_COREFタンパク質（配列番号26）、コリネバクテリウム・マツルショッティ（Corynebacterium matruchotii）ATCC 33806由来のZP_03711358タンパク質（配列番号27）、コリネバクテリウム・アミコラトゥム（Corynebacterium amycolatum）SK46由来のZP_03392764タンパク質（配列番号28）、アルカノバクテリウム・ヘモリティクム（Arcanobacterium haemolyticum）DSM 20595由来のYP_003696648タンパク質（配列番号29）、コリネバクテリウム・アウリムコスム（Corynebacterium aurimucosum）ATCC 700975由来のZP_06042915タンパク質（配列番号30）、コリネバクテリウム・ストリアトゥム（Corynebacterium striatum）ATCC 6940由来のZP_03936401タンパク質（配列番号31）、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）DSM 20306由来のZP_06837496タンパク質（配列番号32）が挙げられる。

従って、好適な実施形態において、細胞内又はカダベリンエクスポーター活性は、少なくとも部分的であり、好適には30%より多く、又は50%より多く、又は60%より多く、又は70%より多く、又は75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%より多くまでであり、これは配列番号1と少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%、又は少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含み、カダベリンエクスポーター活性を有する一以上のポリペプチドに起因する。

本発明の他の好適な実施形態は、カダベリンエクスポーターポリペプチドを発現させようとすることが意図される微生物、例えば大腸菌のコドン使用頻度を適用することによって、又はコリネバクテリウム・グルタミカムにおける発現のためにコドン使用頻度を最適化することによって、DNAに再翻訳され得るコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のカダベリンエクスポーターポリペプチド（配列番号1）を使用する。

本発明の好適な微生物は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性、好ましくは高い細胞内デカルボキシラーゼ活性を含む。細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性は、微生物によって発現させようとする1以上のリシンデカルボキシラーゼ遺伝子で微生物を形質転換することによって創出又は増強され得る。さらに又はあるいは、リシンデカルボキシラーゼ遺伝子は、コードされるリシンデカルボキシラーゼの発現又は酵素活性が増強されるように変異させ得る。

別の実施形態において、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性は、細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と組み合わされる。細胞内又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性のいずれかを欠損する微生物は、細胞内又は細胞外のいずれかでリシンデカルボキシラーゼを発現するように形質転換され得る。細胞外発現は、形質転換される微生物において機能的な、細胞外発現のためのシグナル配列、例えば分泌シグナル又は分子アンカーのためのシグナルを含むように、リシンデカルボキシラーゼ遺伝子を変異させることによって達成され得る。細胞外発現の例は、Choi and Lee Appl Microbiol Biotechnol 2004 64: 625-635、Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:538-545、Trends in Biotechnology 2007 16 73-79に見出すことができる。

細胞内又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性がリシンデカルボキシラーゼ活性を有する異なるポリペプチドをコードする2以上のリシンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現に起因する場合には、細胞内又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性の総活性は、これらの異なるリシンデカルボキシラーゼ活性の結果となる。総リシンデカルボキシラーゼ活性に対する特定のリシンデカルボキシラーゼ遺伝子の寄与は、特定の微生物における異なるリシンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現レベルを比較し、これらの遺伝子から発現されたリシンデカルボキシラーゼの酵素比活性を比較することによって測定され得る。異なる遺伝子の発現レベルは、当技術分野で周知の方法により測定され得、好ましくは、発現レベルはタンパク質レベルで、例えばウエスタンブロット又はELISAアッセイにより、測定され得る。リシンデカルボキシラーゼの酵素比活性を測定する方法もまた当技術分野で周知である。好ましい方法はWO2007113127に開示されている。

内因性リシンデカルボキシラーゼ活性がリシンデカルボキシラーゼ活性を有する少なくとも1つの追加ポリペプチドのトランスジェニック発現により増強される場合には、この又はこれらの追加ポリペプチドの寄与は、形質転換微生物と非形質転換微生物の総リシンデカルボキシラーゼ活性を比較することにより測定され得る。

好ましい実施形態において、細胞内若しくは細胞外デカルボキシラーゼ活性、又は両方の活性は、少なくとも部分的には、好ましくは30％を超えて又は50％を超えて又は60％を超えて又は70％を超えて又は75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％を超えており、これは、配列番号3に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有し、好ましくは高いリシンデカルボキシラーゼ活性を有する1以上のポリペプチドに起因する。

一実施形態において、細胞内若しくは細胞外デカルボキシラーゼ活性、又は両方の活性は、98％を超えて又は99％を超えており、これは、配列番号3に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有し、好ましくは高いリシンデカルボキシラーゼ活性を有する1以上のポリペプチドに起因する。

一実施形態において、細胞内若しくは細胞外デカルボキシラーゼ活性、又は両方の活性は、98％を超えて又は99％を超えており、これは、配列番号4に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有し、好ましくは高いリシンデカルボキシラーゼ活性を有する1以上のポリペプチドに起因する。

一実施形態において、カダベリンエクスポーター活性を含む微生物はまた、増強されたリシンインポート能力をも含む。

改善されたリシンインポート能力は、発酵培地から微生物へのリシンの流れを増強する任意の手段により、又は微生物から発酵培地へのリシンの流れを低減することにより達成され得る。

リシンエクスポート及びインポート活性を測定する方法は、Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, Mら MICROBIOLOGY-SGM 147 pp.1765-1774, 2001、及びBurkovski, A, Kramer, R. APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58 pp.265-274. 2002と、それらで引用された参照文献に見出され得る。

例えば、リシンインポート能力は、リシンエクスポーター活性を減少若しくは排除することにより、又はリシンパーミアーゼ活性を増強することにより、又はリシン／カダベリンアンチポーター活性を増強することにより、あるいはこれらの任意の組み合わせにより、改善すされ得る。

リシンエクスポーター活性は、培地から細胞へとリシンを輸送し得る任意のポリペプチド、例えばリシンエクスポーター、リシンシンポーター（symporter）、又はリシンアンチポーターポリペプチドに起因し得る。

微生物が細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性及び高いリシン生産能力を有する場合、リシンインポート能力を増強するための上述した手段とは対照的な手段を採用することにより、例えば特定の遺伝子の発現を低減する代わりに特定の遺伝子発現を増強することにより、リシンエクスポート能力を増強させることが有利であり得る。高いリシン生産能力を有し、かつリシンエクスポーターポリペプチドの発現が低減又は排除されているが、細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を欠損している微生物の例は、WO 97/23597及びWO2005073390（これは、アミノ酸エクスポートタンパク質の増強された発現若しくは活性を有する微生物を培養することによりアミノ酸を増強して生産する方法を開示する）、並びにUS 7,435,584（これは、lysE（リシンエクスポートキャリア）遺伝子を高発現するコリネバクテリウムを培養することによりL-リシンを増強して生産する方法を開示する）に見出すことができる。

本発明の一実施形態において、少なくとも1つのリシンエクスポーターポリペプチドの活性が低減されるが、ここでリシンエクスポーターポリペプチドは、配列番号5と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有するか、又はリシンエクスポーターポリペプチドは、配列番号5と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有するか、あるいは少なくとも2つのリシンエクスポーターポリペプチドの活性が低減されるが、ここで少なくとも1つは、配列番号5と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有し、また少なくとも1つは、配列番号5と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有するものである。

lysE遺伝子は、文献Eggeling, L, Sahm, H JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 92, 3 201-213、Eggeling, L, Sahm, H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180, 3 155-160 2003に記載されており、またドイツ特許出願DE 95-01048222も参照されたい。

YbjE遺伝子産物（配列番号6）及びその変異体は、例えばWO2005073390に記載されている。

「低減された活性（活性の低減・低下）」という用語は、微生物の操作前に発現されるレベル又は操作していない同等微生物におけるレベルよりも低いレベルにおける、遺伝子産物、例えばカダベリンエクスポーターポリペプチド、又はリシンエクスポーターポリペプチドの発現を含み、好ましくは、遺伝子産物の発現は、同じ条件下で増殖させた特定の微生物種の周知株と比較される。例えばコリネバクテリウムの場合には、遺伝子の発現は、好ましくはATCC13032株における発現レベルと比較され、大腸菌の場合には、遺伝子の発現は、好ましくは菌株コレクションATCCに寄託されたMG1665株における発現レベルと比較され、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の場合には、発現レベルは菌株コレクションATCCに寄託されたW303株と比較される。一実施形態において、微生物を遺伝的に操作して（例えば、遺伝子組換えして）、微生物の操作の前に発現されるレベル又は操作されていない同等微生物において発現されるレベルより低いレベルで遺伝子産物を発現させ得る。遺伝子操作としては、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列又は部位を（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター又は多重プロモーターを除去することによって）改変又は修飾すること、特定の遺伝子の染色体位置を修飾すること、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の特定の遺伝子に隣接する核酸配列を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を減少させること、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーター等）を修飾すること、又は当技術分野においては慣用的な、特定の遺伝子の発現を低下させるための任意の他の慣用手法（例えば、限定されるものではないが、アンチセンス核酸分子の使用、又は標的タンパク質の発現をノックアウト若しくは阻止するための他の方法）が挙げられる。特に、宿主生物の染色体から1以上のヌクレオチドが欠失される遺伝子操作を行い得る。遺伝子産物の活性、例えばリシンエクスポーターポリペプチドの活性の低減はまた、遺伝子産物の活性の低減を導く1以上の遺伝子変異を導入することによって得られ得る。さらに、遺伝子産物の活性は、該遺伝子産物の発現又は活性を調節する調節タンパク質に影響を及ぼすことにより、例えば該遺伝子の転写に影響を及ぼすことにより、低減させることも可能である。例として、転写リプレッサー及び転写アクチベーターが挙げられる。例えば、lysE遺伝子の発現には、lysG遺伝子産物によって負の影響が及ぶ。lysG遺伝子の配列（本明細書中、配列番号7として開示）及びLysG 遺伝子産物の配列（本明細書中、配列番号8として開示）はまた、以下のアクセッション番号P94632、X96471として見出すこともできる。

別の実施形態において、リシンインポート能力は、リシンパーミアーゼ活性の増強により、又はリシン／カダベリンアンチポーター活性の増強により、あるいは両方の組み合わせにより増強される。

所定の微生物のリシンパーミアーゼ活性は、例えば1以上の内因性リシンパーミアーゼ遺伝子（例えば配列番号9に開示されているもの）の発現を増加させることにより、又はリシンパーミアーゼポリペプチド（例えば配列番号10に開示されているもの）のパーミアーゼ活性を増大させることにより、例えば微生物のランダム突然変異誘発により若しくは1以上のリシンパーミアーゼ遺伝子による微生物の形質転換により又はそれらの任意の組み合わせにより、増強され得る。

一実施形態において、微生物のリシンパーミアーゼ活性は、配列番号10に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンパーミアーゼ活性を有する1以上のリシンパーミアーゼポリペプチド（例えばリシンパーミアーゼ活性を有するホモログ又は変異体）の組換え発現により、増強される。リシンパーミアーゼ活性を測定する方法は、Bellmann, A, Vrljic, M , Patek, Mら MICROBIOLOGY-SGM 147 pp.1765-1774 2001、及びBurkovski, A, Kramer, R APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58 pp.265-274 2002、並びにFujii, Tら、BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66, pp.1981-1984, 2002、及びこれらで引用された参照文献中に見出すことができる。

組換え発現は、例えば1以上のリシンパーミアーゼ遺伝子の形質転換により、より高い発現活性を有する脱調節されたプロモーターを内因性リシンパーミアーゼ遺伝子に提供することにより、又はリシンパーミアーゼ遺伝子発現若しくは遺伝子産物活性の負の調節因子を低減することにより、達成され得る。

別の実施形態において、リシンインポート能力は、リシン／カダベリンアンチポーター活性の増強によって増強される。リシン／カダベリンアンチポーターは、細胞膜を横切って異なる方向へ同時にリシン及びカダベリンを輸送するタンパク質である。リシン／カダベリンアンチポーター活性の増強は、1以上の内因性リシン／カダベリンアンチポーター遺伝子の発現を増大させることにより、微生物のランダム突然変異誘発により、1以上のリシン／カダベリンアンチポーター遺伝子による微生物の形質転換により、又はリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドのリシン／カダベリンアンチポーター活性の最適化によって（例えば好ましくはリシンインポート及びカダベリンエクスポート）、あるいはそれらの任意の組み合わせによって、達成され得る。

一実施形態において、微生物のリシン／カダベリンアンチポーター活性は、配列番号11に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシン／カダベリンアンチポーター活性を有する1以上のリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチド（例えばリシン／カダベリンアンチポーター活性を有するホモログ又は変異体）の組換え発現により、増強される。

組換え発現は、例えば、1以上のリシン／カダベリンアンチポーター遺伝子の形質転換により、より高い発現活性を有する脱調節されたプロモーターを内因性リシン／カダベリンアンチポーター遺伝子に提供することにより、又はリシン／カダベリンアンチポーター遺伝子発現若しくは遺伝子産物活性の負の調節因子を低減することにより、達成され得る。

cadB遺伝子産物（本明細書中、配列番号11として開示される）のインポート又はエクスポート活性は、細胞及び発酵培地中のリシン及びカダベリン濃度に依存することが知られている。従って、機能性cadB遺伝子産物を発現する特定の微生物のリシンインポート能力は、発酵培地中のリシン濃度を増加させることにより、発酵培地の低いpH値を防止することにより、又は発酵培地中の所定のリシン濃度若しくはpH値におけるリシンインポートを促進する変異を挿入することにより、あるいはそれらの組み合わせにより、改善され得る（Soksawatmaekhin W.ら; Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli; Molecular Microbiology; 2004, volume 51,5; pp.1401-1412）。

発酵培地中の所定のリシン濃度又はpH値において大腸菌cadB遺伝子産物のリシンインポートを促進するいくつかの変異が記載されている（Soksawatmaekhin W.ら; Identification of the Cadaverine Recognition Site on the Cadaverine-Lysine Antiporter CadB; The Journal of Biological Chemistry; 2006; volume 281, 39; pp.29213-29220）。当業者であれば、他のcadBタンパク質（例えばcadBのホモログ又は変異体）における同様の変異を同定し得る。

従って、一実施形態において、リシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドは、配列番号11に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有し、かつ以下の変異：C12S、W41L、W43L、Y55L、Y57L、Y73L、Y73F、Y73W、Y89L、Y89F、Y89W、Y90L、Y90F、Y90W、Y107L、Y174L、C125S、D185N、E204Q、E204D、Y235L、Y235F、Y235W、W289L、D303N、D303E、Y310L、Y366L、Y368L、D372N、E377Q、E408Q、Y423L、Y423F及びY423Wの1以上を含むアミノ酸配列を含む。上述した変異は、cadB遺伝子産物のアミノ酸配列に基づいて命名されている。当業者であれば、これらの変異を、配列比較ツールを用いて、例えば配列アライメントを用いて、他の遺伝子産物、例えばcadB遺伝子産物と相同である遺伝子産物に移し得る。

好ましくは、配列番号11に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドは、以下の変異：W41L、W43L、Y57L、Y89L、Y107L、Y174L、D185N、E204Q、Y235L、W289L、D303N、Y366L、Y368L、D372N及びE408Qの1以上を含む。

配列番号11に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むより好ましいリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドは、以下の変異：W41L、W43L、Y57L、Y107L、Y174L、D185N、Y366L、Y368L及びE408Qの1以上を含む。

別の実施形態において、本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を含み、かつ高いリシン生産能力を有する微生物を提供する。高いリシン生産能力を有する微生物は、リシンがさらに代謝されて例えばカダベリンとならない場合に、例えば細胞内又は周囲の培地中で、リシンを富化し得る。

好ましくは、高いリシン産生能力を有する微生物は、群（i）から選択される少なくとも1つの脱調節された遺伝子を有する。この群（i）は、リシンの生合成において重要な役割を果たす遺伝子の群であり、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニル-アミノ-ケトピメレートトランスアミナーゼ、スクシニル-ジアミノ-ピメレートデスクシニラーゼ、ジアミノピメレートエピメラーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、ジアミンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子からなる。

群（i）の少なくとも1種の遺伝子が、本発明の方法に従って脱調節されていなければならない。好ましくは、群（i）の2種以上の遺伝子、例えば、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種の遺伝子が、本発明に係る微生物中で脱調節される。

群（i）の脱調節される好ましい遺伝子は、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、ジアミンアセチルトランスフェラーゼである。

群（i）の遺伝子及び遺伝子産物は、当技術分野において公知である。EP 1108790は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子中の変異を開示しており、この変異はリシンの生産における組換えコリネ型細菌の生産性に有利な効果を有する。WO 00/63388は、アスパルトキナーゼ遺伝子中の変異を開示しており、この変異はリシンの生産における組換えコリネ型細菌の生産性に有利な効果を有する。EP 1108790及びWO 00/63388は、これらの上記遺伝子中の変異に関して参照により本明細書中に組み入れられる。

全ての遺伝子/遺伝子産物についての以下の表において、各遺伝子の脱調節の可能な方法について記載する。この表の「脱調節」の列において引用される文献及び刊行物は、遺伝子の脱調節に関して参照により本明細書に組み入れられる。表に記載される方法は、各遺伝子の脱調節の好適な実施形態である。

アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニル-アミノ-ケトピメレートトランスアミナーゼ、スクシニル-ジアミノ-ピメレートデスクシニラーゼ、ジアミノピメレートエピメラーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼの遺伝子の脱調節の好適な方法は、例えば、強力な発現シグナルを用いた遺伝子増幅によって遺伝子活性を増加させる「上方」変異、及び／又は酵素活性を増強する点変異である。

ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、スクシニルCoAシンテターゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、アセチルトランスフェラーゼの遺伝子の脱調節の好適な方法は、例えば、弱い発現シグナルを用いた遺伝子欠失若しくは遺伝子破壊によって遺伝子活性を低下させる「下方」変異、及び／又は上記の酵素活性を破壊し若しくは低下させる点変異である。

アスパルトキナーゼが遺伝子群（i）のメンバーとして脱調節される場合、少なくとも第2の遺伝子（i）のメンバー（アスパルトキナーゼ以外）も脱調節されなければならない。

本発明の方法により微生物中で生産されるカダベリンのかなりの部分が後にアセチル化され得ることが観察されている（WO 2007/113127）。N-アセチルカダベリン形成ポリペプチド（N-アセチルカダベリンを生産し得る酵素活性ポリペプチドとして定義される）に起因するアセチル化反応を阻害するため、またカダベリンの収量を増大させるため、本発明の好ましい実施形態では、生産微生物のジアミンアセチルトランスフェラーゼを脱調節し、特に、例えば該遺伝子の欠失又は破壊によってその活性を低下させる。

N-アセチルカダベリン形成ポリペプチドの一例は、コリネバクテリウム・グルタミカムのアセチル-CoA依存性ジアミンアセチルトランスフェラーゼ（NP_600742タンパク質）、例えば配列番号12及び配列番号13に開示されるものである。

本発明の一実施形態において、N-アセチルカダベリン形成活性は、配列番号13に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつN-アセチルカダベリン形成活性を有する少なくとも1つのN-アセチルカダベリン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより低減されている。N-アセチルカダベリン形成活性は、WO 2007/113127に記載されているように試験され得る。

本発明の方法に従って微生物において産生されるカダベリンのかなりの部分が、アミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドによりアミノプロピルカダベリンに変換され得ることが観察されている。この反応を阻止し、カダベリンの収量を高めるために、本発明の好ましい実施形態では、生産微生物のアミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドを脱調節する、特にその活性を、例えば該遺伝子の欠失又は破壊により低減させる。

アミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドの一例は、Soksawatmaekhin W.ら; Molecular Microbiology; (2004) Vol.51,5; p.1401-1412に記載されている大腸菌のスペルミジンシンターゼ（配列番号14）である。

従って、本発明の一実施形態において、アミノプロピルカダベリン形成活性は、配列番号14に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのアミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより低減される。

リシンについての微生物の生産能力は、JP2004222569に記載されているようにカダベリン産生微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を脱調節することによって、好ましくはその活性をホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の欠失又は破壊により低減することによって改善され得ることが観察されている。

ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドの一例は、本明細書において配列番号15として開示されるコリネバクテリウム・グルタミカムのホモセリンデヒドロゲナーゼ、又は本明細書において配列番号16及び配列番号17として開示される大腸菌のホモセリンデヒドロゲナーゼである。

従って、本発明の一実施形態において、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性は、配列番号15、16又は17に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を低下させることにより低減されている。ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は、M. B. Jenkins, V.W. Woodward, Biochimica et Biophysica Acta, 1970, 212, 21-32に見出すことができる。

本発明の別の実施形態において、微生物は、脱炭酸以外により、例えばリシンヒドロキシラーゼ活性の低減により、低減されたリシン分解能力を有する。
リシンヒドロキシラーゼポリペプチドは、リシンN6-ヒドロキシラーゼ［EC:1.14.13.59］としても記載されているリシンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである。リシンヒドロキシラーゼ活性を有するかの試験は、Meneely KM, and Lamb AL BIOCHEMISTRY 46 p.11930-11937 2007、及びIJ, Hsueh LC, Baldwin JEら EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 268 p.6625-6636に見出すことができる。

一例は、大腸菌CFT073のリシンヒドロキシラーゼ iucD（配列番号 18）である。

本発明の別の実施形態において、リシン分解活性は、配列番号18のリシンヒドロキシラーゼに対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リシンヒドロキシラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を低下させることにより低減される。

本発明の別の実施形態において、微生物は、脱調節されたスペルミジン形成若しくは取り込み活性又はプトレシン形成若しくは取り込み活性、あるいはそれらの組み合わせを有する。

スペルミジン形成活性は、スペルミジンを合成可能なポリペプチドによってもたらされる。スペルミジン形成ポリペプチドの一例は、配列番号14のスペルミジンシンターゼである。

プトレシン形成活性は、プトレシンを合成可能なポリペプチドによってもたらされる。プトレシン形成ポリペプチドの一例は、大腸菌のプトレシンシンターゼspeE （例えば配列番号19に開示されるもの）、又は大腸菌のオルニチンデカルボキシラーゼspeF （例えば配列番号20に開示されるもの）である。

スペルミジン又はプトレシン取り込み活性を有するポリペプチドは、スペルミジン若しくはプトレシン又はその両方を細胞に輸送（transport）可能なポリペプチドである。スペルミジン及び／又はプトレシン取り込みポリペプチドの一例は、プトレシン/オルニチンアンチポーターとして機能する、大腸菌のpotE（例えば配列番号21に開示されるもの）である。

本発明の一実施形態において、微生物は、低減されたスペルミジン形成若しくは取り込み活性又はプトレシン形成若しくは取り込み活性を有し、
（a）スペルミジン形成活性が、配列番号14に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むスペルミジン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されるか、あるいは
（b）プトレシン形成活性が、配列番号19に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプトレシン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されるか、あるいは
（c）プトレシン形成活性が、配列番号20に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むオルニチンデカルボキシラーゼポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されるか、あるいは
（d）スペルミジン若しくはプトレシン又はスペルミジン及びプトレシン取り込み活性が、配列番号21に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むスペルミジン若しくはプトレシン又はスペルミジン及びプトレシン取り込みポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されるか、あるいは
（e）スペルミジン形成若しくは取り込み活性又はプトレシン形成若しくは取り込み活性あるいはその組み合わせが、（a）、（b）、（c）又は（d）の組み合わせの活性を低下させることにより低減される。

本発明の重要な側面は、所望の化合物であるカダベリンが生産されるように本明細書に記載の組換え微生物を育成又は培養することを含む。

従って、本発明の一実施形態は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含む微生物、並びにこの微生物の培養に好適な発酵培地（好ましくは発酵培地はリシンを含む）を含んでなるカダベリン生産系である。

カダベリン生産系は、カダベリンの生産のための技術システム、例えばカダベリン産生微生物を含む培養培地、又はリシン含有溶液若しくは培養培地とリシンデカルボキシラーゼ産生微生物である。通常、カダベリン生産系は、カダベリンの生産を支持する技術システム、例えば発酵槽を備える。

「培養（育成）する」という用語は、本発明の生きている微生物を保持し及び/又は増殖させる（例えば、培養物又は株を保持し及び/又は増殖させる）ことを包含する。一実施形態において、本発明の微生物は、液体培地中で培養される。別の実施形態において、本発明の微生物は、固形培地又は半固形培地中で培養される。好適な実施形態において、本発明の微生物は、該微生物を保持し及び/又は増殖させるために不可欠な又は有益な栄養物を含有する培地（例えば滅菌液体培地）中で培養される。

使用され得る炭素源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロースなど）、油脂（例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸など）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノールなど）、並びに有機酸（例えば、酢酸など）が挙げられる。好適な実施形態において、グルコース、フルクトース又はスクロースが、炭素源として使用される。これらの物質は、個別にあるいは混合物として使用され得る。

別の好ましい実施形態において、本明細書に記載する微生物は、キシロース、アラビノース、セロビオース又はそれらの混合物を含む液体培地、固形培地又は半固形培地中又は上で培養されるが、かかる培地は、上述したもののような他の炭素源を含んでもよいし又は含まなくてもよい。本発明の微生物を培養するための培地は、限定された数の異なる炭素源、例えば1、2、3、4、5若しくはそれ以上の炭素源のみを含み得るか、又は炭素源の非常に複雑な混合物、リグノセルロース基質若しくは農業残渣の加水分解物、例えば限定されるものではないが、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、キャッサバなどの供与源に由来するデンプンの加水分解物、又は麦わら、木材、紙若しくは植物起源の他の材料の加水分解物を含み得る。

炭素源の好ましい組み合わせは、高含量のグルコース及びキシロース、フルクトース及びキシロース、スクロース及びキシロース、又はスクロース及びグルコース、又はスクロース及びフルクトース、又はスクロース、グルコース及びフルクトース、又はスクロース、グルコース、フルクトース及びキシロース、又はグルコース、フルクトース及びキシロース、又はグルコース、フルクトース、キシロース及びアラビノース、又はスクロース、キシロース及びアラビノース、又はグルコース、キシロース及びアラビノース、並びに上述した糖の他の組み合わせを含む培地である。

培地がキシロースを含む場合には、キシロース代謝の遺伝子を発現又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。キシロース代謝の遺伝子は、例えば、キシロース輸送系の遺伝子（xylE、xylT及びxylFGH遺伝子）、キシロース利用の遺伝子（xylA及びxylB遺伝子）、並びにキシロース転写アクチベーターの遺伝子（xylR遺伝子）を含む、大腸菌のxylABFGHR遺伝子座の遺伝子である。xylABFGHR遺伝子座の遺伝子を過剰発現する微生物は、EP1577396及びEP1577369に記載されている。キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌のxylA遺伝子単独又は一緒にキシルロキナーゼをコードするxylB遺伝子を過剰発現するコリネバクテリウムは、例えばKawaguchiら（Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium gutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2006, Vol.72, 5, p.3418-3428）に記載されている。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、少なくともxylA若しくはxylB遺伝子、又はよりさらに好ましくはxylA及びxylB遺伝子を発現又は過剰発現する。

培地がアラビノースを含む場合には、アラビノース代謝の遺伝子を発現する又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。アラビノース代謝の遺伝子は、例えば、大腸菌のaraBADオペロンの遺伝子（例えば、L-アラビノースイソメラーゼ（araA）、L-リボロキナーゼ（araB）及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ（araD）をコードするaraA、araB、araD及びaraE遺伝子）、又はコリネバクテリウム・グルタミカムのaraBDAオペロンの遺伝子（araA、araB及びaraD遺伝子のホモログを含む）、L-アラビノースイソメラーゼをコードするaraE、転写調節因子をコードするaraR遺伝子、並びに推定アルドース1-エピメラーゼをコードするgalM遺伝子である。好ましくは、本発明の微生物は少なくともaraA、araB及びaraD遺伝子、より好ましくは少なくともaraA、araB、araD及びaraE遺伝子を発現又は過剰発現する（Kawaguchiら Identification and Functional Analysis of the Gene Cluster for L-Arabinose Utilization in Corynebacterium glutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75, Vol.11, p.3419-3429）。アラビノース代謝の遺伝子の大腸菌ホモログは、異種微生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムにおいても使用され得る（Kawaguchiら Engineering of an L-arabinose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 77, Vol,5, p.1053-1062）。

培地がセロビオースを含む場合には、セロビオース代謝の遺伝子を発現又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。セロビオース代謝の遺伝子は、例えば、ホスホエノールピルビン酸：炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系（PTS）ベータ-グルコシド特異的酵素IIBCA成分及びホスホル-ベータ-グルコシダーゼをコードするコリネバクテリウム・グルタミカムのbglA遺伝子である。コリネバクテリウムR株由来のこれらの遺伝子及び各タンパク質の例は、アクセッション番号AF508972に見出すことができる。

培地がキシロース、アラビノース、セロビオース又は他の炭素源の組合せを含む場合には、キシロース代謝、アラビノース代謝又はセロビオース代謝の遺伝子を発現又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。例えば、培地が高含量のキシロース及びアラビノースを有する場合には、キシロース及びアラビノース代謝の遺伝子を発現又は過剰発現する、例えばxylA及びxylB遺伝子並びにaraA、araB、araD遺伝子、好ましくはxylA及びxylB、並びにaraA、araB、araD及びaraE遺伝子を発現する微生物を使用することが有利である。

培地が高含量のキシロース及びセロビオースを有する場合には、キシロース及びセロビオース代謝の遺伝子を発現又は過剰発現する、例えばxylA及びxylB並びにbglA遺伝子を発現する微生物を使用することが有利である（Sasakiら Simultaneous utilization of D-cellobiose, D-glucose, and D-xylose by recombinant Corynebacterium glutamicum under oxygen-deprived conditions, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, Vol.81, 4, p.691-699）。

使用され得る窒素源には、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉及び尿素）、又は無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）が包含される。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用され得る。使用され得るリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウム若しくはリン酸水素二カリウム、又はこれに相当するナトリウム含有塩である。培地は、増殖に必要な金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）をさらに含むものでなければならない。最後に、上記の物質に加えて、アミノ酸及びビタミンなどの必須の増殖促進物質も使用され得る。好適な前駆物質が、本発明の培地にさらに添加され得る。上記の供給物質（feed substance）は、単一バッチとして培地に添加され得るか、あるいは培養中に適切に供給され得る。

好ましくは、本発明の微生物は、制御されたpH下で培養される。「制御されたpH」という用語は、所望のファインケミカル（例えばカダベリン）の生産を生じさせる任意のpHを包含する。一実施形態において、微生物は、pH約7で培養される。別の実施形態において、微生物は、pH6.0〜8.5で培養される。所望のpHは、任意の数の当業者に公知の方法で維持され得る。例えば、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、若しくはアンモニア水）、又は酸性化合物（例えば、リン酸若しくは硫酸）が、培地のpHを適切に制御するために用いられる。

また好ましくは、本発明の微生物は、制御された通気下で培養される。「制御された通気」という用語は、所望のファインケミカル（例えば、カダベリン）の生産を生じさせるのに十分な通気（例えば、酸素）を包含する。一実施形態において、通気は、培地中の酸素レベルを調節することによって（例えば、培地中に溶解している酸素量を調節することによって）制御される。好ましくは、培地の通気は、培地を攪拌することによって制御される。攪拌は、プロペラ又は同様の機械式攪拌装置によって、増殖容器（例えば発酵槽）を回転又は振とうさせることによって、あるいは多様なポンプ装置によって提供され得る。通気は、無菌空気又は酸素を培地に通す（例えば、発酵混合物に通す）ことによってさらに制御され得る。また好ましくは、本発明の微生物は、（例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を添加することによって）過剰な発泡を伴わずに培養される。

さらに、本発明の微生物は、制御された温度下で培養され得る。「制御された温度」という用語は、所望のファインケミカル（例えば、カダベリン）の生産を生じさせる任意の温度を包含する。一実施形態において、制御された温度は、15℃〜95℃の温度を包含する。別の実施形態において、制御された温度は、15℃〜70℃の温度を包含する。好適な温度は20℃〜55℃、さらに好ましくは30℃〜45℃、又は30℃〜50℃である。

微生物は、液体培地中で培養（例えば、保持及び/又は増殖）され得、好ましくは、静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、回転振盪培養、振盪フラスコ培養等）、通気攪拌培養、又は発酵などの従来の培養法で連続的又は断続的に培養される。好適な実施形態において、微生物は、振盪フラスコで培養される。さらに好適な実施形態において、微生物は、発酵槽中で培養される（例えば、発酵法）。本発明の発酵法としては、限定されるものではないが、バッチ法、フェドバッチ法及び連続発酵法が挙げられる。「バッチ法」又は「バッチ発酵」という表現は、培地、栄養素、補助添加剤等の組成が発酵開始時に設定されていて、発酵中には変更されないが、pH及び酸素濃度などの因子を制御して培地の過剰な酸性化及び/又は微生物の死滅を防ぐ試みをなし得る閉鎖系を意味する。「フェドバッチ法」又は「フェドバッチ」発酵という表現は、発酵の進行に伴って1以上の基質又は栄養補助剤が添加される（例えば、徐々に又は連続的に添加される）点を除いて、バッチ発酵を意味する。「連続法」又は「連続発酵」という表現は、好ましくは所望のカダベリンの回収のために、規定の発酵培地を発酵槽に連続的に添加し、同量の使用済み又は「調整」培地を同時に除去する系を指す。このような多様な方法が開発されており、当技術分野において周知である。

本発明の方法は、カダベリンを回収するステップをさらに含み得る。カダベリンを「回収する」という用語は、該化合物を培地から抽出し、採取し、単離し、又は精製することを包含する。化合物の回収は、任意の当技術分野において公知の従来の単離法又は精製法に従って実施され得、このような方法として、限定されるものではないが、慣用の樹脂（例えば、アニオン又はカチオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂等）を用いた処理、慣用の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）を用いた処理、pHの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、へキサン等の慣用の溶媒を用いた抽出）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥等が挙げられる。例えば、カダベリンは、まず培地から微生物を除去することによって回収され得る。次いで、バイオマスを除去したブロスをカチオン交換樹脂に通液させて不要なカチオンを除去し、その後、アニオン交換樹脂に通液させて不要な無機アニオン及びカダベリンより酸性度の強い有機酸を除去する。さらに、ブロスを苛性薬剤（caustic agent）で処理して、相分離によりアルコールなどの有機溶媒を用いてカダベリンを抽出し得る。カダベリンは、蒸留によって抽出された相から種々の用途に十分な純度で回収され得る。可能性ある用途としては、有機ジカルボン酸を用いた重縮合によるポリアミドの生産が挙げられる。

従って、別の側面において、本発明は、カダベリン生産のための、上記ステップを含むポリアミド（例えばナイロン^TM)の生産方法を提供する。カダベリンを、公知の方法で、ジカルボン酸、トリカルボン酸、又はポリカルボン酸と反応させてポリアミドを得る。好ましくは、カダベリンを、4〜10個の炭素を含むジカルボン酸（例えば、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）と反応させる。上記のジカルボン酸は、好ましくは遊離酸である。

本発明の微生物は、これらの微生物を発酵させることによりカダベリンを生産するために有用であり、ここでは培養で微生物を増殖させる、好ましくは上述したような培養条件下で微生物を増殖させる。

従って本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含む微生物を発酵させることを含んでなるカダベリンの生産方法を含む。好ましくは、本方法は、培養培地からカダベリンを回収することを含む。

一実施形態において、微生物は、増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性を含む、例えば微生物は、配列番号11に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有し、かつリシン／カダベリンアンチポーター活性を有するポリペプチド（例えば、リシン／カダベリンアンチポーター活性を有するホモログ又は変異体）を過剰発現するものであり、本方法は、リシンを含む培地中で上記微生物を発酵させることを含む。好ましくは、培養培地は、0.1mMを超える、又は0.5mMを超える、又は1mMを超える、又は3mMを超える、又は5mMを超える、又は7mMを超える、又は8mMを超える、又は9mMを超える、又は10mMを超えるリシンを含む。より好ましくは、培養培地は15mMを超えるリシンを含む。よりさらに好ましくは、培養培地は20mMを超えるリシンを含む。最も好ましくは、培養培地は30mMを超えるリシンを含む。

別の実施形態において、微生物は、細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性を含む。

本発明の別の実施形態は、カダベリンの生産方法であって、培養培地中のカダベリンの濃度（mol/l）が、N-アセチルカダベリン若しくはアミノプロピルカダベリン又はその両方の濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、又は1.3倍を超えて高い、又は1.4倍を超えて、又は1.5倍を超えて、又は1.6倍を超えて、又は1.7倍を超えて、又は1.8倍を超えて、又は1.9倍を超えて、又は2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍を超えて高い方法である。本発明の別の実施形態は、上記方法において製造される培養培地である。

上述した方法により生産されるカダベリンは、カダベリン（DAP）を含む発酵ブロス（すなわち、カダベリンの生産過程が完了又は停止した後の状態の培養培地）の仕上げ（work up）により回収又は精製され得る。

以下に記載する発酵ブロスからカダベリンを回収又は精製する方法は、単に例示理由のためである。当業者には、同様にうまく適用可能な、以下に記載する方法の別の方法又は変法が知られている。

生産されたカダベリンを回収するために、発酵ブロスを濃厚化又は濃縮することが有利である。発酵ブロスは、公知の方法、例えばロータリーエバポレーター、薄膜式エバポレーター、流下膜式エバポレーターを用いて、逆浸透により、又はナノ濾過により、濃厚化又は濃縮され得る。必要に応じて、濃縮手順によって沈殿し得る塩を、例えば濾過又は遠心分離により除去し得る。その後、この濃縮発酵ブロスは本発明の方法では、カダベリンを得るために仕上げ処理（work up）を行う。本発明における仕上げ処理のために、このような濃縮手順が実行可能であるが、必ず必要なものではない。

本発明において、カダベリンは有機抽出剤を用いて発酵ブロスから抽出される。より具体的には、できる限り極性が高く、アルカリpHにおいて安定な、水との混和性の差（miscibility gap）がある有機溶媒、例えば特に極性、双極性のプロトン性有機溶媒を使用する。好適な溶媒は、特に3〜8個の炭素原子を有する、環状又は開環状の、任意に分枝状のアルカノール、特にn-及びイソプロパノール、n-、sec-及びイソブタノール、又はシクロヘキサノール、並びにn-ペンタノール、n-ヘキサノール、n-ヘプタノール、n-オクタノール、2-オクタノール、及びこれらの一分枝状若しくは多分枝状異性体である。ここで、特にn-ブタノールについて言及する。

好ましい実施形態において、抽出及び／又は続く相分離は、水及び抽出剤又は場合により形成する共沸混合物の沸点により制限される高温においてバッチ式で行う。抽出剤としてn-ブタノールを使用する場合には、抽出及び相分離を、例えば約25〜90℃、又は好ましくは40〜70℃で、行い得る。抽出のため、分配平衡が確立されるまで、例えば10秒から2時間の期間にわたって、好ましくは5〜15分間にわたって、2つの相を撹拌する。続いて、相が完全に分離するまで相を放置し、これは好ましくは10秒から5時間、例えば15〜120分、又は30〜90分、特にn-ブタノールの場合には、約25〜90℃又は40〜70℃の範囲の温度で行う。

別の好ましい実施形態において、カダベリンを、多段階プロセス（例えば混合槽-沈殿槽の組み合わせ）において連続的に、又は抽出カラム中で連続的に、発酵ブロスから抽出する。

当業者であれば、慣用の最適化技法の一部として、各場合に分離しようとする相のために本発明において使用可能な抽出カラムの構成を確立し得る。好適な抽出カラムは、原理的には、電源入力を有しないもの、又は電源入力を有するもの、例えばパルスカラム又は回転内部構造物を有するカラムである。当業者であれば、また慣用の技法の一部として、好適な方法で、相分離を最適化するために、内部構造物の種類及び材料、例えばふるいトレイ及びカラムトレイを選択し得る。小分子の液液抽出の基本的な理論は周知である（例えばH.-J. Rehm and G. Reed(編) (1993), Biotechology, Volume 3 Bioprocessing, Chapter 21, VCH, Weinheim参照）。工業的に適用可能な抽出カラムの構成は、例えばLoら編, (1983) Handbook of Solvent Extraction, JohnWiley& Sons, New Yorkに記載されている。上記テキストブックの開示内容に関して明示的に参照する。

相分離後、カダベリンを、それ自体は公知の方法によりカダベリンを含む抽出相から単離及び精製する。カダベリンを回収する可能な手段は、特に、限定されるものではないが、蒸留、好適な有機若しくは無機酸を用いた塩としての沈殿、又はこれらの好適な手段の組み合わせである。

蒸留は、連続的に又はバッチ式で行い得る。単一の蒸留カラム又は互いに連結された複数の蒸留カラムを用い得る。蒸留カラム装置の構成及び実行パラメータの設定は、当業者の責任である。各場合に用いる蒸留カラムは、それ自体は公知の方法により設計し得る（例えば、Sattler, Thermische Trennverfahren [Thermal separation methods], 2nd Edition 1995, Weinheim, p.135ff；Perry’s Chemical Engineers Handbook, 7th Edition 1997, New York, Section 13参照）。従って、使用する蒸留カラムは、分離に有用な内部構造物、例えば分離トレイ（例えば有孔トレイ、バブルキャップトレイ又はバルブトレイ）、配列されたパッキング材（例えばシートメタル若しくは織物パッキング、又はランダムベッドのパッキング）を備え得る。使用するカラムに必要なプレートの数、及び還流比は、必要な純度、分離しようとする液体の相対沸騰位置によって本質的に決まり、当業者であれば公知の方法によりこれらの具体的な設計及び実行データを確定し得る。

塩としての沈殿は、好適な有機又は無機酸、例えば硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、ギ酸、炭酸、シュウ酸などを添加することにより行い得る。別の好ましい実施形態において、有機ジカルボン酸を用いて、塩を形成し、これを直接に又は例えば再結晶による精製後に、続く重縮合に使用して、ポリアミドを得ることができる。より具体的には、そのようなジカルボン酸はC₄-C₁₂-ジカルボン酸である。

抽出手順において生成された有機カダベリン相はまた、クロマトグラフィーにより仕上げ処理し得る。クロマトグラフィーのため、カダベリン相を適当な樹脂、例えば強い又は弱い酸性イオン交換体（Lewatit 1468 S、Dowex Marathon C、Amberlyst 119 Wetなど）にアプライし、所望の生成物又は混入物を部分的に又は完全にクロマトグラフィー樹脂に保持させる。これらのクロマトグラフィーステップは、必要に応じて、同じ又は他のクロマトグラフィー樹脂を用いて反復して行い得る。当業者であれば、適当なクロマトグラフィー樹脂の選択及びそれらの最も効率的な適用に精通している。精製された生成物は、濾過又は限外濾過により濃縮し、適当な温度で保存し得る。

単離された化合物の同一性（identity）及び純度は、従来の技術により決定し得る。これには、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、分光法、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイ又は微生物学的アッセイが含まれる。これらの分析法は、Patekら(1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140；Malakhovaら(1996) Biotekhnologiya 11 27-32；及びSchmidtら(1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol.A27, VCH: Weinheim, pp.89-90, pp.521-540, pp.540-547, pp.559-566, 575-581及びpp.581-587；Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons；Fallon, A.ら(1987) Applications of HPLC in Biochemistry: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.17にまとめられている。

上述した方法により生産し回収又は精製されたカダベリンは既知の技術によりポリアミドを生成するために使用し得るため、これらのポリアミドは本発明の別の実施形態を構成する。

以下の非限定的な実施例に基づき、添付の図面を参照しながら、本発明をより詳細に説明する。

株及びプラスミド
ジアミノペンタン生産株であるコリネバクテリウム・グルタミカムDAP-3は、リシンデカルボキシラーゼ発現のコドン最適化によって、コリネバクテリウム・グルタミカム11424から合理的に派生した（Kind, S., Jeong, W. K., Schroder, H. and Wittmann, C. (Kind et al., 2010a) "Systems-wide metabolic pathway engineering in Corynebacterium glutamicum for bio-based production of diaminopentane." Metab Eng.; and Kind, S., Jeong, W. K., Schroder, H., Zelder, O. and Wittmann, C. (Kind et al. 2010b). "Identification and elimination of the competing N-acetyldiaminopentane pathway for improved production of diaminopentane by Corynebacterium glutamicum." Appl Environ Microbiol 76(15), 5175-80）。本研究においては、両方の株を用いた。株の構築の為に、大腸菌DH5α及びNM522株（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）並びにプラスミドpTc及びpClik int sacBを、以前記載した通りに（Kind et al., 2010a）用いた。

培地
第一のプレ培養物を、完全培地で増殖させた（Kind et al., 2010a）。第二のプレ培養物及びその後の主培養物のために、最小限の培地を適用した（Becker, J., Klopprogge, C. and Wittmann, C.（2008）（Becker et al., 2008） "Metabolic responses to pyruvate kinase deletion in lysine producing Corynebacterium glutamicum." Microb Cell Fact 7, 8）。

培養
全ての培養をロータリーシェーカー（振盪直径5cm, Multitron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland）において、30℃及び230 rpmで行った。第一のプレ培養物のために、単一のコロニーを接種材料として用いた。約8時間インキュベーションした後、細胞を遠心（8800×g、2分、4℃）により回収し、無菌5% NaCl溶液により2回洗浄し、その後第二のプレ培養のための接種材料として（500mLのバッフル付きフラスコに50mL）用いた。細胞を対数増殖期において上記と同じ条件で回収し、三連で行う主培養のための接種材料として（500mLのバッフル付きフラスコに50mL）用いた。培養の間、pHを7.0±0.2で一定に保った。

化学物質
トリプトン、牛肉抽出物、酵母抽出物、及び寒天を、Difco Laboratories（Detroit, USA）から入手した。他の全ての物質は分析グレードであり、Aldrich（Steinheim, Germany）、Merck（Darmstadt, Germany）、又はFluka（Buchs, Switzerland）から入手した。

コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子組み換え
プラスミドDNAの構築、精製、及び分析、並びにE. coli及びC. glutamicumの形質転換は、以前に記載した通りに行った（Kind et al., 2010a）。野生型のC. glutamicumプロモーターの遺伝子の標的欠損及び変換は、近年記載された通りに行った（(Bolten, C. J., Schr, H., Dickschat, J. and Wittmann, C. (2010) (Bolten et al., 2010). "Towards methionine overproduction in Corynebacterium glutamicum - methanethiol and dimethyldisulfide as reduced sulfur sources." J Microbiol Biotechnol 20(8), 1196-203.; Dickschat, J. S., Wickel, S., Bolten, C. J., Nawrath, T., Schulz, S. and Wittmann, C. (2010) (Dickschat et. 2010). "Pyrazine Biosynthesis in Corynebacterium glutamicum." European Journal of Organic Chemistry 2010(14), 2687-2695. al.)）。手短に言うと、遺伝子を、短くした遺伝子断片によるコード領域の置換によって、欠失させた。ゲノムベースの発現増幅のために、対応する野生型のプロモーターを、sod遺伝子の強力なプロモーター（NCgl2826）によって置換した（Becker, J., Klopprogge, C., Herold, A., Zelder, O., Bolten, C. J. and Wittmann, C. (2007) (Becker et al., 2007). "Metabolic flux engineering of L-lysine production in Corynebacterium glutamicum-over expression and modification of G6P dehydrogenase." J Biotechnol.）。この目的のために、C. glutamicum中では複製できない組み込みプラスミドpClik int sacBを用いた（Becker, J., Klopprogge, C., Zelder, O., Heinzle, E. and Wittmann, C. （2005）（Becker et al., 2005）"Amplified Expression of Fructose 1,6-bisphosphatase in Corynebacterium glutamicum increases in vivo flux through the pentose phosphate pathway and lysine production on different carbon sources." Appl Environ Microbiol 71(12), 8587-8596）。C. glutamicum中で複製するプラスミドpClik 5a MCSを、プラスミドベースの遺伝子の過剰発現のために、tuf遺伝子（NCgl0480）のプロモーターと共に利用した（Kind et al., 2010a）。遺伝子の修飾は、PCRにより確認した。遺伝子変更の構築及び確認のために用いたプライマーを、表２にリストアップした。

表２：野生型及びそれに由来する突然変異体遺伝子、対応する修飾、並びにC. glutamicumの突然変異体株における対立遺伝子の置換のPCRによる構築（1〜4／6）及び確認（1、4／6）のために用いた部位特異的プライマーの配列

基質及び産物の分析
グルコースの濃度を、1:10に希釈した培養上清において、グルコース分析装置（2300 STAT Plus, Yellow Springs Instrument, Ohio）によって定量化した。トレハロース及び有機酸を、1:10に希釈した培養上清において、Aminex HPX-87H column（300×7.8 mm; Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を固定相として、及び12.5 mM H₂SO₄を移動相として用いるHPLC（LaChrom Elite, VWR Hitachi, West Chester, PA, USA）により、0.5mL min^-1及び40℃で定量化した。検出は、UV光の220nm（有機酸）及び屈折率（トレハロース）を用いて、それぞれ行った。細胞濃度の測定を、660 nmでの光学密度として及び細胞の乾燥質量として、以前記載した通りに行った（Kiefer, P., Heinzle, E., Zelder, O. and Wittmann, C. (2004) (Kiefer et al., 2004). "Comparative metabolic flux analysis of lysine-producing Corynebacterium glutamicum cultured on glucose or fructose." Appl Environ Microbiol 70(1), 229-39）。（1:10に希釈した）培養上清及び細胞抽出物におけるアミノ酸の定量化を、HPLCにより行った（Kromer, J. O., Fritz, M., Heinzle, E. and Wittmann, C. (2005). (Kromer et al., 2005) "In vivo quantification of intracellular amino acids and intermediates of the methionine pathway in Corynebacterium glutamicum."）。同方法を、溶出グラジエントの変更によって、1,5-ジアミノペンタン及びN-アセチル-1,5-ジアミノペンタンをはじめとする生物学的ポリアミンの定量化に適合させた（Kind et al., 2010a）。

細胞内代謝産物の分析
細胞内代謝産物のサンプリングを、高速濾過及び煮沸水での抽出により行った（Wittmann, C., Kromer, J. O., Kiefer, P., Binz, T. and Heinzle, E. (2004) (Wittmann et al., 2004). "Impact of the cold shock phenomenon on quantification of intracellular metabolites in bacteria." Anal Biochem 327(1), 135-9.; Bolten et al., 2007）。これは、代謝産物の漏出を防ぐために培養培地のイオン強度を調和させる、フィルターにおける15 mLの5%NaCl溶液による細胞の洗浄ステップを含む(Bolten et al., 2007)。

RNA抽出及び遺伝子発現の分析
対数増殖期の細胞からの全RNA抽出を、以前記載した通りに行った（Kind et al., 2010b）。遺伝子発現の比較分析のために、カスタムDNAマイクロアレイを、オンラインソフトウェアのアジレントeアレイ（Agilent eArray）を用いて、C. glutamicumのゲノムNC_006958から設計した。対象遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブの設計、蛍光ラベリング、ハイブリダイゼーション、スキャン及びデータ処理を、Kind et al.（2010b）に記載された通りに行った。これらの実験において用いられたカスタムDNAマイクロアレイは、3057のオープンリーディングフレームのそれぞれに対し最大5つの複製物を有する14363のプローブを含んでいた。

リシンデカルボキシラーゼ活性
リシンデカルボキシラーゼの活性を、粗細胞抽出物において測定した。該細胞抽出物の調製、タンパク質濃度の測定、及びリシンデカルボキシラーゼ活性の測定を、以前に記載した通りに行った（Kind et al., 2010a）。酵素反応速度の実験の為に、ジアミノペンタンを反応混合物に、それぞれ10、15、20、30、及び35mmol L^-1の終濃度で添加した。

C. glutamicumで発現されたリシンデカルボキシラーゼの反応速度特性
第一の重要な研究が、産物の排出が生産の潜在的ボトルネックとして一般に妥当であることを明らかにした。該研究は、リシンデカルボキシラーゼの反応速度特性、特にその最終産物であるジアミノペンタンによる阻害の側面に注目した。この目的のために、C. glutamicum DAP 3-cの対数増殖期の粗細胞抽出物を得、このジアミノペンタン生産株において発現されたリシンデカルボキシラーゼの活性をアッセイした。in vitroのリシンデカルボキシラーゼの比活性は、97.0±3.5mmol g^-1 h^-1であった。これは、培養培地におけるジアミノペンタン及びN-アセチルジアミノペンタンの蓄積から計算されるin vivoの産物比流速1.07±0.02mmol g^-1 h^-1よりも、ほぼ100倍高い。明らかに、リシンデカルボキシラーゼの有効な触媒能力のわずかな部分のみしか、産物の形成に関与していなかった。

どの程度、これが最終産物による酵素の阻害と関係しているか分析するために、その比活性を様々なジアミノペンタン濃度でさらに測定した。明らかに、リシンデカルボキシラーゼの比活性は、ジアミノペンタン濃度の増加により、激しく減少した（図1）。その後、この阻害の関連性を、生産株における対応する細胞内ジアミノペンタンレベルの定量化により評価した。周囲の培地を完全に取り除く適切な高速濾過法を用いて、三つの生物学的複製物から測定されたジアミノペンタンの細胞内プールの濃度は、20.3±1.6mMであった。これらの条件において、in vitroでのLdcC活性は約40%減少する（図1）。これは、生合成経路の最終ステップが、細胞内産物レベルの上昇によってin vivoにおいて有意に阻害されることを示唆し、かつ、産物の排出が有用な代謝工学的標的として妥当であることを明らかにした。一又は幾つかのこれまで未知のエクスポートタンパク質を含む活動的な輸送プロセスは、おそらく細胞質の中性pHにおけるジアミノペンタンの化学特性、すなわちその高い正電荷に依存するように思われる。

ジアミノペンタン排出の潜在的候補物質の同定
潜在的なコード遺伝子の同定のために、全ゲノムでの転写プロファイリングを行った。この目的のために、全遺伝子発現のパターンを、ジアミノペンタンを生産するC. glutamicum DAP-3cと、その親株であり、リシンを生産するがジアミノペンタンを生産しないC. glutamicum 11424で比較した。分析のために、RNAを対数増殖期、すなわち光学密度3において回収した細胞から抽出した。RNAを、参照については4つの生物学的複製物から、DAP-3cについては7つの生物学的複製物から、それぞれ得た。参照RNAを、ラベリング及び全ゲノムマイクロアレイへの競合的ハイブリダイゼーションの前まで保管した。

分析され、かつ統計的に処理された3000の遺伝子の中で、約35の遺伝子がジアミノペンタン生産株において、統計的に有意な発現上昇を示した（表3）。これらは様々な機能的カテゴリーに属し、最も興味深いことに、様々なトランスポーターを含んでいた。発現上昇したトランスポーターのうち、4つは鉄及び糖の輸送に関与していると考えられ、従って目的の機能に関係がなかった。

しかしながら、5つのオペロンに属する7つの遺伝子は、これまで特徴づけられていない輸送系を意味していた。それらは、ジアミノペンタンの排出の潜在的候補物質を示した。関連するトランスポーターとして、ABCトランスポーター（cg2181及びcg2184）及びパーミアーゼ（cg2893）並びにそのレギュレーター（cg2894）が挙げられる。さらに、トランスポートレギュレーターAsnCファミリーの調節タンパク質（cg2942）、LysE型トランスロケーターのレギュレーター（cg2941）が発現上昇した。全ての候補物質の中で、パーミアーゼにおいて、最も高い発現上昇が認められた（表3）。この遺伝子は、ファシリテーターのスーパーファミリーに属し、ジアミノペンタンの排出を試験する最初の候補物質として選択された。リシンエクスポーターのlysEの発現が約3-8倍減少したことも、言及されるべきである。上記遺伝子に加え、5つの遺伝子が、これまで未知の機能を有するタンパク質をコードしていた。

表3：リシンを生産するC. glutamicum 11424とジアミノペンタンを生産するC. glutamicum DAP-3cの、比較トランスクリプトーム分析。各株につき少なくとも4つの生物学的複製物に由来するデータは、DAP-3c株に対する11424株の発現比として表され、有意に発現上昇した遺伝子を含む。有意に異なる発現比として考慮する下限を、1.7とした。輸送に機能的に関連する遺伝子は、太字で強調した。

推定ジアミノペンタンエクスポーターcg2983の標的欠失
主要なファシリテータースーパーファミリーパーミアーゼをコードする遺伝子であるcg2893を潜在的候補遺伝子として最初に欠失させた。この目的のために、コード領域の659bpが欠如している短くした断片による標的遺伝子のマーカーフリー置換を可能とする組み換えプラスミドを構築した。第二の組み換え由来のクローンにおいて、プライマーcg2893-1及びcg2893-4（表1）を用いて、部位特異的PCRにより所望の欠失を確認した。陽性クローンを、野生型に起因する1329bpの長さの断片から明確に区別できる、短くなった670bpのPCR産物により同定した。パーミアーゼを欠如している欠失変異体を、親株と比較した。本研究では、グルコースの最小培地における培養、それに続くブロスにおける産物スペクトルの分析を行った。パーミアーゼを欠如している株において、ジアミノペンタン分泌の実質的低減が認められた（図2、表4）。200mmol（mol^-1グルコース）から32mmol（mol^-1グルコース）へのジアミノペンタン収量の低減は、84%の減少に相当した。明らかに、パーミアーゼcg2893がC. glutamicumにおけるジアミノペンタンの主要なエクスポーターであることを示した。その機能的役割に基づいて、パーミアーゼcg2893をジアミノペンタンエクスポーターdapEと名付けた。興味深いことに、dapE欠失のN-アセチル-ジアミノペンタンの排出に対する影響は、かなり異なるものであった。命名したC. glutamicum・dapEにおいて、産物のアセチル化バリアントは、まだ有意に排出されていた（図2、表4）。これは、同定されたエクスポートタンパク質が、ジアミノペンタンに対しかなり特異的であるが、N-アセチルジアミノペンタンに対してはそうでないことを明確に示す。親株におけるのと同様に、リシン分泌は無視できる程度であった。ジアミノペンタン排出が、パーミアーゼの欠失によって完全に機能しなくなってはいないことに留意されたい。これは、この酵素が主要であるが、排他的な排出系ではないことを示す。

表４：単一の炭素源としてグルコースを含む最小培地における、ジアミノペンタンを生産するC. glutamicum DAP-3c、_deltadapE、及び_deltadapE _deltalysEの増殖及び生産特性

ジアミノペンタン排出におけるリシンエクスポーターLysEの機能的役割
主要なジアミノペンタンエクスポーターが欠如しているC. glutamicum _deltadapEは、なお培地へのジアミノペンタンの分泌を示した。これは、他のジアミノペンタンエクスポートタンパク質の存在を示した。ジアミノペンタンとその前駆物質であるリシンとの構造類似性により、リシンエクスポーターLysEを、可能性のある候補遺伝子として、さらに試験した。lysEをコードする遺伝子を、C. glutamicum _deltadapEにおいて欠失させた。しかしながら、最小培地におけるC. glutamicum _deltadapE _deltalysE二重欠失変異体の増殖及び生産特性は、その親株に対し、なんら有意な差を示さなかった（表4）。これは、LysEがジアミノペンタンの排出に関与しないことを示す。

dapEの増幅によるジアミノペンタン産物の代謝工学
新規なエクスポーターdapEが、ジアミノペンタンの生産の増加にとっての有望な代謝工学的標的として浮かび上がった。dapEは、最も良好な生産株C. glutamicum DAP-3cにおいて、増幅された。これはゲノムベースの過剰発現によってなされた。この目的のために、野生型のdapEプロモーターをスーパーオキシドジスムターゼの強力なプロモーター（sod）によって置換した。dapEの開始コドンの直前へのsodプロモーターのマーカーフリーな組み込みを可能とするプラスミドを、プライマーP_sod2893-1〜P_sod2893-6（表２）を用いて構築した。sodプロモーターをその遺伝子の上流配列と開始コドンの間に有する陽性クローンを、野生型と比較して200bpの延長されたPCR断片に基づいて、PCRにより確認した。得られた突然変異体を、C. glutamicum P_soddapEと名付けた。

図2は、排出の変更の影響を示す。全体として、dapEの増幅は、有意に増強された産物分泌をもたらした。DAP-3cに比較して、P_soddapEではジアミノペンタンの収量が240mmol（molグルコース）^-1まで、20%増強された（図2）。比生産性（q_DAP）は、1.1 mmol g^-1 h^-1まで、実に40%増加した。有益な副次的効果として、N-アセチル-ジアミノペンタンの形成は75%以上減少し、これは産物の望ましくないアセチル化が、最適な排出により低減されることを示す。さらに、エクスポーター変異体は、より高い比増殖率（0.25に対し0.30 h^-1）及び高い比グルコース取り込み率（4.2に対し4.5 mmol g^-1 h^-1）により反映される、より高い生存率を示した（図2、表4）。バイオマス収率は、両方の株において、ほぼ同様であった。他の副産物もまた同様である。トレハロース、乳酸塩、グリシン、アラニン、グルタミン酸、及びαケトグルタル酸は全てかなり低い量生じたが、影響されなかった。全体として、dapEの発現が増加した変更された突然変異体は、重要な産物特性の優れた改善を示した。さらに試験された、tufプロモーターの制御下におけるプラスミドベースのdapEの過剰発現が、実質的に細胞増殖の遅延（μ=0.18 h^-1）及びわずかに低減したジアミノペンタン収率（Y_Dap/S＝192mmol（molグルコース）^-1）をもたらしたことも言及されるべきである。

dapEの遺伝子配列及びポリペプチド配列を、以下に開示する：
dapE遺伝子配列:
atgacttcagaaaccttacaggcgcaagcgcctacgaaaacccaacgttgggctttcctcgccgttatcagcggtggtctctttctgatcggtgtagacaactcgattctctacaccgcactccctctgctgcgtgaacagctcgcagccaccgaaacccaagcgttgtggatcatcaacgcatatcccctgctcatggcgggccttcttttgggtaccggcactttgggtgacaaaatcggccaccgccggatgttcctcatgggcttgagcattttcggaatcgcttcacttggtgctgcgtttgctccaactgcgtgggctcttgttgctgcgagagctttccttggcatcggtgcggcaacgatgatgcctgcaaccttggctctgatccgcattacgtttgaggatgagcgtgagcgcaacactgcaattggtatttggggttccgtggcaattcttggcgctgcggcaggcccgatcattggtggtgcgctgttggaattcttctggtggggttcggttttcctcattaacgttccggtggctgttatcgcgttgatcgctacgctttttgtggcgccggccaatatcgcgaatccgtctaagcattgggatttcttgtcgtcgttctatgcgctgctcacacttgctgggttgatcatcacgatcaaggaatctgtgaatactgcacgccatatgcctcttcttttgggtgcagtcatcatgttgatcattggtgcggtgttgtttagcagtcgtcagaagaagatcgaggagccacttctagatctgtcgttgttccgtaatcgccttttcttaggcggtgtggttgctgcgggcatggcgatgtttactgtgtccggtttggaaatgactacctcgcagcgtttccagttgtctgtgggtttcactccacttgaggctggtttgctcatgatcccagctgcattgggtagcttcccgatgtctattatcggtggtgcaaacctgcatcgttggggcttcaaaccgctgatcagtggtggttttgctgccactgccgttggcatcgccctgtgtatttggggcgcgactcatactgatggtttgccgtttttcatcgcgggtctattcttcatgggcgcgggtgctggttcggtaatgtctgtgtcttccactgcgattatcggttccgcgccggtgcgtaaggctggcatggcgtcgtcgatcgaagaggtctcttatgagttcggcacgctgttgtctgtcgcgattttgggtagcttgttcccattcttctactcgctgcatgccccggcagaggttgcggataacttctcggcgggtgttcaccacgcgattgatggcgatgcggcgcgtgcatctttggacaccgcatacattaacgtgttgatcattgccctagtatgcgcagtagcggctgctctgatcagcagttaccttttccgcggaaatccgaagggagccaataatgcgcactag
dapEタンパク質の配列:
MTSETLQAQAPTKTQRWAFLAVISGGLFLIGVDNSILYTALPLLREQLAATETQALWIINAYPLLMAGLLLGTGTLGDKIGHRRMFLMGLSIFGIASLGAAFAPTAWALVAARAFLGIGAATMMPATLALIRITFEDERERNTAIGIWGSVAILGAAAGPIIGGALLEFFWWGSVFLINVPVAVIALIATLFVAPANIANPSKHWDFLSSFYALLTLAGLIITIKESVNTARHMPLLLGAVIMLIIGAVLFSSRQKKIEEPLLDLSLFRNRLFLGGVVAAGMAMFTVSGLEMTTSQRFQLSVGFTPLEAGLLMIPAALGSFPMSIIGGANLHRWGFKPLISGGFAATAVGIALCIWGATHTDGLPFFIAGLFFMGAGAGSVMSVSSTAIIGSAPVRKAGMASSIEEVSYEFGTLLSVAILGSLFPFFYSLHAPAEVADNFSAGVHHAIDGDAARASLDTAYINVLIIALVCAVAAALISSYLFRGNPKGANNAH

Claims (14)

1. 増強されたカダベリンエクスポーター活性を含む、微生物であって、増強されたカダベリンエクスポーター活性が、配列番号1と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む1以上のカダベリンエクスポーターポリペプチドの脱調節に少なくとも部分的によるものである、微生物。
2. リシンデカルボキシラーゼ活性が増強されている、請求項１に記載の微生物。
3. リシンデカルボキシラーゼ活性が、配列番号3又は4と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む1以上のリシンデカルボキシラーゼポリペプチドの発現によるものである、請求項２に記載の微生物。
4. アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニル-アミノ-ケトピメレートトランスアミナーゼ、スクシニル-ジアミノ-ピメレートデスクシニラーゼ、ジアミノピメレートエピメラーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼの遺伝子からなる群より選択される、少なくとも一つの上方調節された遺伝子、及び／又は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、ジアミンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子からなる群より選択される、少なくとも一つの下方調節された遺伝子を有する、請求項２又は３に記載の微生物。
5. 増強されたリシンインポート活性を有する、請求項１〜４のいずれか1項に記載の微生物。
6. 増強されたリシンインポート活性が、低減されたリシンエクスポーター活性若しくは増強されたリシンパーミアーゼ活性若しくは増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性、又はそれらの組み合わせによるものである、請求項５に記載の微生物。
7. 増強されたリシンインポート活性が、配列番号5と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも一つのリシンエクスポーターポリペプチドの低減された活性によるものである、請求項５又は６に記載の微生物。
8. 増強されたリシンインポート活性が、増強されたリシンパーミアーゼ活性によるものであるか若しくは増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性によるものであるか、又はその両方である、請求項５〜７のいずれか1項に記載の微生物。
9. 微生物が、脱調節されたN-アセチルカダベリン形成活性を有する、請求項１〜８のいずれか1項に記載の微生物。
10. N-アセチルカダベリン形成活性がないか、又は低減されている、請求項９に記載の微生物。
11. N-アセチルカダベリン形成活性が、配列番号13と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むN-アセチルカダベリン形成ポリペプチドの活性の脱調節により脱調節される、請求項９又は１０に記載の微生物。
12. コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の微生物。
13. 請求項１〜１２のいずれか1項に記載の微生物を発酵させることを含む、カダベリンの生産方法。
14. カダベリンの生産のための、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の微生物の使用。

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