CN109722458A - 电渗析法分离提取全细胞催化液中的戊二胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了电渗析分离提取全细胞催化液中的1,5‑戊二胺的方法，将全细胞催化液中的上清液加入双极膜电渗析设备的盐槽中电渗析，得碱槽溶液。与现有技术相比，在戊二胺生产过程中不需要加入强碱置换出游离戊二胺，并且不会产生相应的固体废渣。该方法不仅降低了辅料成本，还解决了固体废渣排放的问题，在工业化生产中具有极高的应用价值。

Description

电渗析法分离提取全细胞催化液中的戊二胺的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物法生产戊二胺的分离提 取方法。

背景技术

1,5-戊二胺(1,5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷(1,5-Diaminopentane)，与二元酸可聚合成高分子聚酰胺材料(即尼龙)。全球每年 生产约700万吨聚酰胺材料，消耗大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要 组成单体—1,5-戊二胺具有重要的经济学和生态学意义。

全细胞催化法以赖氨酸为底物，利用菌体细胞中的赖氨酸脱羧酶催化产生戊 二胺。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，利润率极低。 因此，开发高效的以赖氨酸为底物的戊二胺生物催化的生产方法，不但可以开发 新型生物基材料市场，还可以推进氨基酸发酵产业的转型升级。

关于从发酵液/全细胞催化液中分离提取戊二胺的现有技术，可以列举以下的 报道。专利US7189543B2公布了直接从催化液中制备戊二胺己二酸盐晶体的方 法。使用己二酸中和全细胞催化过程中产生的戊二胺，获得pH为6.0的戊二胺 己二酸盐溶液；去除戊二胺催化液中的细胞，活性炭脱色后浓缩至盐含量为 70-77％，降温得到戊二胺己二酸盐晶体，用于尼龙聚合。专利(US2010/0292429A1, CN101981202A和EP1482055A1)和文献(Metabolic Engineering,2014,25:113– 123)公开了应用丁醇萃取法从发酵液中分离提取戊二胺。在戊二胺发酵液中加 入氢氧化钠，高温回流裂解发酵液中的副产物后，使用丁醇多次萃取获得含有戊 二胺的有机相，蒸出有机相中的低沸点溶剂得到高沸点的戊二胺，进一步精馏获 得高纯度的戊二胺。目前公开的戊二胺分离提取的现有技术中，析晶法得到戊二 胺羧酸盐的收率低，并且残存赖氨酸等杂质，难以进一步精制，所得到的戊二胺 羧酸盐用作聚酰胺树脂膜材料时产生鱼眼等表面外观缺陷，并影响注射成型的流 动性(CN101578256A)。萃取和蒸馏法首先需要在发酵液或全细胞催化液中加 入强碱，如氢氧化钠，置换出游离的戊二胺，才可以进一步萃取或蒸馏出戊二胺。 该方法需要消耗大量的碱，并且与发酵液或全细胞催化液中的酸根离子产生相应 的盐，形成大量的固体废渣，不利于戊二胺的大规模工业化生产。

发明内容

本发明提供的1,5-戊二胺分离提取方法，与现有技术相比，在戊二胺生产过 程中不需要加入强碱置换出游离戊二胺，并且不会产生相应的固体废渣。该方法 不仅降低了辅料成本，还解决了固体废渣排放的问题，在工业化生产中具有极高 的应用价值。

具体而言，本发明的方法包括：

(1)培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞，获得包含1,5-戊二胺的催化液；和

(2)提取步骤(1)获得的催化液中的1,5-戊二胺。

优选在本发明的方法的步骤(1)中，所述细胞是过表达赖氨酸脱羧酶的细 胞，优选是赖氨酸脱羧酶基因表达增强(如，通过替换赖氨酸脱羧酶基因的启动 子为强启动子(如，T7启动子)而表达增强)的细胞。

也优选在本发明的方法的步骤(1)中，所述细胞是细菌细胞，优选是大肠 杆菌细胞，如大肠杆菌BL21(DE3)。

另外优选在本发明的方法的步骤(1)中，所述细菌以赖氨酸盐为底物，通 过赖氨酸脱羧酶催化而产生1,5-戊二胺。

优选在本发明的方法中，步骤(2)包括：

(21)分离(如，离心或过滤)出发酵液中的清液，去除菌体细胞和沉淀物；

(22)使用电渗析装置将清夜中的戊二胺、钾离子、钠离子和铵离子等阳离子迁 移到碱室，阴离子成分(如硫酸根离子、磷酸根离子、碳酸根和氯离子等)迁移 到酸室；相应的，碱室溶液包含戊二胺、氢氧化钾、氢氧化钠和氨水，酸室溶液 包括硫酸、磷酸、碳酸和盐酸等。

(23)从步骤(22)获得的处理液中提取出含1,5-戊二胺的成分(如，馏分)。

优选在本发明的方法的步骤(23)中，所述提取包括蒸馏(如，常压蒸馏、 减压蒸馏和/或精馏)、蒸发(如，闪蒸)和/或干燥(如，喷雾干燥和/或减压干 燥)。

更优选在本发明的方法的步骤(23)中，所述提取包括使用有机溶剂(如醇 类、烷烃类或酯类等)萃取出碱室溶液中的戊二胺；进一步还包括蒸馏(如，常 压蒸馏、减压蒸馏和/或精馏)、蒸发(如，闪蒸)，从有机溶剂中分理出戊二胺。

本发明中用于催化生产戊二胺的细胞是指过表达赖氨酸脱羧酶基因的细菌。

其中赖氨酸脱羧酶为将赖氨酸转化为1，5-戊二胺的酶，没有特别限制，可 举出例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨 酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、 反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、霍乱弧 菌(Vibriocholerae)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌 (Streptomycespilosus)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒 沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或深海热球菌(Pyrococcus abyssi)等微生物的酶。 优选来自大肠杆菌的酶。

本发明用于全细胞催化生产戊二胺的工程菌是过表达赖氨酸脱羧酶基因的 细菌。所述细菌优选为大肠杆菌，更有选为大肠杆菌B株或其衍生菌株。所述 过表达是指提高赖氨酸脱羧酶在细胞内的量，具体方法可以是增加所述赖氨酸脱 羧酶基因的拷贝数，例如使用多拷贝表达质粒携带赖氨酸脱羧酶基因全部或部分 核苷酸序列，或是在染色体中插入多拷贝赖氨酸脱羧酶基因全部或部分核苷酸序 列；过表达的方法也可以是应用高效的仅表达元件调控基因的表达水平，所述元 件可以是强启动子，增强子或RBS等；过表达的方法也可以是改造基因的编码 序列，如密码子优化，提高赖氨酸脱羧酶的翻译效率。

用于全细胞催化生产戊二胺的工程菌还可以是在过表达赖氨酸脱羧酶基因 的基础上进一步适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB。所述适量表达 赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因cadB是指将包含或不包含RBS序列的赖氨酸- 戊二胺逆向转运蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨 酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或使用适用于大肠杆菌的能解除 cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸-戊二 胺逆向转运蛋白基因自身的启动子；所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻 遏的启动子具体为L启动子、trc启动子、T₅启动子、lac启动子、tac启动子或 T₇启动子。

一种制备1,5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上 述任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种子液；将 种子液接入丰富培养基中，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸 和磷酸吡哆醛开始全细胞催化，即得；

所述诱导剂具体为IPTG或乳糖；

所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨 酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、 游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液；

所述丰富培养基中含有10g/L酵母提取物,20g/L胰蛋白胨,0.9g/L K₂HPO₄·3H₂O,1.14g/L KH₂PO₄,10g/L(NH₄)₂SO₄,0.3g/L MgSO₄·7H₂O,5mL/L 微量元素储液，50mg/L卡那霉素，余量为水；

所述微量元素储液含有6g/L FeSO₄·7H₂O,1.35g/L CaCl₂,0.8g/L ZnSO₄·7H₂O,1.5g/L MnSO₄·4H₂O,0.15g/L CuSO₄·5H₂O,0.2g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O,0.1g/L H₃BO₃,0.25g/L CoCl₂·6H₂O和10mL/L浓盐酸，余 量为水。

上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为 50mg/L；

所述种子液的OD₆₀₀为2-25，优选为3-5；

所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30％，具体为5％；

所述发酵培养的温度为25℃-45℃，具体为37℃；

所述发酵培养的DO在50％以上；

所述发酵培养的pH为4.0-9.0；

所述IPTG的终浓度为0.01-10mM，优选为0.05-0.4mM；

所述IPTG加入的时间为发酵培养后2-10h，优选为2-6h；

所述IPTG诱导时还包括0.5-10g/L的速率补加葡萄糖的步骤，所述速率具 体为3g/L；

所述赖氨酸盐包括L-赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐；

所述加入底物赖氨酸和维生素B6开始全细胞催化的时间为诱导开始后的 0.5-10h，优选为1-5h；

所述催化过程中pH维持在4.0-10.0之间；

调节pH所用的酸可以是无机酸或有机酸，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸、 硝酸；有机酸可以是己二酸、丁二酸、癸二酸、乙酸、乳酸等。也可以使用催化 过程中产生的酸性气体二氧化碳自调控(专利申请号201610227775.1)。

所述催化还包括如下步骤：按照0-5g/L的速率补加葡萄糖，通气量为0-10 vvm，温度控制在25-60℃，搅拌转速为0-1200rpm；

所述催化过程中，所述温度具体为30-50℃；

所述催化过程中，所述搅拌转速具体为200-1000rpm。

一种制备1,5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将权 利要求1-4任一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，得到种 子液；将种子液接入无机盐培养基，发酵培养；加入诱导剂诱导表达，再加入底 物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化，即得；

所述诱导剂为IPTG或乳糖；

所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发 酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离 赖氨酸以及赖氨酸盐干粉或其溶液；

所述无机盐培养基含有2g/L(NH₄)₂HPO₄,4g/L KH₂PO₄,0.85g/L柠檬酸,0.7 g/LMgSO₄·7H₂O，10mg/L FeSO₄·7H₂O,2.25mg/L ZnSO₄·7H₂O,0.2mg/L CuSO₄·5H₂O,0.5mg/LMnSO₄·5H₂O,0.23mg/L NaB₄O₇·10H₂O,2.0mg/L CaCl₂·2H₂O,0.1mg/L NH₄Mo₇O₂₄，0.15mg/LCoCl₂·6H₂O，余量为水。

上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为 50mg/L；

所述种子液的OD₆₀₀为2-25，优选为3-5；

所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30％，具体为2％；

所述发酵培养的温度为25℃-45℃，具体为37℃；

所述发酵培养的DO在50％以上；

所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，具体是通过流加补料液实 现的，所述补料液含有700g/L葡萄糖和20g/L MgSO₄·7H₂O，余量为水；

所述IPTG的终浓度为0.01-10mM，优选为0.05-0.4mM；

所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-20h，具体为4-12h；

所述赖氨酸盐包括L-赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐；

所述加入底物赖氨酸和磷酸吡哆醛开始全细胞催化的时间为诱导开始后的 0.5-24h，具体为1-5h；

所述催化过程中pH维持在4.0-10.0之间，具体为6.5；

调节pH所用的酸可以是无机酸或有机酸，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸、 硝酸；有机酸可以是己二酸、丁二酸、癸二酸、乙酸、乳酸等。也可以使用催化 过程中产生的酸性气体二氧化碳自调控(专利申请号201610227775.1)。

所述催化还包括如下步骤：

所述催化过程中，所述通气量具体为0.5-5vvm；

所述催化过程中，所述温度具体为30-50℃；

所述搅拌转速具体为200-1000rpm。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

双极膜电渗析设备(TRPB3010-Ⅰ型)购自北京廷润膜技术开发有限公司； 连续减压精馏装置(CheersNet-3SMZ SUS316L，智能DCS操作系统，北洋精馏 CheersNet)购自天津启熙科技有限公司。

实施例1

HPLC法检测赖氨酸和戊二胺

取1mL全细胞催化液，8000g离心5min，收集上清液检测赖氨酸含量； 取10μL上清液于2mL离心管中，加入200μL 0.5mol/L NaHCO₃水溶液和100μL 1％(体积比)二硝基氟苯乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后 冷却至室温，加入700μL 0.04mol/LKH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/L KOH 水溶液调整pH)释并摇匀，放置15min过滤后可进样，进样量为15μL；

所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent， USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55％(体 积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1mL/min，洗脱过程如下：

洗脱起始时刻(0min)流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动 相B占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为5个阶段，每个阶段中 流动相A和流动相D占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从 起始时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为88％、 流动相B占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻 开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相 B占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进 行6min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为70％、流动相B占流动 相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min) 结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为30％、流动相B占流动相总流量 的体积份数为70％。以市售L-赖氨酸标准品制作标准曲线，计算样品的赖氨酸 浓度。

检测戊二胺时，取10μL样品上清液加入含有100μL4.2g/100mL的碳酸氢 钠水溶液的2mL离心管，混匀后加入200μL含有体积百分含量为1％的2,4-二 硝基氟苯的乙腈溶液，混匀；60℃衍生反应60分钟(严格计时，30分钟取出 轻微震荡混匀继续衍生反应)。取出避光降温至室温，加入1600μL乙腈，漩涡 震荡混匀30秒，有机系滤膜过滤后取15μL进样。

流动相A为pH7.2的5.4g/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为体积百分含量 80％的乙腈水溶液，将A和B按照体积比5：95的比例，1mL/min的流速泵入 流动相，所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm,Agilent, USA)；柱温：35℃；检测波长：360nm。

以1,5-戊二胺盐酸盐(购自sigma公司)为标准品，1,5-戊二胺盐酸盐的浓 度在1-5g/L之间线性关系良好。以标准品的浓度为横坐标，标准品积分峰面积 为纵坐标，制作标准曲线。

以下实施例中的1,5-戊二胺浓度均由标准曲线公式计算得到的1,5-戊二胺 盐酸盐的测定值换算成1,5-戊二胺浓度值。

实施例2

全细胞催化生产戊二胺工程菌的构建

(一)赖氨酸脱羧酶基因cadA过表达质粒的构建

在pET28a(+)表达载体的T7启动子和RBS之后插入优化的赖氨酸脱羧酶 基因cadA的ORF。以优化设计的序列设计引物，以野生型大肠杆菌K12W3110 菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFi^TM HotStar，以P1和 P2为引物，PCR扩增cadA基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 PCR程序为：98℃变性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26个循环， 通过引物P1引入突变位点，从而获得改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA*的片段。

P1：5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT

(下划线所示序列为Nco I酶切识别位点)

P2：5’-ACGCGTCGACCTCCTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTG-3’

(下划线所示序列为Sal I酶切识别位点)

切胶回收上述PCR电泳条带,使用限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切赖氨酸 脱羧酶基因cadA*的DNA片段和pET28a(+)质粒，得到酶切后的赖氨酸脱羧 酶基因cadA*基因片段和载体大片段；将酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因 片段与载体大片段连接，转化至大肠杆菌EC135(Zhang et al,Plos Genetics，2012, 8(9):e1002987)的感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获 得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序，将结果正确的质粒命名为 pET28a-cadA*质粒。

(二)染色体cadB基因启动子的替换

以大肠杆菌BL21(DE3)菌株基因组DNA为模板，以引物P3和P4、P5和 P6分别进行PCR扩增，获得长度分别为510bp和610bp的两条DNA片段,分 别如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示。其中，T7启动子序列和lac调控序列由 引物P4和P5引入。PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以 及72℃延伸30s(30个循环)。其中，引物序列如下：

P3：5’-CGCGGATCCTGCGCCATTCTCAACATCCTT-3’

(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点)

P4：5’-TCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCGCA ACATATT ATACCAACAG-3’

P5： 5’-ACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGAAATTAG GAGAAGAGCATGAG-3’

P6：5’-ATTGCGGCCGC TCCGCAGTATTCCAGTTAGCT-3’

(下划线所示序列为Not I酶切识别位点)

将SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA分子的混合物为模板，以P3 和P6为引物，通过Overlap PCR扩增到长约1.1kb的Overlap片段，如SEQ ID No.4 所示。其中PCR程序为：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸60秒， 26个循环。

SEQ ID No.4中自5’末端起第477位至第495位核苷酸所示的序列为T₇启 动子序列，SEQ ID No.4中自5’末端起第496位至第520位核苷酸所示的序列为 lac调控序列。

Bam HI和Not I双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；Bam HI和NotI双酶切pKOV质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接， 得到重组质粒，将其命名为pKOV-P_T7-cadB，并其送测序，验证其含有正确T₇启动子和lac调控基因序列，保存备用。

将构建好的pKOV-P_T7-cadB质粒电转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，于30 ℃、150rpm，在LB培养基中复苏2h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的 商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的cadB基因 的自身启动子被替换为T7启动子，将该菌株命名为E.coli BL21P_cadB::P_T7。

(三)戊二胺工程菌的构建

将质粒pET28a-cadA转化至E.coli BL21P_cadB::P_T7的感受态细胞，在含有 50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21P_cadB:: P_T7/pET28a-cadA^*，用于1,5-戊二胺全细胞催化。

实施例3

菌体培养和戊二胺催化生产工艺

刮取工程菌E.coli BL21(DE3)P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*菌苔接入含有50 mL LB(含50mg/L卡那霉素)培养基的500mL三角瓶中，在37℃ 220rpm摇 床中培养4h，得到种子液，OD₆₀₀为4-5；培养所得的种子液按2％的接种量接 入含有2L无机盐培养基的10L发酵罐中，培养温度为37℃，DO控制在30％ 以上，罐压控制在0.02-0.10MPa。通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维 持在5g/L以下。当培养液中菌体OD₆₀₀达到30-40时加入0.1mM诱导剂IPTG， 2h后菌体培养液OD₆₀₀达到80左右，离心获得湿菌体。

其中无机盐培养基成分和补料液成分如下：无机盐培养基：2g/L(NH₄)₂HPO₄, 4g/LKH₂PO₄,0.85g/L Citric acid(柠檬酸),0.7g/L MgSO₄·7H₂O，10mg/L FeSO₄·7H₂O,2.25mg/L ZnSO₄·7H₂O,0.2mg/L CuSO₄·5H₂O,0.5mg/L MnSO₄·5H₂O,0.23mg/L NaB₄O₇·10H₂O,2.0mg/L CaCl₂·2H₂O,0.1mg/L NH₄Mo₇O₂₄，0.15mg/L CoCl₂·6H₂O，余量为水。补料液包含700g/L葡萄糖和 20g/L MgSO₄·7H₂O，余量为水。

配制含有300g/L赖氨酸盐酸盐和0.1mmol/L PLP的催化液体系，调控温度 至37℃以后，发酵罐搅拌转速设置为500rpm，加入10g/L湿菌体开始全细胞 催化。催化过程中补加硫酸调节pH，使pH维持在7.0左右，每隔0.5h从发酵 罐中取出催化液，12000g离心5分钟，倒出上清液，按照实施例1的赖氨酸 和-戊二胺方法检测全细胞催化过程中1,5-戊二胺产量。催化2h赖氨酸几乎耗尽， 戊二胺产量达到167.6g/L。

实施例4

电渗析分离催化液中的戊二胺

离心实施例3中的戊二胺催化液，去除菌体和和其它固体沉淀物，收集上清 液。量取2L上清液，加入双极膜电渗析设备的盐槽，将电压设置在20V，盐槽 中的阳离子逐步迁移至碱槽，阴离子逐步迁移至酸槽。电渗析过程中，设置电压 恒定，电流先增高后降低盐槽液位逐步降低，酸槽和碱槽液位逐步升高。每隔1 h取样检测盐槽、碱槽和酸槽中的戊二胺，检测结果如表1所示，通电3h，盐 槽中的戊二胺几乎全部迁移至碱槽。由于碱槽液位持续上升，在2～3h期间戊二 胺浓度反而降低。

实施例5

减压蒸馏提取电渗析碱槽中的戊二胺

取1L电渗析碱槽溶液，加入20L油浴旋转蒸发仪的圆底烧瓶中减压蒸馏。 蒸馏过程中循环水式真空泵的真空表读数达到-0.095Mpa左右，水浴锅加热温度 从60℃逐步升高至120℃，去除从60℃～80℃之间加热的前馏分0.5L，收集 高温加热的后馏分，去除挥发性碱(如氨)和不挥发性碱(如氢氧化钠和氢氧化 钾)，得到99％高纯度戊二胺。

实施例6

萃取精馏法提取电渗析碱槽中的戊二胺

取相同体积的电渗析碱槽溶液和壬醇、醇类溶剂、烷烃类溶剂或酯类溶剂， 加入萃取瓶中萃取，收集有机相，加入精馏装置(CheersNet-3SMZ，SUS316L， 天津启熙科技有限公司)的储液罐中，进行减压连续精馏，收集馏分，真空度为 -0.095Mpa，温度为80℃--120℃，得到99.5％高纯度戊二胺。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 电渗析法分离提取全细胞催化液中的戊二胺的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2148

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)

<400> 1

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

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agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 2

<211> 510

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)

<400> 2

cgcggatcct gcgccattct caacatcctt tagatgaaaa acaattagca gcactgaaca 60

cagaaataga taacattgtt acactaccgg aattgaataa cctgtccatt atatatcaaa 120

taaaagcggt cagtgctctg gtaaaaggta aaacagatga gtcttaccag gcgataaata 180

ctggcattga tcttgaaatg tcctggctaa attatgtatt gcttggcaag gtttatgaaa 240

tgaaggggat gaaccgggaa gcggctgatg catatctcac cgcctttaat ttacgcccag 300

gggcaaacac cctttactgg attgaaaatg gtatattcca gacttctgtt ccttatgttg 360

taccttatct cgacaaattt ctcgcttcag aataagtaac tcccgggttg atttatgctc 420

ggcaatattt gttgttgagt ttttgtatgt tactgttggt ataatatgtt gcggcataat 480

acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 510

<210> 3

<211> 610

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)

<400> 3

actcactata ggggaattgt gagcggataa caattccgaa attaggagaa gagcatgagt 60

tctgccaaga agatcgggct atttgcctgt accggtgttg ttgccggtaa tatgatgggg 120

agcggtattg cattattacc tgcgaaccta gcaagtatcg gtggtattgc tatctggggt 180

tggattatct ctattattgg tgcaatgtcg ctggcgtatg tatatgcccg actggcaaca 240

aaaaacccgc aacaaggtgg cccaattgct tatgccggag aaatttcccc tgcatttggt 300

tttcagacag gtgttcttta ttaccatgct aactggattg gtaacctggc gattggtatt 360

accgctgtat cttatctttc caccttcttc ccagtattaa atgatcctgt tccggcgggt 420

atcgcctgta ttgctatcgt ctgggtattt acctttgtaa atatgctcgg cggtacctgg 480

gtaagccgtt taaccactat tggtctggtg ctggttctta ttcctgtggt gatgactgct 540

attgttggct ggcattggtt tgatgcggca acttatgcag ctaactggaa tactgcggag 600

cggccgcaat 610

<210> 4

<211> 1080

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coil)

<400> 4

cgcggatcct gcgccattct caacatcctt tagatgaaaa acaattagca gcactgaaca 60

cagaaataga taacattgtt acactaccgg aattgaataa cctgtccatt atatatcaaa 120

taaaagcggt cagtgctctg gtaaaaggta aaacagatga gtcttaccag gcgataaata 180

ctggcattga tcttgaaatg tcctggctaa attatgtatt gcttggcaag gtttatgaaa 240

tgaaggggat gaaccgggaa gcggctgatg catatctcac cgcctttaat ttacgcccag 300

gggcaaacac cctttactgg attgaaaatg gtatattcca gacttctgtt ccttatgttg 360

taccttatct cgacaaattt ctcgcttcag aataagtaac tcccgggttg atttatgctc 420

ggcaatattt gttgttgagt ttttgtatgt tactgttggt ataatatgtt gcggcataat 480

acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc gaaattagga gaagagcatg 540

agttctgcca agaagatcgg gctatttgcc tgtaccggtg ttgttgccgg taatatgatg 600

gggagcggta ttgcattatt acctgcgaac ctagcaagta tcggtggtat tgctatctgg 660

ggttggatta tctctattat tggtgcaatg tcgctggcgt atgtatatgc ccgactggca 720

acaaaaaacc cgcaacaagg tggcccaatt gcttatgccg gagaaatttc ccctgcattt 780

ggttttcaga caggtgttct ttattaccat gctaactgga ttggtaacct ggcgattggt 840

attaccgctg tatcttatct ttccaccttc ttcccagtat taaatgatcc tgttccggcg 900

ggtatcgcct gtattgctat cgtctgggta tttacctttg taaatatgct cggcggtacc 960

tgggtaagcc gtttaaccac tattggtctg gtgctggttc ttattcctgt ggtgatgact 1020

gctattgttg gctggcattg gtttgatgcg gcaacttatg cagctaactg gaatactgcg 1080

Claims (8)

1.从全细胞催化液中分离提取1,5-戊二胺的方法，其特征在于，

将全细胞催化液中的上清液加入双极膜电渗析设备的盐槽中电渗析，得碱槽溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，将所述的碱槽溶液减压蒸馏，真空度为-0.095Mpa，温度为80℃--120℃，得到高纯度戊二胺。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，所述的碱槽溶液和有机溶剂加入萃取瓶中萃取，收集有机相，加入精馏装置进行减压连续精馏，收集馏分，真空度为-0.095Mpa，温度为80℃--120℃，得到高纯度戊二胺。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的上清液，其制备方法为将配制含有300g/L赖氨酸盐酸盐和0.1mmol/L PLP的催化液体系，调控温度至37℃以后，发酵罐搅拌转速设置为500rpm，加入10g/L湿菌体开始全细胞催化，催化过程中补加硫酸调节pH维持在7.0左右，催化2h，得到上清液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的湿菌体，其制备方法为将刮取工程菌E.coli BL21(DE3)P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*菌苔接入培养基中，在37℃220rpm摇床中培养4h，得到种子液，OD₆₀₀为4-5；培养所得的种子液按2％的接种量接入含有无机盐培养基的发酵罐中，培养温度为37℃，DO控制在30％以上，罐压控制在0.02-0.10MPa；通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维持在5g/L以下，当培养液中菌体OD₆₀₀达到30-40时加入0.1mM诱导剂IPTG，2h后菌体培养液OD₆₀₀达到80左右，离心获得湿菌体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的工程菌E.coli BL21(DE3)P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*，其制备方法为将质粒pET28a-cadA^*转化至E.coli BL21P_cadB::PT7的感受态细胞，在卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E.coli BL21P_cadB::P_T7/pET28a-cadA^*。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的质粒pET28a-cadA^*，其获得方法为：

在pET28a(+)表达载体的T7启动子和RBS之后插入优化的赖氨酸脱羧酶基因cadA^*的ORF；

以优化设计的序列设计引物，以野生型大肠杆菌K12W3110菌株的基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶KAPA HiFi^TM HotStar，以P1和P2为引物，PCR扩增cadA^*基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，获得改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA；

使用限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切赖氨酸脱羧酶基因cadA*的DNA片段和pET28a(+)质粒，得到酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段和载体大片段；

将酶切后的赖氨酸脱羧酶基因cadA*基因片段与载体大片段连接，转化至大肠杆菌的感受态细胞，在卡那霉素的LB平板上筛选，获得质粒pET28a-cadA^*。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括，所述的有机溶剂包括壬醇、醇类溶剂、烷烃类溶剂或酯类溶剂。