CN110541007A - 一种二元酸戊二胺盐的制备方法及其培养基 - Google Patents

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徐敏
刘修才
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Abstract

本发明公开了二元酸戊二胺盐的制备方法及其培养基。发酵培养基中以二元酸铵盐为氮源，且二元酸铵盐还作为底物，通过补料培养基的方式加入。发酵过程中，发酵的接种量为5‑20％，温度为35‑39℃，通风量为0.4‑0.8vvm；和/或，罐压为0.05‑0.2MPa，pH值为6‑7，发酵2‑6h后，流加补料培养基。本发明的方法，避免了发酵体系中大量无机离子的产生，大大降低了后续处理工作和成本，减少了无机离子对环境的损害。

Description

一种二元酸戊二胺盐的制备方法及其培养基
技术领域
本发明涉及环境友好型培养基、以及利用该培养基的发酵制备二元酸戊二胺盐的方法。
背景技术
戊二胺(Diaminopentane；DN5)，又名尸胺，在农业、医学以及工业上具有广泛的应用。在农业上，外源施加戊二胺，可以改善坐果和促进果实成熟；在医学上，戊二胺可以作为一种有效治疗痢疾的药物；在工业上，生物发酵法制备的戊二胺可以代替来自于石油化工产品的二胺，进行聚合反应生成各类性质不同的聚合物，从而避免石油化工产品成本高且生产对环境有不利影响的弊端，并且可以广泛应用于航空航天、汽车部件、机械零部件、电子电器与包装材料等领域。
对于生物发酵法制备戊二胺，现已经有文献报道可以利用微生物转化合成尸胺。例如：构建能分泌表达赖氨酸脱羧酶的微生物，在发酵生产赖氨酸脱羧酶，然后向微生物培养基中投入赖氨酸，从而把赖氨酸转化为尸胺。这种方法对赖氨酸纯度要求很高。另一方面，中国专利CN201410004636.3公开了向赖氨酸发酵液中加入赖氨酸脱羧酶的方法来生产尸胺，该方法虽然不需要纯化赖氨酸，但需要生产和纯化赖氨酸脱羧酶，也是一个非常复杂的工艺过程。还有一些文献公开了利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，利用基因工程技术，将不同来源的赖氨酸脱羧酶基因克隆至高产赖氨酸的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌中进行分泌表达，将重组菌株进行发酵，第一阶段主要是重组菌株合成赖氨酸，第二阶段诱导赖氨酸脱羧酶基因进行分泌表达，并将赖氨酸转化成戊二胺。
但是生物发酵法生产戊二胺的过程中，微生物发酵过程，例如底物，培养基，pH调节过程等，会产生大量的无机盐，对后续提取过程有很大的压力，使得后期的污水处理成本非常高，且除盐工艺复杂度很高，处理不当则对环境有很不利的影响。因此，在保证发酵的转化率的基础上，尽量减少发酵液中盐含量，为后续处理工艺带来方便且不增加环保压力，是现有技术亟待解决的非常有现实意义的问题。
发明内容
为了解决生物发酵法制备戊二胺过程中会产生大量无机盐从而对后续处理有很大压力的问题，本发明提供多种特别针对戊二胺发酵的环境友好型培养基、以及利用该培养基的发酵制备二元酸戊二胺盐的方法。本发明的发酵制备二元酸戊二胺盐的方法，避免了现有生物发酵法制备戊二胺过程中产生大量无机离子的问题，从而避免了后续对无机离子的处理过程，大大降低了后续处理工作和成本，减少了无机离子对环境的损害，并且得到的二元酸戊二胺盐经过处理可以直接聚合得到特定的聚合物。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸铵盐的结构式为：H4NOOC(CH2)nCOONH4和/或HOOC(CH2)nCOONH4，其中4≤n≤18，可以为4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。所述二元酸铵盐优选长链二元酸铵盐，可以包括：长链二元酸一铵盐和/或长链二元酸二铵盐；优选包括：壬二酸一铵盐和/或二铵盐、癸二酸一铵盐和/或二铵盐、十一碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十二碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十三碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十四碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十五碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十六碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十七碳二元酸一铵盐和/或二铵盐和十八碳二元酸一铵盐和/或二铵盐中的一种或多种。
本发明的目的之一是，提供二元酸铵盐作为氮源和/或底物在发酵生产戊二胺的方法中的应用。
本发明的目的之二是，提供一种二元酸戊二胺盐溶液的制备方法，其中，所述戊二胺由发酵法制得，所述发酵过程中，以二元酸铵盐为底物和/或氮源。
本发明的一个优选的技术方案，所述底物还包括葡萄糖。
本发明的目的之三是，提供一种种子培养基，所述种子培养基包括氮源，所述氮源包括：二元酸铵盐。
本发明的一个优选的技术方案，所述种子培养基中的所述氮源还包括玉米浆。
本发明的一个优选的技术方案，所述种子培养基中的所述氮源的浓度为0.15％-2.8％。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸铵盐的浓度为0.1％-2.5％；和/或，所述玉米浆的浓度为0.05％-0.3％。
本发明的一个优选的技术方案，所述种子培养基还包括碳源、磷源、微量元素和生长因子。
其中，所述碳源包括：葡萄糖；所述碳源的浓度为5％-15％。
其中，所述磷源包括：KH2PO4；所述磷源的浓度为0.2-0.5％。
其中，所述微量元素包括：MgSO4·7H2O和/或MnSO4·H2O；所述微量元素的浓度为0.151-0.452％；优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.15-0.45％，和/或，所述MnSO4·H2O的浓度为10-20ppm。
其中，所述生长因子包括：苏氨酸和/或亮氨酸；所述生长因子的浓度为0.035-0.057％；优选的，所述苏氨酸的浓度为0.015-0.045％，和/或，所述亮氨酸的浓度为0.010-0.025％。
本发明的一个优选的技术方案，所述种子培养基包括：KH2PO40.2-0.5％，MgSO4·7H2O 0.15-0.45％，MnSO4·H2O 10-20ppm，长链二元酸铵盐0.1％-2.5％，葡萄糖5％-15％，玉米浆0.05％-0.3％，苏氨酸0.015-0.045％和亮氨酸0.010-0.025％，所述百分比为质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL。
本发明的目的之四是，提供一种发酵培养基，所述发酵培养基包括氮源，所述氮源包括：二元酸铵盐。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基中的所述氮源还包括玉米浆。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基中的所述氮源的浓度为0.2-1.5％。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸铵盐的浓度为0.1％-1％；和/或，所述玉米浆的浓度为0.1％-0.5％。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基还包括碳源、磷源、微量元素和生长因子。
其中，所述碳源包括：葡萄糖；所述碳源的浓度为1％-6％。
其中，所述磷源包括：KH2PO4；所述磷源的浓度为0.02-0.06％。
其中，所述微量元素包括：MgSO4·7H2O和/或MnSO4·H2O；所述微量元素的浓度为0.11-0.55％；优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.1-0.5％，和/或，所述MnSO4·H2O的浓度为0.01-0.05％。
其中，所述生长因子包括：苏氨酸；所述生长因子的浓度为0.001-0.03％。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基包括以下成分：KH2PO4 0.02％-0.06％，MgSO4·7H2O 0.10％-0.50％，MnSO4·H2O 0.01％-0.05％，长链二元酸铵盐0.1％-1.0％，葡萄糖1.0％-6.0％，玉米浆0.1％-0.5％，苏氨酸0.01％-0.03％。
本发明的目的之五是，提供一种补料培养基，所述补料培养基中包括底物，所述底物包括二元酸铵盐。
本发明的一个优选的技术方案，所述补料培养基中所述二元酸铵盐的浓度为5％-60％。
本发明的一个优选的技术方案，所述补料培养基中的底物还包括：葡萄糖10-80％。
本发明的目的之六是，一种二元酸戊二胺盐的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在戊二胺发酵过程中，使用如上所述的发酵培养基和补料培养基。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵2-6h后，流加如上所述的补料培养基。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸戊二胺盐可以包括：C4～C18的脂肪族或芳香族二元胺和C4～C18的脂肪族或芳香族二元羧酸形成的盐。二元胺的胺基和二元羧酸的羧基都位于端基。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸戊二胺盐中，所述二元酸的结构式为：HOOC(CH2)nCOOH，其中4≤n≤18，优选6≤n≤18,，可以为4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18；所述胺的结构式为：H2N-(CH2)m-NH2，其中4≤m≤18，优选4≤m≤6，即，m可以为4、5或6；所述二元酸胺的结构式为：-OOC(CH2)nCOO-+H3N-(CH2)m-NH3 +，其中4≤n≤18且4≤m≤6。
例如：所述二元酸戊二胺盐可以为：丁二酸戊二胺盐、己二酸戊二胺盐、癸二酸戊二胺盐、十二碳二羧酸戊二胺盐、十三碳戊二胺盐、十四碳戊二胺盐等。二元酸戊二胺盐还可以包括含芳香结构的二元酸戊二胺盐，例如：对苯二甲酸戊二胺盐等。并且，为了得到不同性能的共聚物，还可以根据需要得到不同种类聚酰胺形成的二元酸戊二胺盐或聚酰胺和聚合单体形成的二元酸戊二胺盐。本发明的二元酸戊二胺盐还可以是不同的二元酸戊二胺盐混合物。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中使用的微生物选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵前，进行种子培养，所述种子培养使用如上所述的种子培养基。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，接种后的起始体积为发酵罐体积的30％-70％，所述百分比为发酵培养基的体积占发酵罐体积的百分比。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，发酵的接种量为5-20％(v/v)，所述百分比为相对于发酵起始体积的体积百分比。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，发酵的温度为35-39℃。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，发酵的通风量为0.4-0.8vvm。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，发酵的罐压为0.05-0.2MPa，所述压力为表压。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，发酵的pH值为6-7。
本发明中，所述二元酸铵盐，可以以二元酸铵盐固体的形式加入，或者以二元酸铵盐溶液的形式加入，例如二元酸铵盐发酵液或者二元酸铵盐发酵处理液；在计算二元酸铵盐的加入量时，不管是以哪种方式加入，均以有效成分二元酸铵盐的质量，计算加入量。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸铵盐溶液的制备方法可以为发酵法制备长链二元酸铵盐溶液的方法，所述发酵以烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸盐中的一种或多种为底物，在所述发酵时和/或所述发酵结束后，加入液氨和/或氨水。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，在所述发酵时和/或所述发酵结束后，加入液氨和/或氨水，一方面，液氨和/或氨水可以部分参与调节pH，另一方面，还可以选择性的作为氮源使用。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述液氨和/或氨水的加入方式为连续加入，或，间歇分批加入。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述液氨和/或氨水可以是发酵过程中加入，也可以是发酵结束后加入。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述氨水的加入量为50～500g/L，优选100～300g/L。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述液氨的加入量为12～125g/L，优选35～80g/L。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述连续加入为恒速加入，或，变速加入。所述恒速加入的加入速度为0.35～3.5g/h/L。所述变速加入的加入速度为0～3.5g/h/L。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述氨水浓度为氨气含量25％以上，所述百分比为质量百分比。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，当所述发酵结束后加入氨水时，所述氨水的加入量为100～300g/L。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，当所述发酵时和发酵结束后加入氨水时，所述发酵时氨水的加入量为50～200g/L，且所述发酵结束后氨水的加入量为100～300g/L。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述发酵的温度为28～32℃。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述发酵的通风比为0.3～0.7vvm。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述发酵的罐压为0.05～0.14MPa，所述罐压为表压。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，菌体生长期控制pH为3.0～6.5，发酵产酸期控制pH为5.0～8.0。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述发酵的溶氧为10％以上。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，发酵12～18h时第一次批加底物，之后当发酵液中底物含量低于5％～8％时再批加底物，发酵过程中可补加葡萄糖。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述发酵的周期为130～180h。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述底物包括C9-C18的烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C14、C15和C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸铵盐的结构式为：H4NOOC(CH2)nCOONH4和/或HOOC(CH2)nCOONH4，其中4≤n≤18。所述二元酸铵盐优选包括长链二元酸一铵盐和/或长链二元酸二铵盐；优选包括：壬二酸一铵盐和/或二铵盐、癸二酸一铵盐和/或二铵盐、十一碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十二碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十三碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十四碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十五碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十六碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十七碳二元酸一铵盐和/或二铵盐，和十八碳二元酸一铵盐和/或二铵盐中的一种或多种。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸铵盐中，长链二元酸二铵盐的含量为90％以上，一般而言为90％-100％，可以为：90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述百分比为占长链二元酸胺盐总量的质量百分比。
本发明的一个优选的技术方案，在制备所述二元酸铵盐溶液时，所述发酵的菌种包括：热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)。
本领域技术人员均理解，本发明中，各类培养基中各成分的浓度％表示g/100mL，即所述百分比为该成分占发酵液的质量体积比；所述ppm为g/10000mL。
本发明的发酵制备二元酸戊二胺盐的方法，避免了在发酵液中产生无法利用且对环境有损害的无机离子的问题，发酵结束后发酵液中就存在可以聚合的单体的盐，再通过后续提取纯化工艺，可以直接得到二元酸戊二胺盐产品。并且，本发明为了该特殊的发酵工艺，针对性的涉及了特定的培养基，该培养基自身无机离子含量少，减少了无机离子对环境的损害，可以满足二元酸二胺的制备工艺。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明各实施例涉及的性能参数的检测方法如下所示：
发酵液中硫酸根离子的检测方法参考：GB/T 13025.8-2012
发酵液中氯离子的检测方法参考：GB/T 15453-2008。
具体实施方式中，所使用的细菌为大肠杆菌，可以为：大肠杆菌CIB60-1、CIB60-2、CIB60-3、CIB132-3、CIB120-3、CIB132-3、CIB169-3、CIB132-3、CIB179-3、CIB180-3、CIB172-3等。上述菌种的构建方法，见申请号为PCT/CN2015/094121、公开号为WO2017/079872A1、公开日为2017年5月18日的PCT申请，具体见该专利申请说明书实施例1-17，例如：实施例16和实施例17。以下实施例，可以使用上述菌株作为发酵菌株，但本发明可使用的菌株不仅限于上述菌株，只要能够实现将底物转化为胺并且得到二元酸戊二胺盐溶液，均适用于本发明。
具体实施方式中主要使用三种培养基：
1、种子培养基
包括以下成分：KH2PO4 0.2-0.5％，MgSO4·7H2O 0.15-0.45％，MnSO4·H2O 10-20ppm，二元酸铵盐0.1％-2.5％，葡萄糖5％-15％，玉米浆0.05％-0.30％，苏氨酸0.015-0.045％，亮氨酸0.010-0.025％；
2、发酵培养基
包括以下成分：KH2PO4 0.02％-0.06％，MgSO4·7H2O 0.10％-0.50％，MnSO4·H2O0.010％-0.050％，二元酸铵盐0.1％-1.0％，葡萄糖1.0％-6.0％，玉米浆0.10％-0.50％，苏氨酸0.010％-0.030％；
3、补料培养基：
包括以下成分：葡萄糖10％-80％，二元酸铵盐5％-60％。
发酵培养方法：
(1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积4-7L)，接种比0.5-2％，通气比0.4-0.8vvm，温度35-39℃，转速300-800rpm，罐压0.05-0.15MPa，氨水控pH为6.0-7.0，在菌浓OD562达0.55-1.00后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积4-7L)，接种比5-20％，通气比0.4-0.8vvm，温度35-39℃，转速500-800rpm，罐压0.05-0.2MPa，氨水控pH为6.0-7.0，发酵2-6h后流加补料培养基，发酵周期为30h-40h；
得到长链二元酸戊二胺盐溶液；该溶液进入后续的纯化、聚合生成聚酰胺的过程。
制备实施例1
十二碳二元酸铵盐的制备
1、菌种活化：
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中，pH自然，29℃下，220rpm、振幅26～50mm摇床培养1天；YPD培养基包括：20g/L葡萄糖，10g/L酵母浸粉，20g/l蛋白胨；pH7.0-7.5；
2、种子罐培养，制备种子液：
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种后发酵体系的起始pH值为6.0，29℃下，通风比0.5vvm，罐压0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的溶解氧大于等于10％，培养18h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15；
种子培养基包括：20g/L蔗糖，8g/L玉米浆液，5g/L酵母提取液，8g/L KH2PO4，3g/L脲，15mL/L底物，用水制备，并在121℃下灭菌20min；脲单独灭菌，110℃下灭菌15min，冷却后与灭过菌的其他成分混合；
3、发酵：
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：葡萄糖30g/L、硝酸钾2g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L；
发酵过程控制温度29℃，通风比为0.5vvm，罐压为0.1MPa(表压)，保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10％，发酵起始控制pH为6.0，发酵最初18h内控制pH4.0～5.0，发酵18h直至发酵结束控制pH为5.0～8.0；发酵18h时第一次批加底物正十二烷烃，之后当发酵液中底物含量低于5％时再批加底物；发酵过程中以0.7g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，发酵结束后补加100g/L氨水，氨水的总加入量为210g/L。
总发酵周期155h；得到十二碳二元酸铵盐溶液，浓度为180g/L。
制备实施例2
癸二酸铵盐的制备
1、菌种活化：
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中，pH自然，29℃下，220rpm摇床培养1天；YPD培养基包括：20g/L葡萄糖，10g/L酵母浸粉，20g/l蛋白胨；pH7.0；
2、种子罐培养，制备种子液：
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种后发酵体系的起始pH值为6.0，29℃下，通风比0.5vvm，罐压0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的溶解氧大于等于10％，培养18-20h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15；
种子培养基包括：20g/L蔗糖，8g/L玉米浆液，5g/L酵母提取液，8g/L KH2PO4，3g/L脲，用水制备，并在121℃下灭菌20min；脲单独灭菌，110℃下灭菌15min，冷却后与灭过菌的其他成分混合；
3、发酵：
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：葡萄糖40g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸铵4g/L，硫酸镁1g/L；
发酵过程控制温度29℃，通风比为0.3vvm，罐压为0.1MPa(表压)，保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10％，发酵起始控制pH为6.0，发酵最初18h内控制pH4.0～5.0，发酵18h直至发酵结束控制pH为5.0～8.0；发酵18h时第一次批加底物正十碳烷烃，之后当发酵液中底物含量低于2％时再批加底物；发酵过程中0～5h以0.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，5～18h以2g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，18～48h以1.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，48～120h以0.4g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，氨水的加入量为100g/L。
总发酵周期165h；得到癸二酸铵盐溶液，浓度为120g/L。
实施例1
种子培养基：KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O 0.35％，MnSO4·H2O 16ppm，十二碳二元酸铵盐(制备实施例1制得)0.4％，葡萄糖5％，玉米浆0.30％，苏氨酸0.045％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.30％，MnSO4·H2O0.010％，十二碳二元酸铵盐0.4％，葡萄糖2.0％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.030％；
补料培养基：葡萄糖20％，十二碳二元酸铵盐5％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积7L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比2％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速400rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(7L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比20％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速500rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，发酵6h后流加配置好的补料培养基，发酵周期40h；
最终发酵液中，十二碳二元酸-戊二胺盐的浓度为270.63g/kg；硫酸根离子浓度为0.43g/kg。
实施例2
种子培养基：KH2PO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.45％，MnSO4·H2O20ppm，己二酸铵盐0.15％，葡萄糖10％，玉米浆0.25％，，苏氨酸0.015％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.30％，MnSO4·H2O0.040％，己二酸铵盐0.8％，葡萄糖4％，玉米浆0.20％，苏氨酸0.015％；
补料培养基：葡萄糖10％-80％，己二酸铵盐40％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积5L)，发酵菌株为CIB133-3，接种比1.2％，通气比0.6vvm，温度37℃，转速600rpm，罐压0.12MPa，氨水控pH为6.7，在菌浓OD562达0.75后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积5L)，发酵菌株为CIB133-3，接种比12％，通气比0.6vvm，温度37℃，转速800rpm，罐压0.12MPa，氨水控pH为6.7，发酵3h后流加配置好的补料培养基，发酵周期为33h；
最终发酵液中己二酸-戊二胺盐的浓度为165.33g/kg，硫酸根离子含量为0.37g/kg。
实施例3
种子培养基：KH2PO4 0.4％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O 13.5ppm，癸二酸铵盐(制备实施例2制得)0.58％，葡萄糖15％，玉米浆0.27％，苏氨酸0.035％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O0.017％，癸二酸铵盐0.3％，葡萄糖3.5％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.022％；
补料培养基：葡萄糖50％，癸二酸铵盐25％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积5.5L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比2％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速700rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积6L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比20％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速800rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，发酵5h后流加补料培养基，发酵周期为35h；
最终发酵液中癸二酸-戊二胺盐的浓度为235.33g/kg，硫酸根离子含量为0.48g/kg。
实施例4
种子培养基：KH2PO4 0.3％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O 10ppm，十四碳二元酸铵盐2.0％，葡萄糖8％，玉米浆0.18％，苏氨酸0.033％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.50％，MnSO4·H2O0.040％，十四碳二元酸铵盐0.4％，葡萄糖3.0％，玉米浆0.2％，苏氨酸0.024％；
补料培养基：葡萄糖60％，十四碳二元酸铵盐35％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(5L)，发酵菌株为CIB172-3，接种比0.8％，通气比0.5vvm，温度38℃，转速600rpm，罐压0.08MPa，氨水控pH为7.0，在菌浓OD562达0.75后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积5L)，发酵菌株为CIB172-3，接种比8％，通气比0.5vvm，温度38℃，转速700rpm，罐压0.08MPa，氨水控pH为7.0，发酵3h后流加补料培养基，发酵周期为40h；
最终发酵液中十四碳二酸-戊二胺盐的浓度为266.45g/kg，硫酸根离子含量为0.25g/kg。
对比例1
种子培养基：KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O 0.35％，MnSO4·H2O 16ppm，硫酸铵0.4％，葡萄糖5％，玉米浆0.30％，苏氨酸0.045％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.30％，MnSO4·H2O0.010％，硫酸铵0.4％，葡萄糖2.0％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.030％；
补料培养基：葡萄糖20％，硫酸铵5％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(7L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比2％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速400rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(7L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比20％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速500rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，发酵6h后流加配置好的补料培养基，发酵周期40h；
最终发酵液中戊二胺的浓度为75.25g/kg，硫酸根离子含量为56.73g/kg。
对比例2
种子培养基：KH2PO4 0.4％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O 13.5ppm，氯化铵0.46％，葡萄糖15％，玉米浆0.27％，苏氨酸0.035％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O0.017％，氯化铵0.25％，葡萄糖3.5％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.022％；
补料培养基：葡萄糖50％，氯化铵25％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积5.5L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比2％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速700rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积6L)，发酵菌株为CIB132-3，接种比20％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速800rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，发酵5h后流加补料培养基，发酵周期为35h；
最终发酵液中戊二胺的浓度为55.25g/kg，氯离子含量为32.83g/kg。
效果实施例1
将实施例1-4和对比例1-3中得到的发酵液，检测无机离子的浓度，结果如表1所示。
组别 无机酸根离子浓度(g/kg)
实施例1 0.43
实施例2 0.37
实施例3 0.48
实施例4 0.25
对比例1 56.73
对比例2 32.83
效果实施例2
将实施例1-4制得的发酵液，经如下提取纯化过程，得到聚合级的二元酸戊二胺盐固体产品，再经聚合，可得到与现有聚合级单体聚合相媲美的聚合物。
提取纯化：
(1)将实施例1-4制得的发酵液，加热，以4800rpm的转速离心5min，得上层清液；
(2)将步骤(1)中得到的上层清液，和大孔吸附树脂混合均匀，震荡，吸附，分离，得二元酸戊二胺盐溶液；
(3)步骤(2)得到的二元酸戊二胺盐溶液经旋蒸至水含量30％(百分比为占二元酸戊二胺盐溶液的质量百分比)，调整二元酸和戊二胺的摩尔比为1:1.05，降温结晶，从55℃开始降温至30℃，得二元酸戊二胺盐固体产品。
聚合工艺：
将100升聚合釜用氮气置换空气，并将二元酸戊二胺盐的溶液在聚合釜中聚合，油浴温度升至230℃，待釜内压力升至1.73MPa，开始排气，待釜内温度达到265℃时，抽真空至-0.06MPa(真空表压)，保持该真空度20min，制得相应聚酰胺。
聚酰胺的粘数、色度、机械性能等，与现有市售聚酰胺相同。

Claims (17)

1.二元酸铵盐作为底物和/或氮源在发酵生产戊二胺的方法中的应用。
2.一种二元酸戊二胺盐溶液的制备方法，其中，所述戊二胺由发酵法制得，所述发酵过程中，以二元酸铵盐为底物和/或氮源。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述二元酸铵盐的结构式为：H4NOOC(CH2)nCOONH4和/或HOOC(CH2)nCOONH4，其中4≤n≤18；
所述二元酸铵盐优选包括长链二元酸铵盐，更优选包括：壬二酸一铵盐和/或二铵盐、癸二酸一铵盐和/或二铵盐、十一碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十二碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十三碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十四碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十五碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十六碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十七碳二元酸一铵盐和/或二铵盐和十八碳二元酸一铵盐和/或二铵盐中的一种或多种。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述底物还包括葡萄糖。
5.一种种子培养基，所述种子培养基包括氮源，所述氮源包括：二元酸铵盐。
6.如权利要求5所述的种子培养基，其特征在于：所述氮源还包括玉米浆；
和/或，所述种子培养基中的所述氮源的浓度为0.15％-2.8％；
优选的，所述二元酸铵盐的浓度为0.1％-2.5％；和/或，所述玉米浆的浓度为0.05％-0.3％。
7.如权利要求5或6所述的种子培养基，其特征在于：所述种子培养基还包括碳源、磷源、微量元素和生长因子；
其中，所述碳源包括：葡萄糖；所述碳源的浓度为5％-15％；
其中，所述磷源包括：KH2PO4；所述磷源的浓度为0.2-0.5％；
其中，所述微量元素包括：MgSO4·7H2O和/或MnSO4·H2O；所述微量元素的浓度为0.151-0.452％；优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.15-0.45％，和/或，所述MnSO4·H2O的浓度为10-20ppm；
其中，所述生长因子包括：苏氨酸和/或亮氨酸；所述生长因子的浓度为0.035-0.057％；优选的，所述苏氨酸的浓度为0.015-0.045％，和/或，所述亮氨酸的浓度为0.010-0.025％。
8.如权利要求7所述种子培养基，其特征在于：所述种子培养基包括：KH2PO4 0.2-0.5％，MgSO4·7H2O 0.15-0.45％，MnSO4·H2O 10-20ppm，长链二元酸铵盐0.1％-2.5％，葡萄糖5％-15％，玉米浆0.05％-0.3％，苏氨酸0.015-0.045％和亮氨酸0.010-0.025％，所述百分比为质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL。
9.一种发酵培养基，所述发酵培养基包括氮源，所述氮源包括：二元酸铵盐。
10.如权利要求9所述的发酵培养基，其特征在于：所述氮源还包括玉米浆；所述发酵培养基中的所述氮源的浓度为0.2-1.5％；
优选的，所述二元酸铵盐的浓度为0.1％-1％；和/或，所述玉米浆的浓度为0.1％-0.5％。
11.如权利要求9或10所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基还包括：碳源、磷源、微量元素和生长因子；
其中，所述碳源包括：葡萄糖；所述碳源的浓度为1％-6％；
其中，所述磷源包括：KH2PO4；所述磷源的浓度为0.02-0.06％；
其中，所述微量元素包括：MgSO4·7H2O和/或MnSO4·H2O；所述微量元素的浓度为0.11-0.55％；优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.1-0.5％，和/或，所述MnSO4·H2O的浓度为0.01-0.05％；
其中，所述生长因子包括：苏氨酸；所述生长因子的浓度为0.001-0.03％。
12.如权利要求11所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基包括以下成分：KH2PO4 0.02％-0.06％，MgSO4·7H2O 0.10％-0.50％，MnSO4·H2O 0.01％-0.05％，长链二元酸铵盐0.1％-1.0％，葡萄糖1.0％-6.0％，玉米浆0.1％-0.5％，苏氨酸0.01％-0.03％，所述百分比为质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL。
13.一种补料培养基，所述补料培养基中包括底物，所述底物包括二元酸铵盐。
14.如权利要求13所述的补料培养基，其特征在于：所述补料培养基中所述二元酸铵盐的浓度为5％-60％；
优选的，所述补料培养基中的底物还包括：葡萄糖10-80％，所述百分比为质量体积比，g/100mL。
15.一种二元酸戊二胺盐的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在戊二胺发酵过程中，使用如权利要求9-12任一项所述的发酵培养基和如权利要求13或14所述的补料培养基。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于：所述发酵过程中，发酵的接种量为5-20％，所述百分比为相对于发酵起始体积的体积百分比；和/或，发酵的温度为35-39℃；和/或，发酵的通风量为0.4-0.8vvm；和/或，发酵的罐压为0.05-0.2MPa，所述压力为表压；和/或，发酵的pH值为6-7；和/或，所述发酵2-6h后，流加如上所述的补料培养基。
17.如权利要求15或16所述的制备方法，其特征在于：所述二元酸胺的结构式为：-OOC(CH2)nCOO-+H3N-(CH2)m-NH3 +，其中4≤n≤18且4≤m≤6；所述二元酸戊二胺盐包括：丁二酸戊二胺盐、己二酸戊二胺盐、癸二酸戊二胺盐、十二碳二羧酸戊二胺盐、十三碳戊二胺盐、十四碳戊二胺盐。
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