CN110541006A - 含二元酸戊二胺盐的发酵液及方法及制得的二元酸戊二胺 - Google Patents

含二元酸戊二胺盐的发酵液及方法及制得的二元酸戊二胺 Download PDF

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CN110541006A CN201810528217.8A CN201810528217A CN110541006A CN 110541006 A CN110541006 A CN 110541006A CN 201810528217 A CN201810528217 A CN 201810528217A CN 110541006 A CN110541006 A CN 110541006A
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Abstract

本发明公开了包括二元酸戊二胺盐的发酵液的制备方法，包括以下步骤：a)发酵法制备二元酸铵盐溶液：以烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸盐为底物发酵，发酵时加入液氨和/或氨水，直至发酵结束，得包括二元酸铵盐的发酵液；(b)发酵法制备赖氨酸，得赖氨酸二元酸盐的发酵液；发酵时，流加补料培养基；(c)步骤(b)中得到的赖氨酸二元酸盐经赖氨酸脱羧酶的脱羧反应，得到二元酸戊二胺盐的酶转化液。本发明巧妙的将单体发酵合并，避免了戊二胺发酵过程中产生大量无机盐的问题，发酵结束后发酵液中就存在可以聚合的单体的盐，再通过后续提取纯化工艺，可以直接得到二元酸戊二胺产品。

Description

含二元酸戊二胺盐的发酵液及方法及制得的二元酸戊二胺
技术领域
本发明涉及发酵方法制得的含有二元酸戊二胺盐的发酵液及其制得的二元酸戊二胺产品。
背景技术
二元酸胺盐(又称：聚酰胺盐或尼龙盐)，是合成聚酰胺的前体。聚酰胺一般以胺和二元酸为单体原料，二者混合形成二元酸胺盐，再通过聚合得到的聚合物；该制备工艺的前提是：单体二元胺和二元酸，都必须是聚合级产品，具有很高的纯度，才能保证得到的聚酰胺具有工业应用价值。然而，聚合级戊二胺和聚合级二元酸的制备，是很复杂的过程，并且环保压力巨大。
以二元酸产品为例，现有二元酸大多通过生物发酵方法制得，并经多种复杂提取、纯化手段，从发酵液中提取得到聚合级二元酸。一般而言，从发酵液中得到常规聚合级二元酸需要经过以下复杂的步骤：发酵液经破乳(例如：加碱破乳或加热破乳)静置去除底物(例如：烷烃)、经结晶(例如：可以为酸化结晶)得到包含有大量菌体的二元酸粗产品晶析液、再经过滤去上层清液，将得到包括菌体的二元酸滤饼，滤饼经低温干燥，再经洗涤去除水溶性杂质，再加入有机溶剂进行抽提(同时可进行脱色)，再经过滤，滤除脱色剂、菌体、无机盐等，得到含有二元酸的有机溶剂，再将二元酸结晶、过滤、干燥，得纯度较高的二元酸产品。由于发酵液中含有菌体、培养基、未发酵的底物、大量无机盐、蛋白质、水等多种杂质，且多相共存，组成复杂，介质粘稠，各个步骤操作要求都比较高，需要消耗大量能量，成本很高，且收率很低。
再以戊二胺产品为例，生物法制备戊二胺的方法主要有两种：一种是使用微生物利用葡萄糖通过复杂的代谢调控，转化得到戊二胺，即从生产赖氨酸的微生物开始，通过引入编码赖氨酸脱羧酶的任选基因可以产生戊二胺；另一种方法是将纯化的赖氨酸盐用赖氨酸脱羧酶进行脱羧生成1，5-戊二胺。中国专利CN201180010538.5公布了一种利用微生物转化合成戊二胺的方法，它构建了能分泌表达赖氨酸脱羧酶的微生物，在发酵生产赖氨酸脱羧酶，然后向微生物培养基中投入赖氨酸，从而把赖氨酸转化为戊二胺。这种方法需要一定纯度的赖氨酸，需要另外的赖氨酸生产和纯化工艺。中国专利CN201410004636.3公布了一种向赖氨酸发酵液中加入赖氨酸脱羧酶的方法来生产戊二胺。这种方法虽然不需要纯化赖氨酸，但需要生产和纯化赖氨酸脱羧酶，这是一个非常复杂的工艺过程。专利CN105441497A，CN105316270A公布了利用微生物发酵和微生物转化偶联生产戊二胺的方法，利用基因工程技术，将不同来源的赖氨酸脱羧酶基因克隆至高产赖氨酸的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌中进行分泌表达，将重组菌株进行发酵，第一阶段主要是重组菌株合成赖氨酸，第二阶段诱导赖氨酸脱羧酶基因进行分泌表达，并将赖氨酸转化成戊二胺。
但是不管是上述哪种方法，在发酵生产戊二胺或者发酵生产赖氨酸的过程中，由于底物，培养基，pH调节过程等，会不可避免的会产生大量无机盐。这些无机盐，需要复杂的处理工艺才能去除，因此大量无机盐的产生对后续提取工艺产生了很大的压力，使得后期的污水处理成本非常高，且除盐工艺复杂度很高，处理不当则对环境有很不利的影响。因此，在保证发酵的转化率的基础上，尽量减少发酵液中盐含量，为后续处理工艺带来方便且不增加环保压力，是现有技术亟待解决的非常有现实意义的问题。
由此，如何解决聚合级戊二胺和聚合级二元酸的制备过程复杂，并且环保压力巨大的问题，具有非常现实的社会意义。
发明内容
为了解决现有戊二胺和二元酸经发酵和提取纯化的工艺得到聚合级产品的过程中，工艺步骤复杂，且会产生大量的无机盐，使得后期的污水处理成本非常高，且除盐工艺复杂度高，处理不当则对环境有很不利的影响的问题，本发明提供一种含二元酸戊二胺盐的酶转化液、其制备方法，以及制得的二元酸戊二胺产品。
本发明的目的之一是，提供一种二元酸戊二胺盐的酶转化液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)发酵法制备二元酸铵盐溶液：以烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸盐中的一种或多种为底物发酵，在所述发酵时加入液氨和/或氨水，直至发酵结束，得到包括二元酸铵盐的发酵液；
(b)发酵法制备赖氨酸，得赖氨酸二元酸盐的发酵液；
其中，步骤(b)中所述发酵时，流加补料培养基，所述补料培养基包括底物，所述底物包括：葡萄糖和步骤(a)制得的二元酸铵盐；
步骤(b)中所述发酵的培养基包括：氮源、碳源、磷源、微量元素和生长因子，所述氮源包括玉米浆和步骤(a)制得的二元酸铵盐；
(c)步骤(b)中得到的赖氨酸二元酸盐经赖氨酸脱羧酶的脱羧反应，得到二元酸戊二胺盐的酶转化液。
以下，针对上述技术方案的进一步优选的技术方案，做详细说明：
本发明的发明人，为了制备二元酸铵盐，在二元酸发酵时，加入液氨和/或氨水，一方面，液氨和/或氨水可以部分参与调节pH，另一方面，还可以选择性的作为氮源使用。因此在加入液氨和/或氨水时，需要综合多方面因素考虑，才能保证发酵体系的稳定，保证最终产物的产量和纯度。而现有发酵过程中，都没有制备二元酸铵盐的方法，更加不会对液氨和/或氨水的添加量、添加方式和氨水浓度等有任何说明。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述液氨和/或氨水的加入方式为连续加入，或，间歇分批加入。所述连续加入为恒速加入，或，变速加入。所述恒速加入的加入速度为0.35-3.5g/h/L。所述变速加入的加入速度为0-3.5g/h/L。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述氨水的加入量为50-500g/L，优选100-300g/L。所述氨水浓度为氨含量25％以上，所述百分比为质量百分比。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述液氨的加入量为12-125g/L，优选35-80g/L。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，在所述发酵时加入液氨和/或氨水，控制所述发酵过程中，菌体生长期控制pH为3.0-6.5，发酵产酸期控制pH为5.0-8.0。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述发酵的温度为28-32℃；和或，所述发酵的通风比为0.3-0.7vvm；和或，所述发酵的罐压为0.05-0.14MPa，所述罐压为表压；和或，所述发酵的溶氧为10％以上；和或，所述发酵的周期为130-180h。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，发酵12-18h时第一次批加底物，之后当发酵液中底物含量低于5％-8％时再批加底物，发酵过程中可补加葡萄糖。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述底物包括C9-C18的烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C14、C15和C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸戊二胺盐可以包括：C9-C18的脂肪族或芳香族二元胺和C9-C18的脂肪族或芳香族二元羧酸形成的盐。二元胺的胺基和二元羧酸的羧基都位于端基。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸铵盐的结构式为：H4NOOC(CH2)nCOONH4和/或HOOC(CH2)nCOONH4，其中9≤n≤18。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述二元酸铵盐包括长链二元酸一铵盐和/或长链二元酸二铵盐；优选包括：壬二酸一铵盐和/或二铵盐、癸二酸一铵盐和/或二铵盐、十一碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十二碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十三碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十四碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十五碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十六碳二元酸一铵盐和/或二铵盐、十七碳二元酸一铵盐和/或二铵盐，和十八碳二元酸一铵盐和/或二铵盐中的一种或多种。
本发明的一个优选的技术方案，所述二元酸戊二胺盐可以为：癸二酸戊二胺盐、十二碳二羧酸戊二胺盐、十三碳戊二胺盐、十四碳戊二胺盐等。二元酸戊二胺盐还可以包括含芳香结构的二元酸戊二胺盐，例如：对苯二甲酸戊二胺盐等。并且，为了得到不同性能的共聚物，还可以根据需要得到不同种类聚酰胺形成的二元酸戊二胺盐或聚酰胺和聚合单体形成的二元酸戊二胺盐。本发明的二元酸戊二胺盐还可以是不同的二元酸戊二胺盐混合物。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述发酵的菌种包括：热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述发酵的培养基包括：碳源、氮源、磷源、微量金属元素源和生长因子；
其中，步骤(a)中，所述碳源包括或者是：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、阿拉伯糖、鼠李糖、甲醇和乙醇中的一种或多种。所述碳源的浓度优选10-60g/L；
其中，步骤(a)中，所述氮源包括或者是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种。所述氮源的浓度优选1-10g/L；
其中，步骤(a)中，所述磷源包括或者是磷酸正盐、磷酸一氢盐和磷酸二氢盐中的一种或多种；优选包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵和磷酸二氢钠中的一种或多种。所述磷源的浓度优选1-10g/L；
其中，步骤(a)中，所述微量金属元素包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种；优选地，所述微量金属元素源包括或者是氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁和硫酸铜中的一种或多种。每种所述微量元素的浓度优选0.1-50ppm；
其中，步骤(a)中，所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种；优选地，所述生长因子包括或者是维生素B1、维生素B2、维生素C和生物素中的一种或多种。每种所述生长因子的浓度优选0.01-1ppm。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述发酵培养基为水溶液培养基；优选地，所述发酵培养基包含如下成分：葡萄糖10-60g/L、硝酸钾0.2-6g/L、磷酸二氢钾0.2-6g/L、硫酸铵0.5-3g/L以及硫酸镁0.5-6g/L。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述包括二元酸铵盐的发酵液中，所述二元酸铵盐的浓度为80-180g/L。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述包括二元酸铵盐的发酵液中包括但不仅限于水分、长链二元酸盐、菌体和其它杂质。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(a)中，所述包括二元酸铵盐的发酵液还可以进一步处理，得包括二元酸铵盐的发酵处理液；所述的发酵处理液是除去发酵液中的除二元酸铵盐以外的一种或者多种其它组分或降低其含量后得到的液体。可以通过陶瓷膜过滤、离心机、絮凝过滤、活性炭过滤等手段除去发酵液中除长链二元酸盐以外的一种或者多种其它组分或降低其含量来获得发酵处理液。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵培养基中的所述氮源的浓度为0.2％-1.5％。所述二元酸铵盐的浓度为0.1％-1％；和/或，所述玉米浆的浓度为0.1％-0.5％。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵培养基中的碳源包括：葡萄糖；所述碳源的浓度为1％-6％。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵培养基中的磷源包括：KH2PO4；所述磷源的浓度为0.02％-0.06％。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵培养基中的微量元素包括：MgSO4·7H2O和/或MnSO4·H2O；所述微量元素的浓度为0.11％-0.55％；优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.1％-0.5％，和/或，所述MnSO4·H2O的浓度为0.01％-0.05％。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵培养基中的生长因子包括：苏氨酸；所述生长因子的浓度为0.001％-0.03％。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵培养基包括以下成分：KH2PO40.02％-0.06％，MgSO4·7H2O 0.10％-0.50％，MnSO4·H2O 0.01％-0.05％，二元酸铵盐0.1％-1.0％，葡萄糖1.0％-6.0％，玉米浆0.1％-0.5％，苏氨酸0.01％-0.03％。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述底物以补料培养基的方式加入。所述补料培养基中所述二元酸铵盐的浓度为5％-60％。所述补料培养基中所述葡萄糖的浓度为10％-80％。所述发酵2-6h后，流加如上所述的补料培养基。
本领域技术人员均理解，上述培养基中的所述百分比为质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵过程中使用的微生物选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、深海热球菌(Pyrococcusabyssi)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述发酵过程中，接种后的起始体积为发酵罐体积的30％-70％，所述百分比为发酵培养基的体积占发酵罐体积的百分比；和/或，所述发酵的接种量为5-20％(v/v)，所述百分比为相对于发酵起始体积的体积百分比；和/或，所述发酵的温度为35-39℃；和/或，所述发酵的通风量为0.4-0.8vvm；和/或，所述发酵的罐压为0.05-0.2MPa，所述压力为表压；和/或，所述发酵的pH值为6-7。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述底物以补料培养基的方式加入，所述发酵2-6h后，流加所述补料培养基。
本发明中，所述二元酸铵盐，可以以二元酸铵盐固体或者湿固体的形式加入，或者以二元酸铵盐溶液的形式加入，例如二元酸铵盐发酵液或者二元酸铵盐的发酵处理液；在计算二元酸铵盐的加入量时，不管是以哪种方式加入，均以有效成分二元酸铵盐的质量，计算加入量。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述的赖氨酸发酵液可以为：赖氨酸发酵原液，赖氨酸发酵原液的浓缩液或稀释液，赖氨酸发酵原液去除菌体后的除菌赖氨酸发酵液和除菌赖氨酸发酵液的浓缩液或稀释液。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述赖氨酸发酵液中的赖氨酸含量为1％-50％，更优选5-20％(w/w)。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(b)中，所述赖氨酸的发酵液的pH值为4.0-9.0，优选为4.5-8.5。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(c)中，所述赖氨酸脱羧酶添加重量(按赖氨酸脱羧酶细胞干基计算)与赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量(按照赖氨酸二元酸盐分子量计)比值为(1：80)-(1：295)，优选(1：200)-(1：295)。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(c)中，所述赖氨酸经赖氨酸脱羧酶作用时，还加入辅酶，所述辅酶包括：吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺中的一种或多种，更优选为5'－磷酸吡哆醛。
本发明的一个优选的技术方案，所述辅酶的浓度按反应体系重量计为0.1-0.5mmol/L。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(c)中，所述脱羧反应的温度为20-50℃，优选28℃-40℃，例如可以为：25℃、36℃、38℃、40℃、50℃。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(c)中，所述脱羧反应的时间为10-20h。
本发明的一个优选的技术方案，步骤(c)中，所述脱羧反应结束后反应体系中残余的赖氨酸的含量为100ppm以下。
本发明的目的之二是，提供如上所述的制备方法制得的包括二元酸戊二胺盐的酶转化液。
本发明的目的之三是，提供一种包括二元酸戊二胺盐的酶转化液，所述发酵液中，所述二元酸戊二胺盐的含量为50-500g/kg，优选100-350g/kg，所述含量为二元酸戊二胺盐占酶转化液的量。
从本发明的发明构思加以考虑，现有技术的常规思路均先得到质量较高的聚合单体——二元酸和二胺(特别是戊二胺)，二者再经成盐、聚合，得到各种聚合物。而本发明，巧妙的将单体发酵合并，利用二元酸发酵后得到的产物二元酸铵盐，作为赖氨酸发酵的底物和培养基中的氮源，不但可以节省赖氨酸发酵再制备戊二胺的过程中的原料的消耗，更主要的，避免了戊二胺制备过程中产生的无法利用且对环境有损害的无机离子的问题，避免了后续提取纯化工艺的压力。发酵结束后经酶转化得到的酶转化液中，存在可以聚合的单体的盐，再通过后续提取纯化工艺，可以直接得到二元酸戊二胺盐产品。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明各实施例涉及的性能参数的检测方法如下所示：
发酵液中硫酸根离子的检测方法参考：GB/T 13025.8-2012
发酵液中氯离子的检测方法参考：GB/T 15453-2008。
实施例1
(a)发酵法制备十二碳二元酸铵盐：
(a-1)菌种活化：
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中，pH自然，29℃下，220rpm、振幅26-50mm摇床培养1天；YPD培养基包括：20g/L葡萄糖，10g/L酵母浸粉，20g/l蛋白胨；pH7.0-7.5；
(a-2)种子罐培养，制备种子液：
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种后发酵体系的起始pH值为6.0，29℃下，通风比0.5vvm，罐压0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的溶解氧大于等于10％，培养18h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15；
种子培养基包括：20g/L蔗糖，8g/L玉米浆液，5g/L酵母提取液，8g/L KH2PO4，3g/L脲，15mL/L底物，用水制备，并在121℃下灭菌20min；脲单独灭菌，110℃下灭菌15min，冷却后与灭过菌的其他成分混合；
(a-3)发酵：
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：葡萄糖30g/L、硝酸钾2g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L；
发酵过程控制温度29℃，通风比为0.5vvm，罐压为0.1MPa(表压)，保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10％，发酵起始控制pH为6.0，发酵最初18h内控制pH4.0-5.0，发酵18h直至发酵结束控制pH为5.0-8.0；发酵18h时第一次批加底物正十二烷烃，之后当发酵液中底物含量低于5％时再批加底物；发酵过程中以0.7g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，发酵结束后补加100g/L氨水，氨水的总加入量为210g/L；
总发酵周期155h；得到十二碳二元酸铵盐溶液，浓度为180g/L；
(b)将步骤(a)制得的十二碳二元酸铵盐溶液，按照如下配比，制备赖氨酸发酵的种子培养基、发酵培养基和补料培养基(其中，百分比为占培养基的质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL，十二碳二元酸铵盐的百分比为有效成分十二碳二元酸铵盐占培养基的质量体积比)：
种子培养基：KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O 0.35％，MnSO4·H2O 16ppm，十二碳二元酸铵盐(步骤(a)制得)0.4％，葡萄糖5％，玉米浆0.30％，苏氨酸0.045％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.30％，MnSO4·H2O 0.010％，十二碳二元酸铵盐(步骤(a)制得)0.4％，葡萄糖2.0％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.030％；
补料培养基：葡萄糖20％，十二碳二元酸铵盐(步骤(a)制得)5％；
(c)发酵法制备赖氨酸，得赖氨酸二元酸盐的发酵液：
(c-1)种子罐培养：10L发酵罐(7L)，发酵菌株为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，接种比2％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速400rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐；
(c-2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积7L)，接种比20％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速500rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，发酵6h后流加配置好的补料培养基，发酵周期40h，得到赖氨酸发酵液，赖氨酸发酵液中的赖氨酸含量为31.8％，pH值为6.7；
(d)赖氨酸二元酸盐中的赖氨酸经赖氨酸脱羧酶作用得戊二胺，形成十二碳二元酸戊二胺盐的酶转化液：
在赖氨酸发酵液中加入一定量的赖氨酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶添加重量(按赖氨酸脱羧酶细胞干基计算)与赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量(按照赖氨酸十二碳二元酸盐计)比值为1：255，辅酶5'－磷酸吡哆醛的浓度按反应体系重量计为0.2mmol/L；在100rpm、35℃进行脱羧反应12h，赖氨酸转化成戊二胺，赖氨酸转化率大于99％，结束反应，形成十二碳二元酸-戊二胺盐的溶液；
最终十二碳二元酸-戊二胺盐的溶液(酶转化液)中，十二碳二元酸-戊二胺盐的浓度为270.63g/kg；硫酸根离子浓度为0.43g/kg。
实施例2
(a)发酵法制备癸二酸铵盐：
(a-1)菌种活化：
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中，pH自然，29℃下，220rpm摇床培养1天；YPD培养基包括：20g/L葡萄糖，10g/L酵母浸粉，20g/l蛋白胨；pH7.0；
(a-2)种子罐培养，制备种子液：
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种后发酵体系的起始pH值为6.0，29℃下，通风比0.5vvm，罐压0.1MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的溶解氧大于等于10％，培养18-20h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15；
种子培养基包括：20g/L蔗糖，8g/L玉米浆液，5g/L酵母提取液，8g/L KH2PO4，3g/L脲，用水制备，并在121℃下灭菌20min；脲单独灭菌，110℃下灭菌15min，冷却后与灭过菌的其他成分混合；
(a-3)发酵：
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：葡萄糖40g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸铵4g/L，硫酸镁1g/L；
发酵过程控制温度29℃，通风比为0.3vvm，罐压为0.1MPa(表压)，保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10％，发酵起始控制pH为6.0，发酵最初18h内控制pH4.0-5.0，发酵18h直至发酵结束控制pH为5.0-8.0；发酵18h时第一次批加底物正十碳烷烃，之后当发酵液中底物含量低于2％时再批加底物；发酵过程中0-5h以0.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，5-18h以2g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，18-48h以1.5g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，48-120h以0.4g/h/L的速度连续补加氨水(氨气含量25％)，氨水的加入量为100g/L；
总发酵周期165h；得到癸二酸铵盐溶液，浓度为120g/L；
(b)将步骤(a)制得的癸二酸铵盐溶液，按照如下配比，制备赖氨酸发酵的种子培养基、发酵培养基和补料培养基(其中，百分比为占培养基的质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL，癸二酸铵盐的百分比为有效成分癸二酸铵盐占培养基的质量体积比)：
种子培养基：KH2PO4 0.4％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O 13.5ppm，癸二酸铵盐(步骤(a)制得)0.58％，葡萄糖15％，玉米浆0.27％，苏氨酸0.035％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O 0.017％，癸二酸铵盐(步骤(a)制得)0.3％，葡萄糖3.5％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.022％；
补料培养基：葡萄糖50％，癸二酸铵盐(步骤(a)制得)25％；
(c)发酵法制备赖氨酸，得赖氨酸二元酸盐的发酵液：
(c-1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积5.5L)，发酵菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)，接种比2％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速700rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐。
(c-2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积6L)，接种比20％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速800rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，发酵5h后流加补料培养基，发酵周期为35h，得到赖氨酸发酵液，赖氨酸发酵液中的赖氨酸含量为27.6％，pH值为6.7；
(d)赖氨酸二元酸盐中的赖氨酸经赖氨酸脱羧酶作用得戊二胺，形成十二碳二元酸戊二胺盐的酶转化液：
在赖氨酸发酵液中加入一定量的如上所制得的赖氨酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶添加重量(按赖氨酸脱羧酶细胞干基计算)与赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量(按照赖氨酸癸二酸盐计)比值为1：249，辅酶5'－磷酸吡哆醛的浓度按反应体系重量计为0.15mmol/L；在100rpm、35℃进行脱羧反应12h，赖氨酸转化成戊二胺，赖氨酸转化率大于99％，结束反应，形成癸二酸-戊二胺盐的溶液；
最终癸二酸-戊二胺盐的溶液(酶转化液)中，癸二酸-戊二胺盐的浓度为235.33g/kg，硫酸根离子含量为0.48g/kg。
实施例3
(a)发酵法制备十二碳二元酸铵盐：
(a-1)菌种活化：
取假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm、振幅26-50mm摇床培养1天；YPD培养基包括：20g/L葡萄糖，10g/L酵母浸粉，20g/l蛋白胨；pH7.0-7.5；
(a-2)种子罐培养，制备种子液：
取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种后发酵体系的起始pH值为6.0，30℃下，通风比0.55vvm，罐压0.08MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的溶解氧大于等于10％，培养16h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为15；
种子培养基包括：22g/L蔗糖，6g/L玉米浆液，6g/L酵母提取液，7g/L KH2PO4，3g/L脲，15mL/L底物，用水制备，并在121℃下灭菌20min；脲单独灭菌，110℃下灭菌15min，冷却后与灭过菌的其他成分混合；
(a-3)发酵：
将种子液接种到所述含有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括：葡萄糖42g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸铵3g/L，硫酸镁1.6g/L；
发酵过程控制温度28℃，通风比为0.6vvm，罐压为0.1MPa(表压)，保持一定的搅拌速度以控制溶氧≥10％，发酵起始控制pH为6.0，发酵最初18h内控制pH4.0-5.0，发酵18h直至发酵结束控制pH为5.0-8.0；发酵18h时第一次批加底物正十二烷烃，之后当发酵液中底物含量低于5％时再批加底物；发酵过程中以0.12g/h/L的速度连续补加液氨，液氨的加入量为20g/L。
总发酵周期180h；得到十二碳二元酸铵盐溶液，浓度为166g/L；
(b)将步骤(a)制得的十二碳二元酸铵盐溶液，按照如下配比，制备赖氨酸发酵的种子培养基、发酵培养基和补料培养基(其中，百分比为占培养基的质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL，十二碳二元酸铵盐的百分比为有效成分十二碳二元酸铵盐占培养基的质量体积比)：
种子培养基：KH2PO4 0.6％，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 15ppm，十二碳二元酸铵盐(步骤(a)制得)0.35％，葡萄糖5％，玉米浆0.30％，苏氨酸0.05％，亮氨酸0.030％；
发酵培养基：KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.35％，MnSO4·H2O 0.015％，十二碳二元酸铵盐(步骤(a)制得)0.4％，葡萄糖1.5％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.030％；
补料培养基：葡萄糖20％，十二碳二元酸铵盐(步骤(a)制得)5％；
(c)发酵法制备赖氨酸，得赖氨酸二元酸盐的发酵液：
(c-1)种子罐培养：10L发酵罐(7L)，发酵菌株为嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)，接种比2％，通气比0.7vvm，温度38℃，转速450rpm，罐压0.045MPa，氨水控pH为7.0，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐；
(c-2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积7L)，接种比20％，通气比0.7vvm，温度38℃，转速450rpm，罐压0.045MPa，氨水控pH为7.0，发酵6h后流加配置好的补料培养基，发酵周期40h，得到赖氨酸发酵液，赖氨酸发酵液中的赖氨酸含量为33％，pH值为6.8；
(d)赖氨酸二元酸盐中的赖氨酸经赖氨酸脱羧酶作用得戊二胺，形成十二碳二元酸戊二胺盐的酶转化液：
在赖氨酸发酵液中加入一定量的赖氨酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶添加重量(按赖氨酸脱羧酶细胞干基计算)与赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量(按照赖氨酸十二碳二元酸盐计)比值为1：255，辅酶5'－磷酸吡哆醛的浓度按反应体系重量计为0.2mmol/L；在100rpm、35℃进行脱羧反应12h，赖氨酸转化成戊二胺，赖氨酸转化率大于99％，结束反应，形成十二碳二元酸-戊二胺盐的溶液；
最终十二碳二元酸-戊二胺盐的溶液(酶转化液)中，十二碳二元酸-戊二胺盐的浓度为272.5g/kg；硫酸根离子浓度为0.45g/kg。
对比例1
种子培养基：KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O 0.35％，MnSO4·H2O 16ppm，硫酸铵0.4％，葡萄糖5％，玉米浆0.30％，苏氨酸0.045％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.30％，MnSO4·H2O 0.010％，硫酸铵0.4％，葡萄糖2.0％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.030％；
补料培养基：葡萄糖20％，硫酸铵5％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积7L)，发酵菌株为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，接种比2％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速400rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐；
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积7L)，接种比20％，通气比0.8vvm，温度39℃，转速500rpm，罐压0.05MPa，氨水控pH为7.0，发酵6h后流加配置好的补料培养基，发酵周期40h，得到赖氨酸发酵液，赖氨酸发酵液中的赖氨酸含量为8.8％，pH值为6.7；
(3)在赖氨酸发酵液中加入一定量的如上所制得的赖氨酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶添加重量(按赖氨酸脱羧酶细胞干基计算)与赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量(按照赖氨酸硫酸盐计)比值为1：186，辅酶5'－磷酸吡哆醛的浓度按反应体系重量计为0.1mmol/L；在100rpm、35℃进行脱羧反应6h，赖氨酸转化成戊二胺，赖氨酸转化率大于99％，结束反应，形成戊二胺的溶液；
最终戊二胺盐的溶液(酶转化液)中，戊二胺的浓度为75.25g/kg，硫酸根离子含量为56.73g/kg。
对比例2
种子培养基：KH2PO4 0.4％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O 13.5ppm，氯化铵0.46％，葡萄糖15％，玉米浆0.27％，苏氨酸0.035％，亮氨酸0.025％；
发酵培养基：KH2PO4 0.04％，MgSO4·7H2O 0.25％，MnSO4·H2O 0.017％，氯化铵0.25％，葡萄糖3.5％，玉米浆0.50％，苏氨酸0.022％；
补料培养基：葡萄糖50％，氯化铵25％。
(1)种子罐培养：10L发酵罐(工作体积5.5L)，发酵菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)，接种比2％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速700rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，在菌浓OD562达1.00后，接入发酵罐。
(2)发酵罐培养：10L发酵罐(工作体积6L)，接种比20％，通气比0.4vvm，温度37℃，转速800rpm，罐压0.10MPa，氨水控pH为6.5，发酵5h后流加补料培养基，发酵周期为35h，得到赖氨酸发酵液，赖氨酸发酵液中的赖氨酸含量为6.5％，pH值为6.7；
(3)在赖氨酸发酵液中加入一定量的如上所制得的赖氨酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶添加重量(按赖氨酸脱羧酶细胞干基计算)与赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量(按照赖氨酸盐酸盐计)比值为1：273，辅酶5'－磷酸吡哆醛的浓度按反应体系重量计为0.1mmol/L；在100rpm、37℃进行脱羧反应5h，赖氨酸转化成戊二胺，赖氨酸转化率大于99％，结束反应，形成戊二胺盐的溶液；
最终戊二胺盐的溶液(酶转化液)中，戊二胺的浓度为55.25g/kg，氯离子含量为32.83g/kg。
效果实施例1
将实施例1-3制得的发酵液，经如下提取纯化过程，得到聚合级的二元酸戊二胺盐固体产品，再经聚合，可得到与现有聚合级单体聚合相媲美的聚合物。
提取纯化：
(1)将实施例1-3制得的发酵液，加热，以4800rpm的转速离心5min，得上层清液；
(2)将步骤(1)中得到的上层清液，和大孔吸附树脂混合均匀，震荡，吸附，分离，得二元酸戊二胺盐溶液；
(3)步骤(2)得到的二元酸戊二胺盐溶液经旋蒸至水含量30％(百分比为占二元酸戊二胺盐溶液的质量百分比)，降温结晶，从55℃开始降温至30℃，得二元酸戊二胺盐固体产品。
聚合工艺：
将100升聚合釜用氮气置换空气，并将二元酸戊二胺盐的溶液在聚合釜中聚合，油浴温度升至230℃，待釜内压力升至1.73MPa，开始排气，待釜内温度达到265℃时，抽真空至-0.06MPa(真空表压)，保持该真空度20min，制得相应聚酰胺。
聚酰胺的粘数、色度、机械性能等，与现有市售聚酰胺相同。

Claims (13)

1.一种二元酸戊二胺盐的酶转化液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)发酵法制备二元酸铵盐溶液：以烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酸盐中的一种或多种为底物发酵，在所述发酵时加入液氨和/或氨水，直至发酵结束，得到包括二元酸铵盐的发酵液；
(b)发酵法制备赖氨酸，得赖氨酸二元酸盐的发酵液；
其中，步骤(b)中所述发酵时，流加补料培养基，所述补料培养基包括底物，所述底物包括：葡萄糖和步骤(a)制得的二元酸铵盐；
步骤(b)中所述发酵的培养基包括：氮源、碳源、磷源、微量元素和生长因子，所述氮源包括玉米浆和步骤(a)制得的二元酸铵盐；
(c)步骤(b)中得到的赖氨酸二元酸盐经赖氨酸脱羧酶的脱羧反应，得到二元酸戊二胺盐的酶转化液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，控制所述发酵过程中，菌体生长期控制pH为3.0-6.5，发酵产酸期控制pH为5.0-8.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述底物包括C9-C18的烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；所述二元酸铵盐的结构式为：H4NOOC(CH2)nCOONH4和/或HOOC(CH2)nCOONH4，其中9≤n≤18；
所述二元酸铵盐包括癸二酸戊二胺盐、十二碳二羧酸戊二胺盐、十三碳戊二胺盐和十四碳戊二胺盐中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述包括二元酸铵盐的发酵液中，所述二元酸铵盐的浓度为80-180g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述包括二元酸铵盐的发酵液经进一步处理，得包括二元酸铵盐的发酵处理液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述发酵培养基中的所述氮源的浓度为0.2％-1.5％；其中，所述二元酸铵盐的浓度为0.1％-1％；和/或，所述玉米浆的浓度为0.1％-0.5％，所述百分比为质量体积比，g/100mL；
步骤(b)中，所述发酵培养基中的碳源包括：葡萄糖；所述碳源的浓度为1％-6％；所述发酵培养基中的磷源包括：KH2PO4；所述磷源的浓度为0.02％-0.06％；所述发酵培养基中的微量元素包括：MgSO4·7H2O和/或MnSO4·H2O；所述微量元素的浓度为0.11％-0.55％；优选的，所述MgSO4·7H2O的浓度为0.1％-0.5％，和/或，所述MnSO4·H2O的浓度为0.01％-0.05％；所述发酵培养基中的生长因子包括：苏氨酸；所述生长因子的浓度为0.001％-0.03％，所述百分比为质量体积比，g/100mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述底物以补料培养基的方式加入；所述补料培养基中，所述二元酸铵盐的浓度为5％-60％；所述葡萄糖的浓度为10％-80％；所述发酵2-6h后，流加如上所述的补料培养基；所述百分比为质量体积比，g/100mL，所述ppm为g/10000mL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述发酵过程中使用的微生物选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、深海热球菌(Pyrococcusabyssi)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述发酵的温度为35-39℃；和/或，所述发酵的通风量为0.4-0.8vvm；和/或，所述发酵的罐压为0.05-0.2MPa，所述压力为表压；和/或，所述发酵的pH值为6-7。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中，所述赖氨酸脱羧酶添加重量与赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量(按照赖氨酸二元酸盐分子量计)比值为(1：80)-(1：295)，优选(1：200)-(1：295)；其中，所述赖氨酸脱羧酶添加重量按赖氨酸脱羧酶细胞干基计算，所述赖氨酸发酵液中的赖氨酸重量按照赖氨酸二元酸盐分子量计；
所述赖氨酸经赖氨酸脱羧酶作用时，还加入辅酶，所述辅酶包括：吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺中的一种或多种；所述辅酶的浓度按反应体系重量计为0.1-0.5mmol/L。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中，所述脱羧反应的温度为20-50℃；所述脱羧反应的时间为10-20h。
12.如权利要求1-11任一项所述的制备方法制得的包括二元酸戊二胺盐的酶转化液。
13.一种包括二元酸戊二胺盐的酶转化液，所述发酵液中，所述二元酸戊二胺盐的含量为50-500g/kg，优选100-350g/kg，所述含量为二元酸戊二胺盐占酶转化液的量。
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