PL194140B1 - Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego - Google Patents

Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego

Info

Publication number
PL194140B1
PL194140B1 PL332071A PL33207199A PL194140B1 PL 194140 B1 PL194140 B1 PL 194140B1 PL 332071 A PL332071 A PL 332071A PL 33207199 A PL33207199 A PL 33207199A PL 194140 B1 PL194140 B1 PL 194140B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
glutamic acid
gene
leu
val
ala
Prior art date
Application number
PL332071A
Other languages
English (en)
Other versions
PL332071A1 (en
Inventor
Mika Moriya
Hiroshi Izui
Eiji Ono
Kazuhiko Matsui
Hisao Ito
Yoshihiko Hara
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of PL332071A1 publication Critical patent/PL332071A1/xx
Publication of PL194140B1 publication Critical patent/PL194140B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/18—Erwinia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/22—Klebsiella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/847—Erwinia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/852—Klebsiella

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Mikroorganizm nalezacy do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea wy- twarzajacy kwas L-glutaminowy i posiadajacy rekombinacyjny gen kodujacy co najmniej jeden enzym wybrany z grupy obejmujacej syntaze cytrynianowa, karboksylaze fosfoenolopirogronianowa i dehy- drogenaze glutaminianowa. 2. Mikroorganizm wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jest nim Pantoea agglomerans. 8. Sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego, w którym hoduje sie mikroorganizm w plynnej pozywce wytwarzajac i gromadzac kwas L-glutaminowy, po czym wyodrebnia sie kwas L-glutaminowy z pozywki hodowlanej, znamienny tym, ze hoduje sie mikroorganizm nalezacy do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea wytwarzajacy kwas L-glutaminowy i posiadajacy rekombina- cyjny gen kodujacy co najmniej jeden enzym wybrany z grupy obejmujacej syntaze cytrynianowa, karboksylaze fosfoenolopirogronianowa i dehydrogenaze glutaminianowa. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowa bakteria wytwarzająca kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego z zastosowaniem fermentacji przy wykorzystaniu wymienionej bakterii. Kwas L-glutaminowy jest ważnym aminokwasem znajdującym zastosowanie m.in. jako materiał pokarmowy i składnik farmaceutyków.
Kwas L-glutaminowy wytwarzany jest zwyczajowo sposobami fermentacyjnymi z wykorzystaniem tak zwanych bakterii podobnych do bakterii maczugowatych wytwarzających L-glutaminian i należących zasadniczo do rodzaju Brevibacterium, Corynebacterium i Microbacterium lub ich odmiany („Amino Acids Fermentation”, Gakkai Shuppan Ctr, str. 195-215, 1986). Kwas L-glutaminowy można wytwarzać sposobem fermentacyjnym z wykorzystaniem innych szczepów bakteryjnych. Itak, znane są sposoby wykorzystujące mikroorganizmy należące do rodzaju Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida i podobne (Patent USA nr 3,563,857), sposoby wykorzystujące szczepy Escherichia coli (Japońskie Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr 5-244970 (1993) i podobne.
Jakkolwiek zwiększono produktywność L-glutaminianu poprzez odpowiednie hodowanie wspomnianych wyżej mikroorganizmów lub ulepszenie sposobów wytwarzania, nadal istnieje potrzeba rozwoju mniej kosztownych i bardziej wydajnych sposobów wytwarzania kwasu L-glutaminowego w celu sprostania oczekiwanemu, znacznemu zwiększeniu zapotrzebowania na wspomniany aminokwas.
Celem wynalazku jest znalezienie nowej bakterii wytwarzającej kwas L-glutaminowy, posiadającej wysoką produktywność kwasu L-glutaminowego, a zatem wypracowanie bardziej tanich i bardziej efektywnych sposobów wytwarzania L-glutaminianu.
W celu osiągnięcia przedstawionego powyżej celu poszukiwano intensywnie oraz badano mikroorganizmy obdarzone zdolnością do wytwarzania kwasu L-glutaminowego, inne niż dotychczas znane. W wyniku poszukiwań znaleziono pewne szczepy pochodzące z mikroorganizmów należących do rodzaju Klebsiella lub Erwinia, wykazujące wysoką zdolność do wytwarzania L-glutaminianu.
Mikroorganizm według wynalazku należy do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea i wytwarza kwas L-glutaminowy, przy czym posiada rekombinacyjny gen kodujący co najmniej jeden enzym wybrany z grupy obejmującej syntezę cytrynianową (CS), karboksylazę fosfoenolopirogronianową (PEPC) i dehydrogenazę glutaminianową (GDH).
Korzystnie, mikroorganizmem jest Pantoea agglomerans.
Korzystnie, mikroorganizm posiada rekombinacyjne geny kodujące wszystkie enzymy: syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową.
Korzystnie, mikroorganizm posiada modyfikację, która przerywa gen kodujący dehydrogenazę kwasu a-ketoglutarowego.
Wynalazek obejmuje także mikroorganizm należący do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea wytwarzający kwas L-glutaminowy, w którym gen kodujący dehydrogenazę kwasu a-ketoglutarowego jest przerwany. Korzystnie, takim mikroorganizmem jest Klebsiella planticola.
W sposobie wytwarzania kwasu L-glutaminowego według wynalazku hoduje się mikroorganizm w płynnej pożywce wytwarzając i gromadząc kwas L-glutaminowy, po czym wyodrębnia się kwas L-glutaminowy z pożywki hodowlanej, przy czym hoduje się mikroorganizm należący do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea wytwarzający kwas L-glutaminowy i posiadający rekombinacyjny gen kodujący co najmniej jeden enzym wybrany z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową.
Ponieważ mikroorganizm według wynalazku posiada wysoką zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego, uznano że możliwe jest dalsze, zwiększenie zdolności wytwórczej mikroorganizmu przez zastosowanie technik hodowlanych opisanych wcześniej dla bakterii maczugowatych wytwarzających L-glutaminian, w celu zwiększenia wydajności i ekonomiczności sposobu wytwarzania L-glutaminianu poprzez odpowiedni wybór pożywki hodowlanej i inne modyfikacje procesu hodowli.
Wynalazek, w przykładach wykonania został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia tworzenie plazmidu pMWCPG z genem gltA, genem ppc i genem gdhA, fig. 2 przedstawia tworzenie plazmidu pMVG z genem gdhA, fig. 3 przedstawia tworzenie plazmidu pMVC z genem gltA, fig. 4 przedstawia tworzenie plazmidu RSF-Tet posiadającego miejsce startu replikacji z plazmidu o szerokim zakresie gospodarza RSF1010 i gen oporności na tetracyklinę, natomiast fig. 5 przedstawia konstruowanie plazmidu RSFCPG posiadającego miejsce startu replikacji z plazmidu o szerokim zakresie gospodarza RSF1010, gen oporności na tetracyklinę, gen gltA, gen ppci gen gdhA.
PL 194 140 B1
Przykłady mikroorganizmów należących do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea, które można zastosować zgodnie z wynalazkiem zestawiono poniżej:
Klebsiella planticola Klebsiella terrigena
Erwinia herbicola (obecnie klasyfikowana jako Pantoea agglomerans)
Erwinia ananas Erwinia cactida Erwinia cgrysanthemi Erwinia mallotivora Erwinia persicinus Erwinia psidii
Erwinia quercina Erwinia rhapontici Erwinia rubrifaciens Erwinia salicis
Erwinia uredovora Pantoea agglomerans Pantoea dspersa
Korzystne szczepy bakterii to:
Klebsiella planticola AJ13399
Erwinia herbicola IAM1595 (Pantoea agglomerans AJ2666)
Klebsiella planticola AJ13399 przekazany został do depozytu w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 19 lutego 1998 i otrzymał numer FERM P-16646, a następnie przekazany został do depozytu międzynarodowego 11,01,1999 zgodnie z Układem Budapeszteńskim, i uzyskał numer FERM BP-6616. Mikroorganizmy sklasyfikowane jako Erwinia herbicola, oznaczono obecnie jako Pantoea agglomerans. Erwinia herbicola IAM1595, oznaczony zatem jako Pantoea agglomerans AJ2666, przekazany został do depozytu w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 25 lutego 1999 jako depozyt międzynarodowy zgodnie z Układem Budapeszteńskim, i uzyskał numer FERM BP-6660.
Klebsiella planticola AJ13399 jest szczepem wyizolowanym z gleby w Sapporo-shi, Hokkaido, Japonia,
Fizjologiczne właściwości AJ 13399 są następujące:
(1) Morfologia komórki: pałeczka (2) Ruchliwość: nieruchliwa (3) Tworzenie spor: nie (4) Morfologia kolonii na podłożu agarowym LabM: okrągłe o gładkiej powierzchni, kremowego koloru, równomierne, uniesione, błyszczące (5) Test glukozowy OF: pozytywny, ulega fermentacji (6) Klasyfikacja wg. metody Gram'a: Gram ujemna (7) Zależność od tlenu: fakultatywny beztlenowiec (8) Katalaza: obecna (9) Oksydaza: brak (10) Ureaza: obecna (11) oksydaza cytochromowa: brak (12) b-galaktozydaza: obecna (13) Dehydrataza argininowa: brak (14) Dekarboksylaza ornitynowa: brak (15) Dekarboksylaza lizynowa: obecna (16) Deaminaza tryptofanowa: brak (17) Reakcja Vogesa i Proskaurea: tak (18) Wytwarzanie indolu: tak (19) Wytwarzanie siarkowodoru w pożywce TSI: nie (20) Przyswajanie kwasu cytrynowego: tak (21) Przyswajanie m-hydroksybenzenianu: nie (22) Upłynnianie żelatyny
PL 194 140 B1 (23) Wytwarzanie kwasu z cukru:
glukoza: tak mannitol: tak ramnoza: tak arabinboza: tak sacharoza: tak sorbitol: tak inozytol: tak melibioza: tak amigdalina: tak mieszanina adonitolu, peptonu i wody: tak mieszanina celobiozy, peptonu i wody: tak mieszanina dulcytolu, peptonu i wody: nie mieszanina rafinozy, peptonu i wody: tak (24) Temperatura wzrostu: dobry przy 37°C, brak przy 45°C.
Na podstawie podanych właściwości bakteriologicznych określono, że AJ13399 to Klebsiella planticola.
W „Bergey's Manuał of Determinative Bacteriology” (wyd. 9) Erwinia herbicola nie została opisana, a mikroorganizm, który klasyfikowano uprzednio jako Erwinia herbicola, został opisany jako Pantoea agglomerans. Zatem mikroorganizmy należące do rodzaju Erwinia i mikroorganizmy należące do rodzaju Pantoea są ze sobą blisko spokrewnione. Zgodnie z wynalazkiem wykorzystać można dowolny mikroorganizm należący do rodzaju Erwinia i do rodzaju Pantoea.
Metabolizm cukrów w komórce bakterii należącej do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea takich, jak wymienione powyżej, dokonuje się poprzez szlak Embdena i Meyerhofa, i wytwarzany w ten sposób pirogronian utleniany jest w cyklu kwasów trójkarboksylowych w warunkach tlenowych. Kwas L-glutaminowy syntezowany jest z kwasu a-ketoglutarowego, który jest związkiem pośrednim cyklu kwasów trójkarboksylowych w reakcji katalizowanej przez GDH lub syntetazę glutaminową syntezę glutaminianową. Tak więc, mikroorganizmy te posiadają wspólny szlak biosyntezy kwasu L-glutaminowego, wynalazek dotyczy zatem w równym stopniu mikroorganizmów należących do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea. Mikroorganizmy należące do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea i należącej do innych szczepów i gatunków niż podane powyżej również należą do zakresu wynalazku. Mikroorganizm według wynalazku jest mikroorganizmem należącym do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea posiadającym zdolność do produkcji L-glutaminianu. Wyrażenie „posiadający zdolność do produkcji L-glutaminianuę oznacza tu zdolność do gromadzenia L-glutaminianu w pożywce podczas hodowli. Zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego może być cechą szczepu dzikiego lub może być nadana lub wzmocniona w wyniku odpowiedniej hodowli. Przykłady mikroorganizmów należących do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea i posiadających zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego obejmują na przykład takie mikroorganizmy, które charakteryzują się zwiększoną aktywnością enzymu katalizującego reakcję biosyntezy kwasu L-glutaminowego lub takie mikroorganizmy, które cechują się zmniejszoną i aktywnością lub brakiem aktywności enzymu katalizującego reakcję odgałęziającą się od szlaku biosyntezy kwasu L-glutaminowego i prowadzącą do wytwarzania związków innych niż kwas L-glutaminowy. Przykłady mikroorganizmów obejmują ponadto mikroorganizmy, które charakteryzują się zwiększoną aktywnością enzymu katalizującego reakcję biosyntezy kwasu L-glutaminowego lub takie mikroorganizmy, które cechują się zmniejszoną aktywnością lub brakiem aktywności enzymu katalizującego reakcję odgałęziającą się od szlaku biosyntezy kwasu L-glutaminowego i prowadzącą do wytwarzania związków innych niż kwas L-glutaminowy.
Jako przykłady enzymu katalizującego reakcję biosyntezy L-glutaminianu można wymienić dehydrogenazę glutaminianową GDH, syntetazę glutaminową, syntazę glutaminianową, dehydrogenazę izocytrynianową, hydratazę kwasu akonitynowego, syntezę cytrynianową CS, karboksylazę fosfoenolopirogronianową PEPC, dehydratazę pirogronianową, kinazę pirogronianową, enolazę, fosfogliceromutazę, kinazę fosforoglicerynbianową, dehydrogenazę gliceroaldehydo-3-fosforanową, izomerazę trozofosforanową, aldolazę fruktozobisfosforanową, fosfofruktokinazę, izomerazę glukozo-fosforanową i podobne enzymy. Spośród wyżej wymienionych korzystne są jeden, dwa lub trzy enzymy: CS, PEPC i GDH. Dla konkretnego mikroorganizmu według wynalazku jest ponadto korzystne by aktywności wszystkich trzech rodzajów enzymów, CS, PEPC i GDH, były zwiększone. To, czy mikroorganizm charakteryzuje zwiększona aktywność docelowego enzymu oraz stopień zwiększenia aktywności
PL 194 140 B1 można określić mierząc aktywność enzymu w ekstrakcie komórek bakteryjnych lub w oczyszczonej frakcji, i przyrównując do odpowiedniej aktywności szczepu dzikiego lub szczepu rodzicielskiego.
Mikroorganizm według wynalazku, należący do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea i wykazujący zwiększoną aktywność enzymu katalizującego reakcję biosyntezy kwasu L-glutaminowego, można uzyskać, na przykład, jako odmianę dowolnego z mikroorganizmów wymienionych powyżej, traktowanego jako szczep wyjściowy, wprowadzając mutację do genu kodującego enzym lub poprzez rekombinację genetyczną.
W celu zwiększenia aktywności CS, PEPC lub GDH na przykład można sklonować gen kodujący CS, PEPC lub GDH w użytecznym plazmidzie, a następnie wspomniany powyżej szczep wyjściowy można stransformować uzyskanym plazmidem. Manipulacja ta może zwiększyć liczbę kopii każdego z genów kodujących CS, PEPC i GDH (określanych dalej odpowiednio jako „gen gltA”, „gen ppc” i „gen gdhA”) tak, że w rezultacie prowadzi to do podniesienia aktywności CS, PEPC i GDH.
Jeden lub dwa lub trzy rodzaje genów wybrane z genu gltA, genu ppc i genu gdhA w dowolnej kombinacji wprowadzono do wyjściowych szczepów wspomnianych powyżej. Gdy wprowadzone są dwa lub trzy rodzaje wspomnianych genów, to dwa lub trzy rodzaje genów sklonowane są albo w jednym rodzaju plazmidu i wprowadzone do komórki gospodarza, albo są sklonowane oddzielnie w dwu lub trzech rodzajach plazmidów, które mogą współistnieć w jednym gospodarzu, i są następnie wprowadzone do komórki gospodarza.
Rodzaj plazmidu nie jest w żaden szczególny sposób ograniczony, o ile jest zdolny do autonomicznej replikacji w mikroorganizmie należącym do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea. Przykłady plazmidu obejmują na przykład pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 i analogiczne. Można wykorzystać w tym celu również inne niż plazmidowe wektory DNA na przykład DNA wektory fagowe.
Transformację można prowadzić na przykład sposobem opisanym przez DM Morrisona (Methods Enzymol 68, 326 (1979)), metodą zwiększania przepuszczalności komórki przyjmującej DNA poprzez działanie CaCl2 (M Mandel, A Higa J Mol Biol 53, 159 (1970)) lub innymi znanymi metodami.
Aktywności CS, PEPC i GDH można również zwiększyć stosując wielokrotne kopie genu gltA, genu ppc i/lub genu gdhA obecne w chromosomalnym DNA szczepu wyjściowego. W celu wprowadzenia wielu kopii genu gltA, genu ppc i/lub gdhA do chromosomalnego DNA mikroorganizmu należącego do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea, można wykorzystać sekwencje obecne w chromosomalnym DNA w wielu kopiach, takie jak powtarzalny DNA oraz odwrócone sekwencje powtarzalne (IR) obecne na końcach transpozonów. Alternatywnie, do chromosomalnego DNA można wprowadzać wielokrotne kopie genów z wykorzystaniem przeniesienia transpozonów niosących gen gltA, gen ppc lub gen gdhA. Wymienione techniki również zwiększają liczbę kopii genu gltA, genu ppc i genu gdhA w komórkach transformanta, prowadząc do wzrostu aktywności CS, PEPC i GDH.
Jako źródło genu gltA, genu ppc i genu gdhA do zwiększania liczby kopii można wykorzystać dowolne organizmy, o ile posiadają one aktywność CS, PEPC i GDH. Korzystnymi organizmami są bakterie (Prokaryota), takie jak bakterie należące do rodzaju Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium i Bacillus. Jako szczególny przykład wymienić i można Eschrichia coli. Gen gltA, gen ppc igen gdhA można uzyskać z chromosomalnego DNA mikroorganizmów, takich jak podano wyżej.
Gen gltA, gen ppc i gen gdhA można uzyskać z chromosomalnego DNA dowolnego z mikroorganizmów, jak podano wyżej, izolując fragmenty DNA, które w teście komplementacji znoszą auksotrofię szczepów pozbawionych aktywności CS, PEPC lub GDH. Alternatywnie, ponieważ znana jest sekwencja nukleotydowa wymienionych genów należących do bakterii z rodzaju Escherichia lub Corynebacterium (Biochemistry 22, 5243-49, 1983; J Biochem 95, 909-16, 19S4; Gene 27, 193-9, 1984; Microbiol 140, 1817-28, 1994; Mol Gen Genet 218, 330-39, 1989; Mol Microbiol 6, 317-26, 1992) wspomniane geny można uzyskać techniką PCR stosując startery zsyntezowane w oparciu o podane sekwencje nukleotydowe oraz chromosomalny DNA jako matrycę.
Aktywność CS, PEPC lub GDH można również zwiększyć sposobami innymi niż wspomniana wyżej amplifikacja genu, poprzez zwiększanie ekspresji genu gltA, genu ppc lub genu gdhA. Na przykład, ekspresja ulega zwiększeniu poprzez zastąpienie promotora genu gltA, genu ppc lub genu gdhA innym, silniejszym promotorem. Przykłady takich silnych promotorów obejmują promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR i PL faga lambda i podobne. Gen gltA, gen ppc lub gen gdhA, których promotor zastąpiono, klonowane są następnie w plazmidzie i wprowadzane do mikroor6
PL 194 140 B1 ganizmu gospodarza lub wprowadzane do chromosomalnego DNA mikroorganizmu gospodarza z wykorzystaniem powtarzalnego DNA, elementów IR, transpozonów i podobnych metod.
Aktywność CS, PEPC lub GDH można również zwiększyć zastępując promotor genu gltA, genu ppc lub genu gdhA w chromosomie silniejszym promotorem (patrz WO87/03006 i Japońskie Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr. 61-268183 (1986), lub wprowadzając silny promotor w pozycji powyżej od sekwencji kodującej genów (patrz: Gene 29, 231-41, 1984). Konkretnie, można cel ten osiągnąć metodą rekombinacji homologicznej pomiędzy genem gltA, genem ppc lub genem gdhA, których promotor został zastąpiony silnym promotorem lub DNA zawierającym część ich sekwencji i odpowiednim genem w chromosomie.
Konkretne przykłady mikroorganizmów należących do rodzajów Klebsiella, Erwinia lub Pantoea, w których aktywność CS, PEPC lub GDH jest zwiększona, obejmują na przykład: Klebsiella planticola ATJ13399/RSFCPG i Erwinia herbicola IAM1595/RSFCPG.
Przykłady enzymów katalizujących reakcję odgałęziającą się od szlaku biosyntezy L-glutaminianu i prowadzącą do wytwarzania związków innych niż kwas L-glutaminowy obejmują na przykład: aKGDH, liazę izocytrynianową, acetylotransferazę fosforanową, kinazę octanową, syntezę kwasu acetohydroksowego, syntezę acetomleczanową, acetylotransferazę mrówczanową, dehydrogenazę mleczanową, dekarboksylazę glutaminianową, dehydrogenazę 1-pyrolinową i podobne enzymy. Korzystnym enzymem spośród wymienionych jest aKGDH.
W celu uzyskania ograniczenia aktywności lub braku aktywności wymienionych enzymów w mikroorganizmie należącym do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea, wprowadzić można mutację ograniczającą aktywność lub prowadzącą do braku aktywności, z zastosowaniem standardowych technik mutagenezy lub inżynierii genetycznej.
Przykłady technik mutagenezy obejmują na przykład sposoby wykorzystujące naświetlania promieniami X lub UV, sposoby wykorzystujące traktowanie czynnikami mutagennymi typu N-metyloN-nitro-N'-nitrozoguanidyną lub sposoby pokrewne. Miejsce w obrębie genu, do którego wprowadzana jest mutacja, może obejmować region kodujący białko enzymatyczne lub region regulatorowy, taki jak promotor.
Przykłady technik inżynierii genetycznej obejmują rekombinację genetyczną, transdukcję, fuzję komórek i sposoby podobne. Na przykład, do genu docelowego może być wprowadzony gen oporności na leki, w celu uzyskania funkcjonalnie nieaktywnego genu (genu defektywnego). Następnie, defektywny gen wprowadzany jest do komórki mikroorganizmu należącego do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea, i gen docelowy w chromosomie zastępowany, jest genem defektywnym w wyniku rekombinacji homologicznej (niszczenie genu).
To, czy mikroorganizm charakteryzuje zmniejszona aktywność docelowego enzymu oraz stopień zmniejszenia aktywności można określić mierząc aktywność enzymu w ekstrakcie komórek bakteryjnych lub w oczyszczonej frakcji otrzymanej ze szczepu kandydującego i przyrównując ją do odpowiedniej aktywności szczepu dzikiego lub szczepu wyjściowego. Aktywność enzymatyczną aKGDH można mierzyć na przykład metodą Reeda i wsp. (LJ Reed, MN Mukherjee Metods Enzymol (1969) 13, 55-61).
W zależności od rodzaju docelowego enzymu, docelowy wariant można wybrać w oparciu o fenotyp szczepu zmienionego. Na przykład wariant charakteryzujący się brakiem lub zmniejszoną aktywnością aKGDH nie wzrasta na podłożu minimalnym uzupełnionym glukozą, lub podłożu minimalnym zawierającym kwas octowy lub kwas L-glutaminowy jako jedyne źródło węgla lub wykazuje zasadniczo zmniejszone tempo wzrostu w warunkach tlenowych. Jednakże, nawet w tych samych warunkach, może wykazywać normalny wzrost po dodaniu kwasu bursztynowego lub lizyny, metioniny i kwasu diaminopimelinowego do podłoża minimalnego zawierającego glukozę. W oparciu o znajomość tych zjawisk można wyselekcjonować szczep o zmniejszonej lub wygaszonej aktywności aKGDH.
Sposób wytwarzania szczepu Brevibacterium lactofermentum pozbawionego genu aKGDH w oparciu o metodę rekombinacji homologicznej przedstawiono szczegółowo w WO95/34672 i podobne sposoby można zastosować do mikroorganizmów należących do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea.
Ponadto, procedury klonowania, przecinania i ligacji DNA, transformacji oraz inne metody przedstawione są w Molecular Cloning, wyd. 2, CSH Lab Press (1989) i podobnych publikacjach.
Przykładem szczepu pozbawionego aktywności aKGDH lub o obniżonej jego aktywności uzyskanego jak przedstawiono to powyżej, jest Klebsiella planticola ATJ13410. Klebsiella planticola
PL 194 140 B1
ATJ13410 został przekazany do depozytu w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 19 lutego 199S i otrzymał numer FERM P-16647, a następnie 11,01,1999 przekazany do depozytu międzynarodowego zgodnie z Układem Budapeszteńskim i uzyskał numer FERM BP-6617.
Szczep bakteryjny należący do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea o zmniejszonej aktywności lub pozbawiony aktywności aKGDH, lub szczep o zwiększonej aktywności CS, PEPC lub GDH, uzyskany jak podano powyżej, wykazuje zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego, jak przedstawiono to w poniższych przykładach.
O mikroorganizmach należących do rodzaju Escherichia, sklasyfikowanego jako rodzaj bakterii jelitowych podobnie jak rodzaj Klebsiella, Erwinia lub Pantoea, wiadomo, że szczepy o zmniejszonej aktywności lub pozbawione aktywności aKGDH mogą wytwarzać kwas L-glutaminowy (Japońskie Zgłoszenie Patentowe nr 5-244970 (1993)). Wiadomo też, że szczepy o zmniejszonej aktywności lub pozbawione aktywności aKGDH, lub szczepy o zwiększonej aktywności PEPC lub GDH mogą wytwarzać większe ilości kwasu L-glutaminowego (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe nr 7-203980 (1995)), i wiadomo, że szczepy wykazujące wrażliwość na walinę i cechujące się zwiększoną aktywnością CS i GDH mogą wytwarzać kwas L-glutaminowy (WO97/08294).
Podobnie jak dla mikroorganizmów rodzaju Enterobacter, klasyfikowanych podobnie jako bakterie jelitowe, wynalazcy odkryli, że szczepy o zmniejszonej aktywności lub pozbawione aktywności aKGDH, lub o zwiększonej aktywności CS, PEPC lub GDH uzyskane jak podano powyżej wykazują zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego (Japońskie Zgłoszenie Patentowe nr 10-69068 (1998)).
Ponadto, podobnie jak dla mikroorganizmów należących do rodzaju Serratia, wynalazcy odkryli że szczepy o zwiększonej aktywności CS, PEPC lub GDH uzyskane jak podano powyżej, wykazują zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego (Japońskie Zgłoszenie Patentowe nr 10-69068 (1998)).
Z faktów tych wynika, że dla bakterii należącej do rodzajów Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Escherichia, Enterobacter lub Serratia, innych niż szczepy przedstawione w Przykładach, szczepy o zmniejszonej aktywności lub pozbawione aktywności aKGDH, lub o zwiększonej aktywności CS, PEPC lub GDH uzyskane jak podano powyżej, mogą wytwarzać kwas L-glutaminowy. Jak wykazano to w Przykładach, zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego można nadać Klebsiella planticola AJ13399 poprzez delecję aKGDH, co silnie wskazuje, że w ten sam sposób właściwość tę można nadać bakteriom z rodzajów Klebsiella, Erwinia lub Pantoea.
L-glutaminian można wytwarzać hodując mikroorganizm należący do rodzaju Klebsiella, Erwinia lub Pantoea i wykazujący zdolność do wytwarzania kwasu L-glutaminowego w płynnej pożywce w celu wytworzenia i gromadzenia kwasu L-glutaminowego w pożywce, i zbierając kwas L-glutaminowy z pożywki hodowlanej.
Pożywka hodowlana może być zwykłym podłożem zawierającym źródło węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne, jak również organiczne związki śladowe, takie jak aminokwasy, witaminy i substancje podobne, jakie są niezbędne do wzrostu. Pożywka może być sztuczna lub naturalna. W pożywce można zastosować dowolne źródło węgla lub azotu, o ile jest ono wykorzystywane przez hodowane w niej mikroorganizmy.
Źródłem węgla może być cukrowiec, taki jak glukoza, glicerol, fruktoza, sacharoza, maltoza, mannoza, galaktoza, hydrolizat skrobiowy, melasa i podobne. Ponadto, kwasy organiczne, takie jak kwas octowy i cytrynowy, można stosować również osobno lub w połączeniu z innymi źródłami węgla.
Źródłem azotu może być amoniak, sole amonowe, takie jak siarczan amonowy, węglan amonowy, chlorek amonowy, fosforan amonowy i octan amonowy, azotany i inne.
Organicznymi substancjami śladowymi mogą być witaminy, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, kwasy nukleinowe, zawierające je substancje takie jak pepton, kwas kazaminowy, ekstrakt drożdżowy i hydrolizat sojowy i substancje podobne, które są niezbędne do wzrostu szczepów auksotroficznych, wymagających aminokwasu lub substancji podobnych do wzrostu, i które są niezbędnym uzupełnieniem pożywki hodowlanej.
Jako sole nieorganiczne, można wykorzystywać fosforany, sole magnezu, sole wapnia, sole żelaza, sole manganu i inne podobne substancje.
Hodowlę można prowadzić w temperaturze od 20 do 42°C w warunkach tlenowych, przy pH o wartości od 4 do 8. Hodowlę można prowadzić przez okres od 10 godzin do 4 dni w celu zgromadzenia znaczących ilości kwasu L-glutaminowego w płynnym podłożu hodowlanym.
PL 194 140 B1
Po ukończeniu hodowli kwas L-glutaminowy zgromadzony w podłożu można zebrać znanymi sposobami. Na przykład, można wyizolować L-glutaminian sposobem obejmującym zagęszczanie podłoża po usunięciu z niego komórek w celu wykrystalizowania produktu, chromatografię jonowymienną, lub stosując inne sposoby.
Przykłady (1) Tworzenie plazmidu zawierającego gen gltA, gen ppc, igen gdhA
Procedura konstruowania plazmidu zawierającego gen gen gltA, gen ppc,i gen gdhA wyjaśniona jest w odniesieniu do fig. 1, 2 i 3.
Plazmid pBRGDH niosący gen gdhA pochodzący z Escherichia coli (Japońskie Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr. 7-203980 (1995) strawiono enzymem HindlII i Sphl, a lepkie końce uzupełniono do końców tępych działając polimerazą DNA z faga T4. Następnie, fragment DNA zawierający gen gdhA oczyszczono i zebrano. Z drugiej strony plazmid pMWCP niosący gen gltA i gen ppc pochodzące z Escherichia coli (WO97/O8294) strawiono enzymem Xbal, a lepkie końce uzupełniono do końców tępych działając polimerazą DNA z faga T4. Otrzymany fragment DNA zmieszano z fragmentem DNA zawierającym gen gdhA oczyszczonym jak podano powyżej i zligowano działając ligazą z faga T4, uzyskując plazmid pMWCPG, odpowiadający plazmidowi pMWCP niosącemu ponadto gen gdhA (fig. 1).
Fragment DNA niosący gen gdhA uzyskano przez trawienie plazmidu pBRGDH enzymami HindllI i SalI, następnie oczyszczono i zebrano oraz wprowadzono do miejsca Hindlll-Sall plazmidu pMW219 (Nippon Gene) otrzymując plazmid pMVG (fig. 2). Ponadto, plazmid pTWVC niosący gen gltA pochodzący z Escherichia coli (WO97/08294) strawiono enzymem HindlII i EcoRI i otrzymany fragment DNA niosący gen gltA oczyszczono i zebrano i wprowadzono do miejsca HindlIl-EcoRI plazmidu pMW219 w celu otrzymania plazmidu pMWC (fig. 3).
Równocześnie, produkt uzyskany poprzez trawienie plazmidu pVIC40, niosący miejsce startu replikacji z plazmidu RSF1010 o szerokim zakresie gospodarza (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe (KOKAI) nr 8-047397 (1996)) strawiono enzymem Notl, poddano działaniu polimerazy z faga T4 oraz strawiono enzymem Pstl, i produkt uzyskany przez strawienie plazmidu pBR322 enzymem EcoT141 poddano działaniu polimerazy z faga T4 oraz strawiono enzymem Pstl, zmieszano i zligowano działając ligazą z faga T4 w celu uzyskania plazmidu RSF-Tet, niosącego miejsce startu replikacji z plazmidu RSF1010 i gen oporności na tetracyklinę (fig. 4).
Następnie, plazmid pMWCPG strawiono enzymami EcoRI i Pstl, a fragment niosący gen gltA, gen ppc i gen gdhA oczyszczono i zebrano. Podobnie plazmid RSF-Tet strawiono enzymami EcoRI i Pstl, i fragment DNA niosący miejsce startu replikacji z plazmidu RSF1010 oczyszczono i zebrano. Wymienione fragmenty DNA zmieszano i zligowano działając ligazą z faga T4 otrzymując plazmid RSFCPG, składający się z plazmidu RSF-Tet niosącego gen gltA, gen ppc i gen gdhA (fig. 5). Potwierdzono ekspresję genu gltA, genu ppc i genu gdhA z matrycy plazmidu RSFCPG i ekspresję genu gdhA z plazmidu pSTVG metodą komplementacji auksotrofii szczepu Escherichia coli pozbawionego genu gltA, genu ppc oraz genu gdhA oraz mierząc aktywność każdego z enzymów.
Podobnie potwierdzono ekspresję genu gdhA lub genu gltA w plazmidzie pMWG lub pMWC, stosując test komplementacji auksotrofii szczepu Escherichia coli pozbawionego genu gdhA lub genu gltA i mierząc aktywność każdego z enzymów.
(2) Wprowadzenie plazmidów RSFCPG, pMWCB i pSTVG do bakterii z rodzaju Klebsiella i rodzaju Erwinia (Pantoea) i oszacowanie produktywności kwasu L-glutaminowego
Erwinia herbicola IAM1595 (Pantoea agglomerans) i Klebsiella planticola AJ13399 stransformowano plazmidami RSFCPG, pMWC i pMWG metodą elektroporacji (JH Miller „A Short Course in Bacterial Genetics: Handbook” CSH Lab Pres, 1992) w celu uzyskania transformantów wykazujących oporność na tetracyklinę.
Każdym z uzyskanych transformantów i szczepem wyjściowym zaszczepiano kolbę o pojemności 50 ml zawierającą 5 ml podłoża hodowlanego składającego się z 40g/l glukozy, 20g/l siarczanu amonowego, 0,5 g/l sześciowodnego siarczanu magnezowego, 2 g/l diwodorofosforanu potasowego, 0,5 g/l chlorku sodowego, 0,25 g/l sześciowodnego chlorku wapniowego, 0,02 g/l sześciowodnego siarczku żelazowego, 0,02 g/l tetrawodnego siarczanu manganowego, 0,72 mg/l diwodnego siarczanu cynkowego, 0,64 mg/l pięciowodnego siarczanu miedziowego, 0,72 mg/l sześciowodnego chlorku kobaltowego, 0,4 mg/l kwasu borowego, 1,2 mg/l diwodoromolibdenianu sodowego, 2 g/l ekstraktu drożdżowego i 30 g/l węglanu wapniowego i hodowano w 37°C z wytrząsaniem do czasu zużycia zawartej w pożywce glukozy. Do pożywki hodowlanej transformantów dodawano 25 mg//l tetracykliny.
PL 194 140 B1
Po zakończonej hodowli mierzono ilość zgromadzonego w podłożu kwasu L-glutaminowego. Rezultaty przedstawia Tabela 1.
Tabel a 1.
Zgromadzone ilości kwasu L-glutaminowego
szczep bakteryjny zgromadzona ilość kwasu L-glutaminowego (g/l)
IAM1595 0,0
IAM1595/RSFCPG 5,0
AJ13399 0,0
AJ13399/RSFCPG 3,1
AJ13399/pMWC 2,5
AJ13399/pMWG 0,6
kontrola (podłoże) 0,2
Erwinia herbicola IAM1595 i Klebsiella planticola AJ13399 nie gromadziły L-glutaminianu w podłożu, natomiast szczepy, w których aktywność CS, PEPC i GDH została podwyższona przez wprowadzenie plazmidu RSFCPG gromadziły odpowiednio 5,0 g/l i 3,1 g/l kwasu L-glutaminowego. Szczep AJ13399, w którym podwyższono jedynie aktywność CS gromadził 2,5 g/l L-glutaminianu, szczep w którym podwyższono jedynie aktywność GDH gromadził 0,8 g/l L-glutaminianu.
(3) Klonowanie fragmentu DNA obejmującego część genu aKGDH z Klebsiella planticola AJ13399
Fragment obejmujący część genu aKGDH z Klebsiella planticola AJ13399 sklonowano wykorzystując reakcję PCR z oligonukleotydowymi starterami o sekwencji odpowiadającej z jednej strony homologicznemu regionowi genu aKGDH z organizmów, których sekwencja nukleotydowa była znana tj. Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Haemophilus influenzae, organizmu człowieka i Saccharomyces cerevisiae (Eur J Biochem 181, 235-239, 1990; Mol Gen Genet 234, 285-96, 1992; Eur J Biochem 141, 351-359, 1984; Microbiology 142, 3347-54, 1996; Science 269, 496-512, 1995; PNAS 89, 1963-67, 1992; Mol Cell Biol 9, 2695-2705, 1989), i miejscu EcoRI z drugiej strony.
Konkretnie, użyto następujących starterów:
Starter 1
5' CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA 3' (Sek Id Nr 1)
Starter 2
5' GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC 3' (Sek Id Nr 2)
Chromosomalny DNA Klebsiella planticola AJ13399 użyty jako matryca w reakcji PCR izolowano metodą stosowaną zazwyczaj do wyodrębniania chromosomalnego DNA z Escherichia coli (Seibutsu Kpgaku Jikken-sho (Textbook of Bioengineering Experiments) wyd. Society of Fermentation and Bioengineering, Japonia, str. 97-98, Baifukan 1992).
Podstawowy cykl reakcji PCR składał się z następujących elementów: 94°C przez 1 minutę, 50°C przez 1 minutę, 73°C przez 3 minuty, cykl powtórzono 30 razy, otrzymany fragment DNA trawiono EcoRI i wstawiano do plazmidu pT7Blue strawionego EcoRI otrzymując zrekombinowany plazmid pT7KP. Plazmid wektorowy pT7Blue (niosący gen oporności na ampicilinę) pochodził z firmy Novagen.
Sekwencję nukleotydową sklonowanego fragmentu oraz sekwencję aminokwasową kodowaną przez tę sekwencję przedstawia Sek Id Nr 3. Sama sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest Sek Id Nr 4. Sekwencja wykazuje 82,3% homologii z sekwencją genu kodującego podjednostkę aKGDH-E1 z Escherichia coli (oznaczanym jako sucA), i łatwo można w niej rozpoznać część genu sucA Klebsiella planticola AJ13399. W sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 3 pozycje nukleotydowe 18-1659 odpowiadają sekwencji genu sucA, pozycje 0-17 i 1660-1679 odpowiadają sekwencji starterów.
(4) Utworzenie szczepu pozbawionego aKGDH pochodzącego z Klebsiella planticola AJ13399
Metodą rekombinacji homologicznej, wykorzystując: fragment genu sucA z Klebsiella planticola uzyskany jak podano wyżej, otrzymano szczep Klebsiella planticola pozbawiony aKGDH.
PL 194 140 B1
Najpierw plazmid pT7KP strawiono enzymem BstEII i w miejsce to wprowadzono fragment genu oporności na kanamycynę sklonowany techniką PCR z plazmidu pNEO (Pharmacia) z wprowadzonymi miejscami BstEII, uzyskując plazmid pTK7KPKm, w którym gen oporności na kanamycynę wstawiony był w część centralną genu sucA z Klebsiella planticola.
Startery wykorzystane do klonowania genu oporności na kanamycynę były następujące:
Starter 1
5' TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT 3' (Sek Id Nr5)
Starter 2
5' CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG 3' (Sek Id Nr6)
Następnie, plazmid pT7KPKm przecięto enzymem Kpnl i w utworzone miejsce wstawiono fragment genu oporności na tetracyklinę sklonowany techniką PCR z plazmidu pBR322 (Takara Shuzo), z wprowadzonymi miejscami Kpnl z obu stron, otrzymując plazmid pT7KPKmTc, w którym gen oporności na kanamycynę wstawiony był w część centralną genu sucA z Klebsiella planticola wraz z wstawionym obok genem oporności na tetracyklinę.
Startery wykorzystane do klonowania genu oporności na tetracyklinę były następujące:
Starter 1
5' GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG 3' (Sek Id Nr7)
Starter 2
5' GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG 3' (Sek Id Nr 8)
Następnie, plazmid pT7KPKmTc strawiono enzymami SacI i XbaI w celu wycięcia fragmentu DNA posiadającego gen oporności na kanamycynę wstawionego w część centralną genu sucA z Klebsiella planticola wraz z wstawionym obok genem oporności na tetracyklinę, i fragment ten wprowadzono do plazmidu pochodzącego z chromosomu bakterii Gram ujemnej pGP704, przeciętego enzymami SacI i SbaIw celu uzyskania plazmidu pUTONOTK.
Plazmid pUTONOTK otrzymany jak podano wyżej wykorzystano do transformacji metodą elektroporacji komórki Klebsiella planticola AJ13399, a szczep w którym plazmid pUTONOTK został wstawiony do chromosomu w wyniku rekombinacji homologicznej w miejsce genu sucA wybrano na podstawie cechy oporności na kanamycynę i tetracyklinę. Ze szczepu tego uzyskano następnie na podstawie wrażliwości na tetracyklinę i oporności na kanamycynę, Klebsiella planticola AJ13399 pozbawiony sucA, w którym gen sucA w chromosomie został zastąpiony genem sucA, do którego w centralną część został wprowadzony gen oporności na kanamycynę.
W celu potwierdzenia że szczep AJ1399 uzyskany jak podano powyżej nie wykazuje aktywności aKGDH, aktywność enzymatyczną określono metodą Reeda (LJ Reed i BB Mukherjee Methods Enzymol (1969) 13, 55-61). Szczep AJ13356 nie wykazywał aktywności aKGDH (Tabela 2), co potwierdziło, że szczep nie posiadał genu sucA.
T ab el a 2: Aktywność aKGDH
szczep bakteryjny aktywność aKGDH (DABS/min/mg białka)
AJ13399 0,101
AJ13410 <0,002
(5) Ocena produktywności L-glutaminianu przez szczep Klebsiella planticola pozbawiony aktywności aKGDH
Obydwoma szczepami AJ13399 i AJ13410 zaszczepiano podłoże w kolbie 500 ml zawierającej 20 ml podłoża hodowlanego składającego się z 40 g/l glukozy, 20 g/l siarczanu amonowego, 0,5 g/l sześciowodnego siarczanu magnezowego, 2 g/l diwodorofosforanu potasowego, 0,5 g/l chlorku sodowego, 0,25 g/l sześciowodnego chlorku wapniowego, 0,02 g/l sześciowodnego siarczku żelazowego, 0,02 g/l czterowodnego siarczanu manganowego, 0,72 mg/l diwodnego siarczanu cynkowego, 0,64 mg/l pięciowodnego siarczanu miedziowego, 0,72 mg/l sześciowodnego chlorku kobaltowego, 0,4 mg/l kwasu borowego, 1,2 mg/l diwodoromolibdenianu sodowego, 2 g/l ekstraktu drożdżowego, 200 mg/l chlorowodorku lizynowego, 200 mg/l L-metioniny, 200 mg/l kwasu DL-a,e-diaminopimelinowego (DAP) i 30 g/l węglanu wapniowego i hodowano w 37°C z wytrząsaniem do czasu zużycia zawartej w pożywce glukozy. Po zakończonej hodowli mierzono ilość zgromadzonego w podłożu kwasu L-glutaminowego i kwasu a-ketoglutarowego (aKG). Rezultaty przedstawia Tabela 3.
PL 194 140 B1
Tabel a 3
Zgromadzone w podłożu ilości L-glutaminianu oraz aKG
szczep bakteryjny zgromadzona ilość L-glutaminianu (g/l) zgromadzona ilość aKG (g/l)
AJ13399 0,0 0,0
AJ13410 12,8 1,5
Szczep AJ13410 pozbawiony aktywności aKGDH zgromadził 12,8 g/l kwasu L-glutaminowego oraz jednocześnie zgromadził 1,5 g/l aKG.
(6) Wprowadzenie RSFCPG do szczepu Klebsiella planticola pozbawionego aktywności aKGDH i ocena produktywności kwasu L-glutaminowego
Szczep AJ1410 stransformowano plazmidem RSFCPG i otrzymanym szczepem z wprowadzonym plazmidem RSFCPG, AJ13410/RSFCPG, inokulowano podłoże w kolbie 500 ml zawierającej 20 ml podłoża hodowlanego składającego się z 40 g/l glukozy, 20 g/l siarczanu amonowego, 0,5 g/l sześciowodnego siarczanu magnezowego, 2 g/l diwodorofosforanu potasowego, 0,5 g/l chlorku sodowego, 0,25 g/l sześciowodnego chlorku wapniowego, 0,02 g/l sześciowodnego siarczku żelazowego, 0,02 g/l czterowodnego siarczanu manganowego, 0,72 mg/l dwuwodnego siarczanu cynkowego, 0,64 mg/l pięciowodnego siarczanu miedziowego, 0,72 mg/l sześciowodnego chlorku kobaltowego, 0,4 mg/l kwasu borowego, 1,2 mg/l dwuwodoromolibdenianu sodowego, 2 g/l ekstraktu drożdżowego, 25 mg/l tetracykliny, 200 mg/l chlorowodorku lizynowego, 200 mg/l L-metioniny, 200 mg/l kwasu DL-a,e-diaminopimelinowego (DAP) i 30 g/l węglanu wapniowego i hodowano w 37°C z wytrząsaniem do czasu zużycia zawartej w pożywce glukozy. Po zakończonej hodowli mierzono ilość zgromadzonego w podłożu kwasu L-glutaminowego i aKG. Rezultaty przedstawia Tabela 4.
T a b e l a 4
szczep bakteryjny zgromadzona ilość L-glutaminianu (g/l) zgromadzona ilość aKG (g/l)
AJ13410 12,8 1,5
AJ13410/RSFCPG 24,2 0,0
W przypadku szczepu, w którym zwielokrotniono aktywności CS, PEPC i GDH poprzez wprowadzenie plazmidu RSFCPG, zgromadzone w podłożu hodowlanym ilości aKG zostały zmniejszone a zgromadzone ilości kwasu L-glutaminowego zwiększone.
PL 194 140 B1
Zestawienie sekwencji <110> Ajinomoto Co Inc <120> Bakteria wytwarzająca kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego <130>
<150> JP 10-69106 <151> 1998-03-18 <15> JP 10-224909 <151> 1988-08-07 <160> 8 <170> Patentln ver. 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<221> sekwencja zdegenerowana <222> (19) <223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 1 ccgggaattcggtgacgtna artayca <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 2 ggcgaattcg ggaacgggta sagytgytc <210> 3 <211> 1679 <212> DNA <213> Klebsiella planticola <220>
<221> sekwencja kodująca <222> (2) . . .(1679) <400> 3
PL 194 140 B1
ggt gac gtg aaa tat cac atg ggc ttc tct tct gac atg gaa acc gaa 48
Gly Asp Val Lys Tyr Hi s Met Gly Phe Ser Ser Asp Met Glu Thr Glu
1 5 10 15
ggc ggc ctg gtg cac ctg gcg ctg gcg ttt aac ccg tca cac ctc gaa 96
Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu
20 25 30
atc gtc agc ccg gtg gtt atc ggg tcg gtt cgc gcg cgt ctc gat cgt 144
Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg
35 40 45
ctc gac gag ccg agc agc aat aaa gtg ctg ccg att act atc cac ggc 192
Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly
50 55 60
gac gcc gca gtg acg ggt cag ggc gtg gtt cag gaa acc ctg aac atg 240
Asp Ala Ala Val Thr Gly Gin Gly Val Val Gin Glu Thr Leu Asn Met
65 70 75 80
tcc aag gcg cgt ggc tac gaa gtg ggc gga acc gta cgt atc gtt atc 288
Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Va1 Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile
85 90 95
aac aac cag gtg ggc ttc act acc tcg aac ccg ctg gat gcg cgc tcc 336
Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser
100 105 110
acg cca tac tgc acc gat atc ggt aaa atg gtt cag gcg ccg atc ttc 384
Thr Pro Tyr Cys Thr Asp .Ile Gly Lys Met Val Gin Al a Pro Ile Phe
115 120 125
cac gtg aac gcg gac gat ccg gaa gcc gtt gct ttc gtt acc cgc ctg 432
His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu
130 135 140
gcg ctg gat ttc cgt aat acc ttc aaa cgc gat gtc ttc atc gac ctg 480
Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu
145 150 155 160
gtg tgc tac cgc cgt cac ggc cat aac gaa gcc gac gag ccg agc gca 528
Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu Pro Ser Ala
165 170 175
acg cag ccg ctg atg tat cag aaa atc aaa aaa cat ccg acc ccg cgc 576
Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys Ile Lys Lys Hi s Pro Thr Pro Arg
180 185 190
aaa atc 'tac gcc gac aaa ctt gag cag gac aaa gtg tcg acc ctg gaa 624
Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gin Asp Lys Val Ser Thr Leu Glu
195 200 205
gat gcg acc gaa ctg gtt aac ctc tat cgt gat gcg ctg gat gcc ggc 672
Asp Ala Thr Glu Leu Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly
210 215 220
gaa tgc gtg gtt gag gaa tgg cgt ccg atg aac ctg cac tcc ttt acc 720
Glu Cys Val Val Glu Glu Trp Arg Pro Met Asn Leu His Ser Phe Thr
225 230 235 240
tgg tca ccg tac ctc aac cac gag tgg gat gag agc tac ccg agt aaa 768
Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Ser Tyr Pro Ser Lys
245 250 255
gtc gag atg aaa cgt ctg cag gag ctg gct aaa cgc att agc act gtg 816
Val Glu Met Lys Arg Leu Gin Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Val
260 265 270
PL 194 140 B1
ccg gac agc att gaa atg cag tct cgc gtg gcg aag att tat ggc gat 864
Pro Asp Ser Ile Glu Met Gin Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp
275 280 285
cgc cag gcg atg gcc gcc ggc gag aag ctg ttc gac tgg ggg gcg gcg 912
Arg Gin Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Ala Ala
290 295 300
gaa aac ctg gct tac gcc acg ctg gtt gat gaa ggg att ccg att cgc 960
Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Ile Arg
305 310 315 320
ctg tcc ggt gaa gac tcc ggt cgc ggt acg ttc ttc cac cgc cat tcc 1008
Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ser
325 330 335
gtg att cat aac cag gtg aac ggt tcg acc tac acg ccg ctg cag cat 1056
Val Ile His Asn Gin Val Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gin His
340 345 350
gtg cat aac ggc cag gag cat ttc aaa gtc tgg gac tcc gtg ctt tct 1104
Val His Asn Gly Gin Glu His Phe Lys Val Trp Asp Ser Val Leu Ser
355 360 365
gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttc gaa tac ggc tac gcc act gcg gaa ccg 1152
Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro
370 375 380
cgc acc ctg act atc tgg gaa gcg cag ttc ggt gac ttt gct aac ggc 1200
Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gin Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly
385 390 395 400
gct caa gtg gtg atc gat cag ttc atc agc tcc ggc gag cag aag tgg 1248
Ala Gin Val Val Ile Asp Gin Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gin Lys Trp
405 410 415
ggc cgg atg tgt ggc ctg gtc atg ctg ctg ccg cac ggc tac gaa ggc 1296
G1 y Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly
420 425 430
cag ggc ccg gag cac tcc tcc gcg cgt ctg gaa cgc tat ctg cag ctg 1344
Gin Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gin Leu
435 440 445
tgt gct gaa cag aat atg cag gtt tgt gtg cca tcg act ccg gct cag 1392
Cys Ala Glu Gin Asn Met Gin Val Cys Val Pro Ser Thr Pro Ala Gin
450 455 460
gtt tac cac atg ctg cgt cgt cag gcg ctg cgc ggt atg cgt cgt ccg 1440
Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gin Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro
465 470 475 480
ctg gtg gtg atg tcg ccg aaa tct ctg ctg cgc cat ccg ctg gcg gtc 1488
Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val
485 490 495
tcc agc ctg gac gag ctg gcg aac ggc acc ttc ctg ccg gcc atc ggt 1536
Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly
500 505 510
gaa atc gat gac ctc gac ccg aaa gcg gtg aag cgt gtt gtc ctg tgc 1584
G1 u Ile Asp Asp Leu Asp Pro Lys Al a val Lys Arg Val Val Leu Cys
PL 194 140 B1
515 520 525
tct ggt aag gtt tat tac gat ctg ctg gaa caa cgc cgt aag aac gac 1632
Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gin Arg Arg Lys Asn Asp
530 535 540
caa aaa gat gtc gct atc gtg cgt ata gaa caa ctg tac ccg ttc cc 1679
Gin Lys Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gin Leu Tyr Pro Phe
545 550 555
<210> 4 <211> 559 <212> białko <213> Klebsiella planticola <400> 4
Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp Met Glu Thr Glu
1 5 10 15
Gly Gly Leu Va1 His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu
20 25 30
Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg
35 40 45
Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly
50 55 60
Asp Ala Ala Val Thr Gly Gin Gly Val Val Gin Glu Thr Leu Asn Met
65 70 75 80
Ser Lys Ala Arg Gly Tyr G1u Val Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile
85 90 95
Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser
100 105 110
Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gin Ala Pro Ile Phe
115 120 125
His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu
130 135 140
Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu
145 150 155 160
Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu Pro Ser Ala
165 170 175
Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys Ile Lys Lys His Pro Thr Pro Arg
180 185 190
Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gin Asp Lys Val Ser Thr Leu Glu
195 200 205
Asp Ala Thr Glu Leu Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly
210 215 220
Glu Cys Va1 Val Glu Glu Trp Arg Pro Met Asn Leu His Ser Phe Thr
225 230 235 240
Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Ser Tyr Pro Ser Lys
245 250 255
Val Glu Met Lys Arg Leu Gin Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Va1
260 265 270
PL 194 140 B1
Pro Asp Ser Ile Glu Met Gin Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp
275 280 285
Arg Gin Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Ala Ala
290 295 300
Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Ile Arg
305 310 315 320
Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ser
325 330 335
Val Ile His Asn Gin Val Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gin His
340 345 350
Va1 His Asn Gly Gin Glu His Phe Lys Val Trp Asp Ser Val Leu Ser
355 360 365
Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro
370 375 380
Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gin Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly
385 390 395 400
Ala Gin Val Val Ile Asp Gin Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gin Lys Trp
405 410 415
Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly
420 425 430
Gin Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gin Leu
435 440 445
Cys Ala Glu Gin Asn Met Gin Val Cys Va1 Pro Ser Thr Pro Ala Gin
450 455 460
Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gin Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro
465 470 475 480
Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val
485 490 495
Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly
500 505 510
Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Lys Ala Val Lys Arg Val Val Leu Cys
515 520 525
Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gin Arg Arg Lys Asn Asp
530 535 540
Gin Lys Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gin Leu Tyr Pro Phe
545 550 555
<210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opissekwencji sztucznej: starter <400> 5 tactgggtca cctgacagct tatcatcgat
PL 194 140 B1 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 6 cgttcggtga ccaccaaagc ggccatcgtg <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 7 ggggtaccca aataggcgta tcacgag <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter <400> 8 ggggtacccg cgatggatat gttctg

Claims (8)

1. Mikroorganizm należący do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea wytwarzający kwas L-glutaminowy i posiadający rekombinacyjny gen kodujący co najmniej jeden enzym wybrany z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową.
2. Mikroorganizm według zastrz. 1, znamienny tym, że jest nim Pantoea agglomerans.
3. Mikroorganizm według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że mikroorganizm posiada rekombinacyjne geny kodujące syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową.
4. Mikroorganizm według zastrz. 1albo 2, znamienny tym, że posiada modyfikację, która przerywa gen kodujący dehydrogenazę kwasu a-ketoglutarowego.
5. Mikroorganizm według zastrz. 3, znamienny tym, że posiada modyfikację, która przerywa gen kodujący dehydrogenazę kwasu a-ketoglutarowego.
PL 194 140 B1
6. Mikroorganizm należący do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea wytwarzający kwas L-glutaminowy, znamienny tym, że gen kodujący dehydrogenazę kwasu a-ketoglutarowego w tym organizmie jest przerwany.
7. Mikroorganizm według zastrz. 6, znamienny tym, że jest nim Klebsiella planticola.
8. Sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego, w którym hoduje się mikroorganizm w płynnej pożywce wytwarzając i gromadząc kwas L-glutaminowy, po czym wyodrębnia się kwas L-glutaminowy z pożywki hodowlanej, znamienny tym, że hoduje się mikroorganizm należący do rodzaju Klebsiella lub rodzaju Erwinia lub rodzaju Pantoea wytwarzający kwas L-glutaminowy i posiadający rekombinacyjny gen kodujący co najmniej jeden enzym wybrany z grupy obejmującej syntazę cytrynianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianową i dehydrogenazę glutaminianową.
PL332071A 1998-03-18 1999-03-18 Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego PL194140B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6910698 1998-03-18
JP22490998 1998-08-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL332071A1 PL332071A1 (en) 1999-09-27
PL194140B1 true PL194140B1 (pl) 2007-04-30

Family

ID=26410290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL332071A PL194140B1 (pl) 1998-03-18 1999-03-18 Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego

Country Status (14)

Country Link
US (2) US6197559B1 (pl)
EP (1) EP0955368B1 (pl)
KR (1) KR100638497B1 (pl)
CN (2) CN1238515C (pl)
AU (1) AU746542B2 (pl)
BR (1) BR9901174B1 (pl)
DE (1) DE69941756D1 (pl)
ES (1) ES2334592T3 (pl)
ID (1) ID22267A (pl)
MY (1) MY124660A (pl)
PE (1) PE20000355A1 (pl)
PL (1) PL194140B1 (pl)
RU (1) RU2188236C2 (pl)
TW (1) TWI235177B (pl)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU756507B2 (en) * 1998-03-18 2003-01-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
US7247459B1 (en) * 1998-10-19 2007-07-24 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid producing bacterium and process for producing L-glutamic acid
JP2003159065A (ja) * 1999-07-19 2003-06-03 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
JP4427878B2 (ja) 1999-08-20 2010-03-10 味の素株式会社 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
DE19958160A1 (de) * 1999-12-02 2001-06-07 Degussa Neue für das gpm-Gen codierende Nukleotidsequenzen
US20030017554A1 (en) * 2000-11-15 2003-01-23 Mechthild Rieping Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
JP4599726B2 (ja) 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP4292724B2 (ja) * 2001-02-20 2009-07-08 味の素株式会社 有機態窒素含有組成物及びそれを含む肥料
DE10116518A1 (de) * 2001-04-03 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US7052883B2 (en) 2001-04-03 2006-05-30 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene
US20030059903A1 (en) * 2001-04-03 2003-03-27 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae that contain an attenuated aceA gene
JP2005510999A (ja) 2001-04-04 2005-04-28 ジェネンコー・インターナショナル・インク 宿主細胞における生成物の生産方法
US7241587B2 (en) * 2001-04-04 2007-07-10 Genencor International, Inc. Method of uncoupling the catabolic pathway of glycolysis from the oxidative membrane bound pathway of glucose conversion
DE10213365A1 (de) 2002-03-26 2003-10-09 Geka Brush Gmbh Haarfärbe-oder Kosmetik-Einheit
CN100383252C (zh) * 2003-05-07 2008-04-23 味之素株式会社 生产l-谷氨酸的方法
CN100510092C (zh) * 2003-06-10 2009-07-08 味之素株式会社 生产l-谷氨酸的方法
JP2006230202A (ja) * 2003-06-23 2006-09-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
US7344874B2 (en) 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7501282B2 (en) * 2005-02-25 2009-03-10 Ajinomoto Co., Inc. Plasmid autonomously replicable in Enterobacteriaceae family
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2007119574A2 (en) 2006-03-23 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
EP2007873B1 (en) 2006-04-18 2015-11-18 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2054500B1 (en) 2006-08-18 2016-11-23 Ajinomoto Co., Inc. An l-glutamic acid producing bacterium and a method for producing l-glutamic acid
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN101627110B (zh) 2007-01-22 2014-08-13 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010130899A (ja) 2007-03-14 2010-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
EP2149608A4 (en) 2007-04-16 2013-02-20 Ajinomoto Kk PROCESS FOR PRODUCING AN ORGANIC ACID
WO2008133161A1 (ja) 2007-04-17 2008-11-06 Ajinomoto Co., Inc. カルボキシル基を有する酸性物質の製造法
CN101939412B (zh) 2007-09-04 2016-01-20 味之素株式会社 生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
WO2009072562A1 (ja) 2007-12-06 2009-06-11 Ajinomoto Co., Inc. 有機酸の製造方法
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
EP2248906A4 (en) 2008-01-23 2012-07-11 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
EP2343371B1 (en) 2008-09-05 2015-10-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
EP2336347B1 (en) 2008-09-08 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid
RU2411289C2 (ru) * 2008-09-30 2011-02-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду pantoea, - продуцент l-аспартата или метаболита, являющегося производным l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболита, являющегося производным l-аспартата
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
JPWO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2013-01-10 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
CN103547671A (zh) * 2010-11-22 2014-01-29 美国佛罗里达大学研究基金会公司 制造d型乳酸的耐热凝结芽孢杆菌的基因工程
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2496867C2 (ru) 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
CN103930557A (zh) 2011-11-11 2014-07-16 味之素株式会社 利用发酵法制造目标物质的方法
CN103205390A (zh) * 2013-04-12 2013-07-17 北京轻发生物技术中心 一种l-谷氨酸基因工程菌及其应用
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
CN103397006A (zh) * 2013-08-14 2013-11-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶（rdh）及其编码基因与应用
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
JP5958653B2 (ja) 2013-10-02 2016-08-02 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
BR112018017227A2 (pt) 2016-02-25 2019-02-05 Ajinomoto Kk método para produzir um l-aminoácido
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR102008673B1 (ko) 2017-12-07 2019-08-09 대상 주식회사 락토바실러스 퍼멘텀 c-7a 균주 및 이의 용도
BR112020004575B1 (pt) 2018-03-09 2023-03-14 Cj Cheiljedang Corporation Polinucleotídeo, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium, métodos para produção de substância-alvo e para preparar uma composição fermentada.
EP3778901A4 (en) 2018-03-27 2021-12-22 CJ Cheiljedang Corporation NEW PROMOTER AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF L-AMINO ACID USING THE PROMOTER
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
CN110951766B (zh) * 2019-12-23 2023-02-24 江西农业大学 利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成l-鸟氨酸的方法
WO2022055094A1 (ko) 2020-09-09 2022-03-17 씨제이제일제당 (주) L-글루탐산 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조방법
KR102339271B1 (ko) 2021-05-07 2021-12-14 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이의 용도
KR102339264B1 (ko) 2021-05-07 2021-12-14 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이의 용도
EP4105332A4 (en) * 2021-05-07 2022-12-28 CJ Cheiljedang Corporation NOVEL PROMOTER AND USE THEREOF
KR102665227B1 (ko) 2021-06-30 2024-05-10 씨제이제일제당 주식회사 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
KR20230042953A (ko) 2021-09-23 2023-03-30 씨제이제일제당 (주) 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
US20240117393A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
CN116731950A (zh) * 2023-08-10 2023-09-12 中国科学院天津工业生物技术研究所 谷氨酸棒杆菌抗逆工程菌及其在生产酸性生物基化学品中应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2490495A1 (fr) * 1980-09-19 1982-03-26 Roussel Uclaf Nouvelles glycoproteines hydrosolubles immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant
JPS61268183A (ja) 1985-05-24 1986-11-27 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物
IL80510A0 (en) 1985-11-08 1987-02-27 Genetics Inst Improved yeast strains
JPH06825A (ja) 1992-06-09 1994-01-11 Minnesota Mining & Mfg Co <3M> 樹脂中空製品の金属中子の溶融除去方法
JP3880636B2 (ja) * 1994-01-10 2007-02-14 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
WO1997008294A1 (fr) * 1995-08-23 1997-03-06 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production d'acide l-glutamique par fermentation
JPH09285294A (ja) 1996-04-23 1997-11-04 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
US6280986B1 (en) * 1997-12-01 2001-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Stabilization of pet operon plasmids and ethanol production in bacterial strains lacking lactate dehydrogenase and pyruvate formate lyase activities

Also Published As

Publication number Publication date
US6682912B2 (en) 2004-01-27
MY124660A (en) 2006-06-30
DE69941756D1 (de) 2010-01-21
EP0955368B1 (en) 2009-12-09
BR9901174B1 (pt) 2011-10-04
CN1233661A (zh) 1999-11-03
CN1238515C (zh) 2006-01-25
PE20000355A1 (es) 2000-04-24
AU746542B2 (en) 2002-05-02
EP0955368A3 (en) 2001-09-19
US6197559B1 (en) 2001-03-06
EP0955368A2 (en) 1999-11-10
AU2122499A (en) 1999-09-30
PL332071A1 (en) 1999-09-27
TWI235177B (en) 2005-07-01
KR100638497B1 (ko) 2006-10-26
RU2188236C2 (ru) 2002-08-27
ES2334592T3 (es) 2010-03-12
CN1626667A (zh) 2005-06-15
BR9901174A (pt) 2000-03-28
US20020004231A1 (en) 2002-01-10
CN1291026C (zh) 2006-12-20
KR19990077974A (ko) 1999-10-25
ID22267A (id) 1999-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL194140B1 (pl) Mikroorganizm wytwarzający kwas L-glutaminowy i sposób wytwarzania kwasu L-glutaminowego
KR100626102B1 (ko) Ｌ-글루탐산을 생산하는 박테리아 및 이를 생산하는 방법
KR100866479B1 (ko) 침전을 수반하는 발효에 의한 ｌ-글루타민산의 생산 방법
US6596517B2 (en) Method for producing L-glutamic acid
KR100674401B1 (ko) Ｌ-글루탐산-생성 세균 및 ｌ-글루탐산 제조 방법
RU2282662C2 (ru) Способ получения l-глутаминовой кислоты
JP3921866B2 (ja) Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP4292724B2 (ja) 有機態窒素含有組成物及びそれを含む肥料
JP4144098B2 (ja) Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP2000232890A (ja) 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080318