DE602004000428T2

DE602004000428T2 - Verfahren zur Herstellung von Cadaverindicarboxylat und dessen Verwendung zur Herstellung von Nylon

Info

Publication number: DE602004000428T2
Application number: DE602004000428T
Authority: DE
Inventors: Kiyohiko Nishi; Shuichi Endo; Yukiko Mori; Kazuhiko Totsuka; Yoshinori Hirao
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-05-26
Filing date: 2004-05-05
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2024-05-06
Also published as: EP1482055A1; DE602004000428D1; EP1482055B1; US20050003497A1; BRPI0401812A; ATE318926T1; US7189543B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverindicarboxylat. Cadaverindicarboxylat kann als Ausgangsmaterial für die Produktion von Nylon eingesetzt werden.
Stand der Technik
Naphtha, ein fossiles Material, ist ein Hauptausgangsprodukt bei der Herstellung von Kunststoffen. Die Entsorgung von Kunststoffen, die nicht wiederverwendet werden, ist aufgrund der Freisetzung von Kohlendioxid, wenn sie durch Verbrennen und dergleichen entsorgt werden, zu einem Umweltproblem geworden. Dementsprechend besteht vor dem Hintergrund, die globale Erwärmung zum Verhindern und die Gesellschaft zum Recycling zu ermutigen, ein großer Bedarf daran, Ausgangsmaterialien für die Herstellung von Kunststoffen durch solche zu ersetzen, die von Biomasse abgeleitet sind.
Polymilchsäure ist als ein Kunststoff bekannt, der unter Verwendung von Biomasse als Ausgangsmaterial hergestellt wird. Ein Verfahren zur Herstellung von Polymilchsäure umfasst zunächst das Extrahieren von Stärke oder Zucker aus einer Pflanze, dann die Produktion von Milchsäure durch Fermentation unter Einsatz der extrahierten Stärke oder des extrahierten Zuckers als Kohlenstoffquelle und anschließend die chemische Polymerisation der erhaltenen Milchsäure. Polymilchsäure kann vermutlich in verschiedenen industriellen Produkten, einschließlich Behälterverpackungen, in Kleidung und dergleichen, eingesetzt werden. Da Polymilchsäure jedoch einen Schmelzpunkt von etwa 190°C hat, ist sie für Hochtemperaturverwendungen nicht geeignet.
Kunststoffe mit einer hohen Wärmebeständigkeit umfassen Nyllon, insbesondere Polyamid. Ein Beispiel von weit verbreitetem Nylon ist Nylon-66, das durch Polymerisation von Hexamethylendiamin, einem 6 Kohlenstoffe enthaltenden Diamin, und Adipinsäure, einer 6 Kohlenstoffe enthaltenden Dicarbonsäure, bei einem Molverhältnis von 1:1 produziert wird. Da Nylon-66 einen Schmelzpunkt von 250°C oder höher hat, ist es ein Kunststoffmaterial, das auch Hochtemperaturbedingungen aushält.
Das vorstehend genannte Hexamethylendiamin wird unter Einsatz von Benzol, Propylen oder Butadien hergestellt und kann aus dem Naphtha als Ausgangsmaterial erhalten werden. Produktionsverfahren aus Biomasse sind jedoch unbekannt. Andererseits weiß man, dass Pentamethylendiamin, das 5 Kohlenstoffe enthält und auch als Cadaverin bekannt ist, aus Lysin, einer Aminosäure, unter Verwendung von Lysindecarboxylase (im Folgenden als "LDC" bezeichnet) (Enzyme Handbook, 1. Auflage, S. 636, Asakura Shoten) hergestellt wird. Wenn Nylon unter Einsatz eines 5 Kohlenstoffe enthaltenden Pentamethylendiamins als Ausgangsmaterial anstelle des 6 Kohlenstoffe enthaltenden Hexamethylendiamins hergestellt wird, ist es deshalb möglich, ein Kunststoffmaterial bereitzustellen, das unter Einsatz eines von Biomasse abgeleiteten Ausgangsmaterials hergestellt wird und unter Hochtemperaturbedingungen verwendbar ist.
Man weiß, dass LDC in Bakterien, wie Bacterium cadaveris (Soda K. et al., Biochem. Biophys. Res. Com., Vol. 34, S. 34-39, 1969) und Escherichia coli (E. coli) (Sabo D. L. et al., Biochemistry, Vol. 13, S. 662-670, 1974), und in Pflanzen vorkommt, wie in Lathyrus sativus (Ramakrishna S. et al., Phyto chemistry, Vol. 15, S. 83-86, 1976). LDC kann aus diesen Organismen extrahiert werden und für die Produktion von Cadaverin eingesetzt werden. Außerdem ist die Sequenz des LDC-Gens (cadA) aus E. coli bekannt (Watson N. et al., Journal of Bacteriology, Vol. 174, S. 530-540, 1992; Meng S. Y. et al., Journal of Bacteriology, Vol. 174, S. 2659-2669, 1992). Außerdem sind ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverin durch Kultivieren eines Wirtes, worin die enzymatische Aktivität von LDC oder des Lysin-Cadaverin-Antiporters unter Einsatz eines solchen LDC-Gens oder dergleichen amplifiziert ist (offen gelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 2002-223770), und ein Verfahren zur Produktion von Cadaverin vorgeschlagen worden, in dem LDC, das von einer rekombinanten Zelle abgeleitet ist, worin die intrazelluläre Aktivität von LDC amplifiziert ist, auf Lysin einwirkt (offen gelegtes Japanisches Patent Nr. 2002-223771).
Wenn jedoch LDC auf Lysin einwirkt, wird Kohlendioxid durch die Decarboxylierungsreaktion von LDC freigesetzt, sodass der pH-Wert durch die Produktion von Cadaverin während der Reaktion steigt. Um den Anstieg des pH-Wertes zu verhindern und den optimalen pH-Wert der enzymatischen Reaktion zu gewährleisten, ist es deshalb erforderlich, die Reaktion in einem Puffer einer hohen Konzentration durchzuführen, oder sukzessive Säure in das Reaktionssystem zu geben, um das System zu neutralisieren (offen gelegte Japanische Patentanmeldungen (Kokai) Nrn. 2002-223770 und 2002-223771). Im Allgemeinen werden anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, oder organische Säuren, wie Essigsäure, oft für die Neutralisation des pH-Wertes während der enzymatischen Reaktion eingesetzt. Wenn die Alkalinität mit diesen Säuren neutralisiert wird, ist das Cadaverin, das aus dem Reaktionsgemisch erhalten wird, in der Form eines Salzes, beispielsweise Cadaverinhydrochlorid, Cadaverinsulfat, Cadaverinphosphat und Cadaverinacetat.
Bekannte Verfahren zur Herstellung von Nylon umfassen die Kondensationspolymerisation eines Dicarbonsäuredihalogenids und eines Diamins in Anwesenheit einer Base. Alternativ dazu ist ein Verfahren bekannt, bei dem ein Salz oder ein niederes Kondensat, das aus einer Dicarbonsäure und einem Diamin unter Schmelzbedingungen gebildet worden ist, erhitzt wird, um es zu polykondensieren. (Ise, N. et al., Shinkobunshikagakujoron, S. 22, Kagakudojin, 1995). Wenn Cadaverin durch die enzymatische Reaktion erhalten und dann mit einer Dicarbonsäure durch eines dieser Verfahren polymerisiert wird, muss freies Cadaverin aus einem Salz des Cadaverins gewonnen werden. Deshalb ist dieses Verfahren kompliziert und nicht wirtschaftlich.
Außerdem ist ein Verfahren zur Produktion von Lysin durch Fermentation bekannt und umfasst das Kultivieren eines Bakteriums in einem Medium, das Adipinsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure oder ein Salz davon als Hauptkomponente enthält, wobei der pH-Wert des Mediums mit Ammoniumhydroxid bei pH 7,5 bis 8,2 gehalten wird (offen gelegtes Japanisches Patent Nr. 49-126890). In diesem Verfahren wird ein Bakterium subkultiviert, um dessen Proliferation zu ermöglichen und ein dynamisches Gleichgewicht der Zellen aufrechtzuerhalten, und dann werden die Zellen kultiviert, indem ein Teil der Mediumbedingungen oder Kulturbedingungen verändert wird, um die Fermentation mit einem verschobenen Gleichgewicht des Substanzmetabolismus durchzuführen und somit Lysin in dem Medium in hoher Konzentration anzuhäufen.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur wirtschaftlichen Herstellung von Cadaverin als ein Diamin, das als Ausgangsmaterial für die Produktion von Nylon eingesetzt werden soll, in einer Form bereitzustellen, welche einfach und am effizientesten in der Polymerisation eingesetzt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Produktion eines Cadaverindicarboxylats bereitzustellen, welches die enzymatische Decarboxylierungsreaktion einer Lysinlösung und das Aufrechterhalten des pH-Wertes der Lösung, der ausreicht, sodass die Reaktion stattfinden kann, durch Zugeben von Dicarbonsäure zu der Lösung umfasst.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei der pH-Wert der Lösung bei etwa 4,0 bis 8,0 gehalten wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, worin die Dicarbonsäure 4 bis 10 Kohlenstoffe enthält.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, worin die Dicarbonsäure Adipinsäure ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei die enzymatische Decarboxylierungsreaktion unter Einsatz von Lysindecarboxylase, einer Zelle, die Lysindecarboxylase produziert, oder eines verarbeiteten Produkts der Zelle, die Lysindecarboxylase produziert, durchgeführt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei die Zelle so modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Lysindecarboxylaseaktivität hat.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren durchzuführen, wobei die Zelle rekombinant ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren durchzuführen, wobei die Zelle so modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Kopienzahl eines für Lysindecarboxylase kodierenden Gens enthält.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei die Zelle durch Modifizieren einer Expressionsregulationssequenz eines für Lysindecarboxylase kodierenden Gens modifiziert ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei die Expression des für Lysindecarboxylase kodierenden Gens verstärkt ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei die Zelle Escherichia coli ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei das für Lysindecarboxylase kodierende Gen ein cadA-Gen ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Produktion von Nylon bereitzustellen, welches eine enzymatische Decarboxylierungsreaktion einer Lysinlö sung, das Halten des pH-Wertes der Lösung bei einem Wert, der ausreicht, sodass die Reaktion durch Zugeben einer Dicarbonsäure zu der Lösung stattfinden kann, um Cadaverindicarboxylat herzustellen, und die Polykondensation des Cadaverindicarboxylats umfasst.
Erfindungsgemäß kann Cadaverindicarboxylat einfach und effizient produziert werden. Das durch die vorliegende Erfindung erhaltene Cadaverindicarboxylat kann in einer Polymerisationsreaktion zur Herstellung von Nylon eingesetzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt die Struktur des Plasmids pcadA, welches das cadA-Gen von E. coli enthält.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehende Untersuchungen durchgeführt, um die vorstehend genannten Aufgaben zu lösen. Die vorliegende Erfindung beschreibt, dass eine Decarboxylierungsreaktion von Lysin Cadaverin als Lysindicarboxylat unter Einsatz von freiem Lysin als Ausgangsmaterial in einer enzymatischen Decarboxylierungsreaktion von Lysin, Einstellen des pH-Wertes einer Lysinlösung auf einen Wert, der für die enzymatische Reaktion optimal ist, durch Zugeben einer Dicarbonsäure, Wirken lassen von LDC auf die Lösung und das Durchführen der Decarboxylierungsreaktion unter Zugeben der vorstehend genannten Dicarbonsäure zur Neutralisierung des pH-Wertes, der während der enzymatischen Decarboxylierungsreaktion steigt, umfasst, wodurch die vorliegende Erfindung gemacht wurde.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehend erklärt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Cadaverindicarboxylat durch enzymatische Decarboxylierungsreaktion von Lysin in einer Lysinlösung unter Zugabe einer Dicarbonsäure, um den pH-Wert der Lösung bei einem Wert zu halten, der es erlaubt, dass die enzymatische Decarboxylierungsreaktion stattfindet, hergestellt.
Üblicherweise ist das Ausgangsmaterial Lysin vorzugsweise eine freie Base (Lysinbase). Es kann jedoch auch ein Salz von Lysin mit einer Dicarbonsäure sein. Obwohl das Lysin entweder L-Lysin oder D-Lysin sein kann, solange Cadaverin durch eine enzymatische Decarboxylierungsreaktion produziert wird, ist L-Lysin üblicherweise bevorzugt. Außerdem kann das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Lysin gereinigtes Lysin sein oder in der Form einer Fermentationsbrühe, die Lysin enthält, vorliegen, solange Cadaverin, das durch die enzymatische Decarboxylierungsreaktion hergestellt wird, mit einer Dicarbonsäure ein Salz bilden kann.
Wasser ist als das für die Herstellung der Lysinlösung eingesetzte Lösungsmittel bevorzugt. Da der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit einer Dicarbonsäure eingestellt wird, besteht in der vorliegenden Erfindung kein Bedarf daran, einen weiteren pH-Modifizierer oder Puffer einzusetzen. Ein Puffer kann jedoch als das vorstehend genannte Lösungsmittel eingesetzt werden. Beispiele eines solchen Puffers umfassen einen Natriumacetatpuffer und dergleichen. Aufgrund der potenziellen Bildung eines Cadaverindicarboxylats ist es jedoch bevorzugt, entweder keinen Puffer einzusetzen oder einen Puffer in einer niedrigen Konzentration einzusetzen.
Wenn freies Lysin in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, wird eine Dicarbonsäure zu der Lysinlösung gegeben, um den pH-Wert der Lösung auf einen Wert einzustellen, der aus reicht, sodass die enzymatische Decarboxylierungsreaktion stattfinden kann. Genauer gesagt ist der pH-Wert üblicherweise zwischen 4,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen etwa 5,0 und 7,0, und stärker bevorzugt zwischen etwa 5,5 und 6,5. Wenn ein Lysindicarboxylat eingesetzt wird, muss die Dicarbonsäure nicht zum Zeitpunkt der Herstellung des Reaktionsgemisches zugegeben werden. Im Folgenden kann die Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf einen Wert, der ausreicht, damit die enzymatische Decarboxylierungsreaktion stattfindet, auch als "Neutralisation" bezeichnet werden.
Die vorstehend genannte Dicarbonsäure ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie die enzymatische Decarboxylierungsreaktion von Lysin nicht inhibiert und Nylon durch Kondensationspolymerisationsreaktion mit Cadaverin hergestellt werden kann. Beispiele davon umfassen eine Dicarbonsäure, die 4 bis 10 Kohlenstoffe enthält, vorzugsweise eine Dicarbonsäure, die aus einem geradkettigen Molekül mit Carboxygruppen an beiden Enden besteht. Spezifische Beispiele davon umfassen Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure und dergleichen. Die Dicarbonsäure ist vorzugsweise eine freie Säure.
Die enzymatische Decarboxylierungsreaktion von Lysin kann durch Zugeben von LDC zu einer Lysinlösung durchgeführt werden, die wie vorstehend beschrieben neutralisiert worden ist. Die vorstehend beschriebene LDC ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie zur Produktion von Cadaverin auf Lysin wirken kann. Zellen, die LDC produzieren, können eingesetzt werden, um LDC zu erhalten, einschließlich Mikroorganismen, Pflanzenzellen oder Tierzellen. Gereinigte LDC kann ebenfalls eingesetzt werden. Ein Gemisch verschiedener Quellen von LDC kann ebenfalls eingesetzt werden. Außerdem können die Zellen als solche eingesetzt werden, oder es können verarbeitete Zellprodukte, die LDC enthalten, eingesetzt werden. Beispiele eines verarbeiteten Zellprodukts umfassen eine Zelltrümmersuspension und eine Fraktion davon. Wenn die enzymatische Reaktion unter Verwendung von mikrobiellen Zellen, Pflanzenzellen oder Tierzellen durchgeführt wird, ist es bekannt, dass wenn die Zellen mit einer organischen Säure, einem Detergens oder dergleichen behandelt werden, die Permeabilität der Substanz von der Außenseite der Zelle verbessert werden kann und die Reaktivität erhöht werden kann, deshalb kann die Behandlung von LDC-produzierenden Zellen mit einem organischen Lösungsmittel, einem Detergens oder dergleichen zu einer Erhöhung der Reaktivität der enzymatischen Decarboxylierungsreaktion von Lysin führen. Beispiele des für die Behandlung der Zellen verwendeten Detergens umfassen Triton X-100, Tween 20, Natriumcholat, CHAPS oder dergleichen, und Beispiele des organischen Lösungsmittels umfassen Aceton, Xylol, Toluol oder dergleichen. Genauer gesagt ist es im Fall von Triton X-100 bevorzugt, dass Triton X-100 zu der Zellsuspension in einer Konzentration zwischen 0,01 bis 1,0% (Gew./Vol.) gegeben wird und die Zellen bei 0°C bis 37°C während 2 Minuten bis 1 Stunde behandelt werden.
Beispiele der vorstehend genannten Mikroorganismen umfassen Bakterien der Gattung Escherichia, wie E. coli, coryneforme Bakterien, wie Brevibakterium lactofermentum, Bakterien der Gattung Bacillus, wie Bacillus subtilis, Bakterien der Gattung Serratia, wie Serratia marcescens, eukaryontische Zellen, wie Saccharomyces cerevisiae, und dergleichen. Unter diesen sind Bakterien, insbesondere E. coli, bevorzugt.
Der vorstehend genannte Mikroorganismus kann ein Wildtypstamm oder ein mutierter Stamm sein, solange er LDC produzieren kann. Außerdem kann der Mikroorganismus ein rekombi.nanter Stamm sein, der so modifiziert ist, dass seine LDC-Aktivität erhöht ist. Die vorstehend genannten Pflanzen- und Tierzellen können rekombinante Zellen sein, die so modifiziert sind, dass ihre LDC-Aktivität erhöht ist. Die rekombinanten Zellen werden später beschrieben.
Nachdem LDC zu einer Lysinlösung gegeben worden ist, beginnt die Reaktion, und das freigesetzte Kohlendioxid wird aus dem Reaktionsgemisch entfernt, und der pH-Wert wird mit dem Fortschreiten der Reaktion erhöht. Eine Dicarbonsäure wird zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um den pH-Wert des Reaktionsgemisches in dem vorstehend genannten Bereich zu halten. Dieselbe Dicarbonsäure wird üblicherweise als die Dicarbonsäure eingesetzt, die für die Neutralisation des Ausgangsmaterial-Lysins verwendet wird. Die Dicarbonsäure kann kontinuierlich oder abschnittsweise zugegeben werden, solange der pH-Wert in dem vorstehend genannten Bereich gehalten wird. Obwohl die Reaktionsbedingungen nicht besonders eingeschränkt sind, solange LDC auf Lysin unter Bildung von Cadaverin wirken kann, wird die Reaktion üblicherweise bei einer Temperatur von 20 bis 60°C, vorzugsweise 30 bis 40°C durchgeführt.
Die gesamte Menge des Ausgangsmaterial-Lysins oder des Lysindicarboxylats kann zu dem Reaktionsgemisch zu Beginn der Reaktion zugegeben werden, oder sie kann während der LDC-Reaktion allmählich zugegeben werden.
Wenn die enzymatische Reaktion in Chargen durchgeführt wird, kann die Dicarbonsäure leicht zugegeben werden. Außerdem kann die Reaktion auch durch Einsatz einer Säulenchromatografie unter Verwendung eines Trägers mit immobilisierter LDC, unter Verwendung von LDC-produzierenden Zellen oder verarbeiteten Produkten davon durchgeführt werden. In diesem Fall können Lysin und die Dicarbonsäure in eine geeignete Stelle auf der Säule eingespritzt werden, sodass die Reaktion fortschreitet, während der pH-Wert des Reaktionssystems innerhalb eines vorbestimmten Bereichs gehalten wird.
Wie vorstehend beschrieben wurde, kann die Reaktion durch Neutralisieren des pH-Wertes, der mit der Produktion von Cadaverin durch die enzymatische Decarboxylierungsreaktion von Lysin steigt, unter Verwendung einer Dicarbonsäure nach Bedarf vorteilhaft fortschreiten. Das wie beschrieben hergestellte Cadaverin wird in dem Reaktionsgemisch als Dicarbonsäuresalz angehäuft.
Das durch die LDC-Reaktion erhaltene Cadaverindicarboxylat kann aus dem Reaktionsgemisch unter Verwendung bekannter Verfahren isoliert oder gereinigt werden. Beispielsweise kann das Reaktionsgemisch unter Einsatz eines Autoklaven oder dergleichen sterilisiert werden, und der Überstand wird durch Zentrifugation gewonnen, durch Aktivkohle oder dergleichen entfärbt und nach Bedarf konzentriert. Das Cadaverindicarboxylat kann in Abhängigkeit von der Verwendung in der Form einer Lösung als solcher oder als Kristalle verwendet werden. Kristalle des Cadaverindicarboxylats können durch Ausfällen des Cadaverindicarboxylats erhalten werden, während das konzentrierte Reaktionsgemisch beispielsweise gekühlt wird. Die wie vorstehend beschrieben erhaltenen Kristalle sind als Ausgangsmaterial für die Produktion von Nylon bevorzugt, weil die Kristalle Cadaverin und die Dicarbonsäure in äquimolaren Mengen enthalten.
Nylon wird durch Polykondensation des erfindungsgemäß hergestellten Cadaverindicarboxylats produziert. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Produktion von Nylon, welches die Stufen umfasst, bei denen ein Cadaverindicarboxylat über eine enzymatische Decarboxylierungsreaktion von Lysin produziert wird, während der pH-Wert bei einem Wert, der für die enzymatische Decarboxylierung ausreicht, durch Zugeben einer Dicarbonsäure zu einer Lysinlösung gehalten wird, und danach wird Nylon durch Polykondensation des in der vorstehenden Stufe erhaltenen Cadaverindicarboxylats produziert.
Ein Beispiel eines Verfahrens zur Modifikation eines Mikroorganismus zur Erhöhung seiner LCD-Aktivität wird im Folgenden beschrieben. Die LDC-Aktivität in anderen Zellen kann durch geeignetes Modifizieren des folgenden Verfahrens auf ähnliche Weise erhöht werden.
Die LDC-Aktivität wird beispielsweise durch Verstärken der Expression des für LDC kodierenden Gens (LDC-Gen) erhöht. Die Expression des LDC-Gens kann durch Erhöhen der Kopienzahl des LDC-Gens verstärkt werden. Beispielsweise wird ein LDC-Genfragment an einen Vektor ligiert, der in einem Mikroorganismus funktionieren kann, vorzugsweise an einen Mehrkopienvektor, um eine rekombinante DNA herzustellen, die dann eingesetzt wird, um einen geeigneten Wirt zu transformieren.
Die Erhöhung der Kopienzahl des LDC-Gens kann auch durch Einführen einer Vielzahl von Kopien des Gens auf der chromosomalen DNA des Mikroorganismus erreicht werden. Eine Vielzahl von Kopien des LDC-Gens kann in die chromosomale DNA eines Mikroorganismus durch homologe Rekombination eingeführt werden. Dies wird durchgeführt, indem eine Sequenz, die auf der chromosomalen DNA in hoher Kopienzahl vorliegt, als Zielsequenz genommen wird. Eine repetitive DNA oder eine umgekehrte Wiederholung, die an dem Ende eines transponierbaren Elements vorhanden ist, kann als die Sequenz eingesetzt werden, die auf der chromosomalen DNA in hoher Kopienzahl vorliegt. Alternativ dazu kann, wie in dem offen gelegten Japanischen Patent Nr. 2-109985 offenbart wurde, eine Vielzahl von Kopien des gewünschten Gens in eine chromosomale DNA durch Einverleiben der Kopien in ein Transposon und anschließendes Transferieren des Transposons eingeführt werden.
Neben dem vorstehend beschriebenen Genamplifikationsverfahren kann die LDC-Aktivität auch durch Ersetzen einer Expressionsregulationssequenz, wie eines Promotors des LDC-Gens, auf einer chromosomalen DNA oder einem Plasmid durch eine stärkere Sequenz erhöht werden. Beispielsweise sind der lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor und dergleichen als starke Promotoren bekannt. Außerdem kann, wie in der Internationalen Patentveröffentlichung WO00/18935 beschrieben wurde, ein Promotor auch durch Einführen einer Substitution von mehreren Nukleotiden in die Promotorregion des Gens modifiziert und dadurch verstärkt werden. Die vorstehend genannte Substitution oder Modifikation des Promotors erhöht die Expression des LDC-Gens, sodass die LDC-Aktivität verstärkt wird. Die Modifikation einer Expressionsregulationssequenz kann mit der Erhöhung der Kopienzahl des Gens kombiniert werden.
Die Substitution der Expressionsregulationssequenz kann beispielsweise auf dieselbe Weise wie bei der Gensubstitution unter Verwendung eines temperatursensitiven Plasmids durchgeführt werden. Beispiele eines Vektors mit einem temperatursensitiven Replikationsursprung von E. coli umfassen das Plasmid pMAN997, das in der Internationalen Patentveröffentlichung WO99/03988 offenbart ist, und dergleichen. Außerdem kann die Substitution einer Expressionsregulationssequenz auch durch ein Verfahren unter Einsatz der Red-Rekombinase des Phagen λ durchgeführt werden (Datsenko, K. A., PNAS, 97(12), 6640-6645, 2000).
Das LDC-Gen ist nicht besonders eingeschränkt, solange das kodierte LDC für die Decarboxylierungsreaktion von Lysin wirksam eingesetzt werden kann. Beispiele davon umfassen LDC-Gene von Bakterien, wie Bakterium cadaveris und E. coli, und Pflanzen, wie Lathyrus sativus, sowie das LDC-Gen des Mikroorganismus, der in dem offen gelegten Japanischen Patent Nr. 2002-223770 offenbart ist.
Wenn E. coli als Wirtsmikroorganismus eingesetzt wird, ist ein von E. coli abgeleitetes LDC-Gen bevorzugt. Als das LDC-Gen aus E. coli sind das cadA-Gen und das ldc-Gen bekannt (US-Patent Nr. 5,827,698). Unter diesen ist das cadA-Gen bevorzugt. Die Sequenz des cadA-Gens von E. coli ist bekannt (Watson N. et al., Journal of Bacteriology, Vol. 174, 530-540, 1992; Meng S. Y. et al., Journal of Bacteriology, Vol. 174, 2659-2669, 1992: GenBank Hinterlegungsnummer M76411). Das cadA-Gen kann aus einer chromosomalen DNA von E. coli durch PCR unter Einsatz von Primern, die auf der Grundlage dieser Sequenz präpariert wurden, isoliert werden. Beispiele solcher Primer umfassen Primer mit den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 1 und 2. Die Nukleotidsequenz des vorstehend genannten cadA-Gens und die durch das cadA-Gen kodierte Aminosäuresequenz sind in der SEQ ID NO: 3 beziehungsweise SEQ ID NO: 4 gezeigt.
Um eine rekombinante DNA durch Ligieren des LDC-Gens und eines Vektors herzustellen, kann der Vektor mit Restriktionsenzymen verdaut werden, die für die Enden des LDC-Gens geeignet sind, und das vorstehend genannte Gen und der Vektor können unter Einsatz einer Ligase, wie T4-DNA-Ligase, ligiert werden. Beispiele des Vektors für E. coli umfassen pUC18, pUCl9, pSTV29, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219 und dergleichen.
Das LDC-Gen kann ein Wildtypgen oder ein mutiertes Gen sein. Beispielsweise kann das cadA-Gen LDC mit Substitutionen, De letionen, Insertionen oder Additionen eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren Stellen kodieren, solange die LDC-Aktivität nicht beeinträchtigt wird. Obwohl die Anzahl der "mehreren" Aminosäuren, auf die hier Bezug genommen wird, in Abhängigkeit von den Positionen der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins und der Arten der Aminosäurereste variiert, ist die Anzahl 2 bis 50, vorzugsweise 2 bis 30, stärker bevorzugt 2 bis 10.
Deshalb sind die Änderungen in LDC, wie die vorstehend beschriebenen, typischerweise konservative Änderungen, sodass die LDC-Aktivität erhalten bleibt. Substitutionsänderungen umfassen solche, bei denen mindestens ein Rest in der Aminosäuresequenz entfernt wird und durch einen anderen Rest ersetzt wird. Beispiele für Aminosäuren, die anstelle einer ursprünglichen Aminosäure in ein LDC-Protein eingeführt werden können und als konservative Substitutionen gelten, umfassen: Ala wird ersetzt durch ser oder thr; arg wird ersetzt durch gln, his, oder lys; asn wird ersetzt durch glu, gln, lys, his, asp; asp wird ersetzt durch asn, glu, oder gln; cys wird ersetzt durch ser oder ala; gln wird ersetzt durch asn, glu, lys, his, asp, oder arg; glu wird ersetzt durch asn, gln, lys, oder asp; gly wird ersetzt durch pro; his wird ersetzt durch asn, lys, gln, arg, tyr; ile wird ersetzt durch leu, met, val, phe; leu wird ersetzt durch ile, met, val, phe; lys wird ersetzt durch asn, glu, gln, his, arg; met wird ersetzt durch ile, leu, val, phe; phe wird ersetzt durch trp, tyr, met, ile, oder leu; ser wird ersetzt durch thr, ala; thr wird ersetzt durch ser oder ala; trp wird ersetzt durch phe, tyr; tyr wird ersetzt durch his, phe, oder trp; und val wird ersetzt durch met, ile, leu.
Eine DNA, die für ein Protein kodiert, das der vorstehend genannten LDC im Wesentlichen identisch ist, kann durch Modifi zieren der Nukleotidsequenz des cadA-Gens erhalten werden. Beispielsweise kann eine ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt werden, sodass eine Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines Aminosäurerests oder mehrerer Aminosäurereste an einer spezifischen Stelle auftritt. Außerdem kann eine wie vorstehend beschrieben modifizierte DNA auch durch herkömmliche Mutationsverfahren erhalten werden. Beispiele solcher Mutationsbehandlungen umfassen die Behandlung von DNA vor der Mutationsbehandlung in vitro mit Hydroxylamin oder dergleichen, Behandeln eines Mikroorganismus, beispielsweise eines Escherichia-Bakteriums, das die DNA enthält, vor der Mutationsbehandlung mit UV-Strahlen oder Mutagenesemitteln, die bei üblichen Mutationsbehandlungen eingesetzt werden, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder EMS, und dergleichen.
Eine DNA, die für ein Protein kodiert, das im Wesentlichen identisch zu LDC ist, kann durch Exprimieren einer solchen DNA, einschließlich einer beliebigen der vorstehend genannten Mutationen, in einer geeigneten Zelle und Untersuchen der Aktivität des Expressionsprodukts erhalten werden. Außerdem kann beispielsweise eine DNA, die mit einer Sonde mit der Sequenz der kodierenden Region des cadA-Gens (GenBank Hinterlegungsnummer M76411) oder mit einem Teil dieser Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für ein Protein mit derselben Aktivität wie LDC bei vergleichbaren Konzentration kodiert, aus einer für LDC kodierenden DNA mit einer Mutation oder aus einer Zelle, welche die DNA enthält, erhalten werden. Die "stringenten Bedingungen" umfassen Bedingungen, unter denen ein so genanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diese Bedingungen unter Angabe von Zahlenwerten klar auszudrücken. Die stringenten Bedingun gen umfassen jedoch beispielsweise eine Bedingung, bei der DNAs mit hoher Homologie, beispielsweise DNAs mit einer Homologie von 70% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr, stärker bevorzugt 90%, am stärksten bevorzugt 95% oder höher miteinander hybridisieren, während DNAs mit einer geringeren Homologie nicht miteinander hybridisieren. Alternativ dazu sind Beispiele für stringente Bedingungen solche, bei denen DNAs bei einer Salzkonzentration, die der üblichen Salzkonzentration beim Waschen in der Southern-Hybridisierung entspricht, d. h., 1 x SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 x SSC, 0,1% SDS, bei 60°C miteinander hybridisieren.
Eine Teilsequenz des cadA-Gens kann auch als Sonde eingesetzt werden. Sonden können durch PCR unter Einsatz von Oligonukleotiden, die auf der Grundlage der bekannten Nukleotidsequenz des cadA-Gens hergestellt werden, als Primer und eines DNA-Fragments, das das cadA-Gen enthält, als Matrize erzeugt werden. Wenn ein DNA-Fragment von etwa 300 by als Sonde eingesetzt wird, können die Waschbedingungen für die Hybridisierung beispielsweise 2 x SSC, 0,1% SDS bei 50°C sein.
Beispiele einer DNA, die für ein Protein kodiert, das im Wesentlichen zu LDC identisch ist, umfassen eine DNA, die für ein Protein mit einer Homologie von vorzugsweise 70% oder höher, stärker bevorzugt 80% oder höher, noch stärker bevorzugt 90% oder höher, am stärksten bevorzugt 95% oder höher mit der Aminosäuresequenz, die von dem bekannten cadA-Gen kodiert wird, hat und LDC-Aktivität aufweist.
Um eine rekombinante DNA in einen Mikroorganismus einzuführen, kann jedes herkömmliche Transformationsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise umfassen die Verfahren die Behandlung von Empfängerzellen mit Calciumchlorid, um die Permeabilität der Zellen für DNA zu erhöhen, wie für Escherichia coli K-12 berichtet (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), und ein Verfahren, bei dem kompetente Zellen aus Zellen in der Wachstumsphase hergestellt werden und danach die DNA in diese Zellen eingeführt wird, wie für Bacillus subtilis berichtet (Duncan, C. H., Wilson, G. A. und Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)). Außerdem umfassen die Transformationsverfahren ein Verfahren zur Überführung von DNA-Empfängerzellen im Protoplasten oder Spheroplasten, welche eine rekombinante DNA leicht aufnehmen können, und das anschließende Einführen der rekombinanten DNA in diese DNA-Empfängerzellen, wie für Bacillus subtilis, Actinomycetes und Hefen bekannt (Chang, S. und Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. und Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. und Fink, G. R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Die Transformation eines Mikroorganismus kann auch durch das Elektropulsverfahren durchgeführt werden (offen gelegtes Japanisches Patent Nr. 2-207791).
Die Kultivierung zur Bereitstellung eines Mikroorganismus oder einer Zelle, die LDC produziert, kann nach einem Verfahren, das für die Produktion von LDC geeignet ist, in Abhängigkeit von dem eingesetzten Mikroorganismus oder der eingesetzten Zelle durchgeführt werden.
Beispielsweise kann das Medium ein übliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Komponenten nach Bedarf enthält. Als Kohlenstoffquelle können Saccharide, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Arabinose, Maltose, Xylose, Trehalose, Ribose und Stärkehydrolysat, Alkohole, wie Glycerin, Mannitol und Sorbitol, und organische Säuren, wie Gluconsäure, Fumarsäure, Citronensäure und Bernsteinsäure, eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas, wässriges Ammoniak und dergleichen, verwendet werden. Als organische Spurenelemente sollen bevorzugt erforderliche Substanzen, beispielsweise Vitamine, wie Vitamin B₁, Nucleinsäuren, wie Adenin und RNA, Hefeextrakt und dergleichen in geeigneten Mengen zugesetzt werden. Neben diesen Substanzen können nach Bedarf kleine Mengen von Calciumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zugegeben werden.
Im Fall von Escherichia coli wird die Kultivierung vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während etwa 16 bis 72 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird zwischen 30 bis 45°C kontrolliert, und der pH-Wert wird zwischen 5 und 8 während der Kultivierung kontrolliert. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen sowie Ammoniakgas und dergleichen können zur Einstellung des pH-Werts verwendet werden.
Wenn die Expression des LDC-Gens durch einen induzierbaren Promotor kontrolliert wird, kann ein Induktor zu dem Medium gegeben werden.
Nach der Kultivierung können die Zellen aus der Kulturbrühe durch Zentrifugation oder durch Verwendung einer Membran gewonnen werden. Die Zellen können als solche eingesetzt werden. Wenn jedoch ein verarbeitetes Produkt davon, das LDC enthält, eingesetzt werden soll, können die Zellen durch Ultraschall, durch Behandlung mit einer French Press oder Behandlung mit Enzymen zerstört werden, um das Enzym zu extrahieren und einen zellfreien Extrakt herzustellen. Wenn LDC aus dem Extrakt weiter gereinigt wird, kann diese Reinigung durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder verschiedenen Chromatografietechniken auf herkömmliche Weise durchgeführt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer erklärt.
Beispiel 1: Konstruktion eines LDC-amplifizierten Stammes von Escherichia coli
PCR-Primer mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 wurden auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des LDC-Gens (cadA) von E. coli entworfen (Watson N. et al., Journal of Bacteriology, Vol. 174, 530-540, 1992; Meng S. Y. und Bennet G. N., Journal of Bacteriology, Vol. 174, 2659-2669, 1992) und für die PCR mit dem Chromosom von E. coli W3110 (ATCC 39936) als Matrize eingesetzt, um ein DNA-Fragment, welches das cadA-Gen enthält, zu amplifizieren.
Um das Plasmid pcadA herzustellen, wurde das amplifizierte DNA-Fragment mit KpnI und SphI verdaut, und das erhaltene Fragment (2468 bp) wurde in die KpnI-SphI-Verdauungsstelle von pUC18 (Takara Shuzo) eingeführt (1). Der Stamm E. coli JM109 (Takara Shuzo) wurde mit dem Plasmid pcadA transformiert. Eine Transformante wurde unter Einsatz der Ampicillinresistenz als Marker selektiert und E. coli JM109/pcadA genannt.
Beispiel 2: Produktion von Cadaverinadipat aus Lysinadipat unter Verwendung des cadA-amplifizierten Stammes
(1) Kultivierung des cadA-amplifizierten Stammes
E. coli JM109/pcadA wurde in dem LB-Medium vorkultiviert, und dann wurden 50 ml der Kulturbrühe in 500 ml des LB-Mediums mit doppelter Konzentration (2% Trypton, 1% Hefeextrakt, 1% NaCl) in einem 1 l-Rüttelfermenter (ABLE Co., Ltd.) eingeimpft. Die Zellen wurden unter Belüftung und Rühren unter den folgenden Bedingungen kultiviert. Belüftungsrate 250 ml/min, 35°C und 700 UpM. Nach 15-stündiger Kultivierung wurde die gesamte Kulturbrühe in 22 1 LB-Medium mit doppelter Konzentration in einem 50 l-Rüttelfermenter eingeimpft, und die Kultivierung wurde unter den folgenden Bedingungen fortgesetzt: Belüftungsrate 11 l/min, 35°C, 50 kPa Innendruck in dem Fermenter, und 250 UpM. Nach 4-stündiger Kultivierung wurden 3 g IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) in 50 ml Wasser gelöst und durch einen Filter in die Kultur gegeben. Die Kultivierung wurde 22 Stunden fortgesetzt.
(2) Isolierung von Zellen
Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe unter Verwendung eines röhrenförmigen Separators bei 17.000 UpM bei einer Einspeisungsrate von 550 ml/min gewonnen. Die gewonnenen Zellen wurden in einen Zylinder gegeben und in 1 l physiologischer Natriumchloridlösung suspendiert. Das Nassgewicht der gewonnenen Zellen war 147 g.
(3) Produktion von Cadaverinadipat
Um eine Lysinadipatsubstratlösung herzustellen, wurde Adipinsäure zu einer 50%igen (Gew./Vol.) Lysingrundlösung (Daiichi fine chemical Co., Ltd.) gegeben, sodass die Lösung einen pH-Wert von 6,0 hatte. Um ein Reaktionsgemisch herzustellen, wurde die Substratlösung dann zu Wasser auf eine Endkonzentration von 50 g/l, bezogen auf die Lysinkonzentration, gegeben, und Pyridoxalphosphat wurde zu dem Gemisch in einer Konzentration von 0,1 mM gegeben. Die E. coli JM109/pcadA-Zellsuspension (Nassgewicht der Zellen: 147 g) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu starten. Die Reaktion wurde in 22 l des Reaktionsgemisches, das in einen 50 l-Rüttelfermenter gegeben worden war, durchgeführt. Die Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 37°C, Belüftung 1/10 vvm, 250 UpM und 5 kPa Innendruck. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugeben einer Adipinsäure-Aufschlämmung (250 g/kg H₂O) auf pH 6,0 eingestellt.

Die Substratlösung, die 1 kg Lysin entsprach, wurde nach 2 Stunden und 3 Stunden der Reaktion zugegeben, und die Reaktion wurde fortgesetzt. Nach 6 Stunden waren fast 100 des Lysins in Cadaverin umgewandelt worden. Lysin und Cadaverin wurden unter Einsatz einer HPLC durch das Nachsäulen-OPA-Verfahren gemessen (Vale S. R. und Gloria M. B., Journal Of ADAC International, Vol. 80, 1006-1012, 1997). Die Messergebnisse waren wie folgt:

Cadaverinkonzentration	69 g/l (0,68 M)
Adipinsäurekonzentration	105 g/l (0,72 M)
Verbleibende Lysinkonzentration	< 1 g/l
Menge des erhaltenen Cadaverins	2,2 kg (21 mol)
Menge des eingesetzten Lysins	3,1 kg (21 mmol)
Umwandlungsausbeute	100% (mol/mol)

Wie vorstehend beschrieben wurde, wurde eine Cadaverinadipatlösung, die Cadaverin und Adipinsäure in äquimolaren Mengen enthielt, erhalten.
Beispiel 3: Bildung von Cadaverinadipatkristallen
(1) Entfernen von Zellen aus der Cadaverinadipatlösung
Die in Beispiel 2 erhaltene Cadaverinadipatlösung wurde in einem Autoklaven bei 120°C während 10 Minuten sterilisiert und zentrifugiert, um einen Überstand zu gewinnen.
(2) Entfärbung und Konzentration
Der erhaltene Überstand wurde zu 20% Aktivkohle, bezogen auf das Cadaveringewicht, gegeben und unter Rühren 1 Stunde bei 20°C entfärbt. Die Aktivkohle wurde mittels Filterpapier entfernt, und das erhaltene Filtrat wurde unter vermindertem Druck 4- bis 5-fach konzentriert (55 bis 60°C, 110 bis 150 mmHg). Der Feststoffgehalt des Konzentrats war 70 bis 77%.
(3) Kristallisation von Cadaverinadipat und Abtrennung von Kristallen
Das vorstehend genannte Konzentrat wurde von 60°C auf 10°C mit einer Rate von 4°C/Stunde zur Ausfällung von Kristallen gekühlt. Die Kristallisationsrate war 40 bis 45%. Die ausgefällten Kristalle wurden mittels einer Zentrifuge abgetrennt und gewonnen und dann in einem Exsikkator über mehrere Tage luftgetrocknet. Die Analyse der erhaltenen Kristalle durch Röntgenkristallografie (AFC-5S, hergestellt von Rigaku Corporation, Analyseprogramm: TEXAN) ergab, dass die Kristalle aus Cadaverinadipatdihydrat bestanden und eine Reinheit von 99% oder höher aufwiesen. Diese Kristalle enthielten Cadaverin und Adipinsäure in äquimolaren Mengen und konnten für die Polymerisationsreaktion von Nylon als solche eingesetzt werden.
Beispiel 4: Produktion von Cadaverinsuccinat aus Lysinsuccinat unter Verwendung eines cadA-amplifizierten Stammes
E. coli JM109/pcadA wurde in 50 ml LB-Medium, das 100 mg/l Ampicillin enthielt, in einem 500 ml-Sakaguchi-Kolben eingeimpft. Die Zellen wurden 8 Stunden bei 28°C vorkultiviert. 12 ml der Kulturbrühe wurden in 500 ml des LB-Mediums mit doppelter Konzentration in einem 1 l-Rüttelfermenter (ABLE Co., Ltd.) eingeimpft. Die Zellen wurden unter Belüftung und Rühren unter den folgenden Bedingungen kultiviert: Belüftungsra te 250 ml/min, 35°C und 700 UpM. Nach der Kultivierung während 3,5 Stunden wurde IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) in einer Endkonzentration von 0,67 mM zu der Kulturbrühe gegeben. Dann wurde die Kultivierung 12,5 Stunden fortgesetzt. Die Kulturbrühe wurde 10 min bei 8.000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt, um die Zellen zu gewinnen. Das Nassgewicht der gewonnenen Zellen war 10,3 g pro 1 Liter Kulturbrühe. Die Zellen wurden bei -80°C in gefrorenem Zustand gelagert. Die Zellen wurden vor der Verwendung auf Eis aufgetaut und in entionisiertem Wasser suspendiert, wobei eine Enzymlösung erhalten wurde.
Um ein Lysinsuccinatsubstrat herzustellen, wurde Bernsteinsäure zu einer 50%igen (Gew./Vol.)-Lysinstammlösung (Daiichi fine chemical) gegeben, sodass die Lösung einen pH-Wert von 6,0 hatte. Um ein Reaktionsgemisch herzustellen, wurde Wasser zu der Substratlösung in einer Endkonzentration von 100 g/l, bezogen auf die Lysinkonzentration, gegeben, und Pyridoxalphosphat wurde zu dem Gemisch in einer Konzentration von 0,1 mM gegeben. Die E. coli JM109/pcadA-Zellsuspension (Nassgewicht der Zellen: 0,309 g) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu starten. Die Reaktion wurde mit 0,3 1 des Reaktionsgemisches in einem 1 l-Rüttelfermenter durchgeführt. Die Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 37°C, Belüftung bei 1/10 vvm, 200 UpM. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugeben einer äquimolaren Menge von kristalliner Bernsteinsäure (24,23 g) zu Lysin auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Dann wurde die Reaktion 3 Stunden ohne pH-Kontrolle fortgesetzt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches war am Ende der Reaktion 7,2.

Lysin und Cadaverin wurden unter Einsatz einer HPLC durch das Nachsäulen-OPA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt. Die Decarboxylierung schritt erfolgreich voran, und eine Cadaverinsuccinatlösung, die Cadaverin und Bernsteinsäure in äquimolaren Mengen enthielt, wurde erhalten.

Cadaverinkonzentration	66,8 g/l (0,654 M)
Verbleibende Lysinkonzentration	g/l 0,17
Bernsteinsäurekonzentration	78,3 g/l (0,663 M)
Menge des erhaltenen Cadaverins	20,4 kg (201 mmol)
Menge des zugesetzten Lysins	30 g (204 mmol)
Umwandlungsausbeute	98,6%

Beispiel 5: Produktion von Cadaverinsebacat aus Lysinsebacat unter Einsatz eines cadA-amplifizierten Stammes
E. coli JM109/pcadA wurde in einem 1 l-Rüttelfermenter (ABLE Co., Ltd.) kultiviert, und die Zellen wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 gewonnen.
Um eine Lysinsebacatsubstratlösung herzustellen, wurde Sebacinsäure zu einer 50%igen (Gew./Vol.)-Lysinstammlösung (Daiichi fine chemical) gegeben, sodass die Lösung einen pH-Wert von 6,6 hatte. Um das Reaktionsgemisch herzustellen, wurde Wasser zu der Substratlösung in einer Endkonzentration von 100 g/l, bezogen auf die Lysinkonzentration, gegeben, und Pyridoxalphosphat wurde zu dem Gemisch in einer Konzentration von 0,1 mM gegeben. Die E. coli JM109/pcadA-Zellsuspension (Nassgewicht der Zellen: 0,309 g) wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu starten. Die Reaktion wurde mit 0,3 1 des Reaktionsgemisches in einem 1 l-Rüttelfermenter durchgeführt. Die Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 37°C, Belüftung 1/10 vvm, 200 UpM. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugeben einer äquimolaren Menge von kristalliner Sebacinsäure (41,51 g) zu Lysin auf einen pH-Wert von 6,6 eingestellt. Dann wurde die Reaktion 3 Stun den ohne pH-Kontrolle fortgesetzt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches war am Ende der Reaktion 7,1.
Lysin und Cadaverin wurden mit einer HPLC durch das Nachsäulen-OPA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind wie folgt.

Die Decarboxylierungsreaktion schritt erfolgreich voran, und es wurde eine Cadaverinsebacatlösung, die Cadaverin und Seebacinsäure in äquimolaren Mengen enthielt, erhalten.

Cadaverinkonzentration	63,9 g/l (0,625 M)
Verbleibende Lysinkonzentration	0,17 g/l
Sebacinsäurekonzentration	128,9 g/l (0,637 M)
Menge des erhaltenen Cadaverins	20,4 kg (200 mmol)
Menge des eingesetzten Lysins	30 g (204 mmol)
Umwandlungsausbeute	98,1%

Während die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen eingehend beschrieben wurde, ist es für den Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen ausgeführt werden können und Äquivalente eingesetzt werden können, ohne dass vom Umfang der Erfindung abgewichen wird. Jedes der vorstehend genannten Dokumente wird durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit hier einverleibt, einschließlich das ausländische Prioritätsdokument JP2003-147688.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Cadaverindicarboxylats, welches umfasst: A) enzymatische Decarboxylierungreaktion einer Lysinlösung; B) Halten des pH-Wertes der Lösung durch Zugeben einer Dicarbonsäure zu der Lösung bei einem Wert, der ausreicht, damit die Reaktion auftritt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert etwa 4,0 bis 8,0 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Dicarbonsäure 4 bis 10 Kohlenstoffe enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Dicarbonsäure Adipinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die enzymatische Decarboxylierungsreaktion unter Verwendung von Lysindecarboxylase, einer Lysindecarboxylase-produzierenden Zelle oder eines verarbeiteten Zellprodukts einer Lysindecarboxylase-produzierenden Zelle durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle so modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Lysindecarboxylaseaktivität aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zelle eine Rekombinante ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zelle so modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Kopienzahl eines für Lysindecarboxylase kodierenden Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zelle durch Modifizieren einer Expressionsregulationssequenz eines für Lysindecarboxylase kodierenden Gens modifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Expression des für Lysindecarboxylase kodierenden Gens verstärkt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle Escherichia coli ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das für Lysindecarboxylase kodierende Gen eien cadA-Gen ist.
Verfahren zum Herstellen eines Cadaverindicarboxylats, welches umfasst: A) enzymatische Decarboxylierungreaktion einer Lysinlösung; B) Halten des pH-Wertes der Lösung zwischen 4,0 und 8,0 durch Zugeben einer Dicarbonsäure zu der Lösung.
Verfahren zum Herstellen eines Cadaverindicarboxylats, welches umfasst: A) enzymatische Decarboxylierungreaktion einer Lysinlösung durch Zugeben von Lysindecarboxylase; B) Halten des pH-Wertes der Lösung zwischen 4,0 und 8,0 durch Zugeben einer Dicarbonsäure zu der Lösung.
Verfahren zum Herstellen von Nylon, welches umfasst: A) enzymatische Decarboxylierungsreaktion einer Lysinlösung; B) Halten des pH-Werts der Lösung durch Zugeben einer Dicarbonsäure zu der Lösung bei einem Wert, der ausreicht, damit die Reaktion auftritt, wobei Cadaverindicarboxylat hergestellt wird; und C) Polykondensation des Cadaverindicarboxylats.