CN105316270B - 一种催化生产1,5-戊二胺的工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种催化生产1,5‑戊二胺的工程菌及其应用。本发明公开的一种工程菌，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。本发明公开的工程菌是在大肠杆菌B系列衍生菌株中过量表达赖氨酸脱羧酶基因cadA并同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB构建的1,5‑戊二胺全细胞催化工程菌；本发明进一步公开了利用该工程菌催化生产1,5‑戊二胺的方法，该方法可以实现高转化率、高生产强度和高产量地催化产生1,5‑戊二胺，降低了1,5‑戊二胺的生产成本，从而在实践上可用于1,5‑戊二胺大规模生产，便于推广应用。

Description

一种催化生产1,5-戊二胺的工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种催化生产1,5-戊二胺的工程菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
1,5-戊二胺(1,5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷(1,5-Diaminopentane)，与二元酸聚合可合成高分子聚酰胺材料(即尼龙)。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗了大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要组成单体—1,5-戊二胺，具有重要的经济学和生态学意义。生物法生产1,5-戊二胺主要采用微生物发酵和催化两种方法。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，导致利润率下降。因此，开发高效的以赖氨酸为底物的戊二胺生物催化的生产方法，可以推进氨基酸发酵产业的转型升级。
大肠杆菌是最常用的全细胞催化生产戊二胺的微生物。大肠杆菌中的1,5-戊二胺操纵子依次包括诱导型启动子Pcad、赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB和赖氨酸脱羧酶基因cadA。在低pH值、高赖氨酸浓度条件下，1,5-戊二胺操纵子上游调节基因cadC被激活，其产物作用于Pcad启动子，激活赖氨酸脱羧酶CadA和赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白CadB的表达合成。CadA催化细胞内的赖氨酸合成1,5-戊二胺，CadB将合成的1,5-戊二胺转运至细胞外(J Bacteriol,1992,174(8):2659–2669.)。除了诱导型赖氨酸脱羧酶CadA外，大肠杆菌还包含组成型赖氨酸脱羧酶LdcC。
在全细胞催化生产1,5-戊二胺的现有技术中，专利(US7189543、EP1482055)以pUC18为载体过表达赖氨酸脱羧酶基因cadA，并将该重组质粒转化至大肠杆菌K12衍生系列菌株JM109中，获得全细胞催化生产1,5-戊二胺的工程菌的戊二胺催化产量和戊二胺催化速率较低。为了提升工程菌的催化性能，需要采用热处理、冷冻熔融以及超声等细胞处理工艺(专利CN102782146)，但是该处理工艺增加了实际生产工艺难度和生产成本。此外，上述1,5-戊二胺生物催化工艺需要在工程菌培养结束后收集菌体，去除培养液以后再加入催化液和底物赖氨酸进行戊二胺催化过程，增加了生产工序、操作时间、生产成本和废水排放。总之，目前戊二胺生物催化的现有技术存在工程菌细胞催化性能低、催化工艺复杂、成本高等问题，严重限制了1,5-戊二胺生物催化的实际工业化生产应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种催化生产1,5-戊二胺的工程菌及其应用。
本发明提供一种工程菌，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。
上述工程菌中，所述过表达赖氨酸脱羧酶基因的方法是将所述赖氨酸脱羧酶基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的启动子之后进行表达；
所述适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB是指将包含或不包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或，使用适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子；
所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子具体为L启动子、trc启动子、T5启动子、lac启动子、tac启动子或T7启动子。
上述任一所述的工程菌中，所述赖氨酸脱羧酶基因为cadA；
所述在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB的方法为如下(1)或(2)所示：
(1)将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因和包含RBS22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中；
所述片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体具体是将所述片段插入pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段插入pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位点间，得到重组表达载体1；再将包含RBS22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段插入重组表达载体1的Not I和Hind III位点间得到；
所述赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的核苷酸序列具体如SEQ ID No.12中自5’末端起第7269位至第8603位核苷酸所示；
所述RBS22的核苷酸序列如SEQ ID No.12中自5’末端起第7255位至第7263位核苷酸所示；
所述包含RBS22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段具体如SEQ IDNo.11所示；
(2)将所述大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子，再将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株及其衍生菌株中；
所述将大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为T7启动子的过程如下：将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中进行同源重组得到；
所述带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒是将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因插入pKOV质粒的BamHI和Not I位点间得到；
所述带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；
所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体具体是将所述片段插入pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段插入pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位点间；
所述赖氨酸脱羧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的核苷酸序列具体如SEQ ID No.12中自5’末端起第5071位至第7215位核苷酸所示；
所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段如SEQ ID No.3所示。
上述任一所述的工程菌中，所述大肠杆菌B株为E.coli BL21(DE3)。
一种制备1,5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入丰富培养基中，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂具体为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛；
所述丰富培养基中含有10g/L酵母提取物,20g/L胰蛋白胨,0.9g/L K2HPO4·3H2O,1.14g/L KH2PO4,10g/L(NH4)2SO4,0.3g/L MgSO4·7H2O,5mL/L微量元素储液，50mg/L卡那霉素，余量为水；
所述微量元素储液含有6g/L FeSO4·7H2O,1.35g/L CaCl2,0.8g/LZnSO4·7H2O,1.5g/L MnSO4·4H2O,0.15g/L CuSO4·5H2O,0.2g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.1g/L H3BO3,0.25g/L CoCl2·6H2O和10mL/L浓盐酸，余量为水。
上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为50mg/L；
所述种子液的OD600为5-25；
所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30％，具体为5％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃，具体为37℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养的pH为4.0-9.0；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM，具体为0.4mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-40小时，具体为3h；
所述IPTG诱导时还包括0.5-10g/L的速率补加葡萄糖的步骤，所述速率具体为3g/L；
所述赖氨酸盐为L-赖氨酸盐酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-30h，具体为6h；
所述催化过程中pH维持在5.5-7.0之间，具体用硫酸调节；
所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm；
所述催化过程中，所述补加葡萄糖的速率具体为2g/L；
所述催化过程中，所述通气量具体为1vvm；
所述催化过程中，所述温度具体为37℃；
所述催化过程中，所述搅拌转速具体为500rpm。
一种制备1,5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入无机盐培养基，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和盐酸吡哆醛；
所述无机盐培养基含有2g/L(NH4)2HPO4,4g/L KH2PO4,0.85g/L柠檬酸,0.7g/LMgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O,2.25mg/L ZnSO4·7H2O,0.2mg/L CuSO4·5H2O,0.5mg/LMnSO4·5H2O,0.23mg/L NaB4O7·10H2O,2.0mg/L CaCl2·2H2O,0.1mg/L NH4Mo7O24，0.15mg/LCoCl2·6H2O，余量为水。
上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为50mg/L；
所述种子液的OD600为5-25；
所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30％，具体为2％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃，具体为37℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，具体是通过流加补料液实现的，所述补料液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O，余量为水；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM，具体为0.1mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后5-20h，具体为12h；
所述赖氨酸盐为L-赖氨酸盐酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的10-24h小时，具体为15h；
所述催化过程中pH维持在4.0-9.0之间，具体为6.5，具体用盐酸调节；
所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm；
所述催化过程中，所述补加葡萄糖的速率具体为2g/L；
所述催化过程中，所述通气量具体为1vvm；
所述催化过程中，所述温度具体为37℃；
所述搅拌转速具体为500rpm。
上述任一所述的工程菌在制备1,5-戊二胺中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的工程菌在催化底物赖氨酸和维生素B6生成1,5-戊二胺中的应用也属于本发明的保护范围；
所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液，再具体为L-赖氨酸盐酸盐；
所述维生素B6具体为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛。
本发明提供的工程菌是在大肠杆菌B系列衍生菌株中过量表达赖氨酸脱羧酶基因cadA并同时适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB构建的1,5-戊二胺全细胞催化工程菌；本发明进一步提供了利用该工程菌催化生产1,5-戊二胺的方法，该方法可以实现高转化率、高生产强度和高产量地催化生产1,5-戊二胺，产量为100-300g/L，降低了1,5-戊二胺的生产成本，从而在实践上可用于1,5-戊二胺大规模生产，便于推广应用。
附图说明
图1为pET28a-cadA-RBS22-cadB质粒图谱。
图2为cad操纵子基因的不同过表达组合工程菌的生长曲线。
图3为cad操纵子基因的不同过表达组合工程菌的蛋白质电泳图。
图4为cad操纵子基因的不同过表达组合工程菌的1,5-戊二胺摇瓶产量差异。
图5为IPTG和乳糖诱导基因表达的蛋白质电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
高保真聚合酶KAPA HiFiTM HotStar购自北京阅微基因技术有限公司。
野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center,NBRC)。
pKOV质粒购自Addgene，产品目录号为25769。
实施例1、1,5-戊二胺检测方法
取10μl样品加入含有100μl4.2g/100ml的碳酸氢钠水溶液的2ml离心管，混匀后加入200μl含有体积百分含量为1％的2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液，混匀；60℃衍生反应60分钟(严格计时，30分钟取出轻微震荡混匀继续衍生反应)。取出避光降温至室温，加入1600μl乙腈，震荡混匀30秒，有机系滤膜过滤后取15μl进样。
流动相A为pH7.2的5.4g/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为体积百分含量70％的乙腈水溶液，将A和B按照体积比5：95的比例，1mL/min的流速泵入流动相，所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm,Agilent,USA)；柱温：35℃；检测波长：360nm。
以1,5-戊二胺盐酸盐(购自sigma公司)为标准品，1,5-戊二胺盐酸盐的浓度在1-5g/L之间线性关系良好。以标准品的浓度为横坐标，标准品积分峰面积为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式(X＝0.000649*Y+0.0176(R2＝0.9999))。
以下实施例中的1,5-戊二胺浓度均由标准曲线公式计算得到的1,5-戊二胺盐酸盐的测定值换算成1,5-戊二胺浓度值。
实施例2、戊二胺全细胞催化工程菌的构建
大肠杆菌中的1,5-戊二胺操纵子依次包括诱导型启动子Pcad、赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB和赖氨酸脱羧酶基因cadA。在低pH值、高赖氨酸浓度条件下，1,5-戊二胺操纵子上游调节基因cadC被激活，其产物作用于Pcad启动子，激活赖氨酸脱羧酶CadA和赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白CadB的表达合成。CadA催化细胞内的赖氨酸合成1,5-戊二胺，CadB将合成的1,5-戊二胺转运至细胞外(JBacteriol,1992,174(8):2659–2669.)。除了诱导型赖氨酸脱羧酶CadA外，大肠杆菌还包含组成型赖氨酸脱羧酶LdcC。
一、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA的获得
(一)以野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTM HotStar，以P1和P2为引物进行PCR扩增。PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，获得长度为2188bp的含有赖氨酸脱羧酶基因cadA的片段,该片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3中自5’末端起第7位至第2151位为cadA基因序列。
P1：5’-CATGCCATGGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGT-3’(SEQ ID No.1)
(下划线所示序列为Nco I酶切识别位点)
P2：5’-ACGCGTCGACGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTA-3’(SEQ ID No.2)
(下划线所示序列为Sal I酶切识别位点)
(二)Nco I和Sal I双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；Nco I和Sal I双酶切pET28a(+)质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-cadA，将其送测序，结果正确。
(三)将重组质粒pET28a-cadA转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA，用于1,5-戊二胺全细胞催化。
二、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA的获得
(一)以野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTM HotStar，以P3和P4为引物进行PCR扩增，PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，获得长度为3604bp的cadBA片段(cadB和cadA两个基因在同一个操纵子cadBA上，因此该产物包含两个基因的产物)，该片段的核苷酸序列如SEQID No.6所示。
P3：5’-CATGCCATGGGTTCTGCCAAGAAGATCGGGCT-3’(SEQ ID No.4)
(下划线所示序列为Nco I酶切识别位点)
P4：5’-CCCAAGCTTGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTA-3’(SEQ ID No.5)
(下划线所示序列为Hind III酶切识别位点)
(二)Nco I和Hind III双酶切SEQ ID No.6所示的DNA分子，得到基因片段；Nco I和Hind III双酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-cadBA，将其送测序，结果正确。
(三)将重组质粒pET28a-cadBA转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA，用于1,5-戊二胺全细胞催化。
三、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBSnative-cadB的获得
(一)以野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTM HotStar，以P5和P7为引物进行PCR扩增，PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，获得含有自身RBS的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因序列RBSnative-cadB，该片段的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
P5：5’-CCCAAGCTTTGAAATTAGGAGAAGAGCATG-3’(SEQ ID No.7)
(下划线所示序列为Hind III酶切识别位点)
P6：5’-CCCAAGCTTCTAGGAAGTAGAGCATGAGTTCTGCCAAGA-3’(SEQ ID No.8)
(下划线所示序列为Hind III酶切识别位点)
P7：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGTGCGTTAGACGCGGT-3’(SEQ ID No.9)
(下划线所示序列为Not I酶切识别位点)
(二)Not I和Hind III双酶切SEQ ID No.10所示的DNA分子，得到基因片段；Not I和Hind III双酶切pET28a-cadA，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-cadA-RBSnative-cadB，将其送测序，结果正确。
(三)将pET28a-cadA-RBSnative-cadB转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBSnative-cadB，用于1,5-戊二胺全细胞催化。
四、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB的获得
(一)以野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTM HotStar，以P6和P7为引物进行PCR扩增，PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环，获得包含弱RBS(Mutaliket al,Nature methods,2013.10(4):p.354-360.)的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因序列RBS22-cadB，该片段的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。SEQ ID No.11中自5’末端起第10位至第18位核苷酸所示的序列为RBS22序列，第24位至第1358位核苷酸所示的序列为cadB基因序列。
(二)Not I和Hind III双酶切SEQ ID No.11所示的DNA分子，得到基因片段；Not I和Hind III双酶切pET28a-cadA，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-cadA-RBS22-cadB，将其送测序，结果正确。
(三)将pET28a-cadA-RBS22-cadB转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB，用于1,5-戊二胺全细胞催化。
pET28a-cadA-RBS22-cadB的质粒图谱如图1所示。
pET28a-cadA-RBS22-cadB的质粒如SEQ ID No.12所示。
SEQ ID No.12中自5’末端起第5071位至第7215位核苷酸所示的序列为cadA基因序列，第7255位至第7263位核苷酸所示的序列为RBS22序列，第7269位至第8603位核苷酸所示的序列为cadB基因序列。
cadA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
cadB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
实施例3、不同基因组合表达的工程菌生长差异、蛋白表达差异和1,5-戊二胺生产差异的分析
一、将保存在-80℃冻存管的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA、E.coliBL21(DE3)/pET28a-cadBA、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBSnative-cadB和E.coliBL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB分别划线接种于含有50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12小时，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有3mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的试管，置于37℃摇床200rpm培养10小时。取培养好的菌液按3％接种量(体积比)转接入含有50mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的500mL摇瓶，置于37℃摇床200rpm培养，每隔2小时取样检测600nm波长的吸光值(OD600)。在2.5小时开始加入终浓度0.2mM的诱导剂IPTG，诱导后的菌体生长趋势如图2所示。图2中，cadA代表E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA，cadBA代表E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA，cadA-cadB代表E.coliBL21(DE3)/pET28a-cadA-RBSnative-cadB，cadA-RBS22-cadB代表E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB，箭头所示的时间点为加入诱导剂IPTG的时间点。
图2表明，加入诱导剂后工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA几乎不再生长。而工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBSnative-cadB和E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB则可以继续生长。
二、取培养6小时的各菌体培养液，离心后用pH7.5的0.05mM的Tris-HCl缓冲液重悬菌体细胞，使悬浊液OD600为1。分别取16μL悬浊液加入6μL5倍浓度的Loading Buffer，95℃处理10分钟。取5μL处理后的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳，染色并脱色后的电泳结果如图3所示。
图3中，pET28a-cadA-cadB代表pET28a-cadA-RBSnative-cadB，箭头所示为目的蛋白条带。
图3表明，工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA、E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBSnative-cadB和E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB均存在目的蛋白(cadA蛋白)条带，而E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA则观察不到相应的蛋白条带。
三、根据6小时培养液的OD600测定值，分别取10mg细胞干重的菌体(以1OD600等于0.42g/L细胞干重计)，离心后用1mL生理盐水悬浮，加入含有50mL催化液的500mL三角瓶中，置于37℃摇床200rpm，分别进行1,5-戊二胺催化反应。
催化液包含：20g/L L-赖氨酸盐酸盐，5g/L硫酸铵，0.1mM IPTG，0.1mM磷酸吡哆醛，5g/L葡萄糖，0.5g/L七水合硫酸镁，0.2g/L磷酸二氢钾，10μL/L硅油消泡剂，1g/100mL酚红，余量为水。
每隔1小时加入盐酸调节pH6.0-7.0，根据酚红指示剂调节催化液的颜色由红变黄。催化5小时后结束，离心，取上清液采用实施例1的1,5-戊二胺检测方法检测1,5-戊二胺浓度，结果如图4所示。
图4中，cadA代表E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA，cadBA代表E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA，cadA-B代表E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBSnative-cadB，cadA-RBS22-B代表E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB。
图4表明，工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB催化生产1,5-戊二胺的速度最快，而工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadBA的催化速率最低。
实施例4、染色体上替换cadB基因的启动子
一、以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株基因组DNA为模板，以引物P8和P9、P10和P11分别进行PCR扩增，获得长度分别为510bp和610bp的两条DNA片段,分别如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示。其中，T7启动子序列和lac调控序列由引物P9和P10引入。PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。其中，引物序列如下：
P8：5-CGCGGATCCTGCGCCATTCTCAACATCCTT-3’(SEQ ID No.15)
(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点)
P9：5-TCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCGCA ACATATT ATACCAACAG-3’(SEQ ID No.16)
P10：5-ACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGAAATTAG GAGAAGAGCATGAG-3’(SEQ ID No.17)
P11：5-ATTGCGGCCGC TCCGCAGTATTCCAGTTAGCT-3’(SEQ ID No.18)
(下划线所示序列为Not I酶切识别位点)
二、将SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的DNA分子的混合物为模板，以P8和P11为引物，通过Overlap PCR扩增到长约1.1kb的Overlap片段，如SEQ ID No.21所示。其中PCR程序为：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸60秒，26个循环。
SEQ ID No.21中自5’末端起第477位至第495位核苷酸所示的序列为T7启动子序列，SEQ ID No.21中自5’末端起第496位至第520位核苷酸所示的序列为lac调控序列。
BamHI和Not I双酶切SEQ ID No.21所示的DNA分子，得到基因片段；BamHI和Not I双酶切pKOV质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pKOV-PT7-cadB，并其送测序，验证其含有正确T7启动子和lac调控基因序列，保存备用。
三、将构建好的pKOV-PT7-cadB质粒电转化入E.coli BL21(DE3)菌株，于30℃、150rpm，在LB培养基中复苏2h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的cadB基因的自身启动子被替换为T7启动子，将该菌株命名为E.coli BL21cadB::PT7。将实施例2构建好的质粒pET28a-cadA分别转化至E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21cadB::PT7中，获得工程菌E.coli BL21/pET28a-cadA和E.coli BL21(PT7cadB)/pET28a-cadA。以实施例3的方法比较这两株工程菌的1,5-戊二胺催化性能，催化反应5小时，工程菌E.coliBL21(PT7cadB)/pET28a-cadA的1,5-戊二胺产量比E.coli BL21/pET28a-cadA提高了40％。
实施例5、不同诱导剂IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达
将保存在-80℃冻存管的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB划线于含有50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12小时，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有3mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的试管，置于37℃摇床200rpm培养10小时。取培养好的菌液按3％接种量(体积比)转接入含有50mL液体LB培养基(含有50mg/L卡那霉素)的500mL摇瓶，置于37℃摇床200rpm培养，3.5小时后分别加入终浓度0.1mM的IPTG、2mM和100mM的乳糖，继续培养4小时。将加入诱导剂前后的培养液离心后，加入pH7.5的0.05MTris-HCl缓冲液重悬菌体，调整OD600＝4.0，得到悬浊液，分别取16μL悬浊液加入6μL5倍浓度的Loading Buffer，95℃处理10分钟。取5μL处理后的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳，染色并脱色后的电泳结果如图5所示。
图5表明，与加入诱导剂前的对照0号泳道相比，加入0.1mM IPTG的1号泳道、加入2mM和100mM乳糖的2号和3号泳道均有81kD的目的蛋白(cadA蛋白)条带，说明使用IPTG和乳糖均可诱导目的蛋白表达。
实施例6、使用丰富培养基的菌体培养和1,5-戊二胺催化连续进行的生产工艺
刮取工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB菌苔接入含有50mL LB(含50mg/L卡那霉素(5-200mg/L均可)培养基的500mL三角瓶中，在37℃220rpm摇床中培养8h，得到种子液，OD600为5-25；将培养所得的种子液按5％(0.5-30％均可)的接种量接入含有2L丰富培养基的7.5L发酵罐中，培养温度为37℃(25-45℃均可)，DO控制在50％以上，pH4.0-9.0，必要时可增压或通纯氧。3h(3-40h均可)加入0.4mM(0.01-10mM均可)IPTG诱导，按照3g/L(0.5-10g/L均可)的速率补加葡萄糖。培养6小时(0.5-30均可)后OD600为25.1，加入10-300g/L L-赖氨酸盐酸盐和0.1mM的磷酸吡哆醛，开始全细胞催化。催化过程中pH迅速升高，间歇补加硫酸调节pH维持在5.5-7.0之间。催化过程中按照2g/L(0-5g/L均可)的速率补加葡萄糖，通气量为1vvm(0-10vvm均可)，温度控制在37℃(25-60℃均可)，搅拌桨转速为500rpm(0-1200rpm均可)。
丰富培养基成分如下：酵母提取物10g/L,胰蛋白胨20g/L,K2HPO4·3H2O0.9g/L,KH2PO41.14g/L,(NH4)2SO410g/L,MgSO4·7H2O0.3g/L,微量元素储液5mL/L，卡那霉素50mg/L，余量为水。
微量元素储液：6g/L FeSO4·7H2O,1.35g/L CaCl2,0.8g/L ZnSO4·7H2O,1.5g/LMnSO4·4H2O,0.15g/L CuSO4·5H2O,0.2g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.1g/L H3BO3,0.25g/LCoCl2·6H2O和10mL/L浓盐酸，余量为水。
分别在催化时间为1.5、3.0和4.5h时，从发酵罐中取2mL催化产物，12000g离心5分钟，倒出上清液，检测上清液中的1,5-戊二胺含量。按照实施例1的1,5-戊二胺检测方法检测全细胞催化过程中1,5-戊二胺产量，结果如表1所示，表1表明，在该工艺下工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB4.5h可催化产生151.2g/L(1.48mol/L)1,5-戊二胺。
表1 各催化时间的戊二胺产量
催化时间(h) 1,5-戊二胺浓度(g/L)
1.5 65.0
3.0 129.6
4.5 151.2
工程菌E.coli BL21(PT7cadB)/pET28a-cadA进行上述实验，结果如表2所示。
表2 各催化时间的戊二胺产量
催化时间(h) 1,5-戊二胺浓度(g/L)
1.0 70.0
2.0 130.6
3.0 200.2
实施例7、使用无机盐培养基的菌体培养和1,5-戊二胺催化的生产工艺
种子液培养条件与实施例6相同，培养所得的种子液按2％(0.5-30％均可)的接种量接入含有2L无机盐培养基的7.5L发酵罐中，培养温度为37℃(25-45℃均可)，DO控制在50％以上，必要时可增压或通纯氧。通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维持在5g/L以下。菌体培养12h(5-20h均可)后加入0.1mM(0.01-10mM均可)诱导剂IPTG，15h(10-24h均可)后菌体培养液OD600达到80.5，加入2L L-赖氨酸盐酸盐，并加入0.1mM的磷酸吡哆醛，开始催化生产1,5-戊二胺。催化过程中流加盐酸调节pH维持在6.5(4.0-9.0均可)。催化过程中按照2g/L(0-5g/L均可)的速率补加葡萄糖，通气量为1vvm(0-10vvm均可)，温度控制在37℃(25-60℃均可)，搅拌桨转速为500rpm(0-1200rpm均可)。
其中无机盐培养基成分和补料液成分如下：
无机盐培养基：2g/L(NH4)2HPO4,4g/L KH2PO4,0.85g/L Citric acid(柠檬酸),0.7g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O,2.25mg/L ZnSO4·7H2O,0.2mg/LCuSO4·5H2O,0.5mg/L MnSO4·5H2O,0.23mg/L NaB4O7·10H2O,2.0mg/L CaCl2·2H2O,0.1mg/L NH4Mo7O24，0.15mg/L CoCl2·6H2O，余量为水。
补料液包含700g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O，余量为水。
分别在催化时间为1.5、3.0和4.5h时，从发酵罐中取2mL催化产物，12000g离心5分钟，倒出上清液，检测上清液中的1,5-戊二胺含量。按照实施例1的1,5-戊二胺检测方法检测全细胞催化过程中1,5-戊二胺产量，结果如表3所示，表3表明，在该工艺下工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-cadA-RBS22-cadB4.5h可催化产生74.6g/L(0.73mol/L)1,5-戊二胺。
表3 各催化时间的戊二胺产量
催化时间(h) 1,5-戊二胺浓度(g/L)
1.5 21.6
3.0 42.8
4.5 74.6
工程菌E.coli BL21(PT7cadB)/pET28a-cadA进行上述实验，结果如表4所示。
表4 各催化时间的戊二胺产量
催化时间(h) 1,5-戊二胺浓度(g/L)
1.0 78.6
2.0 150.8
3.0 200.6

Claims (13)

1.一种工程菌，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB；
所述赖氨酸脱羧酶基因为cadA；
所述在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB的方法为如下(1)或(2)所示：
(1)将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因和包含RBS22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中；
所述片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体是将所述片段插入pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段插入pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位点间，得到重组表达载体1；再将包含RBS22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段插入重组表达载体1的Not I和Hind III位点间得到；
所述赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述RBS22的核苷酸序列如SEQ ID No.12中自5’末端起第7255位至第7263位核苷酸所示；
(2)将所述大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子，再将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株及其衍生菌株中；
所述将大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为T7启动子的过程如下：将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中进行同源重组得到；
所述带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒是将带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因插入pKOV质粒的BamHI和Not I位点间得到；
所述带有T7启动子序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；
所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段是通过重组表达载体导入的；
所述重组表达载体是将所述片段插入pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述重组表达载体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段插入pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位点间；
所述赖氨酸脱羧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12中自5’末端起第7269位至第8603位核苷酸所示；
所述包含RBS22的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白编码基因的片段如SEQ ID No.11所示；
所述赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12中自5’末端起第5071位至第7215位核苷酸所示。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌B株为E.coli BL21(DE3)。
4.一种制备1,5-戊二胺的方法，包括如下步骤：将权利要求1-3任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入丰富培养基中，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛；
所述丰富培养基中含有10g/L酵母提取物,20g/L胰蛋白胨,0.9g/L K2HPO4·3H2O,1.14g/L KH2PO4,10g/L(NH4)2SO4,0.3g/L MgSO4·7H2O,5mL/L微量元素储液，50mg/L卡那霉素，余量为水；
所述微量元素储液含有6g/L FeSO4·7H2O,1.35g/L CaCl2,0.8g/L ZnSO4·7H2O,1.5g/L MnSO4·4H2O,0.15g/L CuSO4·5H2O,0.2g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.1g/L H3BO3,0.25g/L CoCl2·6H2O和10mL/L浓盐酸，余量为水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L；
所述种子液的OD600为5-25；
所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养的pH为4.0-9.0；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-40小时；
所述IPTG诱导时还包括0.5-10g/L的速率补加葡萄糖的步骤；
所述赖氨酸盐为L-赖氨酸盐酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-30h；
所述催化过程中pH维持在5.5-7.0之间，用硫酸调节；
所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为为50mg/L；
所述种子液接入丰富培养基的比例为5％；
所述发酵培养的温度为37℃；
所述IPTG的终浓度为0.4mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后3h；
所述速率为3g/L；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的6h。
7.一种制备1,5-戊二胺的方法，包括如下步骤：将权利要求1-3任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将种子液接入无机盐培养基，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化，即得；
所述诱导剂为IPTG或乳糖；
所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和盐酸吡哆醛；
所述无机盐培养基含有2g/L(NH4)2HPO4,4g/L KH2PO4,0.85g/L柠檬酸,0.7g/LMgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O,2.25mg/L ZnSO4·7H2O,0.2mg/L CuSO4·5H2O,0.5mg/L MnSO4·5H2O,0.23mg/L NaB4O7·10H2O,2.0mg/L CaCl2·2H2O,0.1mg/LNH4Mo7O24，0.15mg/L CoCl2·6H2O，余量为水。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L；
所述种子液的OD600为5-25；
所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30％；
所述发酵培养的温度为25℃-45℃；
所述发酵培养的DO在50％以上；
所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，是通过流加补料液实现的，所述补料液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O，余量为水；
所述IPTG的终浓度为0.01-10mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后5-20h；
所述赖氨酸盐为L-赖氨酸盐酸盐；
所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的10-24h小时；
所述催化过程中pH维持在4.0-9.0之间，用盐酸调节；
所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为50mg/L；
所述种子液接入无机盐培养基的比例为2％；
所述发酵培养的温度为37℃；
所述IPTG的终浓度为0.1mM；
所述IPTG加入的时间为发酵培养后12h；
述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的15h小时；
所述催化过程中pH维持在6.5。
10.权利要求1-3任一所述的工程菌在制备1,5-戊二胺中的应用。
11.权利要求1-3任一所述的工程菌在催化底物赖氨酸和维生素B6生成1,5-戊二胺中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液；
所述维生素B6为吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或盐酸吡哆醛。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述赖氨酸盐为L-赖氨酸盐酸盐。
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