BR122023022752A2 - Microrganismo transformado e método de preparação de cadaverina - Google Patents
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Abstract
microrganismo transformado e método de preparação de cadaverina. a presente invenção refere-se a: uma nova lisina descarboxilase; um microrganismo transformado com um gene que codifica a atividade em questão; e um método para produzir cadaverina usando a mesma.
Description
[001] A presente invenção refere-se a uma nova lisina descarboxilase, um microrganismo transformado com um gene que codifica uma proteína possuindo a atividade correspondente, e um método de produção de cadaverina utilizando a mesma.
[002] Um método geral de produção de nylon utilizando diamina é um processo químico de utilização de 1,4- diaminobutano e hexametilenodiamina como matérias-primas. Essas matérias-primas são produzidas a partir de compostos orgânicos à base de petróleo. Portanto, à medida que as regulamentações ambientais são fortalecidas, a demanda do mercado por materiais alternativos produzidos através de rotas bio-baseadas está crescendo.
[003] Enquanto isso, cadaverina é um composto orgânico de diamina composto por 5 carbonos que possui uma fórmula molecular de NH2(CH2)5NH2 e pode ser uma matéria-prima para nylon 5,6. Se a preparação bio-baseada de cadaverina é possível, é esperado que uma variedade de nylons pode ser produzida enquanto satisfaça a demanda do mercado de materiais bio-baseados.
[004] Em relação à produção de cadaverina bio-baseada, os estudos sobre bioconversão da lisina foram amplamente conhecidos antes da década de 1940 (Gale E.F., Epps H.M. 1944. Estudos sobre as descarboxilases de aminoácidos bacterianas. Biochem J. 38, 232-242). Em um estágio chave da bioconversão, a lisina descarboxilase é uma enzima que produz cadaverina a partir da lisina (Figura 1). A atividade da lisina descarboxilase em muitos microrganismos diferentes foi relatada, e a lisina descarboxilase, cuja atividade específica (mmol/min/mg) é conhecida, é derivada de quatro tipos de microrganismos (Escherichia coli, Bacterium cadaveris, Glycine max e Selenomonas ruminantium). Dentre eles, a lisina descarboxilase derivada de Escherichia coli é avaliada como a lisina descarboxilase com a maior atividade, e a enzima utilizada na produção prática também está limitada a CadA que é derivada de Escherichia coli (Patente Japonesa No. 2005-147171, Patente Europeia No. 2004-010711 e Patente Japonesa No. 2002-257374). No entanto, a produção de cadaverina pela reação da lisina com a lisina descarboxilase gera dióxido de carbono pela descarboxilação da lisina, e produz um cátion divalente, cadaverina a partir de um cátion monovalente, a lisina aumentando assim o pH durante a reação. Assim, quando a reação enzimática da lisina descarboxilase ocorre, o pH é alterado, o que gera um problema de redução da eficiência. Além disso, a enzima pode ser desnaturada por um ácido produzido em uma solução de reação, ou uma base, perdendo assim a sua atividade.
[005] Por conseguinte, os presentes inventores descobriram uma nova lisina descarboxilase possuindo estabilidade contra altas temperaturas e pH e verificaram que a lisina descarboxilase pode ser expressa em um microrganismo pertencente a Escherichia sp., completando deste modo a presente invenção.
[006] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma nova lisina descarboxilase e um polinucleotídeo que codifica uma proteína possuindo a atividade correspondente.
[007] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um microrganismo que seja transformado para expressar a lisina descarboxilase.
[008] Ainda outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método de produção de cadaverina utilizando a enzima ou o microrganismo incluindo a mesma.
[009] Em um aspecto específico da presente invenção, é proporcionada uma proteína com nova atividade de lisina descarboxilase, incluindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos possuindo 75% ou mais de homologia de sequência com a mesma.
[010] Tal como aqui utilizado, o termo "proteína que tem a atividade de lisina descarboxilase" refere-se a uma proteína que tem atividade de catalisar uma reação de descarboxilação de lisina utilizando piridoxal-5’-fosfato como uma coenzima para descarboxilar lisina, produzindo assim cadaverina e dióxido de carbono.
[011] A proteína que possui a atividade de lisina descarboxilase incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de aminoácidos possuindo 75% ou mais de homologia de sequência com a mesma pode ser uma proteína que possui atividade de lisina descarboxilase, que é recentemente descoberta em um microrganismo de Pseudomonas sp., e a proteína pode incluir todas as proteínas, desde que tenham a atividade correspondente e sejam descobertas em um microrganismo de Pseudomonas sp. Por exemplo, o microrganismo de Pseudomonas sp. pode ser Pseudomonas thermotolerans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas putida e Pseudomonas synxantha.
[012] Especificamente, uma proteína com nova atividade de lisina descarboxilase derivada do microrganismo de Pseudomonas thermotolerans pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 85 % ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com SEQ ID NO: 1. Uma proteína com atividade de lisina descarboxilase derivada do microrganismo de Pseudomonas alcaligenes pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com SEQ ID NO: 3. Uma proteína com atividade de lisina descarboxilase derivada do microrganismo de Pseudomonas resinovorans pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com SEQ ID NO: 5. Uma proteína com atividade de lisina descarboxilase derivada do microrganismo de Pseudomonas putida pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com SEQ ID NO: 7. Uma proteína com atividade de lisina descarboxilase derivada do microrganismo de Pseudomonas sinxantha de pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com SEQ ID NO: 9. No entanto, as proteínas não estão limitadas às sequências de aminoácidos acima, e as proteínas podem ter todas as sequências de aminoácidos, desde que as sequências de aminoácidos são capazes de manter a atividade da lisina descarboxilase.
[013] Além disso, em outro aspecto específico da presente invenção, é proporcionado um polinucleotídeo que codifica a nova proteína que possui a atividade de lisina descarboxilase, especificamente, um polinucleotídeo com homologia de sequência de 75% ou mais com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.
[014] A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína que tem a atividade de lisina descarboxilase pode ser obtida a partir de uma sequência genômica conhecida derivada do microrganismo Pseudomonas sp. Especificamente, a sequência de nucleotídeos pode ser obtida a partir de sequências genômicas derivadas de um ou mais microrganismos selecionados do grupo que consiste de Pseudomonas thermotolerans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas putida e Pseudomonas synxantha. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a lisina descarboxilase que é derivada do microrganismo de Pseudomonas thermotolerans pode ter a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, e também pode ter uma sequência de nucleotídeos possuindo cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a lisina descarboxilase que é derivada do microrganismo de Pseudomonas alcaligenes pode ter uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 e também pode ter uma sequência de nucleotídeos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a lisina descarboxilase que é derivada do microrganismo Pseudomonas resinovorans pode ser obtida a partir de uma sequência genômica conhecida de Pseudomonas resinovorans e, especificamente, pode ter uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6, e também pode ter uma sequência de nucleotídeos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a lisina descarboxilase que é derivada do microrganismo de Pseudomonas putida pode ter uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8, e também pode ter uma sequência de nucleotídeos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 8. Uma sequência de nucleotídeos que codifica a L-lisina descarboxilase que é derivada do microrganismo de Pseudomonas synxantha pode ter uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10, e também pode ter uma sequência de nucleotídeos com cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 95% ou mais de homologia de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10. No entanto, os polinucleotídeos que codificam as proteínas que possuem a atividade de lisina descarboxilase não são limitados a isso, e os polinucleotídeos podem incluir todos os polinucleotídeos sem limitação, desde que os polinucleotídeos sejam capazes de codificar a nova proteína possuindo a atividade de lisina descarboxilase da presente invenção.
[015] Tal como aqui utilizado, o termo "homologia" refere-se a um grau de correspondência com uma determinada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos, e a homologia pode ser expressa como uma percentagem. Na presente descrição, uma sequência homóloga possuindo atividade que é idêntica ou semelhante à dada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos é expressa como "% de homologia". Por exemplo, a homologia pode ser determinada usando parâmetros de cálculo de software padrão, tal como pontuação, identidade, similaridade, etc., especificamente, BLAST 2.0, ou comparando as sequências em um experimento de hibridação Southern em condições rigorosas como definidas e definindo condições de hibridação apropriada que podem ser determinadas por um método bem conhecido dos especialistas na técnica (por exemplo, ver Sambrook et al., 1989, infra.).
[016] Mais especificamente, a lisina descarboxilase pode ter um ou mais selecionados do grupo que consiste de sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a proteína que tem a atividade L-lisina descarboxilase pode ter um ou mais selecionados do grupo que consiste de sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10.
[017] Em uma modalidade da presente invenção, foi confirmado que as lisinas descarboxilases derivadas dos microrganismos de Pseudomonas sp acima não mostram grandes mudanças em suas atividades com um pH alto e, portanto, têm estabilidade ao pH.
[018] Ainda em outro aspecto específico da presente invenção, é proporcionado um microrganismo que é transformado para expressar a nova proteína que tem a atividade de lisina descarboxilase. O microrganismo transformado pode ser qualquer dos microrganismos procarióticos e eucarióticos, desde que seja transformado para expressar a proteína possuindo a atividade de descarboxilase correspondente. Por exemplo, o microrganismo transformado pode incluir microrganismos da Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp. e Corynebacterium sp.. O microrganismo pode ser especificamente um microrganismo pertencente a Escherichia sp. ou Corynebacterium sp., e mais especificamente, E. coli ou Corynebacterium glutamicum, mas não está limitado a isso.
[019] Além disso, uma cepa parental do microrganismo transformado pode ser um microrganismo com uma capacidade melhorada para produzir lisina, em comparação com um tipo selvagem, mas não está limitado a isso. Tal como aqui utilizado, o termo "microrganismo que melhorou a capacidade de produzir lisina, em comparação com um tipo selvagem" refere-se a um microrganismo com capacidade aumentada para produzir lisina, em comparação com um microrganismo natural ou uma cepa parental, e o microrganismo com capacidade melhorada para produzir a lisina não é particularmente limitado, desde que seja um microrganismo com capacidade melhorada para produzir lisina, em comparação com uma cepa parental.
[020] Para conferir a capacidade melhorada para produzir lisina em comparação com o tipo selvagem, um método geral de microrganismos em crescimento, tal como um método de obtenção de cepas mutantes auxotróficas, cepas resistentes a análogos ou cepas mutantes de controle metabólico com capacidade para produzir lisina, e um método para produzir cepas recombinantes com atividades de enzima biossintética de lisina melhoradas, podem ser usadas. No cultivo de microrganismos produtores de lisina, características tais como auxotrofia, resistência análoga e mutações de controle metabólico podem ser transmitidas sozinhas ou em combinação. A atividade da enzima biossintética da lisina melhorada pode ser transmitida sozinha ou em combinação. Além disso, ao mesmo tempo que transmite as características tais como auxotrofia, resistência análoga e mutações de controle metabólico, a atividade da enzima de biossíntese de lisina também pode ser melhorada ao mesmo tempo. Especificamente, um gene que codifica a enzima biossintética da lisina pode incluir o gene da di-hidrodipicolinato sintase (dapA), o gene da aspartoquinase (lysC), o gene da di-hidrodipicolinato redutase (dapB), o gene da diaminopimelato decarboxilase (lysA), o gene da diaminopimelato desidrogenase (ddh), o gene da fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), o gene da aspartato aminotransferase (aspC) e gene da aspartato semialdeído desidrogenase (asd), mas não está limitado a isso. Um método para conferir ou aumentar a capacidade de produzir lisina através do aumento da atividade da enzima biossintética da lisina pode ser realizado induzindo mutações nos genes que codificam as enzimas correspondentes ou amplificando os genes para aumentar as atividades da enzima intracelular. Estes métodos podem ser realizados por recombinação genética, mas não estão limitados a eles.
[021] O microrganismo pode ser qualquer um dos microrganismos procarióticos e eucarióticos, desde que tenham uma capacidade melhorada de produzir lisina, em comparação com o tipo selvagem. Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo de Escherichia sp. ou um microrganismo de Coryneform. O microrganismo de Escherichia pode ser Escherichia coli, Escherichia albertii, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii ou Escherichia vulneris, mas não se limita a isso. Mais especificamente, o microrganismo da Escherichia sp. pode ser Escherichia coli. O microrganismo Coryneform pode incluir um microrganismo de Corynebacterium ou Brevibacterium sp.. Além disso, o microrganismo Coryneform pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum ou Brevibacterium lactofermentum, mas não está limitado a isto.
[022] Para transformar o microrganismo de tal modo que o microrganismo exprima a proteína que possui a atividade de lisina descarboxilase, o gene da lisina descarboxilase da presente invenção pode ser incluído como a proteína da lisina descarboxilase ou como uma unidade de expressão do gene no microrganismo a ser transformado. A unidade de expressão de genes da lisina descarboxilase pode estar operacionalmente ligada a um vetor, e depois transformada no microrganismo, ou integrada no cromossomo do microrganismo. Especificamente, o gene da lisina descarboxilase pode estar operacionalmente ligado de tal modo que o gene é sobre- expresso por um promotor a montante do códon de iniciação.
[023] Tal como aqui utilizado, o termo "unidade de expressão"refere-se a um fragmento que inclui um promotor ligado de forma operacional a um polinucleotídeo que codifica uma proteína, e pode ainda incluir 3'-UTL, 5'-UTL, rabo de poli A, etc. Aqui utilizado, o termo "unidade de expressão"pode ser intercambiável com "cassete de expressão".
[024] Tal como aqui utilizado, o termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre a sequência de nucleotídeos do gene e uma sequência de nucleotídeos tendo uma atividade de promotor, pelo que a transcrição do gene que codifica a lisina descarboxilase é iniciada e mediada, indicando que a sequência de nucleotídeos possuindo a atividade promotora está operacionalmente ligada ao gene da lisina descarboxilase para controlar a atividade transcricional do gene da lisina descarboxilase.
[025] Tal como aqui utilizado, o termo "transformação"significa uma ação total de introdução do gene da lisina descarboxilase derivado do microrganismo Pseudomonas sp. em uma célula hospedeira, especificamente, um microrganismo da Escherichia sp. ou um microrganismo Coryneform, para a expressão do gene na célula hospedeira. A este respeito, o gene da lisina descarboxilase é um polinucleotídeo, incluindo DNA e RNA, capaz de codificar a lisina descarboxilase. Enquanto o gene pode ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma, pode ser introduzido em qualquer tipo. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira em um cassete de expressão que é uma estrutura polinucleotídica incluindo por si só elementos inteiros para expressar o gene. O cassete de expressão inclui um promotor que está operacionalmente ligado ao gene, um sinal de terminação da transcrição, um local de ligação ao ribossomo e um sinal de terminação da tradução. O cassete de expressão pode ser um vetor de expressão auto-replicável. O gene também pode ser introduzido na célula hospedeira por si só ou em uma estrutura polinucleotídica a ser operacionalmente ligada à sequência necessária para a expressão na célula hospedeira. O vetor recombinante é um meio pelo qual o DNA é introduzido na célula hospedeira para expressar a proteína, e um vetor de expressão conhecido, como um vetor plasmídico, um vetor cósmido, um vetor bacteriófago, etc. podem ser usados. O vetor pode ser facilmente preparado pelos especialistas na técnica de acordo com qualquer método conhecido de utilização de uma técnica de recombinação de DNA, mas não está limitado a isto.
[026] O método de transformação pode ser qualquer método de introdução do polinucleotídeo em células, e pode ser realizado selecionando uma técnica padrão apropriada conhecida na técnica. Por exemplo, o método pode incluir eletroporação, co-precipitação de fosfato de cálcio, infecção retroviral, microinjeção, um método DEAE-dextrano, um método de lipossoma catiônico, etc., mas não está limitado a isso.
[027] Em uma modalidade específica, o microrganismo com a capacidade melhorada para produzir lisina é transformado de tal modo que a proteína que possui a atividade da lisina descarboxilase da presente invenção é expressa, tendo assim excelente capacidade de produzir cadaverina.
[028] Ainda em outra modalidade específica da presente invenção, é proporcionada a utilização da nova lisina descarboxilase ou do microrganismo transformado para expressar a nova proteína possuindo a atividade de lisina descarboxilase na produção de cadaverina.
[029] A nova lisina descarboxilase e o microrganismo transformado para expressar a nova proteína possuindo a atividade de lisina descarboxilase são os mesmos que os descritos acima. Em uma modalidade específica, foi confirmado que a lisina descarboxilase da presente invenção tem uma estabilidade mais elevada contra uma temperatura ou mudança de pH do que a lisina descarboxilase derivada de E. coli que tem sido habitualmente utilizada na produção de cadaverina. Particularmente, a nova lisina descarboxilase da presente invenção tem maior estabilidade de pH do que a lisina descarboxilase derivada de E. coli e, portanto, é vantajoso em uma reação de conversão de lisina em cadaverina. Consequentemente, a nova lisina descarboxilase da presente invenção e o microrganismo transformado para expressar a nova proteína que tem a atividade de lisina descarboxilase podem ser utilizados na produção de cadaverina.
[030] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de preparação de cadaverina.
[031] Em uma modalidade específica do método de preparação de cadaverina da presente invenção, o método é um método de preparação de cadaverina, incluindo as etapas de conversão de lisina em cadaverina usando a nova proteína que possui a atividade da lisina descarboxilase ou o microrganismo transformado para expressar a proteína que tem a atividade; e recuperando a cadaverina convertida.
[032] A nova proteína que tem a atividade de lisina descarboxilase e o microrganismo transformado são os mesmos descritos acima. O microrganismo transformado pode ser especificamente um microrganismo da Escherichia sp..
[033] Na etapa de conversão da lisina em cadaverina, a nova proteína que possui a atividade de lisina descarboxilase é extraída do microrganismo que expressa a proteína, e a enzima é purificada e utilizada para descarboxilar a lisina, produzindo assim cadaverina. Alternativamente, a lisina é adicionada a uma cultura obtida pela cultura do microrganismo transformado, e o microrganismo é usado quando é para descarboxilar a lisina, convertendo assim a lisina em cadaverina.
[034] Em outra modalidade específica do método de preparação de cadaverina da presente invenção, é proporcionado um método de preparação de cadaverina, incluindo as etapas de cultura em um meio o microrganismo que tem capacidade para produzir cadaverina, em que o microrganismo que possui capacidade melhorada para produzir lisina em comparação com o tipo selvagem é transformado para expressar a nova proteína possuindo a atividade de lisina descarboxilase; e recuperando cadaverina do microrganismo ou da cultura.
[035] A nova proteína que tem a atividade L-lisina descarboxilase e o microrganismo possuindo a capacidade melhorada de produzir lisina, em comparação com o tipo selvagem, são os mesmos que os descritos acima.
[036] A cultura pode ser realizada em um meio adequado em condições de cultura que são bem conhecidas na técnica. As condições de meio e de cultura podem ser facilmente modificadas por qualquer especialista na técnica, dependendo do tipo de microrganismo selecionado. O método de cultura pode incluir cultura em batelada, cultura contínua, cultura alimentada em batelada, ou uma combinação destes, mas não está limitada a ela.
[037] O meio pode incluir uma variedade de fontes de carbono, fontes de nitrogênio e elementos traços.
[038] Especificamente, por exemplo, as fontes de carbono podem incluir carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; álcoois tais como glicerol e etanol; ácidos orgânicos tais como ácido acético, ou suas combinações. Especificamente, a glicose pode ser utilizada como fonte de carbono, mas não está limitada a ele. As fontes de nitrogênio podem incluir fontes de nitrogênio orgânico, tais como peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, licor de palha de milho (CSL) e farelo de soja, fontes de nitrogênio inorgânico, tais como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio, ou suas combinações, mas não estão limitadas a elas. O meio pode incluir, como fontes de fósforo, por exemplo, hidrogenofosfato dipotássico, di-hidrogenofosfato de potássio e sais contendo sódio correspondentes e sais metálicos tais como sulfato de magnésio e sulfato de ferro, mas não está limitado a isso. Além disso, aminoácidos, vitaminas e precursores adequados podem ser incluídos no meio. O meio ou os componentes individuais podem ser adicionados ao meio em modo de batelada ou modo contínuo. Estes exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não pretende ser limitada desse modo.
[039] Além disso, o pH do meio pode ser ajustado durante a cultura por adição de um composto tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico por um método adequado. A geração de bolhas de ar pode ser inibida durante a cultura utilizando um agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácidos graxo. Para manter uma condição aeróbica no meio, pode ser injetado oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na cultura. A temperatura da cultura pode ser geralmente de 20°C a 45°C, por exemplo, de 25°C a 40°C. A cultura pode continuar até a produção de lisina descarboxilase atingir um nível desejado, por exemplo, durante 10 horas a 160 horas.
[040] Um método de recuperação de cadaverina pode ser realizado, por exemplo, coletando ou recuperando a cadaverina produzida a partir do meio por um método apropriado conhecido na técnica de acordo com um modo em batelada, um modo contínuo ou um modo alimentado por batelada. Neste método de recuperação, podem ser utilizadas centrifugação, filtração, cromatografia de troca iônica, cristalização, etc. Por exemplo, a biomassa pode ser removida da cultura por centrifugação de baixa velocidade e um sobrenadante resultante pode ser purificado por cromatografia de troca iônica.
[041] Além disso, o método de preparação de cadaverina pode ainda incluir a etapa de recuperação da lisina descarboxilase a partir do microrganismo ou do meio.
[042] Um método de recuperação da lisina descarboxilase a partir do microrganismo ou do meio pode ser realizado, por exemplo, coletando ou recuperando a lisina descarboxilase produzida a partir do microrganismo ou do meio por um método apropriado conhecido na técnica de acordo com um modo em batelada, um modo contínuo ou um modo alimentado em batelada. Neste método de recuperação, podem ser utilizadas centrifugação, filtração, cromatografia de troca iônica, cristalização, etc. Por exemplo, a biomassa pode ser removida da cultura por centrifugação de baixa velocidade e um sobrenadante resultante pode ser purificado por cromatografia de permuta iônica. Além disso, a lisina descarboxilase pode ser recuperada a partir de um lisado de células que é obtido interrompendo o microrganismo no meio. O lisado celular pode ser obtido utilizando um método apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, um homogeneizador físico ou um tampão de lise de células comercialmente disponível pode ser utilizado. A lisina descarboxilase pode ser obtida a partir do lisado de células por um método apropriado conhecido na técnica, tal como centrifugação, etc.
[043] Uma nova proteína que possui atividade de lisina descarboxilase derivada de um microrganismo de Pseudomonas sp., proporcionado na presente invenção, pode ter atividade estável mesmo sob alterações de pH e, por conseguinte, a proteína pode ser eficientemente utilizada em uma reação de conversão de lisina em cadaverina, sendo assim amplamente utilizada na produção de cadaverina.
[044] A Figura 1 mostra um mecanismo de reação da lisina descarboxilase que produz cadaverina a partir da lisina; a figura 2 é uma imagem de gel sds-page mostrando resultados de expressão de ptldc e ptldc com uma his-tag-n- terminal; a figura 3 mostra a reatividade do ptldc de converter a lisina em cadaverina; a figura 4 mostra uma atividade enzimática relativa de ptldc de acordo com a temperatura variável; a figura 5 mostra uma atividade enzimática relativa de ptldc de acordo com o ph variável; a figura 6 é uma imagem do gel sds-page que mostra a expressão paldc e prldc; a figura 7 mostra a reatividade do paldc de converter a lisina em cadaverina; a fig. 8 mostra uma atividade enzimática relativa de paldc de acordo com a temperatura variável; a figura 9 mostra uma atividade enzimática relativa de paldc de acordo com o ph variável; a figura 10 mostra a reatividade prldc da conversão da lisina em cadaverina; a figura 11 mostra uma atividade enzimática relativa de prldc de acordo com a temperatura variável; a figura 12 mostra uma atividade enzimática relativa de prldc de acordo com o ph variável; a figura 13 é uma imagem de gel sds-page mostrando resultados de expressão de ecldc, ppldc, ptldc e pxldc; a figura 14 mostra a reatividade ppldc da conversão da lisina em cadaverina; a figura 15 mostra uma atividade enzimática relativa de ppldc de acordo com a temperatura variável; a figura 16 mostra uma atividade enzimática relativa de ppldc de acordo com o ph variável; a figura 17 mostra a reatividade pxldc da conversão da lisina em cadaverina; a figura 18 mostra uma atividade enzimática relativa de pxldc de acordo com o ph variável; a figura 19 mostra respectivas atividades enzimáticas relativas de ecldc e ptldc de acordo com a temperatura variável; e a figura 20 mostra respectivas atividades enzimáticas relativas de ecldc e ptldc de acordo com o ph variável.
[045] A seguir, a presente invenção será descrita com mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, estes Exemplos são apenas para fins ilustrativos, e o âmbito da presente invenção não se destina a ser limitado por estes Exemplos.
[046] Para selecionar uma nova lisina descarboxilase a ser utilizada na produção de cadaverina, um programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAG E TYPE=BlastSearch&LINK LOC=blasthome) fornecido pelo Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia (NCBI), EUA, foi usado para pesquisar a lisina descarboxilase derivada de uma bactéria termófila que possui alta similaridade com uma sequência peptídica de um sítio ativo de lisina descarboxilase derivada de E. coli. Em detalhe, uma pesquisa BLAST foi realizada, com base em um total de 31 sequências peptídicas (GRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKG: SEQ ID NO: 12) incluindo cada uma incluindo 15 aminoácidos no terminal N e o terminal C centrado em torno da 367a lisina que é o principal aminoácido da lisina descarboxilase derivada de E. coli. Como resultado, foi confirmado que os microrganismos Escherichia, Shigella, Enterobacteria, Edwardsiella, Klebsiella, Serratia, Yersinia, Yokenella, Raoultella, Ceratitis, Salmonella, Sutterella, Shimwellia, Vibrio e Pseudomonas sp. possuem alta homologia. A busca foi destinada a encontrar a lisina descarboxilase com alta estabilidade térmica enquanto possuía atividade similar à da lisina descarboxilase de E. coli. Em geral, as proteínas encontradas em bactérias termófilas são conhecidas por ter alta estabilidade térmica e, portanto, dos microrganismos encontrados a partir da pesquisa, Pseudomonas thermotolerans conhecido como microrganismo termófilo (46 ~ 60°C) foi selecionado.
[047] Para selecionar lisina descarboxilases derivadas de microrganismos da Pseudomonas sp. diferentes de Pseudomonas thermotolerans, quatro microrganismos (Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas putida e Pseudomonas synxantha) apresentando baixa homologia entre Pseudomonas sp. foram selecionados. Os programas de nucleotídeos e genomas fornecidos pelo Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia (NCBI), EUA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) foram utilizados para identificar sequências de nucleotídeos e aminoácidos de lisina descarboxilases derivadas de quatro microrganismos da Pseudomonas Sp. selecionados como acima.
[048] A Tabela 1 seguinte mostra a homologia da sequência de aminoácidos da lisina descarboxilase derivada da Pseudomonas sp. PtLDC: lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas thermotolerans (P. thermotolerans) PaLDC: lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas alcaligenes (P. alcaligenes) PrLDC: lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas resinovorans (P. resinovorans) PpLDC: lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas putida (P. putida) PxLDC: lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas synxantha (P. synxantha)
[049] Para introduzir o gene de lisina descarboxilase derivado de Pseudomonas thermotolerans em E. coli e expressar o gene a partir do mesmo, a clonagem de um gene recombinante foi realizada. A informação genética sobre Pseudomonas thermotolerans foi obtida a partir de dados genômicos do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/).
[050] O DNA genômico de Pseudomonas thermotolerans foi obtido, e depois utilizado como molde para amplificar um gene de lisina descarboxilase derivado de Pseudomonas thermotolerans (ptldc) por reação em cadeia da polimerase (PCR). Para realizar a PCR, iniciadores de 5_LDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAATTCCCC) (SEQ ID NO: 13) e 3_LDC_Xhol (AATATACTCGAGTCAGATCTTGATGCAGTCCACCG) (SEQ ID NO: 14) e polimerase de DNA de PfuUltraTM (Stratagene, EUA) para realizar PCR por 30 ciclos em condições de 94°C: 30 segundos, 55°C: 30 segundos e 72°C: 2 min. Como resultado, ptldc amplificado (SEQ ID NO: 2) foi obtido. Além disso, para expressar a lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas thermotolerans com um His-tag N-terminal, os iniciadores de 5_LDC_BamHl (AATATAGGATCCGTACAAAGACCTCCAATTCCCC) (SEQ ID NO: 15) e 3_LDC_Sacl (AATATAGAGCTCTCAGATCTTGATGCAGTCCACCG) (SEQ ID NO: 16) foram utilizados para realizar PCR da mesma maneira que o método de PCR acima. Em seguida, cada gene ptldc obtido a partir de PCR foi inserido em um vetor de expressão de E. coli, pET-Deut1. Posteriormente, cada plasmídeo clonado com o gene ptldc foi inserido em E. coli Rosetta por um método de transformação por choque térmico. Cada uma das E. coli transformadas foi cultivado em um meio LB líquido de 50 ml (contendo 50 mg/ml de ampicilina) a 37°C. Quando um valor de OD600 atingiu 0,8, 0,4 mM de isopropil β- D-1-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG) foi adicionado e incubada a 18° C durante 48 horas para induzir a expressão. Cada lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas thermotolerans (PtLDC) assim completamente expressada foi identificada por SDS-PAGE (Figura 2). Os resultados de SDS- PAGE mostraram que PtLDC e PtLDC com His-tag expressada a baixa temperatura foram sobre-expressados como proteínas solúveis (Faixas 2 e 4 da Figura 2).
[051] A E. coli Rosetta transformada com o plasmídeo incluindo o ptldc (SEQ ID NO: 2) foi designada como "Escherichia coli CC04-0055" e depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM) em 24 de julho de 2014 sob o número de acesso KCCM11559P.
[052] Para investigar as reatividades de PtLDC e PtLDC com a His-tag, 50 ml de proteína solúvel, fosfato de piridoxal 100 mM (fosfato de piridoxal, PLP) e lisina 250 mM foram feitos reagir num volume de 200 ml a 46°C por 2 horas. Uma solução tampão de reação foi fosfato de sódio 50 mM a pH 6,2. Um microrganismo no qual um vetor vazio foi introduzido foi usado como controle e as quantidades de lisina e cadaverina foram analisadas (Figura 3). A cromatografia líquida de alto desempenho (Waters, Milford, MA) foi realizada para analisar quantidades precisas de lisina e cadaverina em um Detector Refractive Indes 2414 (Waters, Milford, MA). O reagente de Lisina-HCl e o reagente de 1,5- diaminopentano (cadaverina) foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO) e uma fase móvel consistindo em ácido cítrico 1 mM, ácido tartárico 10 mM, etilenodiamina 24 mM e acetonitrila a 5% foi usado para separar e quantificar os dois materiais em uma coluna IonoSpher C3-100 mm, 5mm. O controle não mostrou produção de cadaverina. PtLDC com o His-tag N-terminal mostrou 72% de conversão de lisina, e PtLDC mostrou 100% de conversão de lisina, indicando a produção de cadaverina.
[053] Para analisar as características enzimáticas de PtLDC em várias condições de temperatura (30°C, 42°C, 50°C, 60°C, 70°C e 80°C), as atividades relativas foram comparadas. Quando PtLDC foi diluído e reagiu com 250 mM de substrato de lisina a 60°C durante 30 minutos, foi verificado que a cadaverina 42 mM foi produzida. A este respeito, as concentrações de cadaverina foram analisadas usando tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 6,2) como uma solução tampão, e uma quantidade igual da enzima nas mesmas condições de reação, exceto que as condições de temperatura foram de 30°C, 42°C, 50°C, 70°C e 80°C, e comparado com a quantidade de cadaverina produzida a uma temperatura de reação de 60°C (Figura 4). Como mostrado na Figura 4, PtLDC mostrou a maior atividade a 60°C. Além disso, PtLDC manteve 80% ou mais da atividade a uma temperatura de 55°C ~ 65°C.
[054] Adicionalmente, a atividade da lisina descarboxilase foi avaliada em várias condições de pH (6,2, 7,0, 8,0 e 9,0). A condição de temperatura foi fixada a 60°C, e uma quantidade igual da enzima foi utilizada nas mesmas condições de reação, com a exceção de que o tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 6,2), tampão tris 50 mM (pH 7,0), tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 8,0) e tampão tris 50 mM (pH 9,0) foram utilizados. As reatividades da lisina descarboxilase a diferentes pHs (Figura 5) foram comparadas. O PtLDC mostrou a maior atividade a pH 8,0 e manteve 90% ou mais da atividade a pH 6 a pH 9. Uma quantidade de cadaverina produzida em cada condição de pH foi comparada com a de cadaverina produzida a pH 8 (Figura 5). O resultado experimental mostrou que o PtLDC possui alta estabilidade contra a mudança de pH ou o pH elevado.
[055] Para clonar um gene de lisina descarboxilase (paldc) derivado de Pseudomonas alcaligenes, iniciadores de 5_PaLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCTGAA GTTCCCCATCC) (SEQ ID NO: 17) e 3_PaLDC_Xhol (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC) (SEQ ID NO: 18) e DNA genômico purificado de Pseudomonas alcaligenes como um modelo foram utilizados para executar a PCR. A polimerase de DNA de Pfu foi utilizada como uma polimerase, e a PCR foi realizada durante 30 ciclos em condições de 94°C: 30 segundos, 55°C: 30 segundos e 72°C: 2 min. Como resultado, um gene paldc amplificado (SEQ ID NO: 4) foi obtido.
[056] O gene paldc obtido foi expresso a baixa temperatura em E. coli do mesmo modo que no Exemplo 2-1, e identificado por SDS-PAGE (Figura 6). Como mostrado na Figura 6, a lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas alcaligenes (PaLDC) foi principalmente expressa como proteína insolúvel, e nenhuma proteína solúvel foi observada no gel SDS-PAGE (Figura 6, ver faixas 1 e 2).
[057] Para investigar a reatividade de PaLDC, um lisado de células de PaLDC obtido no Exemplo 3-1 foi centrifugado a 13.000 rpm durante 15 minutos para obter um sobrenadante (proteína solúvel), que foi utilizado na conversão de lisina. 50 μl da proteína solúvel, PLP 100 mM e lisina 250 mM foram feitas reagir em tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 6,2) em um volume de reação de 200 μl a 46°C durante 2 horas. Como resultado, 70% de lisina foram convertidas em cadaverina por PaLDC (Figura 7).
[058] Para encontrar uma condição de temperatura ideal para a atividade da lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas alcaligenes, as atividades enzimáticas foram avaliadas em condições de temperatura de 30°C, 40°C, 46°C e 60°C da mesma maneira que no Exemplo 2-2. Como resultado, o PaLDC mostrou ter a maior atividade a 50°C (figura 8).
[059] A atividade da lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas alcaligenes em diferentes condições de pH foi avaliada do mesmo modo que no Exemplo 2-2. Como resultado, o PaLDC apresentou a maior estabilidade a pH 8 e pH 9 e manteve 95% ou mais da atividade a pH 6 (Figura 9).
[060] Para clonar um gene de lisina descarboxilase (prldc) derivado de Pseudomonas resinovorans, iniciadores de 5_PrLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGAGCTC AAGTTCCCCGTCCTC) (SEQ ID NO: 19) e 3_PrLDC_Xhol (AATATACTCGAG TTATTCCCTGATGCAGTCCACTGTA TAGC) (SEQ ID NO: 20) e DNA genômico purificado de Pseudomonas resinovorans como modelo foram utilizados para realizar PCR. A PCR foi realizada utilizando a mesma polimerase sob as mesmas condições de PCR que no Exemplo 3-1. Como resultado, prldc amplificado (SEQ ID NO: 6) foi obtido.
[061] O gene prldc obtido foi expresso a uma temperatura baixa em E. coli do mesmo modo que no Exemplo 21 e identificado por SDS-PAGE (Figura 6, faixas 3 e 4). Como resultado, PrLDC foi verificado ser dificilmente expressado a baixa temperatura. 4-2. Análise da atividade da lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas resinovorans expressa em E. coli
[062] Para investigar a reatividade da lisina descarboxilase (PrLDC) derivada de Pseudomonas resinovorans, um lisado de células de PrLDC obtido no Exemplo 4-1 foi centrifugado a 13000 rpm durante 15 minutos para obter um sobrenadante, que foi utilizado na conversão de lisina. 50 μl da proteína solúvel, PLP 100 mM e lisina 250 mM foram feitas reagir em tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 6,2) em um volume de reação de 200 μl a 46°C durante 2 horas. Como resultado, 66% de cadaverina (figura 10) foi produzida.
[063] Para encontrar uma condição de temperatura ideal para a atividade de PrLDC, as atividades enzimáticas foram avaliadas em condições de temperatura de 30°C, 40°C, 46°C e 60°C da mesma maneira que no Exemplo 2-2. Como resultado, PrLDC foi verificado ter a maior atividade a 60°C (Figura 11).
[064] A atividade de PrLDC sob diferentes condições de pH foi avaliada do mesmo modo que no Exemplo 2-2. Como resultado, o PrLDC apresentou a maior estabilidade a pH 6 e manteve 90% ou mais da atividade a pH 9 (Figura 12).
[065] Para clonar um gene de lisina descarboxilase (ppldc) derivado de Pseudomonas putida, iniciadores de 5_PpLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAA TTCCCC) (SEQ ID NO: 21) e 3_PpLDC_Xhol (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC) (SEQ ID NO: 22) e DNA genômico purificado de Pseudomonas putida como um modelo foram utilizados para executar a PCR. A polimerase de DNA de Pfu foi utilizada como uma polimerase, e a PCR foi realizada durante 30 ciclos em condições de 94°C: 30 segundos, 55°C: 30 segundos e 72°C: 2 min. Como resultado, um gene ppldc amplificado (SEQ ID NO: 8) foi obtido.
[066] O gene de ppldc obtido foi expresso a uma temperatura baixa em E. coli do mesmo modo que no Exemplo 21 e identificado por SDS-PAGE (Figura 13). Conforme ilustrado nas faixas 3 e 4 da Figura 13, a lisina descarboxilase derivada de Pseudomonas putida (PpLDC) foi verificada ser dificilmente expressa a baixa temperatura.
[067] Um lisado de células foi centrifugado a 13000 rpm durante 15 minutos, e um sobrenadante foi utilizado em uma reação de conversão da lisina.
[068] Para investigar a reatividade de PpLDC, o lisado de células de PpLDC obtido no Exemplo 5-1 foi centrifugado a 13000 rpm durante 15 minutos para obter um sobrenadante, que foi utilizado na conversão de lisina. 50 μl da proteína solúvel, PLP 100 mM e lisina 250 mM foram feitas reagir em tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 6,2) em um volume de reação de 200 μl a 46°C durante 2 horas. Como resultado, 16% de cadaverina foram produzidos (Figura 14).
[069] Para encontrar uma condição de temperatura ideal para a atividade de PpLDC, as atividades enzimáticas foram avaliadas em condições de temperatura de 50°C, 60°C e 70°C da mesma maneira que no Exemplo 2-2. Como resultado, PpLDC foi verificador ter a maior atividade a 50°C (Figura 15).
[070] A atividade de PpLDC sob diferentes condições de pH foi avaliada do mesmo modo que no Exemplo 2-2. Como resultado, PpLDC mostrou a maior atividade a pH 6, e sua reatividade diminuiu com o aumento do pH (Figura 16).
[071] Para clonar um gene de lisina descarboxilase (pxldc) derivado de Pseudomonas synxantha, iniciadores de 5_PxLDC_Ndel (AATATACATATGTACAAAGACCTCCAA TTCCCC) (SEQ ID NO: 23) e 3_PxLDC_Xhol (AATATACTCGAGTCACTCCCTTATGCAATCAACGGTATAGC) (SEQ ID NO: 24) e DNA genômico purificado de Pseudomonas synxantha como um modelo foram utilizados para executar a PCR. A polimerase de DNA de Pfu foi utilizada para amplificação de genes e a PCR foi realizada durante 30 ciclos em condições de 94°C: 30 segundos, 45°C: 30 segundos e 72°C: 2 min para se obter o pxldc amplificado (SEQ ID NO: 10).
[072] O gene pxldc obtido foi expresso a uma temperatura baixa em E. coli do mesmo modo que no Exemplo 21 e identificado por SDS-PAGE (Figura 13). Conforme ilustrado nas faixas 7 e 8 da Figura 13, a lisina descarboxilase (PxLDC) derivada da Pseudomonas synxantha foi verificada estar sobre-expressada como proteína solúvel a baixa temperatura.
[073] Para investigar a reatividade de PxLDC, o lisado de células de PxLDC obtido no Exemplo 6-1 foi centrifugado a 13000 rpm durante 15 minutos para obter um sobrenadante, que foi utilizado na conversão de lisina. 50 μl da proteína solúvel, PLP 100 mM e lisina 250 mM foram feitas reagir em tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 6,2) em um volume de reação de 200 μl a 46°C durante 2 horas. Como resultado, 25% de cadaverina foi produzida (Figura 17).
[074] Para encontrar uma condição de pH ideal para PxLDC, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes condições de pH da mesma maneira que no Exemplo 2-2 (Figura 18). Como resultado, o PxLDC mostrou a maior atividade a pH 6 e sua reatividade diminuiu com o aumento do pH.
[075] Um gene de lisina descarboxilase de E. coli, cadA, foi clonado para expressar EcLDC (SEQ ID NO: 11). A homologia entre as sequências de aminoácidos PtLDC e EcLDC é de 36%. Um plasmídeo clonado com o gene cadA foi inserido em E. coli K-12 BL21, e incubado a 37°C durante 4 horas para induzir a expressão. O EcLDC assim completamente expresso foi identificado por SDS-PAGE (Figura 13, Faixas 1 e 2). Como resultado, EcLDC foi verificado ser sobre-expressado como proteína solúvel.
[076] A atividade enzimática relativa (atividade relativa) foi comparada entre EcLDC e PtLDC sob várias condições de temperatura (37°C, 42°C, 50°C, 60°C, 70°C e 80°C) da mesma maneira como no Exemplo 2-2 (Figura 19).
[077] Como resultado, tanto EcLDC quanto PtLDC foram verificados mostrar a maior atividade a 60°C. EcLDC tinha 54% de atividade relativa a 50°C (quando a atividade de EcLDC a 60°C foi tomada como 100%), e EcLDC tinha 12% de atividade relativa a 80°C. PtLDC tinha 76% de atividade relativa a 50°C (quando a atividade de PtLDC a 60°C foi tomada como 100%), e PtLDC tinha 19% de atividade relativa a 80°C. A atividade de PtLDC foi verificada ser bem mantida a alta temperatura. Em conclusão, ambas as enzimas mostraram uma grande diferença em suas atividades dependendo da temperatura, e a atividade relativa do PtLDC foi bem mantida em comparação com o EcLDC.
[078] Adicionalmente, a atividade foi avaliada sob várias condições de pH (6,2, 7,4, 8,0 e 9,0) do mesmo modo que no Exemplo 2-2 (Figura 20). Como resultado, EcLDC mostrou a maior atividade a pH 6 e a atividade enzimática do EcLDC diminuiu grandemente com o aumento do pH. A pH 9, a EcLDC manteve 50% da atividade. Em contraste, o PtLDC não mostrou grandes mudanças na atividade de acordo com o pH, e PtLDC manteve 90% ou mais da atividade a pH 6,2 ~ 9. Consequentemente, foi avaliado que o PtLDC apresentou maior estabilidade contra a temperatura e o pH do que o EcLDC.
[079] Quando as proteínas PtLDC e EcLDC foram quantificadas para avaliar a atividade específica (unidade/mg), PtLDC mostrou um valor de 10060 (unidade/mg) e EcLDC mostrou um valor de 36335 (unidade/mg). Quando as suas reatividades foram comparadas, EcLDC mostrou atividade cerca de 3,6 vezes maior do que PtLDC. Além disso, quando uma temperatura ótima foi comparada entre as enzimas, ambas as enzimas apresentaram reações ótimas a 60°C, e suas atividades diminuíram muito com a temperatura variável. No entanto, quando as condições ótimas de pH foram comparadas, EcLDC mostrou maior inatividade específica com o aumento do pH, e PtLDC não apresentou grande alteração na atividade enzimática de acordo com a mudança de pH.
[080] EcLDC tem maior atividade do que PtLDC. No entanto, a atividade de EcLDC pode ser fortemente influenciada pela alteração do pH, uma vez que o pH aumenta pela reação da lisina descarboxilase. PtLDC tem maior estabilidade de pH do que EcLDC, o que é vantajoso na reação de conversão de lisina. A produção comercial de cadaverina por bioconversão de lisina requer ajuste de pH por tratamento com ácido, mas PtLDC pode mitigar a necessidade de titulação de pH. É esperado que os custos de produção necessários para a bioconversão de cadaverina possam ser reduzidos.
[081] Instituição depositária: Centro de Cultura da Coréia dos Microrganismos (KCCM)
[082] Número de acesso: KCCM11559P
[083] Data do depósito: 24.07.2014
Claims (2)
1. Microrganismo caracterizadopelo fato que é transformado com um polinucleotídeo que codifica a lisina descarboxilase, o referido polinucleotídeo consistindo na sequência de SEQ ID NO: 8 ou suas sequências degeneradas, em que o microrganismo é ESCHERICHIA sp.
2. Método de preparação de cadaverina caracterizadopelo fato de compreender as etapas de: converter a lisina em cadaverina utilizando o microrganismo, conforme definido na reivindicação 1; e recuperar a cadaverina convertida.
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