ES2949045T3 - Nueva lisina descarboxilasa y método para producir cadaverina usando la misma - Google Patents
Nueva lisina descarboxilasa y método para producir cadaverina usando la misma Download PDFInfo
- Publication number
- ES2949045T3 ES2949045T3 ES16749352T ES16749352T ES2949045T3 ES 2949045 T3 ES2949045 T3 ES 2949045T3 ES 16749352 T ES16749352 T ES 16749352T ES 16749352 T ES16749352 T ES 16749352T ES 2949045 T3 ES2949045 T3 ES 2949045T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- lysine
- microorganism
- lysine decarboxylase
- activity
- pseudomonas
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 title claims abstract description 137
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 114
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 103
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 67
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 19
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 18
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 70
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 68
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 64
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 38
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 19
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 19
- 241000039935 Pseudomonas thermotolerans Species 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000168225 Pseudomonas alcaligenes Species 0.000 description 12
- 241000520900 Pseudomonas resinovorans Species 0.000 description 12
- 241000218902 Pseudomonas synxantha Species 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 8
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 7
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- -1 diamine compound Chemical class 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 101150008667 cadA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000588732 Atlantibacter hermannii Species 0.000 description 1
- 241000186312 Brevibacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000255580 Ceratitis <genus> Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000607473 Edwardsiella <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588699 Erwinia sp. Species 0.000 description 1
- 241001240954 Escherichia albertii Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000588720 Escherichia fergusonii Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100276041 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) ctpD gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588774 Providencia sp. Species 0.000 description 1
- 241000588733 Pseudescherichia vulneris Species 0.000 description 1
- 101000794816 Pseudomonas putida Anthranilate synthase component 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000847784 Pseudomonas putida Anthranilate synthase component 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 241000321184 Raoultella Species 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000605031 Selenomonas ruminantium Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607714 Serratia sp. Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000128154 Shimwellia Species 0.000 description 1
- 241000588717 Shimwellia blattae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000123710 Sutterella Species 0.000 description 1
- 101100492609 Talaromyces wortmannii astC gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 241000043486 Yokenella Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 101150116772 aatA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 101150005925 aspC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006118 nylon 56 Polymers 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- VMNZBBHWHOMWAQ-UHFFFAOYSA-N pentane-1,5-diamine Chemical compound NCCCCCN.NCCCCCN VMNZBBHWHOMWAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a: una nueva lisina descarboxilasa; un microorganismo transformado con un gen que codifica la actividad en cuestión; y un método para producir cadaverina usando la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Nueva lisina descarboxilasa y método para producir cadaverina usando la misma
Campo técnico
En el presente documento se describe un microorganismo transformado con un polinucleótido que codifica una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa, un microorganismo capaz de producir cadaverina, y métodos para producir cadaverina.
Antecedentes de la técnica
Un método general para producir nailon mediante el uso de diamina es un proceso químico en el que se utilizan 1,4-diaminobutano y hexametilendiamina como materias primas. Estas materias primas se producen a partir de compuestos orgánicos derivados del petróleo. Por consiguiente, a medida que se endurecen las regulaciones ambientales, crece la demanda del mercado de materiales alternativos producidos a través de rutas de base biológica.
Por su parte, la cadaverina es un compuesto orgánico de diamina compuesto por 5 carbonos que tiene una fórmula molecular NH2(CH2)5NH2 , y puede ser una materia prima para el nailon 5,6. Si es posible la preparación biológica de cadaverina, se espera que se pueda producir una variedad de nailon mientras se satisface la demanda del mercado de materiales de base biológica.
Con respecto a la producción de base biológica de cadaverina, los estudios sobre la bioconversión de lisina eran ampliamente conocidos antes de la década de 1940 (Gale E.F., Epps H.M. 1944. Studies on bacterial amino-acid decarboxylases. Biochem J. 38, 232-242). En una etapa clave de la bioconversión, la lisina descarboxilasa es una enzima que produce cadaverina a partir de lisina (FIG. 1). Se ha informado de la actividad de la lisina descarboxilasa en muchos microorganismos diferentes, y la lisina descarboxilasa, cuya actividad específica (mmol/min/mg) es conocida, se deriva de cuatro tipos de microorganismos (Escherichia coli, Bacterium cadaveris, Glycine max, y Selenomonas ruminantium). Entre ellas, la lisina descarboxilasa derivada de Escherichia coli se evalúa como la lisina descarboxilasa que tiene la mayor actividad, y la enzima utilizada en la producción práctica también se limita a CadA, que se deriva de Escherichia coli (Patente Japonesa N.° 2005-147171, Patente Europea N.° 2004-010711 y Patente Japonesa N.° 2002-257374). Sin embargo, la producción de cadaverina al hacer reaccionar la lisina con la lisina descarboxilasa genera dióxido de carbono por descarboxilación de la lisina y produce un catión divalente, cadaverina de un catión monovalente, lisina aumentando así el pH durante la reacción. Así pues, cuando se produce la reacción enzimática de la lisina descarboxilasa, se modifica el pH, lo que genera un problema de reducción de la eficiencia. Además, la enzima puede ser desnaturalizada por un ácido producido en una solución de reacción, o una base, perdiendo así su actividad.
En consecuencia, los presentes inventores descubrieron una nueva lisina descarboxilasa que tiene estabilidad frente a altas temperaturas y pH, y descubrieron que la lisina descarboxilasa se puede expresar en un microorganismo que pertenece a la especie Escherichia. BASE DE DATOS del Genbank [en línea], 12 de junio de 2014 (2014-06-12), acceso WP_027896066.1 desvela una secuencia de lisina descarboxilasa de Pseudomonas thermotolerans. El documento WO 2008/142034 A2 se refiere a plantas con mayor tolerancia y/o resistencia al estrés ambiental y mayor producción de biomasa. Kind et al. (Metabolic Engineering, vol. 25, 2014, páginas 113-123) informa "From zero to hero - Production of bio-based nylon from renewable resources using engineered Corynebacterium glutamicum". BASE DE DATOS del Genbank [En línea] NCBI; 21 de septiembre de 2013 (2013-09-21), acceso WP_021221793 desvela una secuencia de lisina descarboxilasa de Pseudomonas alcaligenes. El documento WO 2015/196430 A1 se refiere a medios para expresar polipéptidos involucrados en la descarboxilación de lisina y a métodos y aplicación de los mismos. BASE DE Da To S del GENBANK, 28 de junio de 2013 (2013-06-28), acceso WP_017938426 desvela una lisina descarboxilasa de Pseudomonas thermotolerans. El documento WO 2016/054792 A1 se refiere a la expresión de bombas de eflujo de tetraciclina recombinante para la producción de lisina o productos derivados de lisina, y a métodos y aplicaciones de la misma.
Sumario de la invención
La invención proporciona un microorganismo que se transforma con un polinucleótido que codifica una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa, dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en donde dicha proteína es de Pseudomonas sp., y el microorganismo es un microorganismo de Escherichia sp.
La invención también proporciona un microorganismo que tiene la capacidad de producir cadaverina, en donde el microorganismo se transforma con un polinucleótido que codifica una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa, dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en donde dicha proteína es de Pseudomonas sp., y el microorganismo es un microorganismo de Escherichia sp.
La invención proporciona además un método para preparar cadaverina, que comprende las etapas de: convertir lisina en cadaverina mediante el uso de una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en donde dicha proteína es de Pseudomonas sp. o el microorganismo de la invención; y recuperar la cadaverina convertida.
La invención proporciona además un método para preparar cadaverina, que comprende las etapas de: cultivar el microorganismo de la invención en un medio; y recuperar la cadaverina del microorganismo o del medio.
Descripción detallada
La invención se define en las reivindicaciones independientes. Los aspectos y realizaciones preferentes adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.
También se describe en este documento una proteína que tiene una nueva actividad de lisina descarboxilasa, que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de homología de secuencia con la misma.
Como se usa en el presente documento, el término "proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa" se refiere a una proteína que tiene actividad para catalizar una reacción de descarboxilación de lisina usando piridoxal-5'-fosfato como coenzima para descarboxilar lisina, produciendo así cadaverina y dióxido de carbono.
También se describe en el presente documento una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tiene un 75 % o más de homología de secuencia con la misma puede ser una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa, que se ha descubierto recientemente en un microorganismo de Pseudomonas sp., y la proteína puede incluir todas las proteínas, siempre que tengan la actividad correspondiente y se descubran en un microorganismo de Pseudomonas sp. Por ejemplo, el microorganismo de Pseudomonas sp. puede ser Pseudomonas thermotolerans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas putida, y Pseudomonas synxantha.
También se describe en este documento una proteína que tiene una nueva actividad de lisina descarboxilasa derivada del microorganismo Pseudomonas thermotolerans que puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 85 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con SEQ ID NO: 1. También se describe en este documento una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa derivada del microorganismo Pseudomonas alcaligenes que puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con SEQ ID NO: 3. También se describe en este documento una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa derivada del microorganismo Pseudomonas resinovorans que puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con SEQ ID NO: 5. También se describe en este documento una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa derivada del microorganismo Pseudomonas putida que puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con SEQ ID NO: 7. También se describe en este documento una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa derivada del microorganismo Pseudomonas synxantha que puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con SEQ ID NO: 9. Sin embargo, las proteínas no se limitan a las secuencias de aminoácidos anteriores, y las proteínas pueden tener todas las secuencias de aminoácidos, siempre que las secuencias de aminoácidos sean capaces de mantener la actividad de lisina descarboxilasa.
También se describe en este documento un polinucleótido que codifica la nueva proteína que tiene la actividad de lisina descarboxilasa, específicamente, un polinucleótido que tiene una homología de secuencia del 75 % o más con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
También se describe en el presente documento una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que tiene la actividad de lisina descarboxilasa que se puede obtener a partir de una secuencia genómica conocida derivada del microorganismo Pseudomonas sp. Específicamente, la secuencia de nucleótidos puede obtenerse a partir de secuencias genómicas derivadas de uno o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Pseudomonas thermotolerans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas putida, y Pseudomonas synxantha. Una secuencia de nucleótidos que codifica la lisina descarboxilasa que se deriva del
microorganismo Pseudomonas thermotolerans puede tener la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y también puede tener una secuencia de nucleótidos que tenga aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Una secuencia de nucleótidos que codifica la lisina descarboxilasa que se deriva del microorganismo Pseudomonas alcaligenes puede tener una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, y también puede tener una secuencia de nucleótidos que tenga aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4. Una secuencia de nucleótidos que codifica la lisina descarboxilasa que se deriva del microorganismo Pseudomonas resinovorans puede obtenerse a partir de una secuencia genómica conocida de Pseudomonas resinovorans, y específicamente, puede tener una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6, y también puede tener una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6. Una secuencia de nucleótidos que codifica la lisina descarboxilasa que se deriva del microorganismo Pseudomonas putida puede tener una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, y también puede tener una secuencia de nucleótidos que tenga aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8. Una secuencia de nucleótidos que codifica la L-lisina descarboxilasa que se deriva del microorganismo Pseudomonas synxantha puede tener una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10, y también puede tener una secuencia de nucleótidos que tenga aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 80 % o más, aproximadamente el 90 % o más, o aproximadamente el 95 % o más de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10. Sin embargo, los polinucleótidos que codifican las proteínas que tienen actividad de lisina descarboxilasa no se limitan a ellos, y los polinucleótidos pueden incluir todos los polinucleótidos sin limitación, siempre que los polinucleótidos puedan codificar la nueva proteína que tiene la actividad de lisina descarboxilasa descrita en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "homología" se refiere al grado de apareamiento con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos dada y la homología puede expresarse como un porcentaje. En la presente divulgación, una secuencia homóloga que tiene una actividad que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos o a la secuencia de nucleótidos dada se expresa como "% de homología". Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante el uso de parámetros de cálculo de software convencionales tales como puntuación, identidad, similitud, etc., específicamente, BLAST 2.0, o comparando las secuencias en un experimento de hibridación de Southern en condiciones estrictas como se define, y definiendo las condiciones de hibridación apropiadas pueden determinarse mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica. (por ejemplo, ver Sambrook et al., 1989, más abajo).
También se describe en el presente documento una lisina descarboxilasa que puede tener uno o más seleccionados del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9. Además, el polinucleótido que codifica la proteína que tiene la actividad de L-lisina descarboxilasa puede tener uno o más seleccionados del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10.
Se confirmó que las lisina descarboxilasas derivadas de los microorganismos de Pseudomonas sp. anteriores no muestran grandes cambios en sus actividades a un pH alto, y por lo tanto, tienen estabilidad de pH.
También se describe en el presente documento un microorganismo que se transforma para expresar la nueva proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa. El microorganismo transformado puede ser cualquiera de los microorganismos procarióticos y eucarióticos, siempre que se transforme para expresar la proteína que tiene la actividad descarboxilasa correspondiente. Por ejemplo, el microorganismo transformado puede incluir microorganismos de Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., y Corynebacterium sp. El microorganismo puede ser específicamente un microorganismo perteneciente a Escherichia sp. o Corynebacterium sp., y más específicamente, E. coli o Corynebacterium glutamicum, pero no de manera limitativa.
También se describe en este documento una cepa original del microorganismo transformado que puede ser un microorganismo que tenga una capacidad mejorada para producir lisina, en comparación con un tipo silvestre, pero no de manera limitativa. También se usa en el presente documento, el término "microorganismo que ha mejorado la capacidad de producir lisina, en comparación con un tipo silvestre" que se refiere a un microorganismo que tiene una mayor capacidad para producir lisina, en comparación con un microorganismo natural o una cepa original, y el microorganismo que tiene una capacidad mejorada para producir lisina no está particularmente limitado, siempre que sea un microorganismo que tenga una capacidad mejorada para producir lisina, en comparación con una cepa original.
También se describe en el presente documento, para conferir la capacidad mejorada para producir lisina en comparación con el tipo silvestre, un método general de cultivo de microorganismos, como un método para obtener cepas mutantes auxotróficas, cepas resistentes a análogos, o cepas mutantes de control metabólico que tienen la capacidad de producir lisina, y un método para producir cepas recombinantes que tienen actividades enzimáticas biosintéticas de lisina mejoradas, puede usarse. En el cultivo de microorganismos productores de lisina, características tales como auxotrofia, mutaciones de resistencia a análogos y de control metabólico se pueden conferir solas o en
combinación. La actividad enzimática biosintética de lisina mejorada se puede conferir sola o en combinación. Además, mientras confiere las características tales como auxotrofia, resistencia a análogos y mutaciones de control metabólico, también puede potenciarse al mismo tiempo la actividad enzimática de biosíntesis de lisina. Específicamente, un gen que codifica la enzima biosintética de lisina puede incluir el gen de la dihidrodipicolinato sintasa (dapA), el gen de la aspartoquinasa (lysC), el gen de la dihidrodipicolinato reductasa (dapB), el gen de la diaminopimelato descarboxilasa (lysA), el gen de la diaminopimelato deshidrogenasa (ddh), el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), el gen de la aspartato aminotransferasa (aspC) y el gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), pero no de manera limitativa. Un método para conferir o aumentar la capacidad de producir lisina potenciando la actividad enzimática biosintética de lisina puede realizarse induciendo mutaciones en los genes que codifican las enzimas correspondientes o amplificando los genes para aumentar las actividades enzimáticas intracelulares. Estos métodos pueden realizarse por recombinación genética, pero sin limitarse a los mismos.
El microorganismo puede ser cualquiera de los microorganismos procarióticos y eucarióticos, siempre que tenga una capacidad mejorada para producir lisina, en comparación con el tipo silvestre. Específicamente, el microorganismo puede ser un microorganismo de Escherichia sp. o un microorganismo Corineforme. El microorganismo de Escherichia puede ser Escherichia coli, Escherichia albertii, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, o Escherichia vulneris, pero no de manera limitativa. De manera más específica, el microorganismo Escherichia sp. puede ser Escherichia coli. El microorganismo Corineforme puede incluir un microorganismo de Corynebacterium o Brevibacterium sp. Además, el microorganismo Corineforme puede ser específicamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, o Brevibacterium lactofermentum, pero no de manera limitativa.
Para transformar el microorganismo de manera que el microorganismo exprese la proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa, el gen de la lisina descarboxilasa descrito en el presente documento puede incluirse como la proteína lisina descarboxilasa o como una unidad de expresión génica en el microorganismo a transformar. La unidad de expresión génica de la lisina descarboxilasa puede unirse operativamente a un vector y luego transformarse en el microorganismo o integrarse en el cromosoma del microorganismo. Específicamente, el gen de la lisina descarboxilasa se puede unir operativamente de manera que el gen se sobreexprese mediante un promotor aguas arriba del codón de iniciación.
Como se usa en el presente documento, el término "unidad de expresión" se refiere a un fragmento que incluye un promotor ligado operativamente a un polinucleótido que codifica una proteína, y puede incluir además 3'-UTL, 5'-UTL, cola poli-A, etc. Como se usa en el presente documento, el término "unidad de expresión" puede ser intercambiable con "casete de expresión".
Como se usa en el presente documento, el término "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre la secuencia de nucleótidos del gen y una secuencia de nucleótidos que tiene una actividad promotora, mediante el cual se inicia y media la transcripción del gen que codifica la lisina descarboxilasa, lo que indica que la secuencia de nucleótidos que tiene la actividad promotora está ligada operativamente al gen de la lisina descarboxilasa para controlar la actividad transcripcional del gen de la lisina descarboxilasa.
Como se usa en el presente documento, el término "transformación" significa una acción general de introducir el gen de la lisina descarboxilasa derivado del microorganismo de Pseudomonas sp. en una célula huésped, específicamente, un microorganismo de Escherichia sp. o un microorganismo Corineforme, para la expresión del gen en la célula huésped. En este sentido, el gen de la lisina descarboxilasa es un polinucleótido, incluyendo ADN y ARN, capaz de codificar la lisina descarboxilasa. Siempre que el gen pueda introducirse en la célula huésped y expresarse en ella, se puede introducir en cualquier tipo. Por ejemplo, el gen se puede introducir en la célula huésped en un casete de expresión que es una estructura polinucleotídica que incluye elementos completos para expresar el gen. El casete de expresión incluye un promotor que está ligado operativamente al gen, una señal de terminación de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede ser un vector de expresión autorreplicable. El gen también puede introducirse en la célula huésped por sí mismo o en una estructura polinucleotídica para unirse operativamente a la secuencia necesaria para la expresión en la célula huésped. El vector recombinante es un medio por el cual se introduce ADN en la célula huésped para expresar la proteína, y un vector de expresión conocido, como un vector plasmídico, un vector cósmido, un vector bacteriófago, etc. se pueden usar. El vector puede ser preparado fácilmente por los expertos en la materia de acuerdo con cualquier método conocido de uso de una técnica de recombinación de ADN, pero no de manera limitativa.
El método de transformación puede ser cualquier método para introducir el polinucleótido en las células y puede realizarse seleccionando una técnica convencional apropiada conocida en la materia. Por ejemplo, el método puede incluir electroporación, coprecipitación con fosfato de calcio, infección retrovírica, microinyección, un método de DEAE-dextrano, un método de liposomas catiónicos, etc., pero no de manera limitativa.
El microorganismo que tiene la capacidad mejorada para producir lisina puede transformarse de manera que se exprese la proteína que tiene la actividad de lisina descarboxilasa descrita en el presente documento, teniendo así una excelente capacidad para producir cadaverina.
También se describe en el presente documento el uso de la nueva lisina descarboxilasa o el microorganismo transformado para expresar la nueva proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa en la producción de cadaverina.
La nueva lisina descarboxilasa y el microorganismo transformado para expresar la nueva proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa son los mismos que se han descrito anteriormente. Se confirmó que la lisina descarboxilasa descrita en el presente documento tiene una mayor estabilidad frente a cambios de temperatura o pH que la lisina descarboxilasa derivada de E. coli que se ha utilizado comúnmente en la producción de cadaverina. En particular, la nueva lisina descarboxilasa descrita en este documento tiene una mayor estabilidad al pH que la lisina descarboxilasa derivada de E. coli y, por lo tanto, es ventajosa en una reacción de conversión de lisina en cadaverina. En consecuencia, la nueva lisina descarboxilasa descrita en el presente documento y el microorganismo transformado para expresar la nueva proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa pueden utilizarse en la producción de cadaverina.
También se describe en el presente documento un método para preparar cadaverina.
El método de preparación de cadaverina puede incluir las etapas de convertir la lisina en cadaverina usando la nueva proteína que tiene la actividad de lisina descarboxilasa o el microorganismo transformado para expresar la proteína que tiene la actividad; y recuperar la cadaverina convertida.
La nueva proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa y el microorganismo transformado son los mismos que se han descrito anteriormente. El microorganismo transformado puede ser específicamente un microorganismo de Escherichia sp.
En la etapa de convertir la lisina en cadaverina, la nueva proteína que tiene la actividad de lisina descarboxilasa se extrae del microorganismo que expresa la proteína, y la enzima se purifica y se usa para descarboxilar la lisina, produciendo así cadaverina. Como alternativa, se añade lisina a un cultivo obtenido cultivando el microorganismo transformado, y el microorganismo se utiliza tal cual para descarboxilar la lisina, convirtiendo así la lisina en cadaverina.
También se describe en el presente documento un método para preparar cadaverina, incluyendo las etapas de cultivo en un medio del microorganismo que tiene la capacidad de producir cadaverina, en donde el microorganismo que tiene una capacidad mejorada para producir lisina en comparación con el tipo silvestre se transforma para expresar la nueva proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa; y recuperar la cadaverina del microorganismo o del cultivo.
La nueva proteína que tiene la actividad de L-lisina descarboxilasa y el microorganismo que tiene la capacidad mejorada para producir lisina, en comparación con el tipo silvestre, son los mismos que los descritos anteriormente.
El cultivo se puede realizar en un medio adecuado en condiciones de cultivo que son bien conocidas en la técnica. El medio y las condiciones de cultivo pueden ser modificados fácilmente por cualquier experto en la materia en función del tipo de microorganismo seleccionado. El método de cultivo puede incluir cultivo discontinuo, cultivo continuo, cultivo alimentado por lotes o una combinación de los mismos, pero no de manera limitativa.
El medio puede incluir una variedad de fuentes de carbono, de fuentes de nitrógeno y de elementos traza.
Específicamente, por ejemplo, las fuentes de carbono pueden incluir carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; aceites como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes, tales como glicerol y etanol; ácidos orgánicos tales como ácido acético, o combinaciones de los mismos. Específicamente, se puede utilizar glucosa como fuente de carbono, pero no de manera limitativa. Las fuentes de nitrógeno pueden incluir fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, extracto de levadura, caldo de carne, extracto de malta, licor de maíz (CSL) y harina de soja, fuentes inorgánicas de nitrógeno como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, o combinaciones de los mismos, pero sin limitarse a los mismos. El medio puede incluir, como fuentes de fósforo, por ejemplo, hidrogenofosfato de dipotasio, dihidrogenofosfato de potasio, y las correspondientes sales que contienen sodio, y sales metálicas tales como sulfato de magnesio y sulfato de hierro, pero no de manera limitativa. Además, aminoácidos, vitaminas y precursores adecuados pueden incluirse en el medio. El medio o los componentes individuales se pueden añadir al medio en modo discontinuo o en modo continuo.
Además, el pH del medio se puede ajustar durante el cultivo agregando un compuesto como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico, o ácido sulfúrico por un método adecuado. La generación de burbujas de aire se puede inhibir durante el cultivo usando un agente antiespumante como éster de poliglicol de ácido graso. Para mantener una condición aeróbica en el medio, puede inyectarse oxígeno o gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) en el cultivo. La temperatura del cultivo puede ser generalmente de 20 °C a 45 °C, por ejemplo, de 25 °C a 40 °C. El cultivo puede continuar hasta que la producción de lisina descarboxilasa alcance el nivel deseado, por ejemplo, durante 10 horas a 160 horas.
Un método de recuperación de cadaverina se puede realizar, por ejemplo, recolección o recuperación de la cadaverina
producida del medio mediante un método apropiado conocido en la técnica según un modo discontinuo, un modo continuo o un modo alimentado por lotes. En este método de recuperación, centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio iónico, cristalización, etc. se pueden usar. Por ejemplo, la biomasa se puede eliminar del cultivo mediante centrifugación a baja velocidad y el sobrenadante resultante se puede purificar mediante cromatografía de intercambio iónico.
Además, el método de preparación de cadaverina puede incluir además el paso de recuperar la lisina descarboxilasa del microorganismo o del medio.
Un método para recuperar la lisina descarboxilasa del microorganismo o del medio se puede realizar mediante, por ejemplo, recolección o recuperación de la lisina descarboxilasa producida del microorganismo o del medio mediante un método apropiado conocido en la técnica según un modo discontinuo, un modo continuo o un modo alimentado por lotes. En este método de recuperación, centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio iónico, cristalización, etc. se pueden usar. Por ejemplo, la biomasa se puede eliminar del cultivo mediante centrifugación a baja velocidad y el sobrenadante resultante se puede purificar mediante cromatografía de intercambio iónico. Además, la lisina descarboxilasa se puede recuperar a partir de un lisado celular que se obtiene rompiendo el microorganismo en el medio. El lisado celular se puede obtener usando un método apropiado conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un homogeneizador físico o un tampón de lisis celular disponible en el mercado. La lisina descarboxilasa puede obtenerse del lisado celular mediante un método apropiado conocido en la técnica, tal como centrifugación, etc.
Efectos ventajosos de la divulgación
Una nueva proteína con actividad de lisina descarboxilasa derivada de un microorganismo Pseudomonas sp., como se describe en el presente documento, puede tener actividad estable incluso con cambios de pH, y por lo tanto, la proteína se puede utilizar eficazmente en una reacción de conversión de lisina en cadaverina, siendo así ampliamente utilizada en la producción de cadaverina.
Descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra un mecanismo de reacción de la lisina descarboxilasa que produce cadaverina a partir de lisina;
la FIG. 2 es una imagen de gel SDS-PAGE que muestra los resultados de expresión de la PtLDC y la PtLDC con una etiqueta de his N-terminal;
la FIG. 3 muestra la reactividad de la PtLDC de convertir lisina en cadaverina;
la FIG. 4 muestra una actividad enzimática relativa de la PtLDC según la variación de temperatura;
la FIG. 5 muestra una actividad enzimática relativa de la PtLDC según la variación de pH;
la FIG. 6 es una imagen de gel SDS-PAGE que muestra la expresión de la PaLDC y la PrLDC;
la FIG. 7 muestra la reactividad de la PaLDC de convertir lisina en cadaverina;
la FIG. 8 muestra una actividad enzimática relativa de la PaLDC según la variación de temperatura;
la FIG. 9 muestra una actividad enzimática relativa de la PaLDC según la variación de pH;
la FIG. 10 muestra la reactividad de la PrLDC de convertir lisina en cadaverina;
la FIG. 11 muestra una actividad enzimática relativa de la PrLDC según la variación de temperatura; la FIG. 12 muestra una actividad enzimática relativa de la PrLDC según la variación de pH;
la FIG. 13 es una imagen de gel SDS-PAGE que muestra los resultados de expresión de la EcLDC, la PpLDC, la
PtLDC y la PxLDC;
la FIG. 14 muestra la reactividad de la PpLDC de convertir lisina en cadaverina;
la FIG. 15 muestra una actividad enzimática relativa de la PpLDC según la variación de temperatura;
la FIG. 16 muestra una actividad enzimática relativa de la PpLDC según la variación de pH;
la FIG. 17 muestra la reactividad de la PxLDC de convertir lisina en cadaverina;
la FIG. 18 muestra una actividad enzimática relativa de la PxLDC según la variación de pH;
la FIG. 19 muestra una actividad enzimática relativa de la EcLDC y la PtLDC según la variación de temp la FIG. 20 muestra una actividad enzimática relativa de la EcLDC y la PtLDC según la variación de pH.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente divulgación se describirá en más detalle con referencia a los ejemplos.
Ejemplo 1. Selección de nueva lisina descarboxilasa para producir cadaverina
1-1. Selección de lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas thermotolerans
Para seleccionar una nueva lisina descarboxilasa para ser utilizada en la producción de cadaverina, un programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.n¡h.gov/Blast.cg¡?PROGRAM=blastn&PAGE_____ TYPE=BlastSearc_____ h&LINK LOC=blasthome) proporcionado por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), EE.UU. se utilizó para buscar lisina descarboxilasa derivada de una bacteria termófila que tiene una gran similitud con una secuencia peptídica de un sitio activo de lisina descarboxilasa derivada de E. coli. De manera detallada, se llevó a cabo una búsqueda mediante BLAST, basada en un total de 31 secuencias peptídicas (GRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKG: SEQ ID NO: 12), cada una de los cuales incluye 15 aminoácidos en
el extremo N-terminal y el extremo C-terminal centrado alrededor de la lisina 367, que es el aminoácido principal de la lisina descarboxilasa derivada de E. coli. Como resultado, se confirmó que los microorganismos de Escherichia, Shigella, Enterobacteria, Edwardsiella, Klebsiella, Serratia, Yersinia, Yokenella, Raoultella, Ceratitis, Salmonella, Sutterella, Shimwellia, Vibrio, y Pseudomonas sp. tienen una alta homología. La búsqueda tuvo como objetivo encontrar lisina descarboxilasa que tuviera una alta estabilidad térmica al tiempo que mantuviera una actividad similar a la de la lisina descarboxilasa de E. coli. En general, se sabe que las proteínas que se encuentran en las bacterias termófilas tienen una alta estabilidad térmica y, por lo tanto, de los microorganismos encontrados a partir de la búsqueda, se seleccionó Pseudomonas thermotolerans, conocido como microorganismo termófilo (46-60 °C).
1-2. Selección de lisina descarboxilasa derivada de varios microorganismos de Pseudomonas sp.
Para seleccionar lisina descarboxilasas derivadas de microorganismos de Pseudomonas sp. distintos de Pseudomonas thermotolerans, cuatro microorganismos (Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas putida, y Pseudomonas synxantha) que muestran baja homología entre Pseudomonas sp. fueron seleccionados. Los programas de nucleótidos y el genoma proporcionados por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), EE.UU. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se utilizaron para identificar secuencias de nucleótidos y aminoácidos de lisina descarboxilasas derivadas de los microorganismos de las cuatro Pseudomonas sp. seleccionados como antes.
La siguiente Tabla 1 muestra la homología de la secuencia de aminoácidos de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas sp.
Ejemplo 2. Preparación de E. co li a la que se introduce el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas thermotolerans y análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa expresada a partir del mismo
2-1. Transformación de E. coli con el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas thermotolerans
Para introducir el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas thermotolerans en E. coli y expresar su gen, se realizó la clonación de un gen recombinante. La información genética sobre Pseudomonas thermotolerans se obtuvo a partir de datos genómicos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/).
El ADN genómico de Pseudomonas thermotolerans se obtuvo, y luego se usó como plantilla para amplificar un gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas thermotolerans (ptldc) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para realizar la PCR, se usaron cebadores de 5_LDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCT CCAATTCCCC) (SEQ ID NO: 13) y 3_LDC_Xhol (AATATACTCGAGTCAGATCTTGATGCAGTCCACCG) (SEQ ID NO: 14) y ADN polimerasa PfuUltraTM (Stratagene, EE.UU.) para realizar la PCR durante 30 ciclos en condiciones de 94 °C: 30 s, 55 °C: 30 s, y 72 °C: 2 minutos. Como resultado, se obtuvo el ptldc amplificado (SEQ ID NO: 2). Además, para expresar la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas thermotolerans con una etiqueta de His N-terminal, se usaron los cebadores de 5_LDC_BamHI (AATATAGGATCCGTACAAAGACCTCCAATTCCCC) (SEQ ID NO: 15) y 3_LDC_Sacl (AATATAGAGCTCTCAGATCTTGATGCAGTCCACCG) (SEQ ID NO: 16) para realizar la PCR de la misma manera que el método de PCR anterior. A continuación, cada gen ptldc obtenido de la PCR se insertó en un vector de expresión de E. coli, pET-Deut1. Posteriormente, cada plásmido clonado con el gen ptldc se insertó en E. coli Rosetta por un método de transformación por choque térmico. Cada uno de los transformados de E. coli se cultivó en 50 ml de medio LB líquido (que contenía 50 mg/ml de ampicilina) a 37 °C. Cuando un valor de la DO600 alcanzó 0,8, se añadió isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,4 mM y se incubó a 18 °C durante 48 horas para inducir la expresión. Cada lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas thermotolerans (PtLDC) así completamente expresada se identificó mediante SDS-PAGE (FIG. 2). Los resultados de SDS-PAGE mostraron que la PtLDC y la PtLDC con la etiqueta de His expresada a baja temperatura se sobreexpresaron como proteínas solubles (Carriles 2 y 4 de la FIG.
2).
El E.coli Rosetta transformado con el plásmido que incluye el ptldc (SEQ ID NO: 2) se designó como 'Escherichia coli CC04-0055', y se depositó en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos (KCCM) el 24 de julio de 2014 con el número de Acceso KCCM11559P.
2- 2. Análisis de actividad de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas thermotolerans expresada en E. coli
(1) Análisis de la reactividad de la lisina descarboxilasa
Para investigar las reactividades de PtLDC y PtLDC con la etiqueta de His, 50 ml de proteína soluble, piridoxal-fosfato 100 mM (piridoxal-fosfato, PLP) y lisina 250 mM se hicieron reaccionar en un volumen de 200 ml a 46 °C durante 2 horas. La solución tampón de reacción era fosfato de sodio 50 mM a pH 6,2. Se utilizó como control un microorganismo en el que se introdujo un vector vacío y se analizaron las cantidades de lisina y cadaverina (FIG. 3). La cromatografía líquida de alta resolución (Waters, Milford, MA) se llevó a cabo para analizar cantidades precisas de lisina y cadaverina en un detector de índice de refracción 2414 (Waters, Milford, MA). El reactivo de lisina-HCl y el reactivo de 1,5-diaminopentano (cadaverina) se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO), y una fase móvil que constaba de ácido cítrico 1 mM, ácido tartárico 10 mM, etilendiamina 24 mM y acetonitrilo al 5 % se utilizó para separar y cuantificar los dos materiales en una columna IonoSpher C3-100 mm, 5 mm. El control no mostró producción de cadaverina. La PtLDC con la etiqueta de His N-terminal mostró una conversión de lisina del 72 %, y la PtLDC mostró una conversión de lisina del 100 %, que indica producción de cadaverina.
(2) Análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa según la temperatura y el pH
Para analizar las características enzimáticas de la PtLDC en diversas condiciones de temperatura (30 °C, 42 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C y 80 °C), se compararon las actividades relativas. Cuando se diluyó la PtLDC y se hizo reaccionar con sustrato de lisina 250 mM a 60 °C durante 30 minutos, se encontró que se producía cadaverina 42 mM. En este sentido, las concentraciones de cadaverina se analizaron utilizando tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,2) como solución tampón, y una cantidad igual de la enzima en las mismas condiciones de reacción, salvo que las condiciones de temperatura eran de 30 °C, 42 °C, 50 °C, 70 °C y 80 °C, y se comparó con la cantidad de cadaverina producida a una temperatura de reacción de 60 °C (FIG. 4). Tal como se muestra en la FIG. 4, la PtLDC mostró la mayor actividad a 60 °C. Además, la PtLDC mantuvo el 80 % o más de la actividad a una temperatura de 55 °C-65 °C.
Adicionalmente, la actividad de la lisina descarboxilasa se evaluó en diversas condiciones de pH (6,2, 7,0, 8,0 y 9,0). La condición de temperatura se fijó en 60 °C y se usó una cantidad igual de la enzima en las mismas condiciones de reacción, salvo que se usaron tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,2), tampón tris 50 mM (pH 7,0), tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 8,0) y tampón tris 50 mM (pH 9,0). Se compararon las reactividades de la lisina descarboxilasa a diferentes pH (FIG. 5). La PtLDC mostró la mayor actividad a pH 8,0 y mantuvo el 90 % o más de la actividad de pH 6 a pH 9. Se comparó una cantidad de cadaverina producida en cada condición de pH con la de cadaverina producida a pH 8 (FIG. 5). El resultado experimental mostró que la PtLDC tiene una alta estabilidad frente a cambios de pH o pH elevado.
Ejemplo 3. Preparación de E. co li a la que se introduce el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas alcaligenes y análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa expresada a partir del mismo
3- 1. Transformación de E. coli con el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas alcaligenes
Para clonar un gen de lisina descarboxilasa (paldc) derivado de Pseudomonas alcaligenes, se utilizaron los cebadores de 5_PaLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCTGAA GTTCCCCATCC) (SEQ ID NO: 17) y 3_PaLDC_Xhol (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC) (SEQ ID NO: 18) y ADN genómico purificado de Pseudomonas alcalinas como plantilla para realizar la PCR. Se usó ADN polimerasa Pfu como polimerasa y se realizó la PCR durante 30 ciclos en condiciones de 94 °C: 30 s, 55 °C: 30 s, y 72 °C: 2 minutos. Como resultado, se obtuvo un gen paldc amplificado (SEQ ID NO: 4).
El gen paldc obtenido se expresó a baja temperatura en E. coli de la misma manera que en el Ejemplo 2-1, y se identificó por SDS-PAGE (FIG. 6). Tal como se muestra en la FIG. 6, la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas alcaligenes (PaLDC) se expresó principalmente como proteína insoluble, y no se observó proteína soluble en el gel SDS-PAg E (FIG. 6, véanse Carriles 1 y 2).
3-2. Análisis de actividad de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas alcaligenes expresada en E. coli
(1) Análisis de la reactividad de la lisina descarboxilasa
Para investigar la reactividad de la PaLDC, un lisado celular de PaLDC obtenido en el Ejemplo 3-1 se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 minutos para obtener un sobrenadante (proteína soluble), que se utilizó en la conversión de lisina. 50 |jl de la proteína soluble, PLP 100 mM y lisina 250 mM se hicieron reaccionar en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,2) en un volumen de reacción de 200 j l a 46 °C durante 2 horas. Como resultado, se encontró que el
70 % de la lisina se convertía en cadaverina por PaLDC (FIG. 7).
(2) Análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa según la temperatura y el pH
Para encontrar una condición de temperatura óptima para la actividad de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas alcaligenes, las actividades enzimáticas se evaluaron en condiciones de temperatura de 30 °C, 40 °C, 46 °C y 60 °C de la misma manera que en el Ejemplo 2-2. Como resultado, se encontró que la PaLDC tenía la actividad más alta a 50 °C (FIG. 8).
La actividad de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas alcaligenes se evaluó en diferentes condiciones de pH de la misma manera que en el Ejemplo 2-2. Como resultado, la PaLDC tuvo la mayor estabilidad a pH 8 y pH 9, y mantuvo el 95 % o más de la actividad a pH 6 (FIG. 9).
Ejemplo 4. Preparación de E. co li a la que se introduce el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas resinovorans y análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa expresada a partir del mismo 4-1. Transformación de E. coli con el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas resinovorans Para clonar un gen de lisina descarboxilasa (prldc) derivado de Pseudomonas resinovorans, se utilizaron los cebadores de 5_PrLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGAGCTC AAGTTCCCCGTCCTC) (SEQ ID NO: 19) y 3_PrLDC_Xhol (AATATACTCGAG TTATTCCCTGATGCAGTCCACTGTA TAGC) (SEQ ID NO: 20) y ADN genómico purificado de Pseudomonas resinovorans como plantilla para realizar la PCR. La PCR se realizó utilizando la misma polimerasa en las mismas condiciones de PCR que en el Ejemplo 3-1. Como resultado, se obtuvo el prldc amplificado (SEQ ID NO: 6).
El gen prldc obtenido se expresó a baja temperatura en E. coli de la misma manera que en el Ejemplo 2-1, y se identificó por SDS-PAGE (FIG. 6; Carriles 3 y 4). Como resultado, se encontró que la PrLDC apenas se expresaba a baja temperatura.
4- 2. Análisis de actividad de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas resinovorans expresada en E. coli (1) Análisis de la reactividad de la lisina descarboxilasa
Para investigar la reactividad de la lisina descarboxilasa (PrLDC) derivada de Pseudomonas resinovorans, un lisado celular de PrLDC obtenido en el Ejemplo 4-1 se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 minutos para obtener un sobrenadante, que se utilizó en la conversión de lisina. 50 |jl de la proteína soluble, PLP 100 mM y lisina 250 mM se hicieron reaccionar en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,2) en un volumen de reacción de 200 j l a 46 °C durante 2 horas. Como resultado, se produjo un 66 % de cadaverina (FIG. 10).
(2) Análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa según la temperatura y el pH
Para encontrar una condición de temperatura óptima para la actividad de la PrLDC, las actividades enzimáticas se evaluaron en condiciones de temperatura de 30 °C, 40 °C, 46 °C y 60 °C de la misma manera que en el Ejemplo 2-2. Como resultado, se encontró que la PrLDC tenía la actividad más alta a 60 °C (FIG. 11).
La actividad de la PrLDC en diferentes condiciones de pH se evaluó de la misma manera que en el Ejemplo 2-2. Como resultado, la PrLDC tuvo la mayor estabilidad a pH 6 y mantuvo el 90 % o más de la actividad a pH 9 (FIG. 12). Ejemplo 5. Preparación de E. co li a la que se introduce el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas putida y análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa expresada a partir del mismo 5- 1. Transformación de E. coli con el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas putida
Para clonar un gen de lisina descarboxilasa (ppldc) derivado de Pseudomonas putida, se utilizaron los cebadores de 5_PpLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAA TTCCCC) (SEQ ID NO: 21) y 3_PpLDC_Xhol (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC) (SEQ ID NO: 22) y ADN genómico purificado de Pseudomonas putida como plantilla para realizar la PCR. Se usó ADN polimerasa Pfu como polimerasa y se realizó la PCR durante 30 ciclos en condiciones de 94 °C: 30 s, 55 °C: 30 s, y 72 °C: 2 minutos. Como resultado, se obtuvo un gen ppldc amplificado (SEQ ID NO: 8).
El gen ppldc obtenido se expresó a baja temperatura en E. coli de la misma manera que en el Ejemplo 2-1, y se identificó por SDS-PAGE (FIG. 13). Como se muestra en los Carriles 3 y 4 y en la FIG. 13, se encontró que la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas putida (PpLDC) apenas se expresaba a baja temperatura.
Se centrifugó un lisado celular a 13.000 rpm durante 15 minutos y se usó un sobrenadante en una reacción de conversión de lisina.
5- 2. Análisis de actividad de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas putida expresada en E. coli (1) Análisis de la reactividad de la lisina descarboxilasa
Para investigar la reactividad de la PpLDC, el lisado celular de PpLDC obtenido en el Ejemplo 5-1 se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 minutos para obtener un sobrenadante, que se utilizó en la conversión de lisina. 50 |jl de la proteína soluble, PLP 100 mM y lisina 250 mM se hicieron reaccionar en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,2) en un volumen de reacción de 200 j l a 46 °C durante 2 horas. Como resultado, se produjo un 16 % de cadaverina (FIG. 14).
(2) Análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa según la temperatura y el pH
Para encontrar una condición de temperatura óptima para la actividad de la PpLDC, las actividades enzimáticas se evaluaron en condiciones de temperatura de 50 °C, 60 °C y 70 °C de la misma manera que en el Ejemplo 2-2. Como resultado, se encontró que la PpLDC tenía la mayor actividad a 50 °C (FIG. 15).
La actividad de la PpLDC en diferentes condiciones de pH se evaluó de la misma manera que en el Ejemplo 2-2. Como resultado, la PpLDC mostró la mayor actividad a pH 6, y su reactividad disminuyó al aumentar el pH (FIG. 16). Ejemplo 6. Preparación de E. co li a la que se introduce el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas synxantha y análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa expresada a partir del mismo 6- 1. Transformación de E. coli con el gen de la lisina descarboxilasa derivado de Pseudomonas synxantha Para clonar un gen de lisina descarboxilasa (pxldc) derivado de Pseudomonas synxantha, se utilizaron los cebadores de 5_PxLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAA TTCCCC) (SEQ ID NO: 23) y 3_PxLDC_Xhol (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC) (SEQ ID NO: 24) y ADN genómico purificado de Pseudomonas synxantha como plantilla para realizar la PCR. Se usó ADN polimerasa Pfu para la amplificación génica y se realizó la PCR durante 30 ciclos en condiciones de 94 °C: 30 s, 45 °C: 30 s, y 72 °C: 2 min para obtener pxldc amplificado (SEQ ID NO: 10).
El gen pxldc obtenido se expresó a baja temperatura en E. coli de la misma manera que en el Ejemplo 2-1, y se identificó por SDS-PAGE (FIG. 13). Como se muestra en los Carriles 7 y 8 y en la FIG. 13, se encontró que la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas synxantha (PxLDC) se sobreexpresaba como proteína soluble a baja temperatura.
6-2. Análisis de actividad de la lisina descarboxilasa derivada de Pseudomonas synxantha expresada en E. coli (1) Análisis de reactividad de la PxLDC
Para investigar la reactividad de la PxLDC, el lisado celular de PxLDC obtenido en el Ejemplo 6-1 se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 minutos para obtener un sobrenadante, que se utilizó en la conversión de lisina. 50 j l de la proteína soluble, PLP 100 mM y lisina 250 mM se hicieron reaccionar en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,2) en un volumen de reacción de 200 j l a 46 °C durante 2 horas. Como resultado, se produjo un 25 % de cadaverina (FIG. 17).
(2) Análisis de la actividad de la lisina descarboxilasa según el pH
Para encontrar una condición de pH óptima para PxLDC, las actividades enzimáticas se evaluaron bajo diferentes condiciones de pH de la misma manera que en el Ejemplo 2-2 (FIG. 18). Como resultado, la PxLDC mostró la mayor actividad a pH 6 y su reactividad disminuyó con el aumento del pH.
Ejemplo 7. Comparación de la actividad entre la lisina descarboxilasa derivada de E. coli y la lisina descarboxilasa derivada de
Pseudomonas thermotolerans
7-1. Clonación y expresión de lisina descarboxilasa derivada de E. coli
Un gen de la lisina descarboxilasa de E. coli, cadA, se clonó para expresar EcLDC (SEQ ID NO: 11). La homología entre las secuencias de aminoácidos de PtLDC y EcLDC es del 36 %. Se insertó un plásmido clonado con el gen cadA en E. coli K-12 BL21, y se incubó a 37 °C durante 4 horas para inducir la expresión. La EcLDC así completamente expresada se identificó mediante SDS-PAGE (FIG. 13; Carriles 1 y 2). Como resultado, se encontró que la EcLDC se sobreexpresaba como proteína soluble.
7-2. Comparación de la actividad enzimática relativa entre la EcLDC y la PtLDC
(1) Comparación de la actividad según la temperatura
Se comparó la actividad enzimática relativa (actividad relativa) entre la EcLDC y la PtLDC en diversas condiciones de temperatura (37 °C, 42 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C y 80 °C) de la misma manera que en el Ejemplo 2-2 (FIG. 19).
Como resultado, se encontró que tanto la EcLDC como la PtLDC mostraban la mayor actividad a 60 °C. La EcLDC tenía una actividad relativa del 54 % a 50 °C (cuando la actividad de la EcLDC a 60 °C se tomó como el 100 %), y la EcLDC tenía una actividad relativa del 12 % a 80 °C. La PtLDC tenía una actividad relativa del 76 % a 50 °C (cuando la actividad de la PtLDC a 60 °C se tomó como el 100 %), y la PtLDC tenía una actividad relativa del 19 % a 80 °C. Se encontró que la actividad de la PtLDC se mantenía bien a alta temperatura. En conclusión, ambas enzimas mostraron una gran diferencia en sus actividades dependiendo de la temperatura, y la actividad relativa de la PtLDC se mantuvo bien, en comparación con la EcLDC.
(2) Comparación de la actividad según el pH
Adicionalmente, la actividad se evaluó en diversas condiciones de pH (6,2, 7,4, 8,0 y 9,0) de la misma manera que en el Ejemplo 2-2 (FIG. 20). Como resultado, la EcLDC mostró la mayor actividad a pH 6, y la actividad enzimática de la EcLDC disminuyó considerablemente al aumentar el pH. A pH 9, la EcLDC mantuvo el 50 % de la actividad. Por el contrario, la PtLDC no mostró grandes cambios en la actividad según el pH, y la PtLDC mantuvo el 90 % o más de la actividad a pH 6,2-9. En consecuencia, se evaluó que la PtLDC mostraba mayor estabilidad frente a la temperatura y el pH que la EcLDC.
(3) Comparación de actividad entre la PtLDC y la EcLDC
Cuando se cuantificaron las proteínas PtLDC y EcLDC para evaluar la actividad específica (unidad/mg), la PtLDC mostró un valor de 10060 (unidad/mg) y la EcLDC mostró un valor de 36335 (unidad/mg). Cuando se compararon sus reactividades, la EcLDC mostró una actividad aproximadamente 3,6 veces mayor que la PtLDC. Además, cuando se comparó una temperatura óptima entre las enzimas, ambas enzimas mostraron reacciones óptimas a 60 °C, y sus actividades disminuyeron considerablemente con la variación de la temperatura. Sin embargo, cuando se compararon las condiciones óptimas de pH, la EcLDC mostró una mayor inactividad específica al aumentar el pH, y la PtLDC no mostró grandes cambios en la actividad enzimática según el cambio de pH.
La EcLDC tiene mayor actividad que la PtLDC. Sin embargo, la actividad de la EcLDC puede estar muy influenciada por el cambio de pH, a medida que aumenta el pH por reacción de la lisina descarboxilasa. La PtLDC tiene mayor estabilidad frente al pH que la EcLDC, lo cual es ventajoso en la reacción de conversión de lisina. La producción comercial de cadaverina por bioconversión de lisina requiere ajuste de pH por tratamiento con ácido, pero la PtLDC puede mitigar la necesidad de titulación del pH. Se espera que puedan reducirse los costes de producción requeridos para la bioconversión de cadaverina.
Institución depositaria: El Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos (KCCM, por sus siglas en inglés)
Número de acceso: KCCM11559P
Fecha del depósito: 20140724
(j p )
Claims (6)
1. Un microorganismo que se transforma con un polinucleótido que codifica una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa, dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en donde dicha proteína es de Pseudomonas sp., y el microorganismo es un microorganismo de Escherichia sp.
2. Un microorganismo que tiene la capacidad de producir cadaverina, en donde el microorganismo se transforma con un polinucleótido que codifica una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa, dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en donde dicha proteína es de Pseudomonas sp., y el microorganismo es un microorganismo de Escherichia sp.
3. Un método de preparación de cadaverina, que comprende las etapas de:
convertir lisina en cadaverina mediante el uso de una proteína que tiene actividad de lisina descarboxilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos que tenga un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en donde dicha proteína es de Pseudomonas sp. o el microorganismo de la reivindicación 1; y
recuperar la cadaverina convertida.
4. Un método de preparación de cadaverina, que comprende las etapas de:
cultivar el microorganismo de la reivindicación 2 en un medio; y
recuperar la cadaverina del microorganismo o del medio.
5. El microorganismo de la reivindicación 1 o 2, en donde el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos que tiene un 90 % o más de identidad de secuencia con la misma.
6. El método de la reivindicación 3 o 4, en donde el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos que tiene un 90 % o más de identidad de secuencia con la misma.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150019732A KR20160097691A (ko) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법 |
| PCT/KR2016/000389 WO2016129812A1 (ko) | 2015-02-09 | 2016-01-14 | 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2949045T3 true ES2949045T3 (es) | 2023-09-25 |
Family
ID=56614762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16749352T Active ES2949045T3 (es) | 2015-02-09 | 2016-01-14 | Nueva lisina descarboxilasa y método para producir cadaverina usando la misma |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10351839B2 (es) |
| EP (2) | EP3257939B1 (es) |
| JP (1) | JP6431205B2 (es) |
| KR (1) | KR20160097691A (es) |
| CN (1) | CN107208083A (es) |
| BR (5) | BR112017017071B1 (es) |
| ES (1) | ES2949045T3 (es) |
| HU (1) | HUE062791T2 (es) |
| PL (1) | PL3257939T3 (es) |
| RU (1) | RU2699516C2 (es) |
| WO (1) | WO2016129812A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110291101B (zh) * | 2016-12-30 | 2023-08-08 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 修饰的赖氨酸脱羧酶 |
| EP3562938A4 (en) * | 2016-12-30 | 2020-11-11 | Cathay Biotech Inc. | LYSINE DECARBOXYLASES WITH CHANGES IN THE LEVELS OF TITRABLE AMINO ACIDS |
| WO2019006723A1 (en) * | 2017-07-06 | 2019-01-10 | Cathay R&D Center Co., Ltd. | HETEROLOGOUS EXPRESSION OF THERMOPHILIC DECARBOXYLASE LYSINE AND USES THEREOF |
| CN112746066B (zh) * | 2021-01-25 | 2023-10-31 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 一种l-赖氨酸脱羧酶突变体及其应用 |
| CN112746067B (zh) * | 2021-01-26 | 2023-10-31 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体 |
| CN112899262B (zh) * | 2021-04-01 | 2023-06-09 | 南京工业大学 | 一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6640574B2 (en) | 2000-12-28 | 2003-11-04 | Lg Electronics Inc. | Air conditioner |
| JP4196620B2 (ja) | 2002-04-08 | 2008-12-17 | 東レ株式会社 | ポリアミド原料用カダベリンの製造方法 |
| US7602969B2 (en) | 2002-07-18 | 2009-10-13 | Sony Corporation | Imaging data processing method, imaging data processing device, and computer program |
| DE602004000428T2 (de) | 2003-05-26 | 2006-10-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von Cadaverindicarboxylat und dessen Verwendung zur Herstellung von Nylon |
| JP4157019B2 (ja) | 2003-11-11 | 2008-09-24 | 積水ハウス株式会社 | 騒音防止型二重配管 |
| JP2008193898A (ja) | 2005-05-19 | 2008-08-28 | Ajinomoto Co Inc | カダベリンの製造法 |
| EP2013353B1 (en) * | 2006-03-30 | 2016-06-22 | Basf Se | Process for the production of cadaverine |
| DE102007005072A1 (de) * | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin |
| DE112008001452T5 (de) * | 2007-05-22 | 2010-12-16 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit erhöhter Toleranz und/oder Resistenz gegen Umweltstress und erhöhter Biomasseproduktion |
| EP2222693A4 (en) | 2007-12-07 | 2011-03-09 | Univ Oklahoma State | MUTANTS OF LYSINDECARBOXYLASE, VACCINES AGAINST PERIODONTITIS AND METHOD OF USE |
| KR20110060888A (ko) | 2008-09-30 | 2011-06-08 | 도레이 카부시키가이샤 | 화학품의 제조 방법 및 연속 배양 장치 |
| JP5504608B2 (ja) * | 2008-10-23 | 2014-05-28 | 東レ株式会社 | １，５−ペンタンジアミンの製造方法 |
| SG172038A1 (en) | 2008-12-09 | 2011-07-28 | Toray Industries | Method for producing sugar liquid |
| KR101231897B1 (ko) * | 2010-08-03 | 2013-02-08 | 한국과학기술원 | 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법 |
| EP2650373B1 (en) * | 2010-12-08 | 2018-08-15 | Toray Industries, Inc. | Method for producing cadaverine |
| US9546127B2 (en) | 2013-01-28 | 2017-01-17 | Cathay R&D Center Co., Ltd. | Purification of cadaverine |
| JP6394061B2 (ja) * | 2014-05-20 | 2018-09-26 | 味の素株式会社 | アルカリ性条件下で反応を触媒できるリジン脱炭酸酵素を用いる１，５−ペンタンジアミンの製造方法 |
| US10647976B2 (en) * | 2014-06-26 | 2020-05-12 | Cathay Biotech Inc. | Expression of polypeptides involved in lysine decarboxylation, and methods and applications thereof |
| US10400257B2 (en) * | 2014-10-09 | 2019-09-03 | Cathay R&D Center Co., Ltd | Expression of recombinant tetracycline efflux pumps for the production of lysine or lysine-derived products, and methods and applications thereof |
-
2015
- 2015-02-09 KR KR1020150019732A patent/KR20160097691A/ko active Application Filing
-
2016
- 2016-01-14 BR BR112017017071-0A patent/BR112017017071B1/pt active IP Right Grant
- 2016-01-14 US US15/549,792 patent/US10351839B2/en active Active
- 2016-01-14 BR BR122023022744-1A patent/BR122023022744A2/pt unknown
- 2016-01-14 CN CN201680009472.0A patent/CN107208083A/zh active Pending
- 2016-01-14 BR BR122023022752-2A patent/BR122023022752A2/pt unknown
- 2016-01-14 ES ES16749352T patent/ES2949045T3/es active Active
- 2016-01-14 BR BR122023022754-9A patent/BR122023022754A2/pt unknown
- 2016-01-14 RU RU2017128752A patent/RU2699516C2/ru active
- 2016-01-14 WO PCT/KR2016/000389 patent/WO2016129812A1/ko active Application Filing
- 2016-01-14 PL PL16749352.7T patent/PL3257939T3/pl unknown
- 2016-01-14 EP EP16749352.7A patent/EP3257939B1/en active Active
- 2016-01-14 EP EP20179523.4A patent/EP3739046A1/en active Pending
- 2016-01-14 JP JP2017541814A patent/JP6431205B2/ja active Active
- 2016-01-14 HU HUE16749352A patent/HUE062791T2/hu unknown
- 2016-01-14 BR BR122023022750-6A patent/BR122023022750A2/pt unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018504135A (ja) | 2018-02-15 |
| EP3257939B1 (en) | 2023-06-14 |
| CN107208083A (zh) | 2017-09-26 |
| BR122023022754A2 (pt) | 2024-01-16 |
| JP6431205B2 (ja) | 2018-11-28 |
| RU2017128752A3 (es) | 2019-03-12 |
| RU2699516C2 (ru) | 2019-09-05 |
| BR112017017071B1 (pt) | 2024-01-23 |
| BR122023022750A2 (pt) | 2024-01-16 |
| BR122023022744A2 (pt) | 2024-01-16 |
| BR112017017071A2 (pt) | 2018-04-10 |
| EP3257939A1 (en) | 2017-12-20 |
| PL3257939T3 (pl) | 2023-11-27 |
| US10351839B2 (en) | 2019-07-16 |
| WO2016129812A1 (ko) | 2016-08-18 |
| RU2017128752A (ru) | 2019-03-12 |
| KR20160097691A (ko) | 2016-08-18 |
| BR122023022752A2 (pt) | 2024-01-16 |
| EP3257939A4 (en) | 2018-10-17 |
| HUE062791T2 (hu) | 2023-12-28 |
| US20180030430A1 (en) | 2018-02-01 |
| EP3739046A1 (en) | 2020-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2949045T3 (es) | Nueva lisina descarboxilasa y método para producir cadaverina usando la misma | |
| CN102947460B (zh) | 通过发酵生产l-鸟氨酸的方法 | |
| RU2665825C2 (ru) | Микроорганизмы, продуцирующие путресцин, и способ получения путресцина с использованием этих микроорганизмов | |
| RU2671106C1 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-аргинина и способ получения L-аргинина с использованием этого микроорганизма | |
| TWI635176B (zh) | 用於製造腐胺或鳥胺酸的微生物及使用該微生物用於製造腐胺或鳥胺酸的方法 | |
| JP2016506756A (ja) | Ｌ−バリン産生能が向上した菌株及びこれを用いたｌ−バリンの産生方法 | |
| KR20130082124A (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| CN112888776B (zh) | 生产目标物质的方法 | |
| JP2018512132A (ja) | ピルビン酸デヒドロゲナーゼ変異体、それを含む微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸生産方法 | |
| AU2014291007B2 (en) | A Novel Modified Ornithine Decarboxylase Protein And A Use Thereof | |
| Xu et al. | Improvement of L‐lysine production combines with minimization of by‐products synthesis in Corynebacterium glutamicum | |
| KR101940647B1 (ko) | 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법 | |
| KR101359844B1 (ko) | 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 | |
| CN101952418B (zh) | 生产(2s，3r，4s)-4-羟基-l-异亮氨酸的方法 | |
| CN113278569B (zh) | 无质粒、无诱导剂使用的产d-泛酸基因工程菌及构建方法 | |
| CN110997899B (zh) | 嗜热赖氨酸脱羧酶的异源表达及其用途 | |
| TWI650416B (zh) | 用於製造二胺之微生物及使用該微生物製造二胺之方法 | |
| JP2018529354A (ja) | Ｌ−トレオニンを生産する組み換え微生物及びそれを用いてｌ−トレオニンを生産する方法 | |
| ES2906229T3 (es) | Microorganismo productor de O-acetil-homoserina, y método para producir O-acetil-homoserina mediante el uso de este | |
| TWI756604B (zh) | 鳥胺酸脫羧酶變異體、使用其製造丁二胺之方法、聚核苷酸、微生物、聚醯胺的製備方法以及聚醯胺製備用組成物 | |
| US20230287382A1 (en) | Ornithine decarboxylase variant and method for producing putrescine by using same | |
| KR20200046551A (ko) | 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법 | |
| BR112018068816B1 (pt) | Microrganismo corynebacterium glutamicum produtor de putrescina e método para produzir putrescina utilizando o mesmo | |
| KR20160003615A (ko) | 향상된 퓨트레신 생산능을 가지는 변이된 오르니틴 디카복실레이즈 단백질 및 이의 용도 |