KR100638497B1

KR100638497B1 - Ｌ-글루타민산을 생산하는 세균 및 ｌ-글루타민산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100638497B1
Application number: KR1019990008987A
Authority: KR
Inventors: 모리야미카; 이즈이히로시; 오노에이지; 마쓰이가즈히코; 이토히사오; 하라요시히코
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-17
Publication date: 2006-10-26
Also published as: RU2188236C2; PE20000355A1; ES2334592T3; EP0955368A3; BR9901174A; PL332071A1; TWI235177B; US6197559B1; BR9901174B1; US20020004231A1; ID22267A; DE69941756D1; EP0955368A2; US6682912B2; CN1238515C; EP0955368B1; CN1626667A; CN1291026C; PL194140B1; AU2122499A

Abstract

L-글루타민산을 생산하는 방법은 클렙시엘라(klebsiella) 속, 에르위니아(Erwinia) 속 또는 판토아(Pantoea) 속에 속하며, L-글루타민산을 생산하는 능력을 가지는 미생물을 배양 배지에서 배양하고, 배양 배지로부터 이를 회수하는 것으로 구성된다. 사용된 미생물 균주는, L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어서 L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 결손된 균주 또는 L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가된 균주가 바람직하다.

L-글루타민산, 클렙시엘라, 에르위니아, 판토아, 형질전환체, 트랜스포존, 유전자조작, 돌연변이 유발

Description

Ｌ-글루타민산을 생산하는 세균 및 Ｌ-글루타민산을 생산하는 방법 {L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid}

도 1은 gltA 유전자, ppc 유전자, gdhA 유전자를 가지는 플라스미드 pMWCPG의 구조를 나타낸다.

도 2는 gdhA 유전자를 가지는 플라스미드 pMWG의 구조를 나타낸다.

도 3은 gltA 유전자를 가지는 플라스미드 pMWC의 구조를 나타낸다.

도 4는 숙주 범위가 넓은 플라스미드 RSF1010의 복제 오리진 및 테트라사이클린 내성 유전자를 가지는 플라스미드 RSF-Tet의 구조를 나타낸다.

도 5는 숙주 범위가 넓은 플라스미드 RSF1010의 복제 오리진 및 테트라사이클린 내성 유전자, gltA 유전자, ppc 유전자, gdhA 유전자를 가지는 플라스미드 RSFCPG의 구조를 나타낸다.

본 발명은 L-글루타민산을 생산하는 신규한 세균 및 이를 이용하여 발효에 의해 L-글루타민산을 생산하는 방법에 관한 것이다. L-글루타민산은 식품, 약물 등으로써 중요한 아미노산이다.

L-글루타민산은 이를 생산하는 소위 코리네형 L-글루타민산 생산 세균을 이용하여 발효를 통하여 생산되는 것이 일반적인데, 이러한 세균은 브레비박테리움 , 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium) 또는 이의 변이체 속에 속한다["Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, pp.195-215, 1986]. 다른 세균 균주를 이용하여 발효시켜 L-글루타민산을 생산하는 방법으로는 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 페니실리움(Penicillium) 등의 미생물 속(genus)을 이용하는 방법[미국 특허 제3,220,929호], 슈도모나스(Pseudomonas), 아트로박터 (Arthrobacter), 세라티아(Serratia), 캔디다(Candida) 등의 미생물 속을 이용하는 방법[미국 특허 제3,563,857호] 및 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)의 변이 균주를 이용하는 방법[일본 특허 출원 공개 공보(KOKAI) 제93-244970호(1993)] 등이 공지되어 있다.

상기 언급한 미생물을 배양하거나 또는 생산 방법을 개선시켜, L-글루타민산생산성은 상당히 개선되었지만, 상당히 증가할 것으로 예상되는 아미노산 수요를 충족시키기 위해서는 더 저렴하고, 더 효율적인 L-글루타민산의 생산 방법을 개발할 필요가 있다.

본 발명의 목적은 L-글루타민산을 생산하는 능력이 상당히 큰 새로운 세균을 모색하여, 좀더 저렴하게 좀더 효율적으로 L-글루타민산을 생산하는 방법을 개발하는 것이다.

상기 목적을 이루기 위해, 본 발명자들은 기존의 보고된 미생물과는 상이한 L-글루타민산을 생산하는 능력을 보유한 미생물을 찾는 노력을 하였다. 그 결과, 발명자들은 클렙시엘라(Klebsiella) 속 또는 에르위니아(Erwinia) 속에 속하는 미생물에서 유도한 특정 균주가 L-글루타민산을 생산하는 능력이 우수하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은

(1) 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아(Pantoea) 속에 속하고, L-글루타민산을 생산하는 능력을 가지는 미생물;

(2) 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) 또는 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans)인 상기(1)의 미생물;

(3) L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가된 상기 (1) 또는 (2)의 미생물;

(4) L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소가 시트레이트 신타제(이하 "CS"라 칭함), 포스포에놀피루베이트 카복실라제(이하 "PEPC"라 칭함), 글루타메이트 데하이드로게나제(이하 "GDH"라 칭함)로부터 선택되는 하나 이상의 효소인 상기 (3)의 미생물;

(5) L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소가 CS, PEPC 및 GDH 모두를 포함하는 상기(4)의 미생물;

(6) L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어 L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소 활성이 결손되거나 감소된 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 미생물;

(7) L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어 L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소가 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(이하 "αKGDH"라고 칭함)인 상기 (6)의 미생물; 및

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에서 정의한 미생물을 액체 배양 배지에서 배양하고, 배양 배지에 L-글루타민산을 생산하게 하고 축적시켜, 배양 배지로부터 L-글루타민산을 회수하는 것으로 이루어진 L-글루타민산의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 미생물은 L-글루타민산을 생산하는 능력이 상당히 높기 때문에, 공지의 코리네형 L-글루타민산 생산 세균 등의 배양 기술을 이용하여 미생물의 생산 능력을 추가로 증가시키는 것이 가능한 것으로 보이고, 적절한 배양 조건 등을 선택함으로써 좀더 저렴하고 효율적인 L-글루타민산 생산 방법의 개발을 기대할 수 있을 것이다.

본 발명은 하기에서 상세하게 설명한다.

본 발명에 사용될 수 있는 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물의 예는 다음과 같다;

클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)

클렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena)

에르위니아 허비콜라(Erwinia herbicola([이는 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans)로 새로 분류됨]

에르위니아 아나나스(Erwinia ananas)

에르위니아 카티시다(Erwinia cacticida)

에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi)

에르위니아 말로티보라(Erwinia mallotivora)

에르위니아 페르시치누스(Erwinia persicinus)

에르위니아 프시디(Erwinia psidii)

에르위니아 퀘르시나(Erwinia quercina)

에르위니아 라폰티시(Erwinia rhapontici)

에르위니아 루브리패이션스(Erwinia rubrifaciens)

에르위니아 살리시스(Erwinia salicis)

에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora)

판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans)

판토아 디스페르사(Pantoea dispersa)

더욱 바람직하게는, 하기 세균 균주가 적절하다:

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399

에르위니아 허비콜라 IAM1595(판토아 에글로메란스 AJ2666)

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399는 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry]에 1998년 2월 19일자로 기탁되어, 기탁번호 제FERM P-16646호를 받았고, 이는 1999년 1월 11자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁물로 이관되어, 기탁번호 제FERM BP-6616호를 부여받았다. 에르위니아 허비콜라로 분류되는 미생물은 판토아 에글로메란스로 새로 분류된다. 따라서, 에르위니아 허비콜라 IAM1595는 판토아 에글로메란스 AJ2666로 명명되고, 이는 부다페스트 조약하의 국제 기탁물로서 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry]에 1999년 2월 25일자로 기탁되어, 기탁번호 제FERM BP-6660호를 부여받았다.

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399는 일본 훗카이도 삿포로시의 토양에서 분리하였다.

AJ13399의 생리학적 특징은 다음과 같다;

(1) 세포 형: 막대형

(2) 운동성 : 무(無)

(3) 포자 형성 : 무(無)

(4) LabM 영양 한천에서 콜로니 모양 : 원형, 매끄러운 표면, 크림 색, 균일하고 도드라진 반짝거리는 모양

(5) 글루코즈 OF 테스트 : 발효에 대해 양성

(6) 그램 염색 : 음성

(7) 산소에 대한 반응 : 통성 혐기성균

(8) 카탈라제 : 양성

(9) 옥시다제 : 음성

(10) 우레아제 : 양성

(11) 사이토크롬 옥시다제 : 음성

(12) β-갈락토시다제 : 양성

(13) 아르기닌 데하이드라타제 : 음성

(14) 오르니틴 데카복실라제 : 음성

(15) 리신 데카복실라제 : 양성

(16) 트립토판 데아미나제 : 음성

(17) 보게스-프로스카워(Voges-Proskauer) 반응 : 양성

(18) 인돌 생산 : 양성

(19) TSI 배양 배지에서 황화수소 생산 : 음성

(20) 구연산 동화작용 : 양성

(21) m-하이드록시벤젠산 동화작용 : 음성

(22) 겔라틴 액화 : 음성

(23) 당으로부터 산의 생산

글루코즈 : 양성

만니톨 : 양성

람노즈 : 양성

아라비노즈 : 양성

슈크로즈 : 양성

소르비톨 : 양성

이노시톨 : 양성

멜리비오즈 : 양성

아미그달린 : 양성

아도니톨-펩톤-물 : 양성

셀로비오즈-펩톤-물 : 양성

둘시톨-펩톤-물 : 음성

라피노즈-펩톤-물 : 양성

(24) 성장 온도 : 37℃에서는 양호한 성장, 45℃에서는 성장이 불가능함

이와 같은 세균성 성질을 기초로 AJ13399는 클렙시엘라 플란티콜라로 확인된다.

문헌[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed]에는 에르위니아 허비콜라에 대한 기재는 없으며, 에르위니아 허비콜라로 분류되는 미생물은 판토아 에글로메란스로 분류된다. 따라서, 에르위니아 속에 속하는 미생물과 판토아 속에 속하는 미생물은 서로 상당히 밀접한 관계가 있다. 따라서, 본 발명에서는 에르위니아 속 및 판토아 속에 속하는 미생물을 이용할 수 있다.

클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 세균은 엠브덴-마이어호프(Embden-Meyerhof) 경로를 통하여 당 대사를 할 수 있고, 경로에서 생산되는 피루베이트는 호기성 조건하에 트리카복실산 회로에서 산화된다. GDH 또는 글루타민 신테타제/글루타메이트 신타제에 의해 트리카르복실산 회로에서 중간생성물질인 α-케토글루타르산으로부터 L-글루타민산을 생합성할 수 있다. 따라서, 이들 미생물은 동일한 L-글루타민산 합성 경로를 공유하고, 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물은 본 발명에서 단일 개념에 속한다. 따라서, 상기 특정하게 언급한 종 및 균주 이외의 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 미생물은 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하고, L-글루타민산을 생산하는 능력을 가지는 미생물이다. 본원에서 사용하고 있는 표현 "L-글루타민산을 생산하는 능력이 높은"이란 배양하는 동안에 배양 배지내에 L-글루타민산을 축적하는 능력을 가지는 것을 의미한다. L-글루타민산을 생산하는 능력은 자체 특징으로서 야생형 균주에 의해 소유되거나, 배양에 의해 부여되거나 강화된 것일 수 있다. L-글루타민산을 생산하는 능력을 가지고, 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물의 예는 예를 들어, L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성을 증가시키는 미생물과 L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어 L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소 활성이 결손되거나 감소된 미생물을 포함한다. 또한, 미생물의 예로는 추가로 L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가되고, L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어 L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소 활성이 결손되거나 감소된 미생물이 포함된다.

L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소로는 언급한 GDH, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, CS, PEPC, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 프락토즈 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프락토키나제, 글루코즈 포스페이트 이소머라제 등이 있다. 이들 효소 중에서, CS, PEPC 및 GDH 세 종류 중 하나, 두 개 또는 세 가지 모두 바람직하다. 본 발명의 미생물에서, CS, PEPC 및 GDH 세 종류 효소 모두 활성이 증가되는 것이 바람직하다. 미생물의 표적 효소 활성이 증가되었는지 여부는 세균 세포 추출물 또는 정제된 분취물에서 효소 활성을 측정하고, 야생형 또는 모균주에서의 효소 활성과 비교하여 결정할 수 있다.

클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하고, L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소 활성이 증가된 본 발명의 미생물은 예를 들어, 출발 모균주로 상기 미생물을 이용하여 효소를 암호화하는 유전자에 돌연변이가 일어난 변이체 또는 유전자 재조합 균주로서 수득될 수 있다.

예를 들면 CS, PEPC 또는 GDH 활성을 강화시키기 위해, CS, PEPC 또는 GDH을 암호화하는 유전자를 적절한 플라스미드에 클론시키고, 상기 언급한 출발 모균주를 숙주로하여 생성된 플라스미드를 형질도입시킨다. 이로써 CS, PEPC 또는 GDH(이 하 "gltA 유전자", "ppc 유전자" 및 "gdhA 유전자"의 약어로 각각 사용함)을 암호화하는 각 유전자의 복제수가 증가되고, 그 결과 CS, PEPC 및 GDH 활성이 증가된다.

임의 조합에 의해 클론된 gltA 유전자, ppc 유전자, gdhA 유전자에서 선택된 하나, 두 개 또는 세 가지 종류를 상기 언급한 출발 모균주에 도입시킨다. 두 개 또는 세 가지 종류의 유전자를 도입시키는 경우에, 두 개 또는 세 가지 종류의 유전자를 한 종류의 플라스미드에 클론시켜, 숙주에 도입시키거나 이들은 동일한 숙주에 존재할 수 있는 두 개 또는 세 개의 플라스미드에 각각 클론시켜, 숙주로 도입시킨다.

클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물에서 플라스미드가 자가 복제할 수 있다면, 특정 플라스미드에 국한되지는 않는다. 플라스미드를 예로 들면, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 등이 포함된다. 이들 플라스미드 이외에도 파아지 DNA 벡터를 또한 이용할 수도 있다.

예를 들어, 문헌[D.M. Morrison, Methods in Enzymology 68, 326 (1979)]의 방법, 염화칼슘으로 DNA의 수용능 세포에 대한 투과도를 증가시키는 방법[Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)] 등의 방법으로 형질전환을 달성할 수 있다.

숙주로서 출발 모균주의 염색체 DNA에 있는 gltA 유전자, ppc 유전자 및/또는 gdhA 유전자 다수 복사체를 이용하여, CS, PEPC 및 GDH 활성을 또한 증가시킬 수 있다. 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물의 염색체 DNA에 gltA 유전자, ppc 유전자, gdhA 유전자 다수 복사체를 도입시키기 위해, 염색체 DNA에 반복 DNA 같이 다수 복사체로 존재하는 서열 및 전위 인자의 말단부에 존재하는 역 반복체를 이용할 수 있다. 또는, gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자를 운반하는 트랜스포존의 전이를 이용하여 염색체 DNA안에 유전자 다수 복사체를 도입할 수 있다. 이와 같은 기술을 이용하면, 형질전환된 세포에 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자 복사체 수를 증가시키고, 그 결과 CS, PEPC 및 GDH 활성을 증가시킬 수 있다.

유기체가 CS, PEPC 및 GDH 활성을 가지고 있는 한, 복사체 수를 증가시키기 위해 임의 유기체를 gltA 유전자, ppc 유전자, gdhA 유전자 공급원으로 이용할 수 있다. 이와 같은 유기체로는 원핵세포와 같은 세균 예를 들면, 엔테로박터, 클렙시엘라, 에르위니아, 판토아, 세라티아, 에스케리치아, 코리네박테리움 , 브레비박테리움 또는 바실러스 등에 속하는 세균이 바람직하다. 특정 실시예로서, 에스케리치아 콜라이가 언급될 수 있다. gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자는 상기 언급한 미생물의 염색체 DNA에서 수득할 수 있다.

gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자는 CS, PEPC 또는 GDH 활성이 부족한 DNA 단편 보충 요구성 변이체 균주를 분리하여, 전술한 임의 미생물의 염색체 DNA에서 수득할 수 있다. 또는, 에스케리치아, 코리네박테리움 속의 세균의 이들 유전자의 뉴클레오티드 서열이 이미 공지되어 있기 때문에[Biochemistry, Vol. 22, pp. 5243-5249, 1983; J. Biochem. Vol. 95, pp. 909-916, 1984; Gene, Vol. 27, pp. 193-199, 1984; Microbiology, Vol. 140, pp. 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet. Vol. 218, pp. 330-339, 1989; and Molecular Microbiology, Vol. 6, pp. 317-326, 1992], 밝혀진 각각의 뉴클레오티드 서열을 기초하여 합성된 프라이머 및 주형으로 염색체 DNA를 사용하여, PCR을 통하여 유전자를 수득할 수 있다.

상기 언급한 유전자 증폭보다는 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자의 발현을 강화시켜, CS, PEPC 또는 GDH 활성을 또한 증가시킬 수 있다. 예를 들면, gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자의 프로모터를 다른 강력한 프로모터로 대체시킴으로서, 발현을 강화시킬 수 있다. 이와 같은 강력한 프로모터의 예로는 예를 들어, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터 및 λ파아지의 P_R 프로모터와 P_L 프로모터 등을 포함한다. 이와 같이 프로모터가 치환된 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자를 플라스미드내에 클론시키고, 이를 숙주세포로 도입시키거나 또는 반복 DNA, 역 반복체, 트랜스포존 등을 이용하여 숙주 미생물의 염색체 DNA에 도입시킨다.

염색체 상의 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자의 프로모터를 다른 강력한 프로모터로 대체시키거나[제WO87/03006호 및 일본 특허 출원 공개 공보 (KOKAI) 제61-268183호(1986)], 유전자의 각 코딩 서열의 상류에 강력한 프로모터를 삽입하여[문헌 참조: Gene, 29, pp. 231-241, 1984] CS, PEPC 또는 GDH 활성을 또한 강화시킬 수 있다. 특히, 이의 프로모터가 다른 강력한 프로모터 또는 이의 일부를 포함하는 DNA로 대체된 gltA 유전자, ppc 유전자, gdhA 유전자와 염색체 상에서 이에 상응하는 유전자를 상동성 재조합시켜 이들을 얻을 수 있다.

CS, PEPC 또는 GDH 활성이 증가된 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물의 특정 예는 예를 들어, 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399/RSFCPG와 에르위니아 허비콜라 IAM1595/RSFCPG 등이 포함된다.

L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어, L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소의 예는, 예를 들어, αKGDH, 이소시트레이트 리아제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제, L-글루타메이트 데카복실라제, 1-피롤린 데하이드로게나제 등을 포함한다. 이들 효소 중에 αKGDH가 바람직하다.

클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물에서 상기 언급한 효소 활성을 결손시키거나 감소시키기 위해서, 통상의 돌연변이 유발 기술 또는 유전자 조작 기술을 이용하여 효소를 암호화하는 유전자내에 효소 활성의 감소 또는 결손을 일으키는 돌연변이를 도입할 수 있다.

돌연변이 유발 기술의 예로는 예를 들어, X-선 또는 자외선 조사 방법 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등과 같은 돌연변이 유발제 처리 방법이 있다. 돌연변이를 유발시키고자 하는 유전자 위치는 효소 단백질을 암호화하는 영역 또는 프로모터와 같은 발현 조절 영역일 수 있다.

유전자 조작 기술의 예는 예를 들어, 유전자 재조합, 유전자 도입, 세포 융합 등을 포함한다. 예를 들어, 약물 내성 유전자를 표적 유전자에 도입시켜, 기능상 활성이 없는 유전자(결손 유전자)를 만든다. 이어서, 이와 같은 결손 유전자를 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물의 세포내에 도입시키면, 염색체 상의 표적 유전자는 상동성 재조합에 의해 결손 유전자로 대체된다(유전자 파괴).

미생물에서 표적 효소의 활성이 감소하거나 결손되었는지는 세균 세포 추출물의 효소 활성을 측정하거나 또는 추천 균주의 정제 분취물에서 효소 활성을 측정하고, 야생형 또는 모균주의 것과 비교하여 평가할 수 있다. αKGDH 효소 활성은 예를 들어 Reed 등[L.J. Reed and B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61] 등의 방법으로 측정할 수 있다.

표적 효소에 따라, 변이체의 표현형에 기초하여 표적 변이체를 선택할 수 있다. 예를 들어, αKGDH 활성이 결손되거나 감소된 변이체는 글루코즈를 포함하는 최소 배지 또는 유일한 탄소원으로 아세트산 또는 L-글루타민산을 포함하는 최소 배지에서는 성장할 수 없거나 또는 호기성 상태에서 성장 속도가 상당히 감소되는 것을 알 수 있다. 그러나 동일한 조건에서, 글루코즈를 포함하는 최소 배지에 석신산 또는 리신, 메티오닌 및 디아미노피멜레이트를 첨가하면 정상적인 성장 속도를 나타낼 수 있다. 이와 같은 현상에 기초하여, αKGDH 활성이 결손되거나 감소된 변이체를 선택할 수 있다.

상동성 재조합에 기초하여, αKGDH 유전자가 결손된 브레비박테리움 락토퍼멘툼을 생산하는 방법은 문헌[제WO95/34672호]에 기재되어 있고, 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하는 미생물의 경우에도 유사한 방법을 이용할 수 있다.

또한, 유전자 클로닝, DNA 절단 및 연결, 형질전환 등의 방법은 문헌[Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)]을 참고한다.

상기에서 수득한 αKGDH 활성이 결손되거나 감소된 변이체 균주의 예를 들면, 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410이다. 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410은 1998년 2월 19일자로 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry]에 기탁되어, 기탁번호 제FERM P-16647호를 받았고, 1999년 1월 11일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁물로 이관되어 수탁번호 제FERM BP-6617호를 받았다.

클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하고, αKGDH 활성이 감소되거나 결손된 세균 균주 또는 상기된 바와 같이 수득된 CS, PEPC 또는 GDH의 활성이 증가된 세균은 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이 L-글루타민산 생산 능력을 가진다.

에스케리치아 속에 속하는 미생물은 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속과 같이 장내균으로 분류되고, αKGDH 활성이 감소되거나 결손된 균주는 L-글루타민산을 생산하고[일본 특허 출원 공개 공보 제93-244970호(1993)], αKGDH 활성이 감소되거나 결손되고, PEPC, GDH 활성이 증가된 균주는 추가로 증가된 양의 L-글루타민산을 생산할 수 있고[일본 특허 출원 공개 공보 제95-203980호(1995)], 발린 감수성이 있고, CS 및 GDH 활성이 강화된 균주는 L-글루타민산을 생산할 수 있다는 것[제WO97/08294호]이 공지되어 있다.

엔테로박터 속에 속하는 미생물도 유사하게 장내균으로 분류되기 때문에, 본 발명자들은 αKGDH 활성이 감소되거나 결손된 균주 또는 PEPC, GDH 및 CS 활성이 증가된 균주는 L-글루타민산을 생산할 수 있다는 것을 밝혀냈다[일본 특허 출원 제98-69068호(1998)].

추가로, 또한 세라티아 속에 속하는 미생물의 경우에도, 본 발명자들은 PEPC, GDH 및 CS 활성이 강화된 균주는 L-글루타민산을 생산할 수 있다는 것을 밝혀냈다[일본 특허 출원 제98-69068호(1998)].

이와 같은 사실로, 실시예에서 설명하는 균주 이외에 클렙시엘라 속, 에르위니아 속, 판토아 속, 에스케리치아 속, 엔테로박터 속 또는 세라티아 속에 속하는 세균에 있어서, αKGDH 활성이 감소되거나 결손된 균주, 또는 PEPC, GDH 및 CS 활성이 증가된 균주는 L-글루타민산을 생산할 수 있다는 것을 쉽게 예상할 수 있다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, αKGDH을 제거하여 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399에 L-글루타민산을 생산하는 능력을 부여할 수 있다는 사실은 클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속의 다른 세균에도 적용할 수 있다는 것을 강력하게 지지하고 있는 것이다.

클렙시엘라 속, 에르위니아 속 또는 판토아 속에 속하고, 액체 배양 배지에서 L-글루타민산을 생산하는 능력을 가지는 미생물을 배양하여, 배지에 L-글루타민산을 축적하도록 하여 배양 배지로부터 이를 회수하여 L-글루타민산을 생산할 수 있다.

배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기염 뿐만 아니라 아미노산, 비타민 등과 같은 유기 영양소를 포함하는 통상적인 영양 배지일 수 있다. 이는 합성 배지 또는 천연 배지일 수 있다. 배양된 미생물이 영양소를 이용할 수 있는 한, 임의 탄소원 및 질소원을 배양 배지로 사용할 수 있다.

탄소원은 글루코즈, 글리세롤, 프락토즈, 수크로즈, 말토즈, 만노즈, 갈락코즈, 전분 수화물, 당밀 등과 같은 탄수화물일 수 있다. 또한, 아세트산 및 시트르산과 같은 유기산을 단독 또는 다른 탄소원과 복합하여 사용할 수 있다.

질소원은 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄 및 아세테이트 암모늄과 같은 암모늄 염, 질산염 등이 될 수 있다.

유기 미량 영양물로는, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 펩톤, 카사미노산, 이스트 추출물, 콩 단백질 분해산물 등을 포함하는 물질을 이용할 수 있는데, 성장을 위해 아미노산 등을 요구하는 영양요구성 변이체를 이용하는 경우에 요구하는 영양소를 보충해주어야 한다.

무기염으로는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을 이용한다.

배양 조건으로는, 20 내지 42℃, pH 4 내지 8에서, 호기성 조건하에서 배양할 수 있다. 10시간 내지 4일간 배양을 지속하여, 액체 배양 배지에 상당량의 L-글루타민산을 축적시킬 수 있다.

배양이 완료된 후에, 배양 배지에 축적된 L-글루타민산은 공지의 방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어, 세포를 제거한 후에 배지를 농축시켜, 생성물을 결정화시키고, 이온 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 설명을 한다.

(1) gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 가지는 플라스미드 작제

gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 가지는 플라스미드 작제하는 과정은 도 1, 2 및 3에서 설명한다.

에스케리치아 콜라이에서 유도되는 gdhA 유전자를 가지는 플라스미드 pBRGDH[일본 특허 출원 공개 공보(KOKAI) 제95-203980호(1995)]를 HindIII와 SphI로 절단하고, 양 말단부는 T4 DNA 폴리머라제를 이용하여 평활-말단화시킨다. 그 다음, gdhA 유전자를 포함하는 DNA 단편은 정제하여 수거한다. 한편, 에스케리치아 콜라이로부터 유도된 gltA 유전자와 ppc 유전자를 가지는 플라스미드 pMWCP[제WO97/08294호]는 XbaI으로 절단하고, 양 말단부를 T4 DNA 폴리머라제를 이용하여 평활-말단화시킨다. 이들은 상기 정제된 gdhA 유전자를 가지는 DNA 단편과 혼합하고 T4 리가제로 연결하여 플라스미드 pMWCPG를 작제하며, 이 플라스미드는 gdhA 유전자를 추가로 가지는 플라스미드 pMWCP에 상응한다(도 1).

pBRGDH를 HindIII와 SalI으로 절단하여 수득한 gdhA 유전자를 가지는 DNA 단편을 정제하고 수득하여, 플라스미드 pMW219(Nippon Gene에서 구입)의 HindIII-SalI부위에 도입시켜, 플라스미드 pMWG를 수득한다(도 2). 추가로, 에스케리치아 콜라이에서 유도된 gltA 유전자를 가지는 플라스미드 pTWVC[제WO97/08294호]를 HindIII와 EcoRI으로 절단하고, gltA 유전자를 가지는 DNA 단편을 정제하고 회수하여, 플라스미드 pMW219의 HindIII와 EcoRI 부위에 삽입시켜, 플라스미드 pMWC를 수 득한다(도 3).

동시에, 숙주 범위가 넓은 플라스미드 RSF1010[일본 특허 출원 공개 공보(KOKAI) 제96-047397호(1996)]의 복제 오리진을 가지는 플라스미드 pVIC40를 NotI로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, PstI 절단하여 수득한 생성물과, pBR322를 EcoT141로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, PstI 절단하여 수득된 생성물을 혼합시키고, T4 DNA 리가제로 연결하여, RSF1010 복제 오리진 및 테트라사이클린 내성 유전자를 가지는 플라스미드 RSF-Tet를 수득한다(도 4).

그 다음, pMWCPG는 EcoRI와 PstI로 절단하여, gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 가지는 DNA 단편을 정제하여 회수한다. 마찬가지로, RSF-Tet는 EcoRI과 PstI로 절단하고, RSF1010 복제 오리진을 가지는 DNA 단편을 정제하여 회수한다. 이들 DNA 단편을 혼합시켜, T4 리가제로 연결시켜 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 가지는 RSF-Tet로 구성되는 플라스미드 RSFCPG를 수득한다(도 5). 생성 플라스미드 RSFCPG에 의한 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자의 발현은 gltA 유전자, ppc 유전자 또는 gdhA 유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이의 영양요구성 및 각 효소 활성 측정에 근거하여 확인할 수 있다. 마찬가지로, pMWG 또는 pMWC에 의한 gdhA 유전자 또는 gltA 유전자의 발현은 gdhA 유전자 또는 gltA 유전자가 없는 에스케리치아 영양요구성 보충 및 각 효소 활성 측정에 근거하여 확인할 수 있다.

(2) 클렙시엘라 세균 속 또는 에르위니아(판토아) 세균 속내로 RSFCPG, pMWC 및 pMWG의 도입 및 L-글루타민산 생산성 평가

에르위니아 허비콜라 IAM1595(판토아 에글로메란스 AJ2666)와 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399에 플라스미드 RSFCPG, pMWC 및 pMWG를 전기천공법으로 형질도입시켜, 테트라사이클린 내성을 나타내는 형질전환체를 수득한다[Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992].

형질전환체 각각 및 모균주는 글루코즈 40g/ℓ, 황산 암모늄 20g/ℓ, 헵타하이드레이트 황산 마그네슘 0.5g/ℓ, 디하이드로겐포스페이트 칼륨 2g/ℓ, 염화나트륨 0.5g/ℓ, 헵타하이드레이트 염화칼슘 0.25g/ℓ, 헵타하이드레이트 황화철 0.02g/ℓ, 테트라하이드레이트 황화 망간 0.02g/ℓ, 디하이드레이트 황화아연 0.72㎎/ℓ, 펜타하이드레이트 황화 구리 0.64㎎/ℓ, 헥사하이드레이트 염화 코발트 0.72㎎/ℓ, 붕소산 0.4㎎/ℓ, 디하이드레이트 몰리베이트 나트륨 1.2㎎/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, 탄산칼슘 30g/ℓ를 포함하는, 배양배지 5㎖를 담고 있는 50㎖ 용적의 시험관에 접종을 시키고, 배양 배지에 포함된 글루코즈가 모두 소비될 때 까지 37℃에서 교반하면서 배양한다. 형질전환체 배양 배지에 테트라사이클린 25㎎/ℓ를 첨가한다. 배양이 종료된 후에, 배양 배지에 축적된 L-글루타민산을 측정한다. 그 결과는 표 1에 나타낸다.

축적된 L-글루타민산 양

세균 균주	L-글루타민산 축적량
IAM1595	0.0 g/ℓ
IAM1595/RSFCPG	5.0
AJ13399	0.0
AJ13399/RSFCPG	3.1
AJ13399/pMWC	2.5
AJ13399/pMWG	0.8
배양배지 단독	0.2

에르위니아 허비콜라 IAM1595와 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399는 L-글루타민산을 축적하지 않지만, RSFCPG을 도입시켜, CS, PEPC 및 GDH 활성이 강화된 균주는 L-글루타민산을 각각 5.0g/ℓ 및 3.1g/ℓ씩 축적시킨다. CS 활성만 증폭된 AJ13399 균주는 L-글루타민산 2.5g/ℓ를 축적하지만, GDH 활성만 증폭된 균주는 L-글루타민산 0.8 g/ℓ를 축적시킨다.

(3) 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399의 αKGDH 유전자 일부를 가지는 단편의 클로닝

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399의 αKGDH 유전자 일부를 가지는 단편의 클로닝은 뉴클레오티드 서열이 이미 보고된 바 있는, 즉, 아조토박터 비네란디(Azotobacter vinelandii), 바실러스 서브틸리스, 에스케리치아 콜라이, 코리네박테리움 글루타미쿰, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 사람 및 사카로마이세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisae)[Eur. J. Biochem. Vol. 187, pp.235-239, 1990; Mol. Gen. Genet. Vol. 234, pp.285-296, 1992; Eur. J. Biochem. Vol. 141, pp.351-359, 1984; Microbiology, Vol. 142, pp.3347-3354, 1994; Science, Vol. 269, pp.496-512, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 89, pp.1963-1967, 1992; and Mol. Cel. Biol. Vol. 9, pp.2695-2705, 1989] 등 유기체의 αKGDH 유전자 상동 부분의 뉴클레오티드 서열로 된 올리고뉴클레오티드를 이용하고, 프라이머로는 EcoRI 제한 부위를 이용하여, PCR을 수행한다.

특히, 프라이머는 다음과 같은 서열을 이용한다;

프라이머 1

5' CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA 3'(서열 1)

프라이머 2

5' GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC 3'(서열 2)

PCR의 주형으로 이용된 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399의 염색체 DNA는 에스케리치아 콜라이로부터 염색체 DNA를 추출하는데 이용된 통상의 방법으로 분리할 수 있다[Seibutsu Kogaku Jikken-sho (Textbook of Bioengineering Experiments), by the Society of Fermentation and Bioengineering, Japan, p.97-98, Baifukan, 1992].

PCR은 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 73℃에서 3분으로 이루어진 사이클을 30회 반복하여 수행하고, 생성된 DNA 단편은 EcoRI으로 절단하여, EcoRI으로 절단된 벡터 플라스미드 pT7Blue에 삽입시켜, 재조합 플라스미드 pT7KP를 수득한다. 이용된 벡터 플라스미드 pT7Blue(암피실린 내성)은 노바젠(Novagen)에서 시판하는 것이 다.

클론된 단편의 DNA 뉴클레오티드 서열 및 이 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열 3에 나타낸다. 동일한 아미노산 서열은 단독으로 서열 4에 나타낸다. 이 서열은 에스케리치아 콜라이의 αKGDH-E1 서브 유니트 유전자(이하 "sucA 유전자"라고 칭함)와 82.3% 상동성을 나타내며, 이는 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399의 sucA 유전자의 일부분임을 명확하게 입증한다. 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드에서, 뉴클레오티드 18 내지 1659는 sucA 유전자에서 유도된 것이고, 뉴클레오티드 0 내지 17과 1660 내지 1679는 프라이머에서 유도된 것이다.

(4)클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399에서 유도한 αKGDH이 결손된 균주 획득

상기된 바와 같이 수득된 클렙시엘라 플란티콜라의 sucA 유전자의 일부를 가지는 단편을 이용하여, 상동성 재조합을 통하여, αKGDH가 결손된 클렙시엘라 플란티콜라 균주를 수득한다.

우선, pT7KP를 BstEII로 절단하고, pNEO(Pharmacia에서 구입)로부터 PCR에 의해 클론되고 이의 양 말단에 BstEII 제한 부위가 도입된 카나마이신 내성 유전자 단편을 이 절단 부위에 도입하여 플라스미드 pT7KPKm을 수득하며, 이때 카나마이신 내성 유전자는 클렙시엘라 플란티콜라의 sucA 유전자의 중앙 부분에 삽입된다.

카나마이신 내성 유전자를 클로닝하는데 이용된 프라이머는 다음과 같다;

(프라이머 3)

5' TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT 3' (서열 5)

(프라이머 4)

5' CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG 3' (서열 6)

그 다음, pT7KPKm을 KpnI으로 절단하고, pBR322(Takara Shuzo에서 구입)로부터 PCR에 의해 클론되고 이의 양 말단에 KpnI 제한 부위가 도입된 테트라사이클린 내성 유전자 단편을 이 절단 부위에 도입하여 플라스미드 pT7KPKmTc를 수득하며, 이때 카나마이신 내성 유전자는 삽입된 테트라사이클린 내성 유전자 인접 서열과 함께 클렙시엘라 플란티콜라의 sucA 유전자의 중앙 부분에 삽입된다.

테트라사이클린 내성 유전자의 클로닝에 이용되는 프라이머는 다음과 같다;

(프라이머 5)

5' GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG 3' (서열 7)

(프라이머 6)

5' GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG 3' (서열 8)

연속하여, 플라스미드 pT7KPKmTc를 SacI와 XbaI으로 절단하여, 클렙시엘라 플란티콜라의 sucA 유전자의 중앙 부분에 삽입된 카나마이신 내성 유전자와 삽입된 테트라사이클린 내성 유전자 인접 서열을 가지는 DNA 단편을 잘라내고, 이를 SacI와 XbaI으로 절단된 그램-음성 세균 염색체-삽입된 플라스미드 벡터 pGP704[(Marta Herrero et al., Journal of Bacteriology, 1990, 172, p.6557-6567]에 삽입하여 플라스미드 pUTONOTK를 수득한다.

상기한 바와 같이 수득한 플라스미드 pUTONOTK를 이용하여, 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399를 전기천공법으로 형질전환시키고, sucA 유전자 단편의 상동성 재조합에 의해 염색체 내로 플라스미드 pUTONOTK가 삽입된 균주를 테트라사이클린 및 카나마이신 내성에 근거하여 선별한다. 이들 균주로부터, 염색체 상의 sucA 유전자가 중앙부분에 카나마이신 내성 유전자가 삽입된 sucA 유전자로 대체된 sucA가 결손된 클렙시엘라 플란티콜라[Klebsiella planticola] AJ13410을 테트라사이클린 감수성 및 카나마이신 내성에 근거하여 선별할 수 있다..

상기한 바와 같이 수득된 AJ13410 균주가 αKGDH 활성을 갖지 않는다는 것을 확인하기 위해, 이 효소 활성은 리드[L.J. Reed and B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61]의 방법으로 결정한다. 그 결과로서, 표 2에서 나타낸 바와 같이 AJ13410에서는 αKGDH 활성이 검출되지 않으며, 따라서, 이 균주는 원하는 바와 같이 sucA가 결핍되어 있다는 것이 확인된다.

αKGDH 활성

세균 균주	αKGDH 활성(△ABS/분/㎎ 단백질)
AJ13399	0.101
AJ13410	<0.002

(5) αKGDH이 결손된 클렙시엘라 플란티콜라의 L-글루타민산 생산성 평가

AJ13399와 AJ13410 각 균주를 글루코즈 40g/ℓ, 황산 암모늄 20g/ℓ, 헵타하이드레이트 황산 마그네슘 0.5g/ℓ, 디하이드로겐포스페이트 칼륨 2g/ℓ, 염화나트륨 0.5g/ℓ, 헵타하이드레이트 염화칼슘 0.25g/ℓ,헵타하이드레이트 황화철 0.02g/ ℓ, 테트라하이드레이트 황화 망간 0.02g/ℓ, 디하이드레이트 황화아연 0.72㎎/ℓ, 펜타하이드레이트 황화 구리 0.64㎎/ℓ, 헥사하이드레이트 염화 코발트 0.72㎎/ℓ, 붕소산 0.4㎎/ℓ, 디하이드레이트 몰리베이트 나트륨 1.2㎎/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, 탄산칼슘 30g/ℓ, L-리신 모노하이드로클로라이드 200㎎/ℓ, L-메티오닌 200㎎/ℓ, DL-α,ε-디아미노피멜린산(DAP)으로 이루어지는 배양 배지 20㎖를 포함하는 500㎖ 용적의 시험관에 접종을 시키고, 배양 배지에 포함된 글루코즈가 모두 소비될 때까지 37℃에서 교반하면서 배양한다. 배양을 완료한 후에, 배양 배지에 축적된 L-글루타민산과 α-케토글루타르산(이하 "αKG"로 칭함)을 측정한다. 그 결과는 표 3에 나타낸다.

L-글루타민산과 αKG 축적량

세균 균주	L-글루타민산 축적량	αKG 축적량
AJ13399	0.0 g/ℓ	0.0 g/ℓ
AJ13410	12.8	1.5

αKGDH 활성이 결손된 AJ13410 균주는 L-글루타민산 12.8g/ℓ를 축적하고 동시에 αKG 1.5g/ℓ를 축적한다.

(6) αKGDH가 결손된 클렙시엘라 플란티콜라내로의 RSFCPG 도입 및 L-글루타민산 생산성 평가

AJ13410 균주를 RSFCPG로 형질전환시키고, 생성된 RSFCPG가 도입된 균주 AJ13410/RSFCPG를 글루코즈 40g/ℓ, 황산 암모늄 20g/ℓ, 헵타하이드레이트 황산 마그네슘 0.5g/ℓ, 디하이드로겐포스페이트 칼륨 2g/ℓ, 염화나트륨 0.5g/ℓ, 헵타하이드레이트 염화칼슘 0.25g/ℓ, 헵타하이드레이트 황화철 0.02g/ℓ, 테트라하이드레이트 황화 망간 0.02g/ℓ, 디하이드레이트 황화아연 0.72㎎/ℓ, 펜타하이드레이트 황화 구리 0.64㎎/ℓ, 헥사하이드레이트 염화 코발트 0.72㎎/ℓ, 붕소산 0.4㎎/ℓ, 디하이드레이트 몰리베이트 나트륨 1.2㎎/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, 테트라사이클린 25㎎/ℓ, 탄산칼슘 30g/ℓ, L-리신 모도하이드로클로라이드 200㎎/ℓ, L-메티오닌 200㎎/ℓ, DL-α,ε-디아미노피멜린산(DAP)으로 이루어지는 배양 배지 20㎖를 포함하는 500㎖ 용적의 시험관에 접종을 시키고, 배양 배지에 포함된 글루코즈가 모두 소비될 때까지 37℃에서 교반하면서 배양한다. 배양을 완료한 후에, 배양 배지에 축적된 L-글루타민산과 αKG를 측정한다. 그 결과는 표 4에 나타낸다.

L-글루타민산과 αKG 축적양

세균 균주	L-글루타민산 축적량	αKG 축적량
AJ13410	12.8 g/ℓ	1.5 g/ℓ
AJ13410/RSFCPG	24.2	0.0

RSFEPG를 도입하여, CS, PEPC 및 GDH 활성이 증폭된 균주의 경우에, αKG 축적량이 줄고, L-글루타민산 축적량은 추가로 개선되었다.

본 발명의 미생물은 L-글루타민산을 생산하는 능력이 상당히 높기 때문에, L-글루타민산을 생산하는 공지의 L-글루타민산 생산 세균 등을 이용하여 미생물의 생산능력을 추가로 증가시키는 것이 가능하고, 적절한 배양 조건 등을 선택함으로써 좀더 저렴하고 효율적인 L-글루타민산 생산 방법을 기대할 수 있다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid <130> 5-1998-096241-9 <150> JP 98-69106 <151> 1998-03-18 <150> JP 98-224909 <151> 1998-08-07 <160> 8 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ccgggaattc ggtgacgtna artayca 27 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggcgaattcg ggaacgggta sagytgytc 29 <210> 3 <211> 1679 <212> DNA <213> Klebsiella planticola <220> <221> CDS <222> (1)..(1679) <400> 3 ggt gac gtg aaa tat cac atg ggc ttc tct tct gac atg gaa acc gaa 48 Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp Met Glu Thr Glu 1 5 10 15 ggc ggc ctg gtg cac ctg gcg ctg gcg ttt aac ccg tca cac ctc gaa 96 Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu 20 25 30 atc gtc agc ccg gtg gtt atc ggg tcg gtt cgc gcg cgt ctc gat cgt 144 Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg 35 40 45 ctc gac gag ccg agc agc aat aaa gtg ctg ccg att act atc cac ggc 192 Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly 50 55 60 gac gcc gca gtg acg ggt cag ggc gtg gtt cag gaa acc ctg aac atg 240 Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu Thr Leu Asn Met 65 70 75 80 tcc aag gcg cgt ggc tac gaa gtg ggc gga acc gta cgt atc gtt atc 288 Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile 85 90 95 aac aac cag gtg ggc ttc act acc tcg aac ccg ctg gat gcg cgc tcc 336 Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser 100 105 110 acg cca tac tgc acc gat atc ggt aaa atg gtt cag gcg ccg atc ttc 384 Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln Ala Pro Ile Phe 115 120 125 cac gtg aac gcg gac gat ccg gaa gcc gtt gct ttc gtt acc cgc ctg 432 His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu 130 135 140 gcg ctg gat ttc cgt aat acc ttc aaa cgc gat gtc ttc atc gac ctg 480 Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu 145 150 155 160 gtg tgc tac cgc cgt cac ggc cat aac gaa gcc gac gag ccg agc gca 528 Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu Pro Ser Ala 165 170 175 acg cag ccg ctg atg tat cag aaa atc aaa aaa cat ccg acc ccg cgc 576 Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His Pro Thr Pro Arg 180 185 190 aaa atc tac gcc gac aaa ctt gag cag gac aaa gtg tcg acc ctg gaa 624 Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Asp Lys Val Ser Thr Leu Glu 195 200 205 gat gcg acc gaa ctg gtt aac ctc tat cgt gat gcg ctg gat gcc ggc 672 Asp Ala Thr Glu Leu Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly 210 215 220 gaa tgc gtg gtt gag gaa tgg cgt ccg atg aac ctg cac tcc ttt acc 720 Glu Cys Val Val Glu Glu Trp Arg Pro Met Asn Leu His Ser Phe Thr 225 230 235 240 tgg tca ccg tac ctc aac cac gag tgg gat gag agc tac ccg agt aaa 768 Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Ser Tyr Pro Ser Lys 245 250 255 gtc gag atg aaa cgt ctg cag gag ctg gct aaa cgc att agc act gtg 816 Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Val 260 265 270 ccg gac agc att gaa atg cag tct cgc gtg gcg aag att tat ggc gat 864 Pro Asp Ser Ile Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp 275 280 285 cgc cag gcg atg gcc gcc ggc gag aag ctg ttc gac tgg ggg gcg gcg 912 Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Ala Ala 290 295 300 gaa aac ctg gct tac gcc acg ctg gtt gat gaa ggg att ccg att cgc 960 Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Ile Arg 305 310 315 320 ctg tcc ggt gaa gac tcc ggt cgc ggt acg ttc ttc cac cgc cat tcc 1008 Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ser 325 330 335 gtg att cat aac cag gtg aac ggt tcg acc tac acg ccg ctg cag cat 1056 Val Ile His Asn Gln Val Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gln His 340 345 350 gtg cat aac ggc cag gag cat ttc aaa gtc tgg gac tcc gtg ctt tct 1104 Val His Asn Gly Gln Glu His Phe Lys Val Trp Asp Ser Val Leu Ser 355 360 365 gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttc gaa tac ggc tac gcc act gcg gaa ccg 1152 Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro 370 375 380 cgc acc ctg act atc tgg gaa gcg cag ttc ggt gac ttt gct aac ggc 1200 Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly 385 390 395 400 gct caa gtg gtg atc gat cag ttc atc agc tcc ggc gag cag aag tgg 1248 Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gln Lys Trp 405 410 415 ggc cgg atg tat ggc ctg gtc atg ctg ctg ccg cac ggc tac gaa ggc 1296 Gly Arg Met Tyr Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly 420 425 430 cag ggc ccg gag cac tcc tcc gcg cgt ctg gaa cgc tat ctg cag ctg 1344 Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gln Leu 435 440 445 tgt gct gaa cag aat atg cag gtt tgt gtg cca tcg act ccg gct cag 1392 Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro Ser Thr Pro Ala Gln 450 455 460 gtt tac cac atg ctg cgt cgt cag gcg ctg cgc ggt atg cgt cgt ccg 1440 Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro 465 470 475 480 ctg gtg gtg atg tcg ccg aaa tct ctg ctg cgc cat ccg ctg gcg gtc 1488 Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val 485 490 495 tcc agc ctg gac gag ctg gcg aac ggc acc ttc ctg ccg gcc atc ggt 1536 Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly 500 505 510 gaa atc gat gac ctc gac ccg aaa gcg gtg aag cgt gtt gtc ctg tgc 1584 Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Lys Ala Val Lys Arg Val Val Leu Cys 515 520 525 tct ggt aag gtt tat tac gat ctg ctg gaa caa cgc cgt aag aac gac 1632 Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg Arg Lys Asn Asp 530 535 540 caa aaa gat gtc gct atc gtg cgt ata gaa caa ctg tac ccg ttc cc 1679 Gln Lys Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu Tyr Pro Phe 545 550 555 <210> 4 <211> 559 <212> PRT <213> Klebsiella planticola <400> 4 Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp Met Glu Thr Glu 1 5 10 15 Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu 20 25 30 Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg 35 40 45 Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly 50 55 60 Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu Thr Leu Asn Met 65 70 75 80 Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile 85 90 95 Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser 100 105 110 Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln Ala Pro Ile Phe 115 120 125 His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu 130 135 140 Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu 145 150 155 160 Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu Pro Ser Ala 165 170 175 Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His Pro Thr Pro Arg 180 185 190 Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Asp Lys Val Ser Thr Leu Glu 195 200 205 Asp Ala Thr Glu Leu Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly 210 215 220 Glu Cys Val Val Glu Glu Trp Arg Pro Met Asn Leu His Ser Phe Thr 225 230 235 240 Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Ser Tyr Pro Ser Lys 245 250 255 Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Val 260 265 270 Pro Asp Ser Ile Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp 275 280 285 Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Ala Ala 290 295 300 Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Ile Arg 305 310 315 320 Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ser 325 330 335 Val Ile His Asn Gln Val Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gln His 340 345 350 Val His Asn Gly Gln Glu His Phe Lys Val Trp Asp Ser Val Leu Ser 355 360 365 Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro 370 375 380 Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly 385 390 395 400 Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gln Lys Trp 405 410 415 Gly Arg Met Tyr Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly 420 425 430 Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gln Leu 435 440 445 Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro Ser Thr Pro Ala Gln 450 455 460 Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro 465 470 475 480 Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val 485 490 495 Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly 500 505 510 Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Lys Ala Val Lys Arg Val Val Leu Cys 515 520 525 Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg Arg Lys Asn Asp 530 535 540 Gln Lys Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu Tyr Pro Phe 545 550 555 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tactgggtca cctgacagct tatcatcgat 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgttcggtga ccaccaaagc ggccatcgtg 30 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggggtaccca aataggcgta tcacgag 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggggtacccg cgatggatat gttctg 26

Claims

시트레이트 신타제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 및 글루타메이트 데하이드로게나제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소의 활성이 증가된, 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 에르위니아(Erwinia) 속 또는 판토아(Pantoea) 속에 속하는 L-글루타민산 생산능을 갖는 미생물.
제1항에 있어서, 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) 또는 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans)인 미생물.
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제1항에 있어서, L-글루타민산 생합성 반응을 촉매하는 효소가 시트레이트 신타제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 및 글루타메이트 데하이드로게나제 모두를 포함하는 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어 L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 결손되는 미생물.
제6항에 있어서, L-글루타민산 생합성 경로에서 분기되어 L-글루타민산 이외의 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 효소가 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제인 미생물.
제1항 또는 제2항에서 정의한 미생물을 액체 배양 배지에서 배양하여 L-글루타민산을 생산하고 이를 축적시킨후, 배양 배지로부터 L-글루타민산을 회수함을 포함하는, L-글루타민산의 생산 방법.