DE60301031T2

DE60301031T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren

Info

Publication number: DE60301031T2
Application number: DE60301031T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Hara; Hiroshi Izui; Takahiro Asano; Yasuyuki Watanabe; Nakamatsu Tsuyoshi
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2002-03-27
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2023-03-27
Also published as: EP1352966B1; BR0300978B1; PL359383A1; TWI308594B; DE60301031D1; EP1352966A2; US7037690B2; MY130526A; US7432085B2; TW200306352A; JP2003274988A; US20030219882A1; AU2003202509A1; PE20031014A1; DK1352966T3; US20060115878A1; CN100529094C; ATE299945T1; RU2307165C2; KR100949048B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren und dafür verwendete Bakterien. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Bakterien, die verbesserte Fähigkeit zur Herstellung von L-Aminosäuren haben und auf Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung dieser.
Beschreibung des relevanten Standes der Technik
Üblicherweise werden L-Aminosäuren, wie L-Glutaminsäure hauptsächlich durch Fermentation unter Verwendung von so genannten coryneformen Bakterien produziert, die der Gattung Brevibakterium, Corynebakterium oder Mikrobakterium angehören ("Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, S. 195–215, 1986). Außerdem können zur Herstellung von L-Aminosäuren auch Mikroorganismen der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Penicillium (US-Patent Nr. 3,220,929), Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Aerobacter, Candida (US-Patent Nr. 3,563,857), Escherichia (Japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-244970) oder dergleichen verwendet werden. Weiterhin können auch Mikroorganismen, die den Gattungen Enterobacter ( EP1078989A2 ), Klebsiella, Erwinia oder Pantoea angehören (offen gelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 2000-106869) für die Herstellung von L-Aminosäuren, wie L-Glutaminsäure, verwendet werden.
Es wurden außerdem verschiedene Methoden zum Erhöhen der Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure durch Verbesserung von an der Biosynthese von L-Aminosäuren beteiligten Enzymen durch rekombinante DNA-Methoden offenbart. So wurde beispielsweise ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines Bakteriums, das der Gattung Enterobacter oder Klebsiella angehört, in welches ein Citratsynthasegen eingeführt wurde ( EP0999282A2 ) und ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines der Gattung Enterobacter angehörenden Bakteriums offenbart, in welches Gene eingeschleust wurden, die für Citratsynthase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase und Glutamatdehydrogenase kodieren ( EP 1 078 989 A2 ).
Weiterhin sind auch Methoden zum Erhöhen der Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäuren bekannt, bei denen Gene eingeschleust wurden, die für glykolytische Enzyme, wie Glucose-6-phosphatisomerase (WO 01/02542 A1), Fructosephosphotransferase (WO 01/48146 A1) und Enolase (WO 01/02543 A1) kodieren.
Übrigens haben viele Gram-negative Bakterien einschließlich Enterobakterien den Entner-Doudoroff-Weg als einen der Wege des Glucosemetabolismus. Dieser Weg schließt 6-Phosphogluconat-dehydratase (nachstehend abgekürzt als "EDD"), welche die Reaktion der Bildung von 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat aus 6-Phosphogluconsäure katalysiert und 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat-aldolase ein (nachstehend als "EDA" abgekürzt), welche 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat spaltet, wobei Glyceraldehyd-3-phosphat und Brenztraubensäure gebildet wird. Für EDD und EDA kodierende Gene sind aus Escherichia coli, Zymomonas mobilis und so weiter geklont worden und ihre Nukleotidsequenzen wurden offenbart. Die Nukleotidsequenzen des für EDD (edd) kodierenden Gens und des für EDA (eda) kodierenden Gens von Escherichia coli wurden als GenBank-Hinterlegungsnummer L20897 registriert. Außerdem ist die Nukleotidsequenz des eda-Gens von Zymomonas mobilis unter der GenBank-Hinterlegungsnummer X58364 registriert und die Nukleotidsequenz des entsprechenden edd-Gens ist in der Datenbank unter GenBank-Hinterlegungsnummer M60615 M37982 registriert.
Ein Zusammenhang zwischen dem Entner-Doudoroff-Weg und der Produktivität für L-Aminosäuren ist jedoch unbekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Methode zum Verbessern der Produktivität für L-Aminosäuren in Bakterien zur Verfügung zu stellen, die sich von bekannten Methoden unterscheidet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konzentrierten ihre Aufmerksamkeit auf den Entner-Doudoroff-Weg, den Gram-negative Bakterien besitzen. Unter den metabolischen Wegen von Sacchariden zu L-Aminosäuren, wie L-Glutaminsäure, wird Kohlendioxid durch die Reaktion zur Herstellung von Ribulose-5-phosphat aus 6-Phosphogluconsäuren durch 6-Phosphogluconat-dehydrogenase produziert: In Bakterienstämmen bei denen eine hohe Zuführung von Kohlenstoff in den Pentosephosphat-Weg vorhanden ist, sollte insbesondere auch eine große Menge an Kohlendioxid durch die vorstehend erwähnte Reaktion freigesetzt werden. Sie haben daher angenommen, dass die Fähigkeit zur Bildung einer L-Aminosäure, wie L-Glutaminsäure, dadurch verbessert werden könnte, dass die Zufuhr in den Pentosephosphat-Weg vermieden wird.
Zwei der Methoden zum Vermindern der Zufuhr von Kohlenstoff in den Pentosephosphat-Weg werden betrachtet:
(1) Das Beseitigen oder Vermindern der Aktivität von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase oder 6-Phosphogluconat-dehydrogenase und (2) die Verstärkung des Entner-Doudoroff-Wegs. Es kann von beiden Methoden erwartet werden, dass sie die Wirkung haben, den Pentosephosphat-Weg zu umgehen. Im Fall von (2) wird jedoch angenommen, dass ein Derivat eines Zwischenprodukts in dem Pentosephosphat-Weg; wie eine Nukleinsäure, auch zugeführt werden kann, da die Kohlenstoffverteilung bezüglich des Pento sephosphat-Wegs auch durch Regeln der Aktivitäten von EDD und EDA verändert werden kann. Als Ergebnis von verschiedenen Untersuchungen wurde außerdem gefunden, dass die Fähigkeit von Bakterien, L-Aminosäuren zu produzieren, durch Verstärken des Entner-Doudoroff-Wegs verbessert werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
Erfindungsgemäß wird Folgendes bereitgestellt.

(1) Ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zum Produzieren einer L-Aminosäure in einem Medium, um die L-Aminosäure in dem Medium zu produzieren und anzureichern, und das Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium umfasst, wobei der Mikroorganismus ein Gram-negatives Bakterium ist, das den Entner-Doudoroff-Weg aufweist und so modifiziert worden ist, dass die 6-Phosphogluconat-dehydrataseaktivität oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat-aldolaseaktivität oder beide Aktivitäten verstärkt sind, und die L-Aminosäure unter L-Aminosäuren ausgewählt ist, die über einen Biosyntheseweg unter Verwendung von Brenztraubensäure als Intermediat produziert werden.
(2) Das Verfahren nach (1), wobei das Bakterium ein Enterobakterium ist.
(3) Das Verfahren nach (2), wobei das Bakterium zur Gattung Enterobacter gehört.
(4) Das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (3), wobei die 6-Phosphogluconat-dehydrataseaktivität oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat-aldolaseaktivität durch Erhöhen der Kopienzahl eines Gens, das für 6-Phosphogluconat-dehydratase oder 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat-aldolase kodiert, oder durch Modifizieren einer Expressionsregulationssequenz des Gens verstärkt wird, sodass die Expression des Gens in einer Zelle des Bakteriums verstärkt wird.
(5) Das Verfahren nach (1), wobei die L-Aminosäure L-Glutaminsäure oder eine L-Aminosäure ist, die über einen Biosyntheseweg unter Verwendung von L-Glutaminsäure als Intermediat oder Aminogruppendonor produziert wird.
(6) Das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (5), wobei die L-Aminosäure unter L-Glutaminsäure, L-Arginin, L-Glutamin, L-Prolin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin und L-Alanin ausgewählt ist.
(7) Das Verfahren nach (6), wobei die L-Aminosäure L-Glutaminsäure ist.
Erfindungsgemäß kann durch Erhöhen der Aktivität des Entner-Doudoroff-Wegs die Fähigkeit eines Mikroorganismus, der diesen Weg aufweist, zur Bildung einer L-Aminosäure verbessert werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Wachstum eines Stammes, in welchem das edd-Gen und eda-Gen verstärkt sind (A) und die Menge der gebildeten L-Glutaminsäure (B).
2 zeigt die Mengen von Acetoin und 2,3-Butandiol, die durch einen Stamm produziert werden, in welchem das edd-Gen und das eda-Gen verstärkt sind: (A) die Menge von Acetoin in einem Medium, (B) die Menge von 2,3-Butandiol in einem Medium und (C) die Gesamtmenge des gebildeten Acetoins und 2,3-Butandiols pro Einheit der Bakterienzellen (Gewicht pro Einheit Trockengewicht).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
<1> Bakterium für die vorliegende Erfindung
Das erfindungsgemäß verwendete Gram-negative Bakterium ist ein Gram-negatives Bakterium welches die Fähigkeit hat, eine L-Aminosäure zu produzieren und den Entner-Doudoroff-Weg zu bewirken.
Der Ausdruck "Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure", der erfindungsgemäß verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit, die L-Aminosäure in einem Medium anzureichern, wenn das erfindungsgemäße Bakterium in dem Medium kultiviert wird. Diese Fähigkeit zur Bildung einer L-Aminosäure kann die Eigenschaft eines Wildstammes des Gram-negativen Bakteriums oder eine durch Züchtung verliehene oder verstärkte Eigenschaft sein. L-Aminosäuren, auf welche die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, sind L-Aminosäuren, die durch einen biosynthetischen Weg produziert werden, bei dem Brenztraubensäure als Zwischenprodukt verwendet wird. Spezifische Beispiele dafür umfassen L-Glutaminsäure, L-Arginin, L-Glutamin, L-Prolin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Alanin und so weiter.
Wie in den später beschriebenen Beispielen gezeigt wird, zeigte ein Bakterium, in welchem der Entner-Doudoroff-Weg durch Erhöhen der Aktivitäten von EDD und EDA verstärkt war, erhöhte Produktion von Acetoin und 2,3-Butandiol. Da 2,3-Butandiol aus Acetoin gebildet wird und Acetoin aus Brenztraubensäure gebildet wird, zeigt ein Anstieg der Bildung von Acetoin und 2,3-Butandiol eine Erhöhung der Menge der zugeführten Brenztraubensäure an. Es wird daher angenommen, dass das Bakterium, das einen verstärkten Entner-Doudoroff-Weg aufweist, eine erhöhte Fähigkeit zur Bildung einer L-Aminosäure hat, die durch einen biosynthetischen Weg unter Verwendung von Brenztraubensäure als Zwischenprodukt gebildet wird.
Spezifische Beispiele für Gram-negative Bakterien mit dem Entner-Doudoroff-Weg umfassen Bakterien der Gattungen Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia oder Pantoea, Escherichia, Pseudomonas, Arthrobacter und Aerobacter und so weiter. Ob ein Bakterium den Entner-Doudoroff-Weg hat, kann beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass eine Suspension von aufgebrochenen Zellen mit Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, 6-Phosphogluconsäure und Acetylpyridin-adenindinukleotid vermischt wird und das aus 6-Phosphogluconsäure als Substrat gebildete Glyceraldehyd-3-phosphat durch Messung des Anstiegs der Absorption bei 365 nm nachgewiesen wird. Ein Bakterium, für das die Bildung von Glyceraldehyd-3-phosphat bestätigt wird, hat den Entner-Doudoroff-Weg.
Für die vorliegende Erfindung verwendete Bakterien können in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Art der Ziel-L-Aminosäure ausgewählt werden. Für die Produktion von L-Glutaminsäure geeignete Bakterien sind nachstehend beispielhaft aufgeführt. Der Bereich der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Spezifische Beispiele für die Enterobacter-Bakterien umfassen folgende Bakterien.
Enterobacter agglomerans
Enterobacter aerogenes
Enterobacter amnigenus
Enterobacter asburiae
Enterobacter cloacae
Enterobacter dissolvens
Enterobacter gergoviae
Enterobacter hormaechei
Enterobacter intermedius
Enterobacter nimipressuralis
Enterobacter sakazakii
Enterobacter taylorae
Stärker bevorzugt sind die folgenden Bakterienstämme.
Enterobacter agglomerans ATCC 12287
Enterobacter agglomerans AJ13355
Enterobacter agglomerans AJ13356
Enterobacter agglomerans AJ13601
Enterobacter agglomerans AJ13355 und AJ13556 wurden am 19. Februar 1998 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (zur Zeit unabhängige Verwaltungsgesellschaft, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science und Technology, Addresse: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, Postleitzahl: 305–5466) hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern FERM P-16644 und FERM P-16645. Die Hinterlegungen wurden dann am 11. Januar 1999 in internationale Hinterlegungen nach den Vorschriften des Budapester Vertrags umgewandelt und erhielten die Hinterlegungsnummern FERM BP-6614 und FERM BP-6615. Enterobacter agglomerans AJ13601 wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Bioscience and Human Technology am 18. August 1999 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-17516. Die Hinterlegung wurde dann am 6. Juli 2000 in eine internationale Hinterlegung nach den Vorschriften des Budapester Vertrags umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-7207. Enterobacter agglomerans ATCC 12287 kann von ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA) erhalten werden.
Beispiele für Bakterien der Gattung Klebsiella umfassen die folgenden Bakterien.
Klebsiella planticola
Klebsiella terrigena
Stärker bevorzugt wird Klebsiella planticola AJ13399.
Klebsiella planticola AJ13399 wurde am 19. Februar 1998 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Bioscience and Human Technology (zur Zeit unabhängige Verwaltungsgesellschaft, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-16646. Die Hinterlegung wurde dann am 11. Januar 1999 in eine internationale Hinterlegung nach den Vorschriften des Budapester Vertrags umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-6616.
Der Stamm Klebsiella planticola AJ13399 ist ein Stamm, der in Sapporo-shi, Hokkaido aus Erde isoliert wurde.
Beispiele für Mikroorganismen der Gattung Serratia, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, umfassen die folgenden.
Serratia liquefacience
Serratia entomophila
Serratia ficaria
Serratia fonticola
Serratia grimesii
Serratia proteamaculans
Serratia odorifera
Serratia plymuthica
Serratia rubidaea
Stärker bevorzugt sind die folgenden Bakterienstämme.
Serratia liquefacience ATCC 14460
Serratia liquefacience ATCC 14460 kann von ATCC erhalten werden.
Zu Beispielen für die Mikroorganismen der Gattung Erwinia, die erfindungsgemäß verwendet werden, gehören die folgenden.
Erwinia herbicola (zur Zeit als Pantoea agglomerans klassifiziert)
Erwinia ananas
Erwinia cacticida
Erwinia chrysanthemi
Erwinia mallotivora
Erwinia persicinus
Erwinia psidii
Erwinia quercina
Erwinia rhapontici
Erwinia rubrifaciens
Erwinia salicis
Erwinia uredovora
Stärker bevorzugt wird Erwinia herbicola IAM1595 (Pantoea agglomerans AJ2666). Erwinia herbicola IAM1595 kann von dem Institute of Molecular and Cellular Biosciences, Universität Tokyo, erhalten werden.
Erwinia herbicola ist in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9. Auflage nicht erwähnt und der Mikroorganismus, der als Erwinia herbicola klassifiziert wurde, wird als Pantoea agglomerans klassifiziert. Somit sind Mikroorganismen, die der Gattung Erwinia angehören, und Mikroorganismen, die der Gattung Pantoea angehören, miteinander eng verwandt. Daher können Mikroorganismen der Gattung Pantoea in gleicher Weise verwendet werden, wie Mikroorganismen der Gattung Erwinia. Als solche Mikroorganismen, die der Gattung Pantoea angehören, lassen sich Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa und Pantoea ananas erwähnen. Erwinia herbicola IAM1595 wurde als Pantoea agglomerans AJ2666 bezeichnet und bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Bioscience and Human Technology (zur Zeit International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) als internationale Hinterlegung unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 25. Februar 1999 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-6660.
Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismen, die der Gattung Escherichia angehören, schließen Escherichia coli ein.
Stärker bevorzugt wird Escherichia coli mit Valin-Resistenz und spezifische Beispiele sind die folgenden Stämme.
Escherichia coli K-12 (ATCC 10798)
Escherichia coli W (ATCC 9637)
Escherichia coli K-12 (ATCC 10798) und Escherichia coli W (ATCC 9637) können von ATCC bezogen werden.
Das erfindungsgemäße Gram-negative Bakterium ist ein Gramnegatives Bakterium, welches die Fähigkeit hat, eine L-Aminosäure zu produzieren und den vorstehend erwähnten Entner-Doudoroff-Weg zu befolgen und welches so modifiziert wurde, dass die Aktivität von EDD oder EDA oder beide Aktivitäten verstärkt wurden. Das erfindungsgemäße Bakterium ist vorzugsweise ein Gram-negatives Bakterium, das so modifiziert wurde, dass beide Aktivitäten, das heißt die von EDD und EDA, verstärkt sind.
Der Ausdruck "so modifiziert, dass die Aktivität von EDD oder EDA verstärkt ist" bedeutet, dass die EDD- oder EDA-Aktivität pro Zelle gegenüber der eines Wildtyp-Bakteriums erhöht wurde. So lassen sich beispielsweise solche, in denen die Anzahl von EDD- oder EDA-Molekülen pro Zelle erhöht ist, solche in denen die spezifische Aktivität von EDD oder EDA pro EDD- oder EDA-Molekül erhöht ist und so weiter erwähnen. Ferner ist das zum Vergleich herangezogene Wildtyp-Bakterium ein Bakterium, welches keinerlei Manipulation zum Erhöhen der EDD- oder EDA-Aktivität unterworfen wurde.
Die Erhöhung der EDD- und/oder EDA-Aktivität in einem Bakterium wird durch Erhöhen der Kopienzahl eines Gens erzielt, das für EDD und/oder EDA kodiert. So kann beispielsweise rekombinante DNA durch Ligieren eines Genfragments, das für EDD und/oder EDA kodiert, mit einem in einem Zielbakterium funktionsfähigen Vektor, vorzugsweise einem Vektor des Mehrfachkopientyps (multicopy type vector) hergestellt werden und kann in das Bakterium eingeschleust werden, um dieses zu transformieren. Wenn beide Aktivitäten, die von EDD und EDA, erhöht werden, können das Genfragment, das für EDD kodiert, und das Genfragment, das für EDA kodiert, gesondert in verschiedene Vektoren eingebracht werden, sie werden jedoch vorzugsweise in den gleichen Vektor eingefügt. Die rekombinante DNA kann in ein Bakterium eingeschleust werden, das Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure hat, alternativ kann die rekombinante DNA in ein Bakterium eines Wildtyps eingeschleust werden, um einen Transformantenstamm zu erhalten, und der Transformantenstamm kann dann mit der Fähigkeit zur Produktion der L-Aminosäure ausgestattet werden.
Als Gen, das für EDD kodiert und als Gen, das für EDA kodiert können beliebige Gene verwendet werden, die von Gram-negativen Bakterien mit dem Entner-Doudoroff-Weg abgeleitet sind. Speziell können von Escherichia Bakterien abgeleitete Gene erwähnt werden. Es wurde berichtet, dass das für EDD (edd) kodierende Gen und das für EdzA (eda) kodierende Gen, die von Escherichia coli abgeleitet sind, ein Operon bilden (J. Bacteriol., 174 (14): 4638–46, Juli 1992). Nachstehend wird das für EDD kodierende Gen als edd erwähnt und das für EDA kodierende Gen wird als eda bezeichnet. Außerdem wurde über Gene von Bakterien der Gattung Zymomonas berichtet und das edd-Gen und das eda-Gen können durch PCR (Polymerase Chain Reaction, siehe White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) erhalten werden, wobei Primer verwendet werden, die auf Basis der Sequenzen dieser Gene hergestellt wurden, oder durch Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die auf Basis der vorstehend erwähnten Gensequenzen hergestellt wurde, erhalten werden. So kann beispielsweise ein das edd-Gen und eda-Gen von Escherichia coli enthaltendes Operonfragment durch PCR unter Verwendung der später beschriebenen Primer edd-F (SEQ ID Nr. 1) und eda-R (SEQ ID Nr. 2) erhalten werden. Das edd-Gen und das eda-Gen von anderen Mikroorganismen können in gleicher Weise erhalten werden. Beispielhaft für die Hybridisierungsbedingung ist eine Bedingung, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration entsprechend 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C durchgeführt wird.
Außerdem sind das für die Zwecke der Erfindung verwendete edd-Gen und eda-Gen nicht auf Gene des Wildtyps beschränkt und sie können Mutanten oder künstlich modifizierte Gene sein, die für die Genprodukte kodieren, welche Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder dergleichen von einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehr Stellen einschließen, solange die Funktionen der kodierten EDD und EDA nicht beeinträchtigt werden. Zwar schwankt die Anzahl von "mehreren" Aminosäuren, auf die hier Bezug genommen wird, in Abhängigkeit von der Position oder der Art der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur eines Proteins, sie kann jedoch speziell 2 bis 60, vorzugsweise 2 bis 40, stärker bevorzugt 2 bis 20, betragen. Weiterhin können als DNA, die für ein Protein kodiert, das im Wesentlichen identisch mit den vorstehend erwähnten EDD und/oder EDA ist, DNAs erwähnt werden, die mit den Nukleotidsequenzen eines bekannten edd- oder eda-Gens hybridisierbar ist (beispielsweise GenBank-Hinterlegungsnummer L20897, X58364, M60615, M37982) oder eine Sonde kann erwähnt werden, die aus diesen Nukleotidsequenzen unter stringenten Bedingungen gebildet wird und für ein Protein kodiert, das ähnliche Aktivität wie EDD oder EDR hat. Die hier erwähnte "stringente Bedingung" ist eine Bedingung, unter der ein so genanntes spezifisches Hybrid gebildet wird, jedoch ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diese Bedingung unter Verwendung von numerischen Werten klar auszudrücken. Jedoch umfasst beispielsweise die stringente Bedingung eine Bedingung, unter der DNAs mit hoher Homologie, beispielsweise DNAs mit einer Homologie von 50% oder mehr miteinander hybridisiert werden, jedoch DNAs mit einer Homologie, die weniger als die vorstehende ist, nicht miteinander hybridisieren können.
Alternativ ist die stringente Bedingung durch eine Bedingung beispielhaft erläutert, unter der DNAs miteinander bei einer Salzkonzentration hybridisiert werden, die der üblichen Waschbedingung einer Southern-Hybridisierung entspricht, d. h. 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS, bei 60°C.
Chromosomale DNA kann aus einem Bakterium als DNA-Donor beispielsweise mit Hilfe der Methode von Saito und Miura oder dergleichen (siehe H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, verlegt von der Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, S. 97–98, Baifukan, 1992) hergestellt werden.
Wenn rekombinante DNA durch Ligieren des edd-Gens und/oder des eda-Gens, die durch PCR amplifiziert sind, mit Vektor-DNA, die in einer Zelle von Escherichia coli autonom replizierbar ist, hergestellt wird und in Escherichia coli eingeschleust wird, werden die nachfolgenden Verfahrensschritte erleichtert. Beispiele für Vektoren, die in Escherichia-coli-Zellen autonom replizierbar sind, umfassen pMW219, pSTV28, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184 und so weiter.
Um die wie oben beschrieben hergestellte rekombinante DNA in ein Gram-negatives Bakterium einzuschleusen, können bisher beschriebene Transformationsmethoden angewendet werden. So kann beispielsweise die Methode von D. A. Morrison (Methods in En zymology, 68, 326 (1979)), eine Methode zur Behandlung von Empfängerzellen mit Calciumchlorid, um die Durchlässigkeit für DNA zu erhöhen (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), eine Elektroporationsmethode (Miller J. H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, S. 279, 1992) und so weiter erwähnt werden.
Die Kopienzahl des edd-Gens und/oder eda-Gens kann auch dadurch erhöht werden, dass Mehrfachkopien dieser Gene in chromosomale DNA eines Bakteriums eingebracht werden. Um Mehrfachkopien des edd-Gens und/oder eda-Gens in die chromosomale DNA eines Bakteriums einzuführen, wird eine homologe Rekombination unter Verwendung einer Sequenz durchgeführt, von der Mehrfachkopien in der chromosomalen DNA als Ziel existieren. Als Sequenzen, deren Mehrfachkopien in der chromosomalen DNA vorhanden sind, können repetitive DNA oder inverted repeats, die am Ende eines transposierbaren Elements existieren, verwendet werden. Wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-109985 offenbart ist, ist es auch möglich, das edd-Gen und/oder eda-Gen in ein Transposon einzufügen und die Übertragung zu ermöglichen, um Mehrfachkopien des Gens in die chromosomale DNA einzuführen.
Die Verstärkung der EDD- und/oder EDA-Aktivitäten kann außer durch die vorstehend erwähnte Gen-Amplifizierung, auch dadurch erreicht werden, dass eine die Expression regulierende Sequenz, wie ein Promoter des edd-Gens und/oder eda-Gens in der chromosomalen DNA oder einem Plasmid durch eine stärkere ersetzt wird. So sind beispielsweise der lac-Promoter, trp-Promoter, trc-Promoter und so weiter als starke Promoter bekannt. Wie außerdem in der Internationalen Patentveröffentlichung WO00/18935 offenbart ist, kann der Promoter modifiziert werden, sodass er ein stärkerer Promoter wird, indem eine Substitution von mehreren Nukleotiden in die Promoterregion des edd- Gens und/oder eda-Gens eingeführt wird. Die Substitution oder Modifizierung dieser Promoter verstärkt die Expression des edd-Gens und/oder eda-Gens und somit werden die Aktivitäten von EDD und/oder EDA verstärkt. Die Modifizierung dieser die Expression regulierenden Sequenzen kann mit einer Erhöhung der Kopienzahl des edd-Gens und/oder des eda-Gens kombiniert werden.
Die Verstärkung der Aktivitäten von EDD und EDA kann bestätigt werden, indem eine Suspension von zerbrochenen Zellen mit Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure vermischt wird und das aus 6-Phosphogluconsäure als Substrat gebildete Glyceraldehyd-3-phosphat bestimmt wird. Bei dieser Reaktion kann die EDD-Aktivität gemessen werden, indem die nach der Reaktion verbliebene 6-Phosphogluconsäure mit Hilfe von 6-Phosphogluconat-dehydrogenase quantitativ bestimmt wird oder die in Gegenwart von überschüssiger 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat-aldolase gebildete Brenztraubensäure unter Verwendung von Lactatdehydrogenase quantitativ bestimmt wird. Die 6-Phosphogluconsäure oder die Brenztraubensäure kann als Erhöhung von NADH in der Dehydrogenasereaktion quantitativ erhalten werden. Außerdem kann die EDA-Aktivität auch gemessen werden, indem die aus 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat als Substrat gebildete Brenztraubensäure unter Verwendung von Lactatdehydrogenase bestimmt wird.
In dem erfindungsgemäßen Gram-negativen Bakterium kann die Aktivität eines Enzyms, das die Biosynthese von L-Aminosäure katalysiert und verschieden von EDD und EDA ist, erhöht werden, solange die Wirkung der Verstärkung der Aktivitäten von EDD und EDA nicht beeinträchtigt wird.
Wenn beispielsweise die Ziel-L-Aminosäure L-Glutaminsäure ist, schließen Beispiele für ein solches Enzym Glutamatdehydrogenase (nachstehend auch als "GDH" bezeichnet), Glutaminsyntheta se, Glutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase (nachstehend auch als "CS" bezeichnet), Phosphoenolpyruvatcarboxylase (nachstehend auch als "PEPC" bezeichnet), Phosphoenolpyruvatsynthase, Pyruvatdehydrogenase, Pyruvatkinase, Pyruvatcarboxylase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Triosephosphat-isomerase, Fructosebisphosphat-aldolase, Phosphofructokinase, Glucosephosphatisomerase und so weiter ein. Wenn das für die Produktion von L-Glutaminsäure benutzte Bakterium ein Enterobacter-Bakterium ist, werden unter den vorstehend genannten Enzymen ein bis drei der Enzyme CS, PEPC und GDH bevorzugt. Außerdem wird bevorzugt, dass die Aktivitäten der drei Arten von Enzymen, CS, PEPC und GDH sämtlich verstärkt werden. Insbesondere bevorzugt wird CS von Brevibakterium lactofermentum, weil es nicht der Inhibierung durch α-Ketoglutarsäure, L-Glutaminsäure und NADH unterliegt.
Als Organismen, welche Ausgangsquellen für das Gen, das für CS kodiert (gltA), das Gen, das für PEPC kodiert (ppc) und das Gen, das für GDH kodiert (gdhA) sein können, können beliebige Organismen verwendet werden, soweit sie Aktivitäten von CS, PEPC und GDH haben. Besonders Bakterien, die Prokaryoten sind, beispielsweise Bakterien der Gattungen Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebakterium, Brevibakterium oder Bacillus, werden bevorzugt. Spezifische Beispiele für diese schließen Escherichia coli, Brevibakterium lactofermentum und so weiter ein. Das gltA-Gen, ppc-Gen und das gdhA-Gen können aus chromosomaler DNA der vorstehend genannten Mikroorganismen erhalten werden.
Das gltA-Gen, ppc-Gen und gdhA-Gen können erhalten werden, indem eine Mutante mit Defizienz der CS-, PEPC- oder GDH-Aktivität verwendet wird und ein DNA-Fragment, welches ihre Auxotrophie komplementiert, aus der chromosomalen DNA der vorstehend erwähnten Mikroorganismen isoliert wird. Da außerdem die Nukleotidsequenzen dieser Gene von Escherichia-Bakterien und dieser Gene von Corynebakterien bereits aufgeklärt wurden (Biochemistry, 22: 5243–5249, 1983; J. Biochem., 95: 909–916, 1984; Gene, 27: 193–199, 1984; Microbiology, 140: 1817–1828, 1994; Mol. Gen. Genet., 218, 330–339, 1989; Molecular Microbiology, 6: 317–326, 1992) können sie durch Synthese von Primer auf Basis der jeweiligen Nukleotidsequenzen, und Durchführen von PCR unter Verwendung von chromosomaler DNA als Matrix erhalten werden. Die Einführung dieser Gene in ein Gram-negatives Bakterium, wie Enterobacter-Bakterien, wird in EP 0 670 370 A2, US-Patent Nr. 6,197,559, EP 0 999 282 A2 und EP 1 078 989 A2 ausführlich beschrieben.
Die Aktivitäten von CS, PEPC und GDH sowie die vorstehend erwähnten anderen enzymatischen Aktivitäten können in gleicher Weise verstärkt werden, wie die Verstärkung der vorstehend genannten Aktivitäten von EDD und EDA.
Außerdem kann in dem erfindungsgemäßen Bakterium die enzymatische Aktivität für die Katalyse einer Reaktion zur Herstellung einer anderen Verbindung durch Abzweigen von dem biosynthetischen Weg einer Ziel-L-Aminosäure vermindert oder ausgeschaltet werden, solange die Wirkung der Erhöhung der Aktivitäten von EDD und/oder EDA nicht beeinträchtigt wird. Wenn beispielsweise die angestrebte L-Aminosäure L-Glutaminsäure ist, umfassen Beispiele eines solchen Enzyms α-Ketoglutarat-dehydrogenase (auch als "αKGDH" nachstehend bezeichnet), Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acethydroxysäure-Synthase, Acetolactat-Synthase, Formatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, L-Glutamatdecarboxylase, L-Pyrrolindehydrogenase und so weiter.
Um die Aktivitäten der vorstehend erwähnten Enzyme zu vermindern oder auszuschalten können eine Methode zur Behandlung eines Mikroorganismus mit Ultraviolettstrahlung oder mit einem Mutagenesemittel, das bei einer üblichen Mutationsbehandlung verwendet wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetriger Säure und Selektion eines Mutantenstammes, in welchem die beabsichtigte enzymatische Aktivität vermindert ist, eine Gen-Abbruchmethode unter Verwendung von Gen-Substitution auf Basis von homologer Rekombination oder dergleichen angewendet werden. Die Unterbrechung des Gens, das für αKGDH kodiert, ist in US-Patent Nr. 5,977,331 beschrieben.
Wenn andere Gene als das edd-Gen und eda-Gen bei der Konstruktion des erfindungsgemäßen Bakteriums eingeführt werden, wird bevorzugt, weniger Arten von Vektoren zu verwenden. Das heißt, ein Vektor besitzt gewöhnlich ein Markergen und es ist erforderlich, ein dem Markergen entsprechendes Mittel oder dergleichen dem Medium zuzusetzen. Wenn daher viele Arten von Vektoren verwendet werden, muss eine große Anzahl von Mitteln zu dem Medium zugesetzt werden. Dies kann zu einem schlechten Wachstum von Bakterien führen. Daher wird gewöhnlich bevorzugt, weniger Arten von Vektoren zu verwenden. Es wird bevorzugt, zwei oder weniger Arten, stärker bevorzugt eine Art eines Vektors zu verwenden.
Wenn außerdem zwei oder mehr Arten von Vektoren die jeweils verschiedene Kopienzahlen haben, verwendet werden, wird bevorzugt, die Verteilung der Gene zwischen einem Vektor mit hoher Kopienzahl und einem Vektor mit niederer Kopienzahl in Abhängigkeit von den Arten der einzuführenden Gene zu bestimmen.
Für die Verfahrensschritte des Isolierens eines Gens, Einführen eines Gens in ein Wirtsbakterium, Gen-Aufbrechen und so weiter können dem Fachmann wohlbekannte übliche Methoden als die Methoden zur Herstellung von chromosomaler DNA, für die Konstruktion einer chromosomalen DNA-Bibliothek, die Hybridisierung, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA, Verdauung und Ligation von DNA, Transformation, Aufbau von als Primer verwende ten Oligonukleotiden und dergleichen angewendet werden. Diese Methoden sind in Sambrook J., Fritsch E. F., and Maniatis T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Zweite Auflage", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) und so weiter beschrieben.
<2> Herstellung von L-Aminosäure unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Bakteriums
Eine L-Aminosäure kann durch Kultivieren des wie vorstehend beschrieben erhaltenen erfindungsgemäßen Bakteriums in einem Medium, unter Bildung und Anreicherung der L-Aminosäure in dem Medium, und Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium, hergestellt werden.
Zur Herstellung einer L-Aminosäure unter Verwendung des erfindungsgemäßen Bakteriums können übliche Medien verwendet werden, die eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und organische Spurennährstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine, wie sie in konventioneller Weise gefordert werden, enthalten. Es kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium verwendet werden. In dem Medium können beliebige Arten von Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen vorliegen, soweit diese von den zu züchtenden Bakterienstämmen ausgenutzt werden können.
Als Kohlenstoffquelle werden Saccharide, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Galactose, Stärkehydrolysat und Melassen verwendet. Organische Säuren, wie Essigsäure und Zitronensäure und Alkohole, wie Ethanol werden ebenfalls für sich oder in Kombination mit anderen Kohlenstoffquellen eingesetzt. Unter diesen werden Glucose und Saccharose bevorzugt.
Als Stickstoffquelle können Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphos phat und Ammoniumacetat, Nitrate und so weiter, verwendet werden.
Als organische Spurennährstoffe können Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren und Nukleinsäuren sowie Pepton, Casaminosäure, Hefeextrakt und Sojabohnenprotein-Zersetzungsprodukt, welches diese enthält, und so weiter, verwendet werden. Wenn eine auxotrophe Mutante verwendet wird, die zum Wachstum eine Aminosäure oder dergleichen benötigt, ist es zu bevorzugen, diesen erforderlichen Nährstoff zur Ergänzung zuzusetzen.
Als anorganische Salze können Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze, Mangansalze und so weiter verwendet werden.
Obwohl die Kultur von der Art des zu verwendenden Bakteriums abhängt, wird normalerweise eine belüftete Kultur durchgeführt, bei der die Fermentationstemperatur auf 20 bis 45°C und der pH auf 5 bis 9 eingestellt werden. Wenn der pH-Wert während der Kultur abfällt, wird Calciumcarbonat zugesetzt oder die Kultur wird mit Alkali, wie Ammoniakgas, neutralisiert. Wenn die Kultur in dieser Weise während etwa 10 bis 120 Stunden durchgeführt wird, wird eine bemerkenswerte Menge L-Glutamin in der Kulturbrühe angereichert.
Als Verfahren zum Gewinnen von L-Aminosäuren aus der Kulturbrühe nach Beendigung der Kultur können bekannte Gewinnungsmethoden, beispielsweise Methoden unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, Ausfällen und so weiter, angewendet werden.
Beispiele
Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert.
<1> Klonen von Genen für Enzyme, die an dem Entner-Doudoroff-Weg beteiligt sind
Das edd-Gen und das eda-Gen, welche für die Enzyme EDD beziehungsweise EDA kodieren, die an dem Entner-Doudoroff-Weg beteiligt sind, wurden aus Escherichia coli, Zymomonas mobilis und so weiter kloniert. Enterobacter agglomerans gehört taxonomisch zu der Gruppe der Enterobakterien und wird als eng verwandt mit Escherichia coli angesehen. Es ist außerdem bekannt, dass Escherichia-coli-Gene in Enterobacter agglomerans exprimiert werden können. Daher wurde beschlossen, das edd-Gen und das eda-Gen aus Escherichia coli zu klonen.
Diese beiden Gene bilden in Escherichia coli ein Operon (J. Bacteriol., 174 (14): 4638–46, Juli 1992). Daher wurden edd-F (SEQ ID Nr. 1) und eda-R (SEQ ID Nr. 2) als Primer ausgestaltet, die gleichzeitig beide Gene amplifizieren können um ein DNA-Fragment, das beide Gene einschließt, durch PCR zu amplifizieren. PCR wurde unter Verwendung von Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) durchgeführt und bestand aus einer einminütigen Reaktion bei 94°C mit anschließenden Reaktionen während 30 Sekunden bei 94°C, während 30 Sekunden bei 60°C und während 3 Minuten bei 72°C, die über 30 Zyklen wiederholt wurden.
Anschließend wurde das erhaltene amplifizierte Fragment vollständig mit den Restriktionsenzymen Sa1I und BamHI verdaut, mit Plasmid pMW219, das vollständig mit den Restriktionsenzymen Sa1I und BamHI verdaut war, ligiert und verwendet, um Escherichia coli JM109 (bezogen von Takara Shuzo) zu transformieren. Fünf Stämme von Klonen, die ein Fragment der gewünschten Größe enthielten, wurden aus den erhaltenen Transformanten selektiert und Plasmide wurden aus diesen Stämmen extrahiert.
Jedes Plasmid wurde mit Hilfe der Elektroporationsmethode (Miller J. H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, S. 279, 1992) in den Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 eingeschleust und die Aktivitäten von EDD und EDA wurden gemessen, um einen Klon zu selektieren, in welchem das edd-Gen und das eda-Gen exprimiert wurden.
Stamm AJ13601 ist ein wie folgt erhaltener Bakterienstamm. Der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde aus Erde als Stamm isoliert, der in einer sauren Umgebung Resistenz gegen L-Glutaminsäure und eine überlegene Wachstumsrate zeigte. Danach wurde von dem Stamm AJ13355 ein Mutantenstamm mit niedriger Schleimbildung abgeleitet und das αKGDH-Gen wurde unterbrochen, um den Stamm AJ13356 zu erhalten. Der Stamm AJ13356 zeigte als Ergebnis des Unterbrechens der αKGDH-E1-Genuntereinheit (sucA) ein Fehlen der αKGDH-Aktivität. Anschließend wurden in den Stamm AJ13356 das Plasmid RSFCPG, welches das Citratsynthasegen (gltA), das Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen (ppc) und das Glutamatdehydrogenase (gdhA)-Gen von Escherichia coli enthielt und das Plasmid pSTVCB, welches das von Brevibakterium lactofermentum abgeleitete gltA-Gen enthielt, eingeschleust, wobei der Stamm SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB erhalten wurde. Aus diesem Stamm wurde der Stamm AJ13601 als Bakterienstamm selektiert, der verbesserte Resistenz gegen L-Glutaminsäure in einer Umgebung mit niederem pH und die beste Wachstumsrate zeigte ( EP 1 078 989 A2 ).
Stämme, die regellos aus den Transformanten, in die in der vorstehend beschriebenen Weise ein Plasmid eingeschleust war, welches die edd- und eda-Genfragmente enthielt, ausgewählt wurden, wurden 15 Stunden in einem flüssigen LBGM9-Medium kultiviert (ein Medium, das 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 5 g/l Glucose enthielt und dem 1/10 Volumenteil von gesondert sterilisiertem 10 × M9 (128 g/l Na₂HPO₄·7H₂O, 30 g/l KH₂PO₄, 5 g/l NaCl, 10 g/l NH₄Cl) zugesetzt war), welches Tetracyclin, Chloramphenicol und Kanamycin jeweils in einer Menge von 12,5 mg/l, 25 mg/l oder 25 mg/l enthielt. Die Zellen wurden aus diesen Kulturbrühen durch Zentrifugieren gewonnen, zweimal mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) und 10 mM MgCl₂ gewaschen und dann in dem gleichen Puffer suspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, 30 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde als rohe Enzymlösung verwendet.
Die Aktivitäten von EDD und EDA wurden gleichzeitig durch Bestimmung der Reaktionsprodukte, welche durch zwei der Enzyme erhalten wurden, mit Hilfe einer fotospektrometrischen Methode bestimmt. Das heißt, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM APAD (Acetylpyridin-adenin-dinukleotid), 5 mM K₂HPO₄, 20 Einheiten Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, 6-Phosphogluconsäure und die rohe Enzymlösung wurden vermischt und der Anstieg der Absorption bei 365 nm wurde gemessen, um das aus 6-Phosphogluconsäure als Substrat gebildete Glyceraldehyd-3-phosphat zu bestimmen. Die gleiche Messung wurde für einen Stamm, in den nur ein Vektor eingeführt worden war, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Es wurde bestätigt, dass alle diese Stämme erhöhte Aktivität besaßen. In dem Stamm mit den höchsten Aktivitäten waren die Aktivitäten etwa 7,2-fach erhöht. Das Plasmid dieses Stammes wurde als pMW-EDDA bezeichnet.
<2> Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines bezüglich des Entner-Doudoroff-Wegs verstärkten Stammes
Danach wurde der Einfluss der Verstärkung des Entner-Doudoroff-Wegs auf die L-Glutaminsäurebildung geprüft.
Der in dem vorstehenden Abschnitt verwendete Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 enthielt zwei Arten von Plasmiden und die Stämme, in die außerdem das edd-Gen und das eda-Gen eingeschleust war, enthielten drei Arten von Plasmiden. Daher mussten der Kultur drei Arten von Mitteln zugesetzt werden und somit war das Wachstum sehr schlecht, d. h. in dem System zur Bestimmung der L-Glutaminsäure-Produktionskultur wurde fast kein Wachstum beobachtet. Daher wurden nur zwei Arten von Plasmiden verwendet, indem ein Citratsynthase(nachstehend auch als "CS" bezeichnet)-Gen von Brevibakterium lactofermentum, das edd-Gen und das eda-Gen in ein Plasmid eingeführt wurden.
Von dem Vektor pSTV28, der für die Konstruktion des Plasmids pSTVCB, welches das CS-Gen von Brevibakterium lactofermentum enthielt, verwendet wurde und dem Vektor pMW219, der zum Klonen des edd-Gens und eda-Gens verwendet wurde, zeigt das erstere eine höhere Kopienzahl. Es wurde berücksichtigt, dass zwar das CS-Gen von Brevibakterium lactofermentum durch den pSTV28-Vektor in dem AJ13601-Stamm verstärkt ist, es aber notwendig war, die exprimierte Menge zur Einführung dieses Gens unter Verwendung von pMW219 zu erhöhen. Daher wurde ein Gen konstruiert, in dem die Promoterregion in dem CS-Gen durch die des CS-Gens von Escherichia coli ersetzt war.
Genauer wurde die Promoterregion in dem CS-Gen durch Verwendung der Primer GLTES1 (SEQ ID Nr. 3) und GLTEB0 (SEQ ID Nr. 4) und des Chromosoms des Stammes Escherichia coli W3110 als Matrix (Templat) amplifiziert. Ferner wurde ein Fragment, das die ORF-Region des CS-Gens enthielt, unter Verwendung der Pri mer GLTBB0 (SEQ ID Nr. 5) und GLTBA1 (SEQ ID Nr. 6) und des Chromosoms des Stammes Brevibakterium lactofermentum 2256 als Templat amplifiziert. Eine Crossover-PCR wurde durchgeführt, indem beide Fragmente als Template und die Primer GLTES2 (SEQ ID Nr. 7) und GLTBA2 (SEQ ID Nr. 8) verwendet wurden, um ein Zielfragment (Target-Fragment) zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI und HindIII verdaut und in die gleiche Stelle von pSTV28 eingeführt, wobei pSTV-C^B(*) erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde mit KpnI und HindIII verdaut und ein Fusions-Genfragment, welches den Promoter des CS-Gens von Escherichia coli und den kodierenden Bereich des CS-Gens von Brevibakterium lactofermentum enthielt, wurde gewonnen und mit T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. Dieses Fusions-Genfragment wurde in die SmaI-Schnittstelle von pMW219 eingefügt, wobei pMW-C^B(*) erhalten wurde. Ferner wurde pMW-EDDA mit BamHI behandelt und mit dem vorstehenden Fusions-Genfragment ligiert und das Ligationsprodukt wurde mit Hilfe von T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen, wobei pMW-C^B(*)·ED erhalten wurde.
Danach wurde AJ13601 über Nacht in einem LBGM9-Flüssigmedium bei 31,5°C geschüttelt, welches in geeigneter Weise so verdünnt war, dass 100 bis 200 Kolonien pro Platte erhalten werden sollten, und auf eine LBGM9-Platte aufgetragen, die 12,5 mg/l Tetracyclin enthielt. Die erschienenen Kolonien wurden auf eine LBGM9-Platte, die 12,5 mg/l Tetracyclin und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, repliziert und ein Stamm, der Chloramphenicol-empfindlich geworden war, wurde gewonnen und als G106S bezeichnet. Der Stamm G106S enthielt nur RSFCPG, enthielt jedoch kein pSTVCB. Stämme, die erhalten wurden, indem pMW-C^B(*) oder pMW-C^B(*)·ED in diesen Stamm eingeführt wurden, wurden als G106S pMW·C^B(*) beziehungsweise G106S pMW-C^B(*)·ED bezeichnet.
Um die Fähigkeit dieser Stämme zur Bildung von L-Glutaminsäure zu bestimmen wurde eine Bestimmungskultur unter Verwendung eines Krugfermenters durchgeführt. Das verwendete Kulturmedium war 300 ml eines Mediums, das 50 g/l Saccharose, 0,4 g/l MgSO₄, 0,1 ml/l GD-113 (Schaumverhütungsmittel), 4 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 4 g/l Hefeextrakt, 10 mg/l FeSO₉·7H₂O, 10 mg/l MnSO₄·4-5H₂O, 0,4 g/l L-Lysin, 0,4 g/l DL-Methionin, 0,4 g/l Diaminopimelinsäure, 12,5 mg/l Tetracyclin und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt. Die Kultur wurde unter Belüftung von 1/1 VVM, Rühren bei 1.300 UpM und einem mit Ammoniak geregelten pH von 6,0 durchgeführt, bis die Saccharose verbraucht war. Die Veränderungen der Absorption bei 660 nm und die produzierten Mengen von L-Glutaminsäure in dem Medium im Verlauf der Zeit sind in 1 gezeigt. Außerdem sind die endgültig produzierten Mengen von L-Glutaminsäure in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Es wurde gezeigt, dass die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Verstärken des Entner-Doudoroff-Wegs verbessert werden konnte, wenn auch die Kultur verzögert war.
<3> Untersuchung der Produktion von Acetoin und 2,3-Butandiol durch einen Stamm mit verstärktem Entner-Doudoroff-Weg
Die vorstehend genannten Stämme G106S pMW·C^B(*) und G106S pMW-C^B(*)·ED wurden in gleicher Weise wie für die Auswertung der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure in <2> kultiviert und die Mengen von Acetoin und 2,3-Butandiol in dem Medium und der Zellen wurden im Verlauf der Zeit bestimmt. Die Messung erfolgte durch Gaschromatografie (Shimadzu Corporation, GC-1700A) unter den folgenden Bedingungen.
Verwendete Kolonne: VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25X32 (0,32 mm × 25M)
Temperatur: Verdampfungskammer: 250°C, Kolonne: 240°C, FID: 250°C
Druck am Kolonneneintritt: 180 kPa
Fließrate des Trägergases: 1,6062 ml/min
Die Ergebnisse sind in 2A (Menge von Acetoin in dem Medium), 2B (Menge von 2,3-Butandiol in dem Medium) und 2C (Gesamtmenge an gebildetem Acetoin und 2,3-Butandiol pro Einheit der Zellen) gezeigt. Es wurde gezeigt, dass die Bildung von Acetoin und 2,3-Butandiol durch Verstärken des Entner-Doudoroff-Wegs erhöht wurde.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zum Produzieren einer L-Aminosäure in einem Medium, um die L-Aminosäure in dem Medium zu produzieren und anzuhäufen, und das Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium umfaßt, wobei der Mikroorganismus ein Gram-negatives Bakterium ist, das den Entner-Doudoroff-Weg aufweist und so modifiziert worden ist, daß die 6-Phosphogluconatdehydrataseaktivität oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolaseaktivität oder beide Aktivitäten verstärkt sind, und die L-Aminosäure unter L-Aminosäuren ausgewählt ist, die über einen Biosyntheseweg unter Verwendung von Brenztraubensäure als Intermediat produziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterium ein Enterobakterium ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bakterium zur Gattung Enterobacter gehört.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die 6-Phosphogluconatdehydrataseaktivität oder die 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconataldolaseaktivität durch Erhöhen der Kopienzahl eines Gens, das für 6-Phosphogluconatdehydratase oder 2-Keto-3-deoxy-phosphogluconataldolase kodiert, oder durch Modifizieren einer Expressionsregulationssequenz des Gens verstärkt wird, so daß die Expression des Gens in einer Zelle des Bakteriums verstärkt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die L-Aminosäure L-Glutaminsäure oder eine L-Aminosäure ist, die über einen Biosyntheseweg unter Verwendung von L-Glutaminsäure als Intermediat oder Amingruppendonor produziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die L-Aminosäure unter L-Glutaminsäure, L-Arginin, L-Glutamin, L-Prolin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin und L-Alanin ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die L-Aminosäure L-Glutaminsäure ist.