CN101939412B - 生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法 - Google Patents

生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法 Download PDF

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Abstract

在培养基，例如包含乙醇或脂肪酸作为碳源的培养基中培养具有选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸的生产能力、且经过修饰而增加了丙酮酸合酶或丙酮酸：NADP+氧化还原酶的活性的微生物，使该培养基中或菌体内生成并蓄积所述L-氨基酸，并从该培养基或菌体采集L-氨基酸。

Description

生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
技术领域
本发明涉及生产L-氨基酸的微生物以及L-氨基酸的生产方法。L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸被广泛地作为饲料添加剂等使用。此外，L-苯丙氨酸被作为甜味剂原料使用。L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸可用于氨基酸输液、滋补品。此外，L-丝氨酸可以用作食品添加剂、化妆品的原料等。
背景技术
为了通过使用微生物的发酵法生产L-氨基酸等目的物质，可以采用使用野生型微生物(野生株)的方法、使用从野生株衍生的营养缺陷型株的方法、使用从野生株作为各种药物抗性突变株衍生的代谢调节突变株的方法、使用兼具营养缺陷型株和代谢调节突变株二者的性质的菌株的方法等。
近年来，在目的物质的发酵生产中采用了重组DNA技术。例如，人们通过增强L-氨基酸生物合成体系酶编码基因或涉及L-氨基酸的分泌或抗性的蛋白质的编码基因的表达、或者增强L-氨基酸生物合成体系的碳源流入来提高微生物的L-氨基酸生产性能。
作为如上所述技术，例如，就L-赖氨酸而言，已知可以增强二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶等酶的编码基因的表达(专利文献1)，降低高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(专利文献2)和苹果酸酶(malicenzyme)(专利文献3)的活性等。
就L-苏氨酸而言，作为赋予L-苏氨酸和/或L-高丝氨酸抗性的基因，可以列举下列：rhtA基因(专利文献4)、rhtB基因(专利文献5)、rhtC基因(专利文献6)、yfiK、yeaS基因(专利文献7)。此外，还包括增强编码天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、以及天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)的基因的表达(专利文献8)，降低苏氨酸脱氢酶的活性(专利文献9)等。
就L-色氨酸而言，已知有解除磷酸甘油酸脱氢酶、邻氨基苯甲酸合酶的反馈抑制(专利文献10)，缺损色氨酸酶(专利文献11)等。
就L-苯丙氨酸而言，已知有解除分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的反馈抑制(专利文献12)，以及缺损分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物(专利文献13)等。
就L-缬氨酸而言，已知有生长需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突变株(专利文献14)等；对于L-亮氨酸，已知有解除异丙基苹果酸合酶的反馈抑制(专利文献15)等；对于L-异亮氨酸，已知有强化编码苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶的基因等的表达(专利文献16)等。
就L-丝氨酸而言，已知有携带降低了由丝氨酸导致的反馈抑制的3-磷酸甘油酸脱氢酶的菌株(专利文献17)，具有L-丝氨酸生产能力且增强了磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性中的至少一种的细菌，缺失L-丝氨酸分解能力的细菌(专利文献18)，以及具有偶氮丝氨酸或β-(2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性且具有L-丝氨酸生产能力的细菌(专利文献19)等。
专利文献1美国专利第6,040,160号
专利文献2美国专利第5,827,698号
专利文献3WO2005/010175
专利文献4美国专利第6,303,348号
专利文献5欧洲专利申请公开第0994190号
专利文献6欧洲专利申请公开第1013765号
专利文献7欧洲专利申请公开第1016710号
【专利文献8】WO2006/123764
【专利文献9】美国专利第7,179,623号
【专利文献10】美国专利第6,180,373号
【专利文献11】美国专利第4,371,614号
【专利文献12】美国专利第5,354,672号
【专利文献13】WO03/044191
【专利文献14】美国专利第5,888,783号
【专利文献15】美国专利第6,403,342号
【专利文献16】美国专利第5,998,178号
【专利文献17】美国专利第5,618,716号
【专利文献18】美国专利第6,037,154号
【专利文献19】美国专利第6,258,573号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题是：提供能够高效生产L-氨基酸的菌株，以及提供使用该菌株高效生产L-氨基酸的方法。
解决问题的手段
传统的L-氨基酸生产主要是以糖类作为碳源，利用丙酮酸脱氢酶为TCA循环提供乙酰CoA来实现的。但是，丙酮酸脱氢酶的反应伴有脱碳酸，必然要释放1分子的CO2。因此，本发明人等认为，为了进一步提高生产力，必须要减少这种脱碳酸。于是，本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果发现：以乙醇、脂肪酸等能提供乙酰CoA的物质为碳源，通过提高催化碳酸固定反应的酶--丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的酶活性，进一步通过增强铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性(该酶具有分别从氧化型铁氧还蛋白或氧化型黄素氧还蛋白生成对丙酮酸合酶的酶活性而言必要的还原型铁氧还蛋白或还原型黄素氧还蛋白的活性)、或者通过提高铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白产生能力，能够提高L-氨基酸的生产力，从而完成了本发明。
即，本发明如下述。
(1).一种微生物，其具有生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸的能力，且经过修饰而增强了丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性。
(2).上述的微生物，其经过修饰而增强了丙酮酸合酶的活性。
(3).上述的微生物，其经过修饰而增强了丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性。
(4).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性是通过增加编码丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的基因的表达量和/或增加所述基因的翻译量而增强的。
(5).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性是通过提高编码丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的基因的拷贝数或修饰所述基因的表达调节序列而增强的。
(6).上述的微生物，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因编码下述(A)～(D)中任一项所示的多肽，或下述(E)、(F)、(G)和(H)的多肽，或下述(E)、(F)、(G)、(H)、(I)和(J)的多肽：
(A)包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的多肽；
(B)包含在SEQIDNO：2中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；
(C)包含SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的多肽；
(D)包含在SEQIDNO：4中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；
(E)下述(E1)或(E2)的多肽：
(E1)包含SEQIDNO：57所示的氨基酸序列的多肽；
(E2)包含在SEQIDNO：57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且能够与至少(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的多肽；
(F)下述(F1)或(F2)的多肽：
(F1)包含SEQIDNO：59所示的氨基酸序列的多肽；
(F2)包含在SEQIDNO：59中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的多肽；
(G)下述(G1)或(G2)的多肽：
(G1)包含SEQIDNO：61所示的氨基酸序列的多肽；
(G2)包含在SEQIDNO：61中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的多肽；
(H)下述(H1)或(H2)的多肽：
(H1)包含SEQIDNO：63所示的氨基酸序列的多肽；
(H2)包含在SEQIDNO：63中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)和(G)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的多肽；
(I)下述(I1)或(I2)的多肽：
(I1)包含SEQIDNO：65所示的氨基酸序列的多肽；
(I2)包含在SEQIDNO：65中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的多肽；
(J)下述(J1)或(J2)的多肽：
(J1)包含SEQIDNO：67所示的氨基酸序列的多肽；
(J2)包含在SEQIDNO：67中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的多肽。
(7).上述的微生物，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因包含下述(a)～(d)中任一项的DNA，或下述(e)、(f)、(g)和(h)的DNA，或下述(e)、(f)、(g)、(h)、(i)和(j)的DNA：
(a)具有SEQIDNO：1所示的碱基序列的DNA；
(b)与SEQIDNO：1所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA；
(c)具有SEQIDNO：3所示的碱基序列的DNA；
(d)与SEQIDNO：3所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA；
(e)下述(e1)或(e2)的DNA：
(e1)具有SEQIDNO：56所示的碱基序列的DNA；
(e2)与SEQIDNO：56所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(f)、(g)、以及(h)所示的DNA一起编码具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA；
(f)下述(f1)或(f2)的DNA：
(f1)具有SEQIDNO：58所示的碱基序列的DNA；
(f2)与SEQIDNO：58所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(g)、以及(h)所示的DNA一起编码具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA；
(g)下述(g1)或(g2)的DNA：
(g1)具有SEQIDNO：60所示的碱基序列的DNA、
(g2)与SEQIDNO：60所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、以及(h)所示的DNA一起编码具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA；
(h)下述(h1)或(h2)的DNA：
(h1)具有SEQIDNO：62所示的碱基序列的DNA、
(h2)与SEQIDNO：62所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、以及(g)所示的DNA一起编码具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA；
(i)下述(i1)或(i2)的DNA：
(h1)具有SEQIDNO：64所示的碱基序列的DNA；
(h2)与SEQIDNO：64所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA一起编码具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA；
(j)下述(j1)或(j2)的DNA：
(j1)具有SEQIDNO：66所示的碱基序列的DNA；
(j2)与SEQIDNO：66所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA一起编码具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA。
(8).上述的微生物，其中，编码丙酮酸:NADP+氧化还原酶的基因编码下述(A)或(B)所示的多肽：
(A)包含SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的多肽；
(B)包含在SEQIDNO：6中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性的多肽。
(9).上述的微生物，其中，编码丙酮酸:NADP+氧化还原酶的基因包含下述(a)或(b)的DNA：
(a)具有SEQIDNO：5所示的碱基序列的DNA；
(b)与SEQIDNO：5所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性的多肽的DNA。
(10).上述的微生物，其经过修饰而增强了铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性。
(11).上述的微生物，其经过修饰而提高了产生铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的能力。
(12).上述的微生物，其经过修饰而降低了苹果酸酶的活性。
(13).上述的微生物，其经过修饰而降低了丙酮酸脱氢酶活性。
(14).上述的微生物，其经过修饰从而能够以需氧方式同化乙醇。
(15).上述的微生物，其中，所述微生物是属于选自埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属中的属的细菌。
(16).上述的微生物，其中，该微生物的NAD型苹果酸酶和NADP型苹果酸酶二者的活性均已降低。
(17).上述的微生物，其中，所述微生物为棒状杆菌型细菌。
(18).一种生产L-氨基酸的方法，其中，在培养基中培养上述的微生物，使该培养基中或菌体内生成并蓄积选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸，并从该培养基或菌体收集L-氨基酸。
(19).上述的方法，其中，所述培养基的特征在于含有乙醇或脂肪酸作为碳源。
附图说明
[图1]显示源自纤细裸藻(Euglenagracilis)的丙酮酸:NADP+氧化还原酶(PNO)基因的表达的Western印迹照片。泳道1：分子量标记，泳道2：WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr的粗酶抽提液，泳道3：WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr-PNO的粗酶抽提液
发明的具体实施方式
以下，对本发明进行具体说明。
<1>本发明的微生物
本发明的微生物是具有生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、以及L-丝氨酸中的L-氨基酸的能力，且经过了修饰而增强了丙酮酸合酶或丙酮酸：NADP+氧化还原酶的活性的微生物。
在本发明中，如无特殊说明，“L-氨基酸”是指所述的L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、和/或L-丝氨酸。
“L-氨基酸生产能力”是指当在培养基中培养本发明的微生物时，以可从细胞或培养基中回收的程度在细胞或培养基中生成、蓄积L-氨基酸的能力。本发明的微生物所生产的L-氨基酸可以是1种氨基酸，也可以是2种或2种以上的L-氨基酸。作为具备L-氨基酸生产能力的微生物，可以是本身具备L-氨基酸生产能力的微生物，也可以是通过利用突变法或重组DNA技术对如下文所述的微生物进行修饰而具备了L-氨基酸生产能力的微生物，或者可以是通过导入本发明的基因而被赋予了L-氨基酸生产能力的微生物。
此外，“增强丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性”包括如下两方面含义：在本身具有丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的微生物中，增强所述两种酶中的至少一种的活性；以及，对于赋予不具有丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的微生物，赋予其所述两种酶中的至少一种酶的活性。
<1-1>L-氨基酸生产能力的赋予
本发明的微生物可以通过以具有L-氨基酸生产能力的微生物作为亲本株，对其进行修饰以增强丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶或这两者的活性来获得。本发明的微生物还可以通过以经过了修饰使得丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性增强的微生物作为亲本株，并对其赋予或增强L-氨基酸生产能力来获得。
以下，示例说明对微生物赋予L-氨基酸生产能力的方法以及能够在本发明中使用的被赋予了L-氨基酸生产能力的微生物。但是，微生物只要具有L-氨基酸生产能力，并不限于此。
作为用于本发明的微生物，可以列举例如，属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等γ-变形细菌的肠杆菌科细菌，属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)的所谓棒状杆菌型(coryneform)细菌，属于脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属(Saccharomyces)等的微生物。γ-变形细菌可以使用依据NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)分类学数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi·id＝91347)公布的分类法归属的微生物。
作为埃希氏菌属细菌，可以列举大肠杆菌(Escherichiacoli)等。在采用基因工程方法选育大肠杆菌时，可以使用大肠杆菌K-12株及其衍生物大肠杆菌MG1655株(ATCC47076)和W3110株(ATCC27325)。大肠杆菌K-12株是在1922年由斯坦福大学分离出来的，它是λ噬菌体的溶原菌，具有F因子，是一种能够通过接合等手段来构建遗传重组体的、通用性高的菌株。此外，大肠杆菌K-12株的基因组序列已经测定，其基因信息也可以自由地使用。大肠杆菌K-12株及其衍生株可以从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)零售获得(住所：ATCC，地址：P.O.Box1549，Manassas，VA20108，UnitedStatesofAmerica)。
特别是，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为γ-变形细菌(γ-Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(J.Gen.Appl.Microbiol.1997，43：355-361；Int.J.Syst.Bacteriol.1997，47：1061-1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些被重新分类为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)或分散泛菌(Pantoeadispersa)等(Int.J.Syst.Bacteriol.1989，39：337-345)。此外，属于欧文氏菌属的细菌中，有些被重新分类为菠萝泛菌(Pantoeaananas)、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)(参照Int.J.Syst.Bacteriol.1993，43：162-173)。
肠杆菌属细菌包括例如成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)等。具体地，可以使用欧洲专利申请公开952221号说明书示例的菌株。作为肠杆菌属的代表性菌株，可以列举成团肠杆菌ATCC12287株。
作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以列举Pantoeaananatis、斯氏泛菌、成团泛菌、柠檬泛菌(Pantoeacitrea)。具体地，可以列举下述菌株。
PantoeaananatisAJ13355株(FERMBP-6614)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)
PantoeaananatisAJ13356株(FERMBP-6615)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)
而且，所述菌株在欧洲专利申请公开0952221号说明书中记载为成团肠杆菌，但现在，如上文所述，依据16SrRNA碱基序列分析它们已被重新分类为Pantoeaananatis。
作为欧文氏菌属细菌，可以列举解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)。具体地，可以列举下述菌株。
解淀粉欧文氏菌ATCC15580株
胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713株
植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERMBP-6600)(欧洲专利申请公开955368号说明书)
植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERMBP-6617)(欧洲专利申请公开955368号说明书)
本发明所称的棒状杆菌型细菌包括这样的微生物，它们是在《Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology》第8版599页(1974)中定义的一组微生物，包括为需氧性、革兰氏阳性、非耐酸性、无芽孢形成能力的杆菌，曾经归类于短杆菌属(Brevibacterium)但现在已经统一归类于棒杆菌属(Corynebacterium)的那些细菌(Liebl，W.etal.1991，Int.J.Syst.Bacteriol.41：255-260)，还包括与棒杆菌属极其近缘的短杆菌属细菌和微杆菌属细菌。
作为适于在L-谷氨酸类氨基酸的生产中应用的棒状杆菌型细菌，可以列举例如以下所示的菌株。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)
烷醇棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacteriumcallunae)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)
百合花棒杆菌(Corynebacteriumlilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)
力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)
二歧短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)(谷氨基酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))
黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)(谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))
Brevibacteriumimmariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)(谷氨基酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))
玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)
解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)
生硫短杆菌(Brevibacteriumthiogenitalis)
产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)(产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes))
白色棒杆菌(Brevibacteriumalbum)
蜡状短杆菌(Brevibacteriumcerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)
具体地，可以列举诸如下述的菌株。
嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERMBP-1539)
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826、ATCC14067
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13665、ATCC13869
产氨短杆菌(产氨棒杆菌)ATCC6871
用于本发明的细菌可以是具有乙醇同化性的细菌。作为这样的细菌，可以是本来具有乙醇同化性的细菌，也可以是被赋予了乙醇同化性的重组菌株，还可以是提高了乙醇同化性的突变菌株。在大肠杆菌中，作为在厌氧条件下生成乙醇的酶，已知有可逆地催化以下反应的具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的AdhE的存在。
乙酰-CoA+NADH+H+→乙醛+NAD++CoA
乙醛+NADH+H+→乙醇+NAD+
大肠杆菌在需氧条件下不能同化乙醇，但已知其通过AdhE的突变，可变得能够以需氧方式同化乙醇(ClarkD.P.，andCronan，J.E.Jr.1980.J.Bacteriol.144：179-184；Membrillo-Hernandez，J.etal.2000.J.Biol.Chem.275：33869-33875)。作为这样的具有突变的AdhE突变体，具体地有大肠杆菌AdhE的第568位的谷氨酸残基被谷氨酸和天冬氨酸以外的氨基酸残基、例如赖氨酸取代而得到的突变体(Glu568Lys、E568K)。
而且，所述AdhE突变体还可以包含以下的附加突变。
A)第560位的谷氨酸残基被其它氨基酸残基、例如赖氨酸残基所取代；
B)第566位的苯丙氨酸残基被其它氨基酸残基、例如缬氨酸残基所取代；
C)第22位的谷氨酸残基、第236位的甲硫氨酸残基、第461位的酪氨酸残基、第554位的异亮氨酸残基以及第786位的丙氨酸残基被其它氨基酸残基、例如分别被甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基以及缬氨酸残基所取代；或
D)上述突变的组合。
已知谷氨酸棒杆菌具有多种醇脱氢酶，能够以需氧方式同化乙醇(Pelechova，J.etal.1980.FoliaMicrobiol(Praha)25：341-346)。
用于本发明的细菌还可以是具有油脂或脂肪酸同化性的细菌。这样的细菌可以是本来就具有油脂或脂肪酸同化性的细菌，也可以是赋予了油脂或脂肪酸同化性的重组菌株，还可以是提高了油脂或脂肪酸同化性的突变菌株。已知在大肠杆菌中能够同化链长12以上的长链脂肪酸(Clark，D.P.andCronan，J.E.1996.InEscherichiacoliandSalmonella：CellularandMolecularBiology/SecondEdition(Neidhardt，F.C.Ed.)pp.343-357)。而且，已知能够利用中链、短链脂肪酸的大肠杆菌突变株(Nunn，W.D.etal.1979.J.Biol.Chem.254：9130-9134；Salanitro，J.P.andWegener，W.S.1971.J.Bacteriol.108：885-892)。
在本发明中，具有L-氨基酸生产能力的细菌是指具有下述能力细菌：当在培养基中进行培养时，能够生产L-氨基酸、并能够使L-氨基酸在培养基中蓄积到可从培养基回收的程度。优选能够使目的L-氨基酸以优选0.5g/L以上、更优选1.0g/L以上的量在培养基中蓄积的细菌。L-氨基酸包括L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸。特别是，优选L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸。
以下，说明对如上所述的细菌赋予L-氨基酸生产能力的方法，或增强如上所述的细菌的L-氨基酸生产能力的方法。
为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株，创建L-氨基酸生物合成系统酶表达增强的重组菌株等等(参见《アミノ酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，被赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强可以组合进行。
具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株可如下地获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或紫外线照射或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理；其后，从所得的突变菌株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌株。
此外，可以通过进行基因重组增强酶活性，来赋予或增强L-氨基酸生产能力。就酶活性的增强而言，包括例如通过修饰细菌以增强编码与L-氨基酸的生物合成相关的基因的表达的方法。增强基因的表达的方法可以通过下述方式实现：导入通过将包含所述基因的DNA片段导入合适的质粒(例如至少包含负责质粒在微生物内的复制增殖功能的基因的质粒载体)而得到的扩增质粒；或者通过接合、基因转移等使所述基因在染色体上多拷贝化；抑或在这些基因的启动子区域导入突变等(参考国际公开小册子WO95/34672号)。
当向上文所述的扩增质粒或者染色体上导入目的基因时，用于表达所述基因的启动子可以是任何能够在属于肠杆菌科的细菌中发挥功能的启动子，可以是所使用的基因自身的启动子，也可以是经过修饰的启动子。也可以通过适当地选择在L-氨基酸生产菌中强力发挥功能的启动子，或者通过使启动子的-35、-10区域与共有序列接近，来进行基因表达量的调节。如上所述的增强酶基因表达的方法，在WO00/18935号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等中有记载。
下面，对于给细菌赋予L-氨基酸生产能力的方法、以及被赋予了L-氨基酸生产能力的细菌进行示例。
L-赖氨酸生产菌
属于埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌的实例可以列举出对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株。L-赖氨酸类似物可抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是这种抑制在当L-赖氨酸共存于培养基中时会被全部或部分解除。L-赖氨酸类似物的实例可以列举出、但不限于，氧代赖氨酸，赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)，S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯代己内酰胺等。这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株可以通过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理来得到。可用于L-赖氨酸生产的菌株的具体实例可以列举出大肠杆菌AJ11442(参考FERMBP-1543，NRRLB-12185；参见美国专利第4,346,170号)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对由天冬氨酸激酶的反馈抑制已被解除。
WC196株可以用作大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌。该菌株是通过对大肠杆菌K-12来源的W3110株赋予AEC抗性来选育获得的。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069，于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERMP-14690，并于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERMBP-5252(美国专利第5,827,698号)。
作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株，可以列举出L-赖氨酸生物合成系统酶的1种或者2种以上的活性被增强的菌株。相关的酶包括，但不限于：二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利第6,040,160号)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD)(tetrahydrodipicolinicacidsuccinylase)、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶(dapE)(succinyldiaminopimelicaciddeacylase)以及天冬氨酸酶基因(aspA)(EP1253195A)。酶名称后的括号内为基因名称(下同)。在这些酶中，特别优选为二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶。此外，可以增强亲本株中下述基因的表达水平：与能量效率相关的基因(cyo)(EP1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利第5,830,716号)、ybjE基因(WO2005/073390)、或所述基因的组合。
作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-氨基酸生产菌的亲本株的例子，还可以列举催化通过从L-氨基酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性减少或者缺损的菌株。作为催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸之外的化合物的反应的酶的例子，可以列举出高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利第5,827,698号)、和苹果酸酶(WO2005/010175)。
作为优选的L-赖氨酸生产菌，可以列举出大肠杆菌WC196Δmez/pCABD2(WO2005/010175)、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2(WO2006/078039)等。WC196Δmez/pCABD2株是通过在WC196Δmez株中导入美国专利第6040160所述的质粒pCABD2而获得的菌株，所述WC196Δmez株是通过破坏WC196株的编码苹果酸酶的sfcA和b2463基因而制作的。WC196Δmez株的详细情况在WO2005/010175中有记载。sfcA基因和b2463基因的碱基序列、以及各基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO：52～55所示。
WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株是通过在编码赖氨酸脱羧酶的cadA以及ldcC基因被破坏的WC196株中导入美国专利第6040160所述的质粒pCABD2而获得的菌株。pCABD2包含：编码具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变的大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突变型dapA基因、编码具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变的大肠杆菌来源天冬氨酸激酶III的突变型lysC基因、编码源自大肠杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因、以及编码源自乳发酵短杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。
L-苏氨酸生产菌
作为具有L-苏氨酸生产能力的微生物优选实例可以列举出增强了L-苏氨酸生物合成系统酶的1种或2种以上的活性的细菌。作为L-苏氨酸生物合成系统酶，可以列举出天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、thr操纵子所编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)、苏氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。括号里为该基因的简写符号(下同)。这些酶中特别优选天冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶、以及苏氨酸合酶。也可以将L-苏氨酸生物合成系统基因导入苏氨酸分解受到抑制的埃希氏属细菌中。作为苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌，例如可以列举出苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH-6菌株(特开2001-346578号、美国专利第7,179,623号)。
L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受最终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生产菌合成系统基因进行修饰以使所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构，苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且表达受到弱化作用的抑制。这种修饰可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现(参照Lynn，S.P.etal.，J.F.J.Mol.Biol.194：59-69(1987)；国际公开第02/26993号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。
苏氨酸操纵子的上游存在天然启动子，但可以用非天然启动子将其取代(参考WO98/04715号小册子)，也可以构建苏氨酸操纵子使得苏氨酸生物合成的相关的基因的表达受到λ噬菌体的阻遏物(repressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。此外，为了对细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，可以通过选择对α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来实现。
对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的是其在宿主内的拷贝数有所提高、或者是其连接于强启动子而表达量有所增加。除了通过使用质粒的扩增来提高拷贝数之外，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向基因组中转移苏氨酸操纵子来提高拷贝数。
理想的是，除了L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强与糖酵解系统、TCA循环或呼吸链相关的基因或调控基因表达的基因，或者糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中有效的基因的实例可以列举出，转氢酶基因(pntAB)(欧洲专利733712号说明)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或者芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。
此外，强化赋予L-苏氨酸抗性的基因、赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或对宿主赋予L-苏氨酸抗性、L-高丝氨酸抗性，也是合适的。作为可以赋予抗性的基因的实例，可以列举出rhtA基因(Res.Microbiol.154：123-135(2003))、rhtB基因(欧洲专利申请公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)、yfiK、yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可以参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子中所记载的方法。
作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举：大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPMB-3996)(美国专利第5,175,107号、美国专利第5,705,371号)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC98081)(美国专利第5,631,157号)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利第5,939,307号)、大肠杆菌FERMBP-3756(美国专利第5,474,918号)、大肠杆菌FERMBP-3519和FERMBP-3520(美国专利第5,376,538号)、大肠杆菌MG442(Gusyatineretal.，Genetika(俄语)，14，947-956(1978))、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。
TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突变(leakymutation)。该菌株的rhtA基因也有赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性的突变。B-3996菌株包含pVIC40，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到由RSF1010获得的载体中而获得的。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I对苏氨酸的反馈抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于All-UnionScientificCenterofAntibiotics(全联盟抗生素科学中心)(NagatinskayaStreet3-A，117105Moscow，Russia)，保藏号为RIA1867。该菌株也在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM)(1Dorozhnyproezd.，1Moscow117545，Russia)，保藏号为B-3996。
还可以使用大肠杆菌VKPMB-5318(EP0593792B)作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株。B-5318菌株是异亮氨酸原养型的，并且pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域被置换为温度敏感的λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子。VKPMB-5318菌株在1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，1Dorozhnyproezd.，1Moscow117545，Russia)，保藏号为VKPMB-5318。
编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的大肠杆菌thrA基因已经阐明(核苷酸编号337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrL基因和thrB基因之间。大肠杆菌的编码高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(核苷酸编号2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA基因和thrC基因之间。大肠杆菌的编码苏氨酸合酶的thrC基因已经阐明(核苷酸编号3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所述3个基因全部作为一个单独的苏氨酸操纵子发挥功能。为增强苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子中将影响转录的弱化子区域去除(WO2005/049808，WO2003/097839)。
编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因可以作为一个操纵子从熟知的pVIC40质粒中获得，该质粒存在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPMB-3996菌株中。pVIC40质粒在美国专利5,705,371中有详述。
大肠杆菌的rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上的18min处，靠近编码谷氨酰胺转运系统的成分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸编号764至1651，GenBank登录号AAA218541，gi：440181)相同，位于pexB与ompX基因之间。表达由ORF1编码的蛋白的单元称为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸抗性)。此外，已经证明rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置用G→A取代(ABSTRACTSofthe17thInternationalCongressofBiochemistryandMolecularBiologyinconjugationwithAnnualMeetingoftheAmericanSocietyforBiochemistryandMolecularBiology(第17界国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学协会年会摘要)，SanFrancisco，California，1997年8月24-29日，摘要号457，EP1013765A)。
大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸编号3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16131307)，并且可以根据该基因的碱基序列利用引物通过PCR来获得(参见White，T.J.等，TrendsGenet.，5，185(1989))。其它微生物的asd基因可以通过类似方式获得。
此外，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸编号983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16128895)，并且可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因可以通过类似方式获得。
L-色氨酸生产菌
L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如可以使用由突变的trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷的大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美国专利5,756,345)；具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)的trpE等位基因的大肠杆菌SV164(pGH5)(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRLB-12264)(美国专利4,371,614)；产生磷酸烯醇丙酮酸的能力增强的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利6,319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增加的产生L-色氨酸的属于埃希氏菌属的细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
L-色氨酸生产菌和用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出下述菌株，该菌株的选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮醛酸-7-磷酸合酶(3-デオキシ-D-アラビノヘプツロン酸-7-リン酸シンタ一ゼ)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate3-phosphatesynthase)(aroA)、分支酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1种或2种以上的酶的活性被增强。预苯酸脱水酶以及分支酸变位酶作为双功能酶(CM-PD)，由pheA基因编码。在这些酶中，特别优选磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮醛酸-7-磷酸合酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者均受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此也可以向这些酶中导入使反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164和通过将质粒pGH5(WO94/08031)转入大肠杆菌SV164获得的菌株，所述质粒pGH5包含突变的serA基因，该突变的serA基因编码反馈抑制被解除了的磷酸甘油酸脱氢酶。
L-色氨酸生产菌或者用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出，导入了包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利4,371,614)。此外，可以也通过增强色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚基组成，这两种亚基分别由trpA和trpB基因编码。另外，还可以通过增强异柠檬酸裂解酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。
L-苯丙氨酸生产菌
L-苯丙氨酸生产菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举出，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物缺损的大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)(WO03/044191)，携带了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利第5,354,672号)，大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)、大肠杆菌NRRLB-12141、NRRLB-12145、NRRLB-12146以及NRRLB-12147(美国专利第4,407,952号)等。此外，也可以使用携带有编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERMBP-12659)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERMBP-12662)以及命名为AJ12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERMBP-3579)作为亲本株(EP488424B1)。此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性增强的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1以及2003/0157667A1、WO03/044192)。
L-缬氨酸生产菌
L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株实例包括、但不限于经修饰从而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5,998,178)。理想的是将ilvGMEDA操纵子中对于衰减作用而言必要的区域移除，以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，理想的是将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。
L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的实例还包括具有氨酰t-RNA合成酶中的突变的突变株(美国专利5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，113545Moscow，1DorozhnyProezd.)，保藏号为VKPMB-4411。
此外，还可以使用生长需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突变株(WO96/06926、美国专利第5,888,783号)作为亲本株。
此外，作为属于埃希氏菌属的L-缬氨酸生产菌，还可以使用H-81(VKPMB-8066)、NRRLB-12287和NRRLB-12288(美国专利4,391,907)、VKPMB-4411(美国专利5,658,766)、VKPMB-7707(欧洲专利申请1016710A2)等。H-81株于2001年1月30日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(1Dorozhnyproezd.，1Moscow117545，Russia)，保藏号VKPMB-8066，并于2002年2月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏。
L-亮氨酸生产菌
L-亮氨酸生产菌或者用于衍生L-亮氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美国专利第6,124,121号))或对β-2-噻吩基丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-偶氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等亮氨酸类似物有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)、通过WO96/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株、大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)等。
可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的1种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例可优选列举leuABCD操纵子中的基因，所述操纵子中的基因以突变的leuA基因为代表，该基因编码对L-亮氨酸反馈抑制具有抗性的异丙基苹果酸合酶(美国专利6,403,342)。此外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的1种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。
L-异亮氨酸生产菌
L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出、但不限于对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxatesynthase)等涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白质的基因转化的重组菌株(特开平2-458号，FR0356739，和美国专利第5,998,178号)作为亲本株。
L-丝氨酸生产菌
作为L-丝氨酸生产菌或用于衍生L-丝氨酸的亲本株的例子，可以列举出携带丝氨酸反馈抑制减弱的3-磷酸甘油酸脱氢酶的大肠杆菌(专利2584409号、美国专利第5,618,716号)。此外，还可以使用具有L-丝氨酸生产能力且磷酸丝氨酸磷氧化酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性中的至少一种增强的棒状杆菌型细菌、L-丝氨酸分解能力缺失的棒状杆菌型细菌(特开平11-253187号、美国专利第6,037,154号)、以及偶氮丝氨酸或β-(2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性的具有L-丝氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开平11-266881号、美国专利第6,258,573号)。
当通过基因重组来选育上述L-氨基酸生产菌时，所使用的基因不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不损害所编码的蛋白质的功能的前提下，也可以使用这些基因的同源物、人工修饰体等具有保守突变的基因。即，还可以是编码具有在公知蛋白质的氨基酸序列中在1个或数个位置上取代、缺失、插入或添加1个或者数个氨基酸而得到的序列的蛋白质的基因。关于“保守突变”，在后面关于丙酮酸合酶等的内容中有描述，其也适用于上述基因。
<1-2>丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性的增强
本发明的微生物是对诸如上述的具有L-氨基酸生产能力的微生物进行了修饰使得其丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性增强而得到的微生物。对于增强丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性的修饰而言，优选进行修饰使得与亲本株例如野生株、非修饰株相比，丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性增强。而且，正如所述，当微生物本来不具有丙酮酸合酶活性时，通过修饰而具有了该酶活性的微生物，其丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性与非修饰株变得更强。
可以先对细菌进行修饰使得其丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的酶活性提高，然后再赋予L-氨基酸生产能力。而且，丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性的增强可以采用如前文所述的增强基因表达的方法来进行。即，可以通过以启动子修饰为代表的表达调节区域修饰等来增强内源性丙酮酸合酶基因或丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因的表达，也可以通过在细菌中导入包含丙酮酸合酶基因或丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因的质粒或通过在细菌染色体上导入所述基因等来增强外源性丙酮酸合酶基因的表达。
本发明中的“丙酮酸合酶”是指在电子供体存在下，例如在铁氧还蛋白或者黄素氧还蛋白存在下，可逆地催化由乙酰基-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反应的酶(EC1.2.7.1)。丙酮酸合酶也可简称为PS，或者有些情况下还被命名为丙酮酸氧化还原酶、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸氧化还原酶。作为电子供体，可以使用铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白。
还原型铁氧还蛋白+乙酰-CoA+CO2→氧化型铁氧还蛋白+丙酮酸+CoA
丙酮酸合酶的活性增强的确认，可以通过从增强前微生物和增强后的微生物制备粗酶液、并比较它们的丙酮酸合酶活性来实现。丙酮酸合酶的活性可以按照例如Yoon等的方法(Yoon，K.S.etal.1997.Arch.Microbiol.167：275-279)来测定。例如，向包含作为电子受体的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶液的反应液中添加丙酮酸，采用光谱学方法测定因丙酮酸的脱碳酸反应而增加的还原型甲基紫精的量，这样就可以测定丙酮酸合酶的活性。1个酶活性单位(U)表示为每1分钟1μmol甲基紫精的还原量。当亲本株具有丙酮酸合酶活性时，理想的是，与亲本株相比较，酶活性上升优选1.5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。此外，当亲本株不具有丙酮酸合酶活性时，只要通过导入丙酮酸合酶基因生成丙酮酸合酶即可，但理想的是，优选酶活性被增强到可测定的程度，优选0.001U/mg(菌体蛋白)以上、更优选0.005U/mg以上、更优选0.01U/mg以上。丙酮酸合酶对氧敏感，通常来说其活性表达和测定也往往较为困难(Buckel，W.andGolding，B.T.2006.Ann.Rev.ofMicrobiol.60：27-49)。因此，在测定酶活性时，优选如实施例中描述的那样，降低反应容器中的氧浓度来进行酶反应。
作为编码丙酮酸合酶的基因，可以利用绿硫菌(Chlorobiumtepidum)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacterthermophilus)等具有还原性TCA循环的细菌的丙酮酸合酶基因。此外，也可以利用以大肠杆菌(Escherichiacoli)代表的属于肠杆菌科细菌群(腸内細菌群)的细菌来源的丙酮酸合酶基因。而且，作为编码丙酮酸合酶的基因，还可以利用海藻甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、高温弯曲甲烷热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)等自养型产甲烷古细菌(autotrophicmethanogens)的丙酮酸合酶基因。
具体地，作为绿硫菌(Chlorobiumtepidum)的丙酮酸合酶基因，可以列举出具有位于绿硫菌基因组序列(GenBank登录号：NC_002932)的碱基序号1534432～1537989的、SEQIDNO：1所示的碱基序列的基因。SEQIDNO：2中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：AAC76906)。此外，已知嗜热氢杆菌的丙酮酸合酶由δ亚基(GenBank登录号：BAA95604)、α亚基(GenBank登录号BAA95605)、β亚基(GenBank登录号：BAA95606)、γ亚基(GenBank登录号：BAA95607)这4个亚基的复合体形成(Ikeda，T.etal.2006.Biochem.Biophys.Res.Commun.340：76-82)。而且，还可以示例出由位于幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)基因组序列(GenBank登录号：NC000915)的碱基序号1170138～1173296的HP1108、HP1109、HP1110、HP1111这4个基因构成的丙酮酸合酶基因，由硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)基因组序列(GenBank登录号：NC002754)的碱基序号1047593～1044711所示的SSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206这4个基因编码的丙酮酸合酶基因。而且，丙酮酸合酶基因还可以基于与上述示例的基因的同源性，从绿硫菌属(Chlorobium)、脱硫菌属(Desulfobacter)、产液菌属(Aquifex)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、热变形菌属(Thermoproteus)、热棒菌属(Pyrobaculum)细菌等中克隆。
在大肠杆菌中，ydbK基因(b1378)位于K-12株基因组序列(GenBank登录号：U00096)的碱基序号1435284～1438808，具有SEQIDNO：3所示的碱基序列；从序列同源性推测，其编码丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、即丙酮酸合酶。SEQIDNO：4中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：AAC76906)。如实施例所示，证实了该基因产物具有丙酮酸合酶活性，通过强化该基因的表达，能够提高L-氨基酸生产能力。而且，丙酮酸合酶基因还可以是与大肠杆菌丙酮酸合酶基因(ydbK)具有高同源性的、属于埃希氏菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)等肠杆菌科细菌群的丙酮酸合酶基因。
海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)的丙酮酸合酶由位于海沼甲烷球菌基因组序列(GenBank登录号：NC_005791)(Hendrickson，E.L.etal.2004.J.Bacteriol.186：6956-6969)的碱基序号1462535～1466397的porCDABEF操纵子编码(Lin，W.C.etal.2003.Arch.Microbiol.179.444-456)。已知该丙酮酸合酶包含γ、α、β和δ这4个亚基，除了所述亚基之外，PorE和PorF对丙酮酸合酶的活性而言也是重要的(Lin，W.andWhitman，W.B.2004.Arch.Microbiol.181：68-73)。γ亚基由基因组序列的碱基序号1465867～1466397(互补链)的porA基因编码，SEQIDNO：56中示出了其碱基序列，SEQIDNO：57中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：NP_988626)。δ亚基由基因组序列的碱基序号1465595～1465852(互补链)的porB基因编码，SEQIDNO：58中示出了其碱基序列，SEQIDNO：59中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：NP_988627)。α亚基由基因组序列的碱基序号1464410～1465573(互补链)的porC基因编码，SEQIDNO：60中示出了其碱基序列，SEQIDNO：61中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：NP_988625)。β亚基由基因组序列的碱基序号1463497～1464393(互补链)的porD基因编码，SEQIDNO：62中示出了其碱基序列，SEQIDNO：63中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：NP_988624)。PorE由基因组序列碱基序号1462970～1463473(互补链)的porE基因编码，SEQIDNO：64中示出了其碱基序列，SEQIDNO：65中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：NP_988623)。PorF由基因组序列碱基序号1462535～1462951(互补链)的porF基因编码，SEQIDNO：66中示出了其碱基序列，SEQIDNO：67中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：NP_988622)。
已知自养型的甲烷生成古细菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、高温弯曲甲烷热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)等也具有相同基因结构的丙酮酸合酶基因，可以加以利用。
本发明中，“丙酮酸:NADP+氧化还原酶”是指：在电子供体存在下，例如在NADPH或者NADH存在下，可逆地催化由乙酰-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反应的酶(EC1.2.1.15)。丙酮酸:NADP+氧化还原酶有时简称为PNO，有些情况下还被命名为丙酮酸脱氢酶。然而，本发明中在提及“丙酮酸脱氢酶活性”时，是指如文后述的催化丙酮酸氧化脱碳酸生成乙酰-CoA的反应的活性，催化该反应的丙酮酸脱氢酶(PDH)与丙酮酸:NADP+氧化还原酶不是同一种酶。丙酮酸:NADP+氧化还原酶可以利用NADPH或者NADH作为电子供体。
NADPH+乙酰-CoA+CO2→NADP++丙酮酸+CoA
丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性增强这一事实的确认，可以通过从增强前的微生物和增强后的微生物制备粗酶液、并比较它们的丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性来实现。丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性可以按照例如Inui等的方法(Inui，H.etal.1987.J.Biol.Chem.262：9130-9135)来测定。例如，向包含作为电子受体的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶液的反应液中添加丙酮酸，采用光谱学方法测定由于丙酮酸的脱碳酸反应而增加的还原型甲基紫精的量，这样就可以测定丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性。1个酶活性单位(U)表示为每1分钟1μmol甲基紫精的还原量。当亲本株具有丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性时，理想的是，与亲本株相比较，酶活性上升优选1.5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。此外，当亲本株不具有丙酮酸:NADP+氧化还原酶活性时，只要通过导入丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因可生成丙酮酸:NADP+氧化还原酶即可，但理想的是，优选酶活性被强化到可测定的程度，优选0.001U/mg(菌体蛋白)以上、更优选0.005U/mg以上、更优选0.01U/mg以上。丙酮酸:NADP+氧化还原酶对氧敏感，因而其活性表达和测定通常来说也存在许多困难(Inui，H.etal.1987.J.Biol.Chem.262：9130-9135；Rotte，C.etal.2001.Mol.Biol.Evol.18：710-720)。在由于失活等原因无法测定活性的情况下，可以像实施例所述那样，通过Western印迹等方法来确认蛋白质的表达。
编码丙酮酸:NADP+氧化还原酶的基因除了作为光合成真核微生物(也被分类为原生动物)的纤细裸藻(Euglenagracilis)的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因(Nakazawa，M.etal.2000.FEBSLett.479：155-156)、原生生物小球隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因(Rotte，C.etal.2001.Mol.Biol.Evol.18：710-720)之外，已知在硅藻假微型海链藻(Tharassiosirapseudonana)中也存在同源基因(Ctrnacta，V.etal.2006.J.Eukaryot.Microbiol.53：225-231)。
具体地，作为纤细裸藻(Euglenagracilis)的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因，可以示例出具有SEQIDNO：5所示的碱基序列的基因(GenBank登录号：AB021127)。SEQIDNO：6中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号：BAB12024)。
本发明的微生物还可以是经过了如下的修饰而使得丙酮酸合酶的活性增强的微生物，所述修饰使得与亲本株例如野生株或非修饰株相比，将电子供体从氧化型再生为还原型的活性(该活性对于丙酮酸合酶的活性而言是必需的)增强。将氧化型电子供体再生为还原型的活性包括例如铁氧还蛋白-NADP+还原酶活性。此外，还可以是经过了如下的修饰而使得丙酮酸合酶的活性增强的微生物，所述修饰除了增强电子供体的再生活性之外还增加丙酮酸合酶基因的表达。而且，上述亲本株可以是天然内在地具有编码电子供体的再生活性的基因的微生物，也可以是并非天然具有电子供体的再生活性，但通过导入编码该活性的基因而被赋予了该活性，从而L-谷氨酸生产能力变得更高的微生物。
“铁氧还蛋白-NADP+还原酶”是指可逆地催化以下反应的酶(EC1.18.1.2)。
还原型铁氧还蛋白+NADP+-→氧化型铁氧还蛋白+NADPH+H+
本反应是可逆反应，能够在NADPH和氧化型铁氧还蛋白的存在下生产还原型铁氧还蛋白。铁氧还蛋白可以替换成黄素氧还蛋白，命名为黄素氧还蛋白-NADP+还原酶的酶也具有同等功能。已经确认铁氧还蛋白-NADP+还原酶在从微生物到高等生物中普遍存在(参照Carrillo，N.和Ceccarelli，E.A.2003.Eur.J.Biochem.270：1900-1915；Ceccarelli，E.A.etal.2004.Biochim.Biophys.Acta.1698：155-165)，其也被命名为铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、NADPH-铁氧还蛋白氧化还原酶。
铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性已增强这一事实的确认，可以通过从修饰前的微生物和修饰后的微生物制备粗酶液，并比较它们的铁氧还蛋白-NADP+还原酶活性来实现。铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性可以按照例如Blaschkowski等的方法(Blaschkowski，H.P.etal.1982.Eur.J.Biochem.123：563-569)来测定。例如，可以通过以铁氧还蛋白作为底物、采用光谱学方法测定减少的NADPH的量来测定。1个酶活性单位(U)表示为每1分钟1μmolNADPH的氧化量。当亲本株具有铁氧还蛋白-NADP+还原酶活性时，如亲本株的活性充分高，则没有增强的必要，但理想的是，与亲本株相比较，酶活性上升优选1.5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。
已经在许多生物物种中发现了编码铁氧还蛋白-NADP+还原酶的基因，这些基因只要在目的L-氨基酸生产株中有活性即可加以使用。在大肠杆菌中，作为黄素氧还蛋白-NADP+还原酶，已经鉴定出的有fpr基因(Bianchi，V.etal.1993.J.Bacteriol.175：1590-1595)。此外，已知在恶臭假单胞菌(Psuedomonasputida)中NADPH-假单胞氧还蛋白还原酶(Putidaredoxinreductase)基因和假单胞氧还蛋白(Putidaredoxin)基因以操纵子的形式存在(Koga，H.etal.1989.J.Biochem.(Tokyo)106：831-836)。
大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶包括，例如，位于大肠杆菌K-12株基因组序列(Genbank登录号.U00096)的碱基序号4111749～4112495(互补链)的、具有SEQIDNO：7所示的碱基序列的fpr基因。SEQIDNO：8中示出了Fpr的氨基酸序列(Genbank登录号.AAC76906)。此外，在谷氨酸棒杆菌基因组序列(Genbank登录号.BA00036)的碱基序号2526234～2527211中发现了铁氧还蛋白-NADP+还原酶基因(Genbank登录号.BAB99777)。
对丙酮酸合酶的活性而言，存在铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白作为电子供体是必要的。因此，也可以是经过修饰使得铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力提高，从而丙酮酸合酶的活性增强的微生物。
此外，除了进行修饰以增强丙酮酸合酶的活性或者增强黄素氧还蛋白-NADP+还原酶和丙酮酸合酶的活性之外，还可以进行修饰来提高铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力。
本发明中，“铁氧还蛋白”是指：含有非卟啉铁原子(Fe)和硫原子，并结合有称作4Fe-4S、3Fe-4S、或者2Fe-2S簇的铁-硫簇的蛋白质，其作为单电子传递体发挥功能。“黄素氧还蛋白”是指：包含FMN(Flavin-mononucleotide，黄素单核苷酸)作为辅基的、发挥单电子或者双电子传递体功能的蛋白质。关于铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白，在McLean等的文献中有记载(McLean，K.J.etal.2005.Biochem.Soc.Trans.33：796-801)。
而且，用于修饰的亲本株可以是天然内在地具有编码铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的基因的菌株，也可以是天然不具有铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白基因、但通过导入铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白基因而被赋予了活性，从而L-谷氨酸生产能力提高的菌株。
铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力与亲本株(例如野生株或非修饰株)相比有所提高的事实，可以通过将铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的mRNA的量与野生型或者非修饰株比较来加以确认。作为表达量的确认方法，可以列举Nothern杂交、RT-PCR(Sambrook，J.etal.1989.MolecularCloningALaboratoryManual/SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork)。关于表达量，只要是与野生株或者非修饰株相比较有所上升即可，理想的是，例如与野生株、非修饰株相比，上升1.5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。
此外，铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力与亲本株(例如野生株或非修饰株)相比有所提高的这一事实的确认，可以通过SDS-PAGE、二维电泳或者使用抗体的Western印迹来检测(Sambrook，J.etal.1989.MolecularCloningALaboratoryManual/SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork)。关于生产量，只要与野生株或者非修饰株相比较有所提高可以是任何量，理想的是，例如与野生株、非修饰株相比上升1.5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。
铁氧还蛋白以及黄素氧还蛋白的活性可以通过将其添加至适当的氧化还原反应体系中来测定。例如，Boyer等公开了下述方法：通过铁氧还蛋白-NADP+还原酶还原产生的铁氧还蛋白，对由生成的还原型铁氧还蛋白引起的细胞色素C的还原进行定量(Boyer，M.E.etal.2006.Biotechnol.Bioeng.94：128-138)。此外，黄素氧还蛋白的活性可以通过使用黄素氧还蛋白-NADP+还原酶以相同的方法测定。
编码铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的基因分布广泛，任何基因，只要其编码出的铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白能够被丙酮酸合酶和电子供体再生系统所利用，都可以加以使用。例如，在大肠杆菌中，作为编码具有2Fe-2S簇的铁氧还蛋白的基因，有fdx基因(Ta，D.T.和Vickery，L.E.1992.J.Biol.Chem.267：11120-11125)，而yfhL基因被预想是编码具有4Fe-4S簇的铁氧还蛋白的基因。此外，作为黄素氧还蛋白基因，已知有fldA基因(Osborne，C.etal.1991.J.Bacteriol.173：1729-1737)和fldB基因(Gaudu，P.和Weiss，B.2000.J.Bacteriol.182：1788-1793)。在谷氨酸棒杆菌的基因组序列(Genbank登录号.BA00036)中，在碱基序号562643～562963位发现了铁氧还蛋白基因fdx(Genbank登录号.BAB97942)，而且在碱基序号1148953～1149270位发现了fer(Genbank登录号.BAB98495)。此外，在绿硫菌中，存在许多铁氧还蛋白基因，其中，铁氧还蛋白I以及铁氧还蛋白II被鉴定为作为丙酮酸合酶的电子受体的4Fe-4S型铁氧还蛋白基因(Yoon，K.S.etal.2001.J.Biol.Chem.276：44027-44036)。还可以使用嗜热氢杆菌的铁氧还蛋白基因等来源于具有还原型TCA循环的细菌的铁氧还蛋白基因或黄素氧还蛋白基因。
具体地，大肠杆菌的铁氧还蛋白基因包括例如位于大肠杆菌K-12株基因组序列(Genbank登录号.U00096)的碱基序号2654770～2655105位(互补链)的SEQIDNO：9所示的fdx基因、以及位于碱基序号2697685～2697945位的SEQIDNO：11所示的yfhL基因。SEQIDNO：10以及SEQIDNO：12中示出了Fdx以及YfhL的氨基酸序列(分别为Genbank登录号.AAC75578以及AAC75615)。作为大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因，包括例如：位于大肠杆菌K-12株基因组序列(Genbank登录号.U00096)的碱基序号710688～710158位(互补链)的SEQIDNO：13所示的fldA基因、以及位于碱基序号3037877～3038398位的SEQIDNO：15所示的fldB基因。SEQIDNO：14以及SEQIDNO：16中示出了fldA基因以及fldB基因所编码的氨基酸序列(分别为Genbank登录号.AAC73778以及AAC75933)。
作为绿硫菌的铁氧还蛋白基因，包括例如：位于绿硫菌基因组序列(Genbank登录号.NC_002932)的碱基序号1184078～1184266位的SEQIDNO：17所示的铁氧还蛋白I基因、以及位于碱基序号1184476～1184664位的SEQIDNO：19所示的铁氧还蛋白II基因。SEQIDNO：18以及SEQIDNO：20中示出了铁氧还蛋白I以及铁氧还蛋白II所编码的氨基酸序列(分别为Genbank登录号.AAM72491以及AAM72490)。此外，还可列举：嗜热氢杆菌的铁氧还蛋白基因(Genbank登录号.BAE02673)、硫磺矿硫化叶菌基因组序列中的碱基序号2345414～2345728位所示的硫磺矿硫化叶菌的铁氧还蛋白基因。而且，还可以是基于与上述示例的基因的同源性，从绿菌属、脱硫菌属(Desulfobacter)、产液菌属(Aquifex)、氢杆菌属、热变形菌属(Thermoproteus)、热棒菌属(Pyrobuculum)细菌等克隆的基因，而且还可以是从肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森菌属等γ-变形细菌，谷氨酸棒杆菌、乳发酵短杆菌等棒状杆菌型细菌；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等假单胞菌属细菌；以及结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)等分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌等中克隆的基因。
这些编码丙酮酸合酶、铁氧还蛋白-NADP+还原酶、铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白的基因(以下统称为本发明的基因)还可以使用具有保守突变的基因，如所述基因的同源物或人工变体等，以不损害编码的蛋白质的活性即功能为限。也就是说，可以是编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列或野生型蛋白质的氨基酸序列中的1个或者数个位置上发生1个或者数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列的保守变体的基因。这里所说的1个或者数个，因氨基酸残基在蛋白质立体结构中的位置、氨基酸的种类而异，优选是1～20个、更优选1～10个、特别优选1～5个。
上述突变优选是保守取代，其是功能上无变化的中性突变。关于保守取代，当取代位点是芳香族氨基酸时为Phe、Trp和Tyr之间的相互取代的突变；当取代位点是疏水氨基酸时为Leu、Ile和Val之间的相互取代的突变；当取代位点是极性氨基酸时为Gln和Asn之间的相互取代的突变；当取代位点是碱性氨基酸时为Lys、Arg和His之间的相互取代的突变；当取代位点是酸性氨基酸时为Asp和Glu之间的相互取代的突变；当取代位点是具有羟基的氨基酸时为Ser和Thr之间的相互取代的突变。
更具体地，可以列举：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于携带本发明的基因的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。
此外，还可以替换成在本发明的基因所导入的各个宿主中易于使用的密码子。同样地，本发明的基因只要具有功能即可，所编码的蛋白质的N末端侧和/或C末端侧可以被延长或截短。例如，延长的长度是50个以下、优选20个以下、更优选10个以下、特别优选5个以下的氨基酸残基。
编码如上所述的保守变体的基因，例如可以通过定点突变方法对碱基序列进行修饰，使得被编码的蛋白的特定位点上的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加，来获得这样的基因。此外，还可以通过传统公知的突变处理来获得。突变处理包括例如：用羟胺等对本发明的基因进行体外处理的方法，以及对携带该基因的微生物(例如埃希氏菌属细菌)采用紫外线照射或使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)等在常规突变处理中使用的突变剂来进行处理的方法。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位等还包括因基于携带本发明的基因的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。至于这些基因是否编码有功能的丙酮酸合酶、铁氧还蛋白-NADP+还原酶、铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白，可以通过例如将这些基因导入具有L-氨基酸生产能力的微生物，并测定各基因产物的活性来予以确认。
本发明的基因可以是能够与具有上述碱基序列的DNA或可由与具有所述碱基序列的DNA制备的探针在严格条件下杂交，并且编码丙酮酸合酶、铁氧还蛋白-NADP+还原酶、铁氧还蛋白、或黄素氧还蛋白的DNA。
这里，“严格条件”是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。将该条件明确地数值化是困难的，举一实例：具有高同源性的DNA(例如具有70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，特别优选95％以上同源性的DNA)目互杂交，而同源性较之为低的DNA则不互相杂交的条件；或者：在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃，1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度、温度下洗涤1次，优选2～3次的条件。而且，在本说明书中，“同源性”(homology)有时是指“同一性”(identity)。
探针也可以具有本发明的基因的一部分序列。这样的探针可以采用本领域技术人员熟知的方法，以基于各基因的碱基序列制备的寡核苷酸为引物，以包含各基因的DNA片段为模板进行PCR反应来加以制备。而且，当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时，作为在上述条件下杂交后的洗涤条件，例如可以是50℃、2×SSC、0.1％SDS。
上述关于保守变体的描述同样适用于所述的L-氨基酸生产能力的赋予中描述的酶和基因。
如上文所述的用于增强本发明基因之表达的修饰，可以依照赋予L-氨基酸生产能力的相关记载中描述的增强目的基因表达的方法来进行。本发明的基因可以利用携带该基因的微生物的基因组DNA为模板，通过PCR法获得。
例如，绿硫菌的丙酮酸合酶基因可以使用基于SEQIDNO：1的碱基序列制备的引物，例如SEQIDNO：35、36所示的引物，以绿硫菌的基因组DNA为模板，通过PCR(polymerasechainreaction)方法获得(参考White，T.J.etal.1989.TrendsGenet.5：185-189)。
大肠杆菌的丙酮酸合酶基因可以使用基于SEQIDNO.3的碱基序列制备的引物，使用例如SEQIDNO：38、39所示的引物，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR来获得。
纤细裸藻的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因可以使用基于SEQIDNO：5制备的引物，例如如SEQIDNO：40、41所示的引物，以纤细裸藻的基因组DNA为模板，通过PCR法来获得。
大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因可以使用基于SEQIDNO：7的碱基序列制备的引物，例如SEQIDNO：42、43所示的引物，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR法获得。
大肠杆菌的铁氧还蛋白基因fdx可以使用基于SEQIDNO：9的碱基序列制备的引物，例如SEQIDNO：44、45所示的引物，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR法获得。
大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因fidA和黄素氧还蛋白基因fldB可以分别使用基于SEQIDNO：13的碱基序列和基于SEQIDNO：15的碱基序列制备的引物，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR法获得。
此外，绿硫菌的铁氧还蛋白I基因和铁氧还蛋白II基因可以分别使用基于SEQIDNO：17和基于SEQIDNO：19的碱基序列制备的引物，以绿硫菌的基因组DNA为模板，通过PCR法获得。
对来源其它微生物的本发明的基因，也可以以基于上述各基因的序列信息或该微生物的公知基因或蛋白质序列信息制备的寡核苷酸为引物，通过PCR法，或者，以基于所述序列信息制备的寡核苷酸为探针，通过杂交法，从该微生物的基因组DNA或基因组DNA文库获得。而且，基因组DNA可以从作为DNA供体的微生物采用例如Saito和Miura的方法(参照Saito，H.和Miura，K.I.1963.Biochem.Biophys.Acta，72，619-629；生物工学実験書，日本生物工学会編，97～98页，培風館，1992年)等来制备。
本发明基因以及L-氨基酸生物合成系统基因的表达的增强，可以通过采用如上述的方法，利用转化或同源重组来提高本发明基因的拷贝数，或者修饰本发明基因的表达调节序列来实现。此外，本发明基因的表达增强，可以通过扩增能够提高本发明基因的表达的激活子(activator)、和/或缺失或弱化能够降低本发明基因的表达的调节子(regulator)来实现。
以下，对增强基因表达的方法进行说明。
第一种方法是提高目的基因的拷贝数的方法。例如，可以通过将目的基因克隆在适当的载体上，并用所得载体转化宿主细菌，提高该基因的拷贝数。
作为用于转化的载体，可以列举能够在使用的微生物中自主复制的质粒。例如，作为能够在属于肠杆菌科类细菌的微生物中自主复制的质粒，可以列举pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29(pHSG、pSTV可从TAKARABio公司获得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可从NIPPONGENE公司获得)等。此外，作为棒状杆菌型细菌用的质粒，可以列举pAM330(特开昭58-67699号公报)、pHM1519(特开昭58-77895号公报)、pSFK6(参照特开2000-262288号公报)、pVK7(美国专利申请公开说明书2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特开昭58-192900号公报)、pCG1(特开昭57-134500号公报)、pCG2(特开昭58-35197号公报)、pCG4、pCG11(特开昭57-183799号公报)、pHK4(特开平5-7491号公报)等。此外，从这些载体中取出具有使质粒得以在棒状杆菌型细菌中自主复制的能力的DNA片段，并将其插入到所述大肠杆菌用载体中，可以作为能够在大肠杆菌以及棒状杆菌型细菌这两者中自主复制的所谓穿梭载体来使用。而且，还可以使用噬菌体DNA代替质粒作为载体。
作为转化方法，可以列举例如：用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法，如已被报道用于大肠杆菌K-12的方法(Mandel，M.和Higa，A.J.Mol.Biol.1970.53：159-162)，或者从处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方法，如已被报道用于枯草芽孢杆菌的方法(Duncan，C.H.etal.1997.Gene1：153-167)。或者，还可以应用将DNA受体菌的细胞制备成容易导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态，再将重组DNA导入DNA受体菌的方法，该方法已知用于枯草杆菌、放线菌类和酵母(Chang，S.andChoen，S.N.，1979.Mol.Gen.Genet.168：111-115；Bibb，M.J.etal.1978.Nature274：398-400；Hinnen，A.etal.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1929-1933)。此外，采用电脉冲法(特开平2-207791号公报)也能够进行微生物的转化。
提高基因的拷贝数还可以通过向微生物的基因组DNA上导入多个拷贝的目的基因来实现。为了将多个拷贝的目的基因导入到微生物的基因组DNA上，可以利用基因组DNA上以多拷贝存在的序列作为靶标，通过同源重组来进行(MillerI，J.H.ExperimentsinMolecularGenetics，1972，ColdSpringHarborLaboratory)。作为基因组DNA上以多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA(repetitiveDNA)、存在于转座元件端部的反向重复序列。或者，还可以如特开平2-109985号公报所公开的那样，将目的基因装载在转座子中，使其发生转移，从而将多个基因拷贝导入基因组DNA中。另外，还可以通过使用Mu噬菌体的方法(特开平2-109985号)将目的基因整合到宿主基因组上。目的基因转移到了基因组上的事实，可以通过以该基因的一部分为探针进行Southren杂交来予以确认。
而且，当提高基因拷贝数时，只要能够增强目的基因的产物的活性即可，对于拷贝数没有特殊限制。在微生物本来就具有目的基因的情况下，优选为2个以上；此外，在微生物本来不具有本发明的基因时，导入的基因的拷贝数可以是1个，也可以是2个以上。
第2种方法是在基因组DNA上或质粒上、将目的基因的启动子等表达调节序列替换为适当强度的表达调节序列来增强目的基因的表达的方法。例如，thr启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子、tac启动子等是已知的常用启动子。作为棒状杆菌型细菌中的高表达型启动子，可以列举延伸因子Tu(EF-Tu)基因tuf的启动子，编码共伴侣蛋白(cochaperonin)GroES-伴侣蛋白(chaperonin)GroEL、硫氧还蛋白还原酶、磷酸甘油酸变位酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等的基因的启动子(WO2006/028063号公报、EP1697525号公报)。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子记载于Goldstein和Doi的论文(Goldstein，M.A.andDoiR.H.1995.Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128)等中。
此外，可以如国际公开WO00/18935所描述的那样，通过在基因的启动子区域导入数个碱基的碱基取代将其修饰成强度合适的启动子。表达调节序列的取代例如可以像使用温度敏感型质粒的基因取代那样进行。作为可以在大肠杆菌或Pantoeaananatis中使用的、具有温度敏感型复制起点的载体，可以列举例如WO99/03988号国际公开小册子所述的温度敏感型质粒pMAN997或其衍生质粒等。此外，表达调节序列的取代还可以通过使用线性DNA的方法来进行，如利用λ噬菌体的Red重组酶(Redrecombinase)的称为“Red驱动整合”(Red-drivenintegration)的方法(Datsenko，K.A.andWanner，B.L.，2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)、以及将Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.etal.2002.J.Bacteriol.184：5200-5203)联合使用的方法(参照WO2005/010175号)等。而且，表达调节序列的修饰可以与如上所述的提高基因的拷贝数的方法联合使用。
而且，已知对核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列中，特别是对起始密码子紧邻上游的序列中的数个核苷酸的取代，对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对所述序列进行修饰来提高翻译量。
当丙酮酸合酶由多个亚基构成时，可以分别增强编码各亚基的基因的表达，也可以以多顺反子的形式同时增强这些基因的表达。此外，当使用载体将基因导入微生物时，编码各亚基的基因可以同时担载在单一载体分子上，也可以分别担载在不同载体分子上。此外，当将基因插入基因组时，编码各亚基的基因可以同时插入到基因组上的同一位点，也可以分别插入到不同位置上。
此外，本发明的微生物优选除了丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性增强之外，其苹果酸酶活性也已降低。当本发明的微生物是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属或沙雷氏菌属的细菌时，特别优选降低苹果酸酶的活性。
本发明中，苹果酸酶的活性是指：可逆地催化苹果酸氧化脱碳酸生成丙酮酸的反应的活性。上述反应由以NADP为电子受体的NADP型苹果酸酶(也记作苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)(草酰乙酸脱羧性(oxaloacetate-decarboxylating))(NADP+))(EC：1.1.1.40b2463基因(也记作maeB基因)SEQIDNO：54)、或者以NAD为电子受体的NAD型苹果酸酶(也记作苹果酸脱氢酶(草酰乙酸脱羧性)(NAD+))(EC：1.1.1.38sfcA基因(也记作maeA基因)SEQIDNO：52)这2种酶来催化。苹果酸酶活性的确认可以按照Bologna等的方法(Bologna，F.P.etal.2007.J.Bacteriol.2007189：5937-5946)来测定。
NADP依赖型苹果酸酶:NADP+(NADP-依赖性苹果酸酶:NADP+)+苹果酸(malate)→NADPH+CO2+丙酮酸(pyruvate)
NAD依赖型苹果酸酶:NAD+(NAD-依赖性苹果酸酶:NAD+)+苹果酸→NADH+CO2+丙酮酸
酶活性的降低可以像后述的丙酮酸脱氢酶活性的降低那样进行。
在本发明中，更优选使NADP型苹果酸酶与NAD型苹果酸酶这两者的活性均降低，特别是，当本发明的微生物是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属或沙雷氏菌属的细菌时，优选降低这两种类型的苹果酸酶的活性。
此外，本发明的微生物优选除了增强丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性之外，还降低丙酮酸脱氢酶活性。
在本发明中，丙酮酸脱氢酶(以下也称“PDH”)活性是指催化丙酮酸氧化脱碳酸、生成乙酰-CoA(acetyl-CoA)的反应的活性。上述反应由PDH(Elp：pyruvatedehydrogenase，EC：1.2.4.1aceE基因SEQIDNO：46)、二氢硫辛酰基乙酰转移酶(E2p：dihydrolipoyltransacetylase，EC：2.3.1.12aceF基因SEQIDNO：48)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3：dihydrolipoamidedehydrogenase；EC：1.8.1.4lpdA基因SEQIDNO：50)这3种酶来催化。即，这3种亚单位分别催化以下反应，而将催化这3个反应合起来的反应的活性称为PDH活性。PDH活性的确认可以采用Visser和Strating的方法(Visser，J.andStrating，M.1982.MethodsEnzymol.89：391-399)来测定。
E1p：丙酮酸+[二氢硫辛酰赖氨酸残基琥珀酰转移酶]硫辛酰赖氨酸→[二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶]S-乙酰二氢硫辛酰赖氨酸+CO2
E2p：CoA+酶N6-(S-乙酰二氢硫辛酰)赖氨酸→乙酰-CoA+酶N6-(二氢硫辛酰)赖氨酸
E3：蛋白N6-(二氢硫辛酰)赖氨酸+NAD+→蛋白N6-(硫辛酰)赖氨酸+NADH+H+
酶活性的降低具体地可以通过下述方法实现：使染色体上的PDH编码基因，具体地说是aceE、aceF和lpdA中的1个或2个以上基因的编码区域的一部分或全部缺损，或者对启动子、shine-dalgarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰，等等。此外，对表达调节序列以外的非翻译区的修饰也可以降低基因的表达量。而且，还可以缺失包括染色体上的基因的前后的序列在内的整个基因。此外，所述修饰还可以这样完成：通过基因重组向染色体上的酶编码区域中导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一～二个核苷酸的移码突变(Wang，J.P.etal.2006.J.Agric.FoodChem.54：9405-9410；Winkler，W.C.2005.Curr.Opin.Chem.Biol.9：594-602；Qiu，Z.andGoodman，M.F.1997.J.Biol.Chem.272：8611-8617；Wente，S.R.andSchachman，H.K.1991.J.Biol.Chem.266：20833-20839)。
在本发明中，优选通过利用同源重组，使染色体上的基因表达调节序列例如启动子区域、或编码区域、或非编码区域的一部分或全部缺损，或者在所述区域中插入其它序列，来降低细胞内的酶活性。然而，只要是降低PDH活性的修饰即可，也可以是通过X射线或紫外线照射、或者N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理引起的修饰。
就表达调节序列的修饰而言，优选为1个碱基以上，更优选为2个碱基以上，特别优选为3个碱基以上。此外，在缺失编码区域时，只要产生的酶蛋白质的功能降低或缺失即可，缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域，也可以是整个编码区域。通常，缺失的区域越长，越能够切实地使基因失活。此外，优选的是被缺失区域的上游或下游的读码框不一致。
在编码区域中插入其他序列时，可以为基因的任何区域，但插入的序列越长越能够切实地使编码酶的基因失活。优选的是插入部位前后的序列的读码框不一致。对于其他序列没有特殊限制，只要是能够降低或缺损酶蛋白质的功能即可，包括例如携带有抗生素抗性基因或对L-氨基酸生产有用的基因的转座子等。
对染色体上的基因如上述地进行修饰，可以通过下述方法实现：例如，制备缺失型基因(其经过了修饰使得基因的部分序列缺失、不产生正常功能的酶蛋白质)，用包含该基因的DNA转化细菌，通过使缺失型基因与染色体上的基因发生同源重组，从而将染色体上的基因替换成缺失型基因。缺失型基因所编码的酶蛋白质即使能够产生，其与野生型酶蛋白质的立体结构也不同，其功能降低或消失。这种基于利用同源重组进行的基因取代的基因破坏，还可以采用下述方法进行：前述的Red驱动整合方法、组合使用Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统的方法等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒、可接合转移的质粒的方法，利用在宿主内不含复制起点的自杀载体的方法(美国专利第6303383号说明书，或特开平05-007491号)等。
上述关于降低PDH活性的描述同样适用于前述的其它酶“活性的降低”、或其它基因的“破坏”。
此外，在厌氧或微需氧的条件下进行培养的场合，本发明的微生物还可以是经过修饰，使得除了丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性被增强之外，不在厌氧或微需氧的条件下产生有机酸或乙醇的微生物。这里，作为有机酸，可以列举出乳酸、甲酸、乙酸。作为进行修饰使得不生产有机酸或乙醇的方法，包括例如破坏编码乳酸脱氢酶的基因的方法(Verumi，G.N.etal.2002.J.IndustrialMicrobiol.Biotechnol.28：325-332；特开2005-95169)。
此外，当在包含脂肪酸作为碳源的培养基中进行培养时，还可以提高本发明的微生物的脂肪酸同化能力。提高脂肪酸同化能力的手段包括例如：弱化或缺损fadR基因的表达，增强涉及脂肪酸同化的fadL、fadE、fadD、fadB和/或fadA基因的表达，或增强编码细胞色素bo型氧化酶复合体(cytochromeboterminaloxidasecomplex)的各亚基的基因群(Gennis，R.B.andStewart，V.1996.p.217-261.InF.D.Neidhardt(ed.)，EscherichiacoliandSalmonellaCellularandMolecularBiology/SecondEdition，AmericanSocietyforMicrobiologyPress，Washington，D.C；Chepurietal.1990.J.Biol.Chem.265：11185-11192)即cyoABCDE的表达等。
“fadR基因”是编码FadR的基因，所述FadR是在肠杆菌科细菌群中发现的调节脂肪酸代谢并具有DNA结合能力的转录因子(DiRusso，C.C.etal.1992.J.Biol.Chem.267：8685-8691；DiRusso，C.C.etal.1993.Mol.Microbiol.7：311-322)，大肠杆菌的fadR基因可以示例出具有位于大肠杆菌的基因组序列(Genbank登录号：U00096)碱基序号1234161～1234880的SEQIDNO：82所示的碱基序列的基因。SEQIDNO：83中示出了该基因编码的氨基酸序列。
<2>本发明的L-氨基酸生产方法
本发明的方法是以用培养基培养本发明的微生物，在培养基中或菌体内生成并蓄积L-氨基酸，并从该培养基或菌体收集L-氨基酸为特征的L-氨基酸生产方法。
这里，本发明的方法可以采用分批培养(batchculture)、流加培养(Fed-batchculture)、连续培养法(continuousculture)中的任何方法，培养基中的乙醇或脂肪酸可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中，或者包含于这两者中。
这里，在本发明中，上述流加培养是指下述培养方法：将培养基连续地或间歇地添加至培养容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出培养基。此外，连续培养指下述培养方法：连续地或间歇地将培养基流加至培养容器中，同时从容器中取出培养基(通常而言，等于所流加的培养基的量)。“初始培养基”的意思是在流加培养或连续培养中，流加流加培养基之前的分批培养中所用的培养基(培养开始时的培养基)；“流加培养基”的意思是在进行流加培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。此外，分批培养(batchculture)是指：每批制备一次新的培养基，将菌株接种到其中，并且直至收获都不加入培养基。
作为碳源，优选是能够产生乙酰CoA但不伴随发生脱碳酸反应的碳源，具体地可以列举出：乙醇、脂肪酸、或者、通过分解可产生脂肪酸的脂肪酸酯包括油脂等。以下，就使用乙醇或脂肪酸作为所述碳源的情况进行示例说明。
乙醇是以分子式C2H5OH表示的一元醇，可以利用纯乙醇，也可以直接利用含乙醇的混合物，如乙醇发酵等中产生的培养液中的乙醇等。
脂肪酸是以通式CmHnCOOH表示的一元羧酸。只要能够被具有L-氨基酸生产能力的细菌利用即可，可以是任何链长的脂肪酸，也可以以任意比例含有任何链长的脂肪酸。优选的脂肪酸是油酸(C17H33COOH)以及棕榈酸(C15H31COOH)，特别优选油酸。关于油酸，可以通过油脂的水解来获得包含油酸的长链脂肪酸混合物。用于本发明的油酸可以以棕榈油等油脂的水解物的形式获得，可以使用从动物油、植物油、废食用油、其它混合油脂或巧克力等包含脂肪成分的食品中提取的油酸。此外，脂肪酸可以以游离酸的形式利用，也可以以与钠、钾等碱金属的盐或者铵盐的形式加以利用。
本发明的方法中使用的培养基中所含的乙醇或脂肪酸的量可以是任意的，只要本发明的方法中使用的细菌能够作为碳源加以同化即可，当作为单独的碳源添加到培养基中时，优选包含20w/v％以下、优选10w/v％以下、更优选2w/v％以下。此外，培养基中包含的乙醇或脂肪酸可以是任意的，只要在其含量下能够作为碳源被同化即可，当作为单独的碳源添加到培养基中时，希望包含0.001w/v％以上、优选0.05w/v％以上、更优选0.1w/v％以上。
此外，在作为流加培养基使用的情况下，当作为单独的碳源添加乙醇或脂肪酸时，培养基中优选包含10w/v％以下、优选5w/v％以下、更优选1w/v％以下，优选包含0.001w/v％以上、优选0.05w/v％以上、更优选0.1w/v％以上。
而且，乙醇的浓度可以采用各种方法来测定，酶法测定是简便且常规的(Swift，R.2003.Addiction98：73-80)。脂肪酸的浓度可以采用气相色谱或HPLC等常规方法来测定(Lehotay，S.J.andHajslova，J.TrACTrendsAnal.Chem.2002.21：686-697；Lin，J.T.etal.1998.J.Chromatogr.A.808：43-49)。
而且，还可以将乙醇和脂肪酸混合后添加到本发明的培养基中。乙醇和脂肪酸的添加浓度可以是任意的，只要本发明的方法中使用的细菌能够作为碳源同化所述脂肪酸即可，当在培养基中仅添加乙醇和脂肪酸的混合物作为碳源时，优选合计包含20w/v％以下、优选10w/v％以下、更优选2w/v％以下。此外，培养基中的乙醇和脂肪酸的混合物的含量可以是任意的，只要在其含量下本发明中使用的细菌能够作为碳源加以同化即可。当培养基中仅添加乙醇和脂肪酸的混合作为碳源时，优选与油酸合在一起包含0.001w/v％以上、优选0.05w/v％以上、更优选0.1w/v％以上。
此外，乙醇与脂肪酸的混合比例可以是任意的，只要为本发明的方法中使用的细菌能够作为碳源同化的浓度即可，可以以相对于乙醇1脂肪酸为2以下、优选1.5以下、特别优选1以下左右的比例来进行混合。作为下限，只要混合了脂肪酸即可，优选相对于乙醇1，混合0.05以上、优选0.1以上的脂肪酸。
而且，本发明的方法中使用的培养基中除了乙醇或脂肪酸或乙醇和脂肪酸这两者之外，还可以添加其它碳源。优选的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解物等糖类，甘油等多元醇类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。特别优选葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油。作为甘油，也可以使用在生物柴油燃料生产中产生的粗甘油。碳源可以是1种，也可以是2种以上的混合物。在使用其它碳源的情况下，碳源中的乙醇或脂肪酸、或乙醇和脂肪酸的混合物的比例优选为10重量％以上、优选30重量％以上、更优选50重量％以上。
而且，在本发明中，可以在培养的所有步骤中均包含一定浓度的乙醇或者脂肪酸，也可以仅在流加培养基或初始培养基中添加有乙醇或者脂肪酸，如果其它碳源充足，则也可以存在乙醇或脂肪酸不足的一定时间。所谓“暂时性的”，意思是，例如，在发酵总时间的10％、20％、最大至30％的时间内脂肪酸处于不足的状态。
就培养基中添加的其它成分而言，可以使用除碳源外还含有氮源、无机离子和视需要而定的其它有机成分的常规培养基。本发明的培养基中包含的氮源可以使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等，pH调整中使用的氨气、氨水也可作为氮源利用。此外，还可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。培养基中也以只含这些氮源中的1种，也可以含有这些氮源中的2种以上。这些氮源可以用于初始培养基，也可以用于流加培养基。此外，初始培养基、流加培养基中可以使用相同的氮源，也可以将流加培养基的氮源改变为与初始培养基不同。
本发明的培养基中，除了碳源、氮源之外，优选还包含磷酸源、硫源。作为磷酸源，可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、焦磷酸等磷酸多聚物等。此外，作为硫源，只要包含硫原子即可，优选硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等硫酸盐，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸，这其中优选硫酸铵。
此外，培养基除碳源、氮源、硫源之外，还可以包含生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。能够使用的生长促进因子包括微量金属、氨基酸、维生素、核酸以及含有所述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解产物等。作为微量金属，可以列举铁、锰、镁、钙等；作为维生素，可以列举维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12等。这些生长促进因子可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中。
此外，在使用其生长需求氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选在培养基中添补所需求的营养素。特别是，可在本发明中使用的L-赖氨酸生产菌中大多如后述地强化了L-赖氨酸生物合成途径，而弱化了L-赖氨酸分解能力，因此，优选添加选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1种或2种以上。初始培养基和流加培养基的培养基组成可以相同，也可以不同。此外，初始培养基与流加培养基的培养基组成可以相同，也可以不同。而且，当流加培养基的流加分多个阶段进行时，各流加培养基的组成可以相同，也可以不同。
培养优选在发酵温度20至45℃，特别优选33至42℃的通气条件下进行。这里，将氧浓度调节到5至50％，优选至大约10％来进行发酵。此外，优选将pH控制在5至9进行通气培养。如果在培养期间pH降低，可例如添加碳酸钙或碱例如氨气和氨水以中和培养物。在这些条件下，进行优选大约10至120小时的培养，从而在培养液中蓄积显著量的L-氨基酸。蓄积的L-氨基酸的浓度只要是高于野生型菌株中的浓度并且在该浓度下能够将L-氨基酸从培养基收集和回收即可，可以是50g/L以上，理想的是75g/L以上，更理想的是100g/L以上。
当目的氨基酸为碱性氨基酸时，可以采用通过下述方法进行发酵、并回收目的碱性氨基酸的方法来进行生产(参照特开2002-065287号)：将培养中的pH控制在6.5～9.0、培养结束时的培养基的pH控制在7.2～9.0、发酵中的发酵槽内压力控制为正的方法，或者，向培养基供给二氧化碳或含二氧化碳的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子为至少2g/L以上的培养期，并以所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的抗衡离子的方法。
就培养结束后从培养液中收集L-氨基酸的方法而言，可以按照公知的回收方法来进行。例如，在采用离子交换树脂法、沉淀法，或通过离心分离等从培养液中除去菌体后，进行浓缩晶析来进行收集。
在本发明中，为了确保高于一定水平的L-氨基酸蓄积，微生物的培养可以分为种子培养(seedculture)和主培养(mainculture)来进行，种子培养可通过使用培养瓶等的摇动培养或通过分批培养来进行，而主培养可以以流加培养或连续培养的形式进行。或者，种子培养和主培养均可以以分批培养的方式进行。
在本发明中，当进行流加培养或连续培养时，可以以间歇的方式流加流加培养基，使乙醇或脂肪酸或其它碳源的流加发生暂时的停止。优选的是，停止流加培养基供给的时间为流加进行时间的至多30％，理想的是至多20％，特别理想的是至多10％。当间歇流加流加培养液时，可添加一定时间的流加培养基，并如下控制第二次及以后的添加：在某个添加期前面的添加停止期中发酵培养基内碳源耗尽时pH的上升和溶氧浓度的上升通过计算机被检测到时，即开始添加；从而培养罐(culturetank)中的基质浓度总是自动保持在低水平(美国专利5,912,113号说明书)。
流加培养中使用的流加培养基，优选采用含乙醇或脂肪酸和其它碳源、以及具有生长促进效果的营养素(生长促进因子)的培养基，并且可以进行控制，使得发酵培养基中的脂肪酸浓度在一定浓度以下。这里，所谓一定浓度以下，是指制备添加10w/v％以下、优选5w/v％以下、更优选1w/v％以下的培养基。
作为其它碳源，优选葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油；作为生长促进因子，优选氮源、磷酸、氨基酸等。作为氮源，可以使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，作为氨基酸，在使用营养缺陷型突变株的场合，优选添补所需求的营养素。此外，流加培养基可以是1种，也可以混合2种以上的培养基。在使用2种以上的流加培养基时，这些培养基可以混合起来通过1个补料罐流加，也可以用多个补料罐流加。
在将连续培养方法用于本发明时，可以同时进行取出和流加；也可以取出一部分后再进行流加。此外，所述方法也可以是将包含L-氨基酸和细胞的培养液取出，然后仅将细胞再循环回发酵罐，对菌体进行再利用的连续培养方法(参照法国专利号2669935说明书)。作为连续或间歇流加营养源的方法，可以使用与流加培养中所用的相同方法。
再利用菌体的连续培养方法是如下所述的方法：在氨基酸浓度达到预定水平时，将发酵培养基间歇或连续地取出，仅取出L-氨基酸，并且将包含菌体的过滤残余物再循环到发酵罐中，这种方法可通过参考例如法国专利号2669935说明书来实施。
其中，将培养液间歇取出时，可以在L-氨基酸浓度达到预定浓度时取出部分L-氨基酸，并且新流加培养基来继续培养。此外，至于添加的培养基的量，优选进行设定使其最终与取出之前的培养液的量为等量。这里，“等量”的意思是取出之前培养液量的大约93～107％的量。
在将培养液连续取出时，优选在流加营养培养基的同时或之后开始取出。例如，开始取出的时间是添加开始之后的5小时之内，优选3小时之内，更优选1小时之内。此外，至于培养液的取出量，优选取出的量和流加的量为等量。
实施例
以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受其限制。
〔实施例1〕<大肠杆菌来源的醇脱氢酶(AdhE)突变株的构建>
为了使大肠杆菌能够以需氧方式同化乙醇，获取了醇脱氢酶AdhE突变体。大肠杆菌来源的野生型AdhE基因(adhe)的碱基序列及其编码的氨基酸序列分别示于SEQIDNO：21和SEQIDNO：22。
<1-1>大肠杆菌MG1655::PL-tacadhE株的构建
通过Datsenko和Wanner开发的称为“Red-drivenintegration”的方法(Datsenko，K.A.andWanner，B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)和λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.etal.2002.J.Bacteriol.184：5200-5203)将大肠杆菌adhE基因的启动子区域替换成PL-tac。
通过本方法，使用以5′侧设计有目的基因的一部分、3′侧设计有抗生素抗性基因的一部分的合成寡核苷酸作为引物而得到的PCR产物，可以一步式地构建基因重组株。进而，结合使用λ噬菌体来源的切出系统，可以将整合到基因重组株中的抗生素抗性基因除去。
包含PL-tac和编码氯霉素抗性(CmR)基因的cat基因的片段，以国际专利申请WO2006/043730记载的大肠杆菌MG1655PL-tacxylE株的基因组为模板，使用SEQIDNO：23和SEQIDNO：24所示的引物，通过PCR法来进行扩增。SEQIDNO：23的引物包含adhE基因的上游区域的互补序列，SEQIDNO：24的引物包含adhE基因的5′区域的互补序列。
PL-tac的序列如SEQIDNO：25所示。PCR中使用了GeneAmpPCRSystem2700扩增仪(AppliedBiosystems)和TaqDNA聚合酶(Fermentas公司)。所得扩增片段采用琼脂糖凝胶电泳来进行纯化、回收。通过电穿孔将片段导入携带具有温度敏感型的复制能力的质粒pKD46的大肠杆菌MG1655/pKD46株中。质粒pKD46(Datsenko，K.A.andWanner，B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)中包含λ噬菌体的总计2154个碱基的DNA片段(GenBank/EMBL登录号J02459，第31088位～33241位)，该片段中包含阿拉伯糖诱导性ParaB启动子控制下的编码λRed同源重组系统的Red重组酶的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对于将PCR产物整合至MG1655株的染色体上而言是必要的。
对于扩增得到的PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，通过电穿孔将其导入到包含具有温度敏感型的复制能力的质粒pKD46的大肠杆菌MG1655株中。电穿孔用感受态细胞按下述制备。具体地，将在含100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L)中30℃培养过夜的MG1655/pKD46株用含氨苄青霉素(100mg/L)和L-阿拉伯糖(10mM)的5mL的LB培养基稀释100倍。对于所得稀释物，于30℃在通气条件下使其生长至OD600为约0.6后，100倍浓缩，用10％甘油洗涤3次，从而使其能够用于电穿孔。电穿孔使用70μL的感受态细胞与约100ng的PCR产物来进行。在电穿孔后的杯子中加入1mL的SOC培养基(Sambrook，J.etal.1989.MolecularCloningALaboratoryManual/SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork)，于37℃培养1小时后，于37℃在含Cm(氯霉素)(40mg/L)的LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、琼脂15g/L)上进行平板培养，选择出Cm抗性重组体。
将Cm抗性株接种到含2％乙醇的M9平板培养基(Sambrook，J.etal.1989.MolecularCloningALaboratoryManual/SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork)上，从37℃、培养2-3日所生长出的菌株中选取约100个克隆，再于含2％乙醇的M9平板培养基上37℃进行培养，选择36小时以内生长出的菌株。为了考察所述菌株的CmR基因与启动子区域的序列，使用SEQIDNO：26和SEQIDNO：27所示的引物通过PCR法进行了扩增。对于经确认adhE基因的启动子区域中包含CmR基因的一个克隆，于37℃进行培养来除去温度敏感型质粒pKD46，从而得到了MG1655::PL-tacadhE株。
<1-2>大肠杆菌MG1655ΔadhE株的构建
对于大肠杆菌MG1655(ATCC700926)野生型的adhE基因，采用Datsenko和Wanner开发的方法将其替换成非活性型adhE基因。以质粒pACYC177(GenBank/EMBLaccessionnumberX06402、Fermentas公司)为模板，使用SEQIDNO：28和SEQIDNO：29所示的引物，通过PCR法扩增了包含编码卡那霉素抗性(KanR)基因的kan基因的片段。SEQIDNO：28的引物包含与adhE基因318bp上游的区域的40个碱基互补的序列，SEQIDNO：29的引物包含与adhE基因3′侧区域的41个碱基互补的序列。PCR中使用了GeneAmpPCRSystem2700扩增仪(AppliedBiosystems)和TaqDNA聚合酶(Fermentas公司)。将所得扩增片段用琼脂糖凝胶电泳进行纯化、回收。对于该片段，通过电穿孔将其导入携带质粒pKD46的大肠杆菌MG1655/pKD46株。
为了确认在含20μg/ml卡那霉素的LB平板培养基(Sambrook，J.etal.1989.MolecularCloningALaboratoryManual/SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork)上生长出的克隆中存在KmR基因，使用SEQIDNO：30和SEQIDNO：31所示的引物，采用PCR法进行了扩增。对于一个已确认在adhE基因区域中包含KmR基因的克隆，通过在37℃进行培养，除去温度敏感型质粒pKD46，从而得到了MG1655ΔadhE株。
<1-3>突变型醇脱氢酶(AdhE*)的构建
为了将Glu568Lys(E568K)突变导入AdhE，使用与adhE基因的碱基序列1662-1701和1703-1730互补、且第1702位的碱基引入g→a突变的SEQIDNO：32所示的引物、以及与adhE基因碱基序列的3’末端侧区域同源的SEQIDNO：33所示的引物，以大肠杆菌MG1655株基因组为模板，进行了PCR。PCR中使用了GeneAmpPCRSystem2700扩增仪(AppliedBiosystems)和PyrobestDNA聚合酶(宝酒造)。对于所得的1.05kbp的扩增片段，用琼脂糖凝胶电泳进行了纯化、回收。
以大肠杆菌MG1655::PL-tacadhE株基因组为模板，使用SEQIDNO：34所示的引物以及导入了突变的1.05kbp片段作为引物，进行了PCR。SEQIDNO：34的引物是位于adhE基因起始密码子上游402-425bp的引物。PCR中使用了GeneAmpPCRSystem2700扩增仪(AppliedBiosystems)和TaKaRaLADNA聚合酶(宝酒造)。对于所得4.7kbp的扩增片段，用琼脂糖凝胶电泳进行了纯化、回收。
为了使野生型adhE基因区域与突变型adhE基因重组，对于包含CmR基因和PL-tac下游的突变型adhE基因的4.7kbp片段(cat-PL-tacadhE*)，采用Datsenko和Wanner的方法，通过电穿孔将其导入MG1655ΔadhE/pKD46株。对于所得克隆，在包含2％乙醇作为唯一碳源的M9平板培养基上进行选择。测定了生长出的克隆的adhE基因的序列，结果鉴定出下述引起氨基酸取代的突变：Glu568Lys(gag-aag)、Ile554Ser(atc-agc)、Glu22Gly(gaa-gga)、Met236Val(atg-gtg)、Tyr461Cys(tac-tgc)以及Ala786Val(gca-gta)，将该克隆命名为MG1655::PL-tacadhE*株。
以大肠杆菌MG1655::PL-tacadhE*株作为供体，使P1vir噬菌体感染MG1655ΔtdhrhtA*株的P1转导(Miller，J.H.(1972)ExperimentsinMolecularGenetics，ColdSpringHarborLab.Press，Plainview，NY)，得到了具有乙醇同化性的L-苏氨酸生产株MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE*株。MG1655ΔtdhrhtA*株是这样得到的L-苏氨酸生产株：从MG1655株出发，采用Datsenko和Wanner的方法破坏编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因，并在rhtA基因中通过P1转导导入了来自于在极限培养基中对高浓度苏氨酸具有抗性的菌株VL614rhtA23(Livshits，V.A.etal.2003.Res.Microbiol.154：123-135)的rhtA23突变。
<1-4>大肠杆菌WC196Δmez株来源的醇脱氢酶(AdhE)突变株的构建
为了对L-赖氨酸生产菌赋予乙醇同化性，以MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE*株作为供体，对国际专利公报WO2005/010175所述的L-赖氨酸生产菌WC196Δmez/pCABD2株进行了P1转导，得到了具有乙醇同化性的L-赖氨酸生产株WC196ΔmezPL-tacadhE*/pCABD2株。WC196Δmez株是编码苹果酸酶(malicenzyme)的sfcA以及b2463基因被破坏的WC196株(WO2005/010175)。pCABD2是携带美国专利No.6,040,160所述的对L-赖氨酸反馈抑制呈抗性的dapA*基因、对L-赖氨酸反馈抑制呈抗性的lysC*基因、dapB基因以及ddh基因的质粒。
〔实施例2〕<绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒的构建与活性测定>
<2-1>绿硫菌来源丙酮酸合酶基因表达质粒的构建
绿硫菌是最适生长温度为48℃的中高温型自养细菌，绿硫菌TLS株的基因组序列已由Eisen等阐明(Eisen，J.A.etal.2002.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：9509-9514)。从该菌株中分离出丙酮酸合酶基因，构建了表达质粒。
<2-2>绿硫菌来源丙酮酸合酶基因表达株的丙酮酸合酶活性的测定
以绿硫菌TLS株(ATCC49652)的染色体为模板，使用SEQIDNO：35、36所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了丙酮酸合酶基因片段。将所得基因片段用SacI切割，插入pSTV28(TakaraBio公司制造)的SacI位点，构建了质粒，将其命名为pSTV-PS。在使用BigDyeTerminatorsv1.1CycleSequencingKit确认了丙酮酸合酶基因全长中没有PCR错误后，用SacI从pSTV-PS中切出将丙酮酸合酶基因，插入到pMW-Pthr的SacI位点，构建了丙酮酸合酶基因表达用质粒pMW-Pthr-PS。pMW-Pthr是在载体pMW219(NipponGene公司制造)的HindIII位点与XbaI位点之间具有大肠杆菌K-12株的苏氨酸操纵子(thrABC)的启动子区域(Pthr)的质粒，可通过在该启动子的下游克隆基因来进行基因表达。所使用的苏氨酸操纵子的启动子序列如SEQIDNO：37所示。
通过电穿孔在WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2中分别导入pMW-Pthr-PS以及比较对照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因表达株命名为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr-PS，将对照株命名为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr。
将上述菌株接种于含20mg/L链霉素和40mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养过夜。通过离心分离回收菌体，悬浮于50mMHEPES缓冲液(pH8.0)中。将悬浮液用超声波破碎机破碎，15000rpm离心15分钟后，以所得上清作为粗酶液。
使用ProteinAssayCBB溶液(NakalaiTesque公司制造)测定粗酶液中的蛋白质浓度，将相当于250μg总蛋白质的粗酶液用于活性测定。
活性测定如下进行。在下述反应溶液2mL中加入粗酶液进行反应。首先，将包含除底物丙酮酸以外的所有成分的反应溶液加入光谱测定用比色皿中，用橡胶塞和铝盖将比色皿密闭起来。使用注射器向比色池中吹入氩气5分钟，降低比色池内的氧浓度。然后，将比色皿置于分光光度计(日立公司制造U-3210Spectrophotometer)上，使用注射器添加丙酮酸溶液开始反应。37℃反应30分钟，其中通过经时测定578nm的吸光度来观察还原型甲基紫精(methylviologen)的量的变化。结果如表1所示。表中，比活性的单位为U/mg蛋白。1U定义为每1分钟还原1nmol甲基紫精的活性。
〔反应液〕
MgCl21mM
二硫苏糖醇1mM
甲基紫精5mM
CoA0.25mM
丙酮酸10mM(测定即将开始添加)
HEPES(pH8.0)50mM
【表1】
表1
质粒 比活性
pMW-Pthr 0.0
pMW-Pthr-PS 1.2
〔实施例3〕<绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因表达、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因扩增质粒的构建>
作为丙酮酸合酶活性必需的辅酶再生系统，使用大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因和大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白基因，构建了同时表达上述的两个基因以及丙酮酸合酶基因共三个基因的质粒。作为大肠杆菌的铁氧还蛋白-NADP+还原酶基因使用了fpr基因；作为大肠杆菌的铁氧还蛋白基因使用了fdx基因。
<3-1>大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因扩增质粒的构建
以大肠杆菌MG1655株的染色体为模板，使用SEQIDNO：42、43所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因片段。将该基因片段用SmaI切割，插入到pMW-Pthr的SmaI位点，构建了黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因扩增用质粒，命名为pMW-Pthr-fpr。
<3-2>大肠杆菌来源铁氧还蛋白fdx基因扩增质粒的构建
以大肠杆菌MG1655株的染色体为模板，使用SEQIDNO：44、45所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了铁氧还蛋白fdx基因片段。将该基因片段用EcoRI切割，插入到pMW-Pthr的EcoRI位点，构建了铁氧还蛋白fdx基因扩增用质粒pMW-Pthr-fdx。
<3-3>绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、铁氧还蛋白fdx基因扩增用质粒的构建
将pMW-Pthr-fpr用SmaI消化，将所得fpr基因片段与用SmaI处理pMW-Pthr-fdx所得的片段连接，得到了pMW-Pthr-fpr-fdx。然后，将pMW-Pthr-PS用SacI切割，将所得PS基因片段与用SacI处理pMW-Pthr-fpr-fdx所得的片段连接，构建了绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、铁氧还蛋白fdx基因表达增强质粒pMW-Pthr-fpr-PS-fdx。
在上述各质粒中，绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因通过Pthr转录，其它基因通过来自Pthr的通读而转录。
〔实施例4〕<绿硫菌来源丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源铁氧还蛋白基因表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<4-1>将绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因扩增质粒导入WC196Δmez株
在WC196Δmez/pCABD2中通过电穿孔分别导入pMW-Pthr-fpr-PS-fdx、比较对照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因表达株命名为WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-PS-fdx，对照株命名为WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr。
<4-2>绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因及大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因的表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196Δmez/pCABD2/pMWPthr、WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-PS-fdx这两个菌株接种于LB平板培养基，于37℃预培养过夜。将1/8平板的菌体接种于500mL容量坂口烧瓶中的20mL下述组成的油酸培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养72小时。使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。此外，对培养液中的活菌数也进行了测定。两次培养的平均值如表2所示。与对照相比，绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因及大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因表达增强株中可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔油酸培养基组成〕
油酸钠20g/L
Tween805g/L
MgSO4·7H2O1g/L·
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
卡那霉素40mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟，碳酸钙于180℃干热灭菌2小时以上。油酸钠与Tween80混合，灭菌后添加。MgSO4·7H2O与碳酸钙分别单独灭菌，然后再添加。卡那霉素、链霉素也单独添加。
【表2】
表2
菌株 L-赖氨酸(g/L) 活菌数(108/mL)
WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr 1.77 22.3
WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-PS-fdx 2.35 13.6
〔实施例5〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒的构建与活性测定>
构建了在大肠杆菌MG1655株基因组中发现的与丙酮酸合酶基因具有同源性的ydbK基因的表达质粒，测定了活性。
<5-1>大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒的构建
以大肠杆菌MG1655株的染色体为模板，使用SEQIDNO：38、39所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了丙酮酸合酶基因片段。将所得基因片段用KpnI切割，插入pSTV28(TakaraBio公司制造)的KpnI位点，构建了质粒，命名为pSTV-ydbK。在使用BigDyeTerminatorsv1.1CycleSequencingKit确认了丙酮酸合酶基因的全长中没有PCR错误后，用KpnI从pSTV-ydbK中切出丙酮酸合酶基因，将其插入pMW-Pthr的KpnI位点，构建了丙酮酸合酶基因表达用质粒pMW-Pthr-ydbK。
<5-2>大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因表达株的丙酮酸合酶活性的测定
在WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2中通过电穿孔分别导入pMW-Pthr-ydbK、比较对照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因表达株命名为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr-ydbK，对照株命名为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr。
将上述菌株接种于含20mg/L链霉素和40mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。通过离心分离回收菌体，像实施例2所述的绿硫菌来源丙酮酸合酶基因表达株的活性测定方法那样测定了活性。结果如表3所示。对照株WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr中未确认存在丙酮酸合酶的活性，而在大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达株WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr-ydbK中确认到8.0U/mg的活性。结果如表3所示。比活性的单位与表1相同。
【表3】
表3
质粒 比活性
pMW-Pthr 0.0
pMW-Pthr-ydbK 8.0
〔实施例6〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因表达质粒的构建>
将实施例3所述的包含大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因的质粒pMW-Pthr-fpr用SmaI消化，将所得fpr基因片段与用SmaI处理包含大肠杆菌来源铁氧还蛋白基因的质粒pMW-Pthr-fdx而得到的片段相连接，得到了pMW-Pthr-fpr-fdx。然后，将pMW-Pthr-ydbK用KpnI消化，将所得ydbK基因片段与用KpnI处理pMW-Pthr-fpr-fdx而得到的片段相连接，构建了大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、铁氧还蛋白fdx基因表达增强质粒pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx。
〔实施例7〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<7-1>将大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因扩增质粒导入WC196ΔmezadhE*株
在WC196ΔmezadhE*/pCABD2中通过电穿孔分别导入pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx、比较对照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、丙酮酸合酶基因、以及铁氧还蛋白基因的表达株命名为WC196ΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx、对照株命名为WC196ΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr。
<7-2>大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因的表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196ΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr、WC196ΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx这两个菌株接种于LB平板培养基，37℃培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量坂口烧瓶中的20mL下述组成的乙醇培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养96小时。使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸和残留乙醇。此外，还测定了培养液的浊度。
两次培养的平均值如表4所示。大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因、大肠杆菌来源的铁氧还蛋白基因的表达增强的菌株中，与对照相比，观察到了L-赖氨酸蓄积的提高。
〔乙醇培养基组成〕
乙醇20ml/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
卡那霉素40mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
MgSO4·7H2O与碳酸钙分别单独灭菌，再添加。乙醇、卡那霉素、链霉素单独添加。
【表4】
表4
菌株 Lys(g/L) EtOH(V/V％) OD620
WC196Δmez PL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr 2.47 0.00 14.7
WC196Δmez PL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr-fpr-ydbK-fdx 2.89 0.00 9.3
〔实施例8〕<纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达质粒的构建与表达的确认>
纤细裸藻Z株是最适生长温度为27℃的光合性原生生物。从该生物中分离出丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因，构建了表达该基因的质粒。
<8-1>纤细裸藻来源丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达质粒的构建
按Rotte等的方法从纤细裸藻Z株(ATCC12894)制作cDNA文库(Rotte，C.etal.2001.Mol.Biol.Evol.18：710-720)。以该cDNA为模板，使用SEQIDNO：40、41所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因片段。用KpnI消化所得基因片段，然后插入pUC19(TakaraBio公司制造)的KpnI位点从而构建了质粒，命名为pUC-PNO。在使用BigDyeTerminatorsv1.1CycleSequencingKit确认丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因的全长中没有PCR错误后，用KpnI将丙酮酸:NADP+氧化还原酶从pUC-PNO中切出，插入pMW-Pthr的KpnI位点，构建了丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达用质粒pMW-Pthr-PNO。
<8-2>纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达株的丙酮酸:NADP+氧化还原酶表达的确认
在WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2中通过电穿孔分别导入pMW-Pthr-PNO、比较对照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达株命名为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr-PNO，对照株命名为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMWPthr。
将上述菌株接种于含20mg/L链霉素和40mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养过夜。将1mL培养液接种于20mL含20mg/L链霉素和40mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养5小时。通过离心分离回收菌体，悬浮于1mL的PBS中。将悬浮液用超声波破碎机破碎，15000rpm、离心15分钟后，以所得上清作为粗抽提液。使用蛋白测定CBB溶液(NakalaiTesque公司制造)测定粗抽提液中的蛋白质浓度，将包含10μg蛋白质的粗抽提液用于样品制备。样品制备如下进行：在粗抽提液中加入NuPAGELDS样品缓冲液(Invitrogen公司制造)使其浓度为1.1倍，再加入NuPAGE样品还原剂(Invitrogen公司制造)使其终浓度为10％，70℃加热处理10分钟。对于制备好的样品，使用NuPAGETris-乙酸凝胶3-8％(Invitrogen公司制造)进行电泳。使用MagicMarkXPWesternProteinStandard(Invitrogen公司制造)作为分子量标准。
对于电泳后的凝胶，使用iBlotGelTransferDevice(Invitrogen公司制造)将其转印到膜上。从转印后的封闭直至检测的操作使用WesternBreezeChemiluminescentWesternBlotImmunodetectionKit(Invitrogen公司制造)进行。首先，对膜进行30分钟封闭处理后，用纯水洗涤2次，在1000倍稀释的抗PNO血清溶液中温育1小时。将膜用洗涤液洗涤3次，在第二抗体溶液中温育30分钟。将膜用洗涤液洗涤3次、再用纯水洗涤2次后，加入检测试剂，使用Lumino-imageAnalyzerLAS-1000(FuiiPhotoFilm公司制造)进行检测。结果如图1所示。对于WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr-PNO株，检测到了200kD左右的推定为PNO的条带。另一方面，对于对照株WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2/pMW-Pthr株，没有检测出这样的条带。
〔实施例9〕<纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因的表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<9-1>将纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因扩增质粒导入WC196Δmez株
向WC196Δmez/pCABD2中通过电穿孔分别导入pMW-Pthr-PNO和比较对照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达株命名为WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-PNO，对照株命名为WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr。
<9-2>纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因的表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr和WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-PNO这两个菌株接种于LB平板培养基，37℃培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量的坂口烧瓶中的20mL下述组成的油酸培养基中，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养72小时。使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。此外，对培养液中的活菌数也进行了测定。两次培养的平均值如表5所示。
在纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达增强株中，与对照相比，可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔油酸培养基组成〕
油酸钠20g/L
Tween805g/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
卡那霉素40mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
油酸钠与Tween80混合后灭菌，然后再添加。MgSO4·7H2O和碳酸钙分别单独灭菌，再添加。卡那霉素、链霉素单独添加。
【表5】
表5
菌株 Lys(g/L) 活菌数(108/mL)
WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr 1.77 22.3
WC196Δmez/pCABD2/pMW-Pthr-PNO 2.41 15.9
〔实施例10〕<纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<10-1>将纤细裸藻来源丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因扩增用质粒导入WC196ΔmezadhE*株
在WC196ΔmezadhE*/pCABD2中通过电穿孔分别导入pMW-Pthr-PNO、比较对照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。纤细裸藻来源丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达株命名为WC196ΔmezadhE*/pCABD2/pMW-Pthr-PNO，对照株命名为WC196ΔmezadhE*/pCABD2/pMW-Pthr。
<10-2>纤细裸藻来源丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196ΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr、WC196ΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-Pthr-PNO这两个菌株接种于LB平板培养基，于37℃预培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量坂口烧瓶中的20mL下述组成的乙醇培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养96小时。培养的第96小时取样1mL，使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。此外，还测定了培养液的浊度。两次培养的平均值如表6所示。纤细裸藻来源的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因表达增强的菌株中，与对照相比，可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔乙醇培养基组成〕
乙醇20ml/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
卡那霉素40mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
MgSO4·7H2O和碳酸钙分别单独灭菌后添加。乙醇、卡那霉素、链霉素也单独添加。
【表6】
表6
菌株 Lys(g/L) EtOH(V/V％) OD620
WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr 2.47 0.00 14.7
WC196Δmez adhE*/pCABD2/pMW-Pthr-PNO 2.63 0.00 12.9
〔实施例11〕<大肠杆菌L-赖氨酸生产株WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2的构建>
<11-1>大肠杆菌L-赖氨酸生产株WC196ΔcadAΔldcCΔfadR的构建
调节大肠杆菌脂肪酸代谢的转录因子FadR由fadR基因(SEQIDNO：82)编码(DiRusso，C.C.etal.1992.J.Biol.Chem.267：8685-8691)。作为大肠杆菌的L-赖氨酸生产株，从国际专利公报WO2006/078039所述的WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株构建了fadR基因的缺损株。
编码调节脂肪酸代谢的转录因子的fadR基因的缺失利用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko，K.A.andWanner，B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.etal.2002.J.Bacteriol.184：5200-5203)来进行。使用质粒pMW118-(λattL-Kmr-aλttR)(WO2006/093322)作为模板，SEQIDNO：68和69所示合成寡核苷酸作为引物，进行了PCR，其中所述引物的3′末端具有对应于attL和attR的两端的序列，引物的5′末端具有对应于目的基因fadR基因的一部分的序列。
对于扩增的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，通过电穿孔将其导入包含具有温度敏感型复制能力的质粒pKD46的大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC株中。然后，为了除去pKD46质粒，在含Km(卡那霉素)的LB琼脂培养基上42℃传代2次，测试所得菌落的氨苄青霉素抗性，获得了pKD46脱落的氨苄青霉素敏感型株。在氨苄青霉素敏感型株中通过PCR确认了能够基于卡那霉素抗性基因(kan)识别的fadR基因的缺失。将所得fadR缺损株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔfadR::att-kan株。
然后，为了除去导入fadR基因内的att-kan基因，使用上述的pMW-intxis-ts(美国专利申请公开20060141586)作为辅助质粒。pMW-intxis-ts是一种具有温度敏感型复制能力的质粒，携带编码λ噬菌体的整合酶(Int)的基因、编码切除酶(excisionase、Xis)的基因。
采用常规方法制作上述所得WC196ΔcadAΔldcCΔfadR::att-kan株的感受态细胞，用辅助质粒pMW-intxis-ts进行转化，于30℃在含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行平板培养，选择氨苄青霉素抗性株。为了除去pMW-intxis-ts质粒，在LB琼脂培养基上42℃传代2次，测试所得菌落的氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性，获得了卡那霉素和氨苄青霉素敏感型株，它是att-kan和pMW-intxis-ts脱落的fadR破坏株。将该株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔfadR株。
<11-2>大肠杆菌L-赖氨酸生产株WC196ΔcadAΔldcCΔfadRΔsfcA的构建
按照上述<11-1>的方法，使用SEQIDNO：70、71的引物作为sfcA破坏用引物，使WC196ΔcadAΔldcCΔfadR株中sfcA基因缺失。这样，获得了WC196ΔcadAΔldcCΔfadRΔsfcA株。
<11-3>大肠杆菌L-赖氨酸生产株WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2的构建
按照上述<11-1>的方法，使用SEQIDNO：72、73的引物作为b2463破坏用引物来进行WC196ΔcadAΔldcCΔfadRΔsfcA株中b2463基因的缺失。这样，得到了WC196ΔcadAΔldcCΔfadRΔsfcAΔb2463株。将该菌株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR株。在该菌株中通过电穿孔导入质粒pCABD2，以链霉素抗性为指标获得转化体，确认了质粒的导入。将该菌株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2株。
〔实施例12〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达质粒的构建>
<12-1>大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因扩增用质粒的构建
以大肠杆菌MG1655株的染色体为模板，使用SEQIDNO：42、43所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因片段。将基因片段用SmaI消化后，插入pMW-PL-tac的SmaI位点，构建了大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因扩增用质粒，命名为pMW-PL-tac-fpr。pMW-PL-tac是这样构建的质粒：以WO2006/043730记载的大肠杆菌MG1655PL-tacxylE株的基因组为模板，使用SEQIDNO：84和SEQIDNO：85所示的引物，通过PCR方法扩增包含PL-tac的片段，然后，将所得基因片段用HindIII以及SalI切割后，插入到同样用HindIII以及SalI切割的pMW119(NipponGene制造)中。该质粒中，可以在所述PL-tac下游克隆基因并加以表达。
<12-2>将大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因插入大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达质粒
用KpnI从实施例5记载的pSTV-ydbK中将丙酮酸合酶基因ydbK切出，插入pMW-PL-tac-fpr的KpnI位点，构建了大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达质粒pMW-PL-tac-fpr-ydbK。
〔实施例13〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因的表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<13-1>将大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达质粒导入WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2株
在WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2株中通过电穿孔分别导入pMW-PL-tac-fpr-ydbK和比较对照用载体pMW-PL-tac，以氨苄青霉素抗性为指标获得转化体，确认了质粒的导入。将大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达增强株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-fpr-ydbK，对照株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac。
<13-2>大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac、WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-fpr-ydbK这两个菌株接种于LB平板培养基，于37℃预培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量的坂口烧瓶中的20mL下述组成的油酸培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养72小时。使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。此外，对培养液中的活菌数也进行了测定。两次培养的平均值如表7所示。在大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因的表达增强株中，与对照相比，可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔油酸培养基组成〕
油酸钠10g/L
Tween805g/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
氨苄青霉素100mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
油酸钠与Tween80混合后灭菌，然后再添加。MgSO4·7H2O和碳酸钙分别单独灭菌，再添加。氨苄青霉素、链霉素也是单独添加。
【表7】
表7
菌株 Lys (g/L) 活菌数 (108/mL)
WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-fpr-ydbK 3.17 4.11 6.00 0.23
〔实施例14〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<14-1>大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC株来源的醇脱氢酶(AdhE)突变株的构建
为了赋予L-赖氨酸生产菌以乙醇同化性，以MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE *为供体，对L-赖氨酸生产菌WC196ΔcadAΔldcC株进行了P1转导，获得了WC196ΔcadAΔldcCPL-tacadhE*株。
<14-2>大肠杆菌L-赖氨酸生产株WC196ΔcadAΔldcCΔsfcAPL-tacadhE *的构建
按照上述<11-1>的方法，使用SEQIDNO：70、71的引物作为sfcA破坏用引物，使WC196ΔcadAΔldcCadhE*株中sfcA基因缺失。由此获得了WC196ΔcadAΔldcCΔsfcAPL-tacadhE*株。
<14-3>大肠杆菌L-赖氨酸生产株WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2的构建
按照上述<11-1>的方法，使用SEQIDNO：72、73的引物作为b2463破坏用引物，使WC196ΔcadAΔldcCΔsfcAadhE*株中b2463基因缺失。由此得到了WC196ΔcadAΔldcCΔsfcAΔb2463PL-tacadhE*株。将该菌株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*株。在该菌株中通过电穿孔导入质粒pCABD2，以链霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将该株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2株。
<14-4>将大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达质粒导入WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2株
在WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2株中通过电穿孔分别导pMW-PL-tac-fpr-ydbK、比较对照用载体pMW-PL-tac，以氨苄青霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达增强的菌株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac-fpr-ydbK，对照株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac。
<14-5>大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因的表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac、WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac-fpr-ydbK这两个菌株接种于LB平板培养基，于37℃预培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量的坂口烧瓶中的20mL下述组成的乙醇培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养120小时。培养第120小时，取样1mL，使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。此外，还测定了培养液的浊度。两次培养的平均值如表8所示。大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因、大肠杆菌来源的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因表达增强株中，与对照相比，可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔乙醇培养基组成〕
乙醇20mL/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
氨苄青霉素100mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
MgSO4·7H2O和碳酸钙分别单独灭菌后再添加。乙醇、氨苄青霉素、链霉素也单独添加。
【表8】
表8
菌株 Lys (g/L) EtOH (％V/V) OD600
WC196ΔcadAΔldcCΔmez PL-tacadhE */pCABD2/pMW-PL-tac WC196ΔcadAΔldcCΔmez PL-tacadhE */pCABD2/pMW-PL-tac-fpr-ydbK 2.15 2.52 0.00 0.00 12.0 10.0
〔实施例15〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒的构建及该基因增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<15-1>大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒的构建
以大肠杆菌MG1655株的染色体为模板，使用SEQIDNO：74、75所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了丙酮酸合酶基因片段。将所得基因片段用KpnI消化，插入到pMW-PL-tac的KpnI位点，构建了大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因表达质粒pMW-PL-tac-ydbK。
<15-2>将大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒导入WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2株
向WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2株中通过电穿孔分别导入pMW-PL-tac-ydbK、比较对照用载体pMW-PL-tac，以氨苄青霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达增强株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-ydbK，对照株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac。
<15-3>大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac、WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-ydbK这两个菌株接种于LB平板培养基，于37℃预培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量的坂口烧瓶中的20mL下述组成的油酸培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养72小时培养。使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。三次培养的平均值如表9所示。在大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因表达增强的菌株中，与对照相比，可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔油酸培养基组成〕
油酸钠10g/L
Tween805g/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
氨苄青霉素100mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
油酸钠与Tween80混合后灭菌，然后再添加。MgSO4·7H2O和碳酸钙分别单独灭菌，再添加。氨苄青霉素、链霉素也单独添加。
表9
菌株 Lys(g/L)
WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-ydbK 2.95 4.05
〔实施例16〕<海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶表达质粒的构建与活性测定>
<16-1>海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒的构建
以海藻甲烷球菌ATCC43000株的染色体为模板，使用SEQIDNO：76、77所示的寡核苷酸进行PCR，扩增了丙酮酸合酶基因片段。将所得基因片段用SacI消化，插入到pMW-PL-tac的SacI位点，构建了海藻甲烷球菌来源丙酮酸合酶基因表达质粒pMW-PL-tac-MmPS。
<16-2>海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶的活性测定
在大肠杆菌JM109株(TakaraBio)中通过电穿孔分别导入pMW-PL-tac-MmPS、比较对照用载体pMW-PL-tac，以氨苄青霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。海藻甲烷球菌来源丙酮酸合酶基因表达株命名为JM109/pMW-PL-tac-MmPS，对照株命名为JM109/pMW-PL-tac。
将上述菌株接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养过夜。通过离心分离回收菌体、按照实施例2所述的绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因表达株的活性测定方法测定了活性。结果如表10所示。对照株JM109/pMW-PL-tac中，未确认到丙酮酸合酶的活性，而海藻甲烷球菌来源丙酮酸合酶基因表达株JM109/pMW-PL-tac-MmPS中，确认到了7.1U/mg的活性。比活性的单位与表1相同。
【表10】
表10
质粒 比活性
pMW-PL-tac 0.0
pMW-PL-tac-MmPS 7.1
〔实施例17〕<海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶基因的基因表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<17-1>将海藻甲烷球菌来源丙酮酸合酶基因表达质粒导入WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2株
在WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2株中通过电穿孔分别导入pMW-PL-tac-MmPS和比较对照用载体pMW-PL-tac，以氨苄青霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将海藻甲烷球菌来源丙酮酸合酶基因表达增强株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-MmPS，对照株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac。
<17-2>海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶基因的表达增强对以油酸作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac、WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-MmPS这两个菌株接种于LB平板培养基，于37℃预培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量的坂口烧瓶中的20mL下述组成的油酸培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养72小时培养。使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。此外，对培养液中的活菌数也进行了测定。三次培养的平均值如表11所示。海藻甲烷球菌来源丙酮酸合酶基因表达增强株中，与对照相比，可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔油酸培养基组成〕
油酸钠10g/L
Tween805g/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
氨苄青霉素100mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH7.0(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
油酸钠与Tween80混合后灭菌，然后再添加。MgSO4·7H2O和碳酸钙分别单独灭菌，再添加。氨苄青霉素、链霉素也单独添加。
【表11】
表11
菌株 Lys(g/L)
WC196ΔcadAΔldcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac WC196ΔcadAΔIdcCΔmezΔfadR/pCABD2/pMW-PL-tac-MmPS 2.90 4.22
〔实施例18〕<海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶基因的基因表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果>
<18-1>将海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶基因基因表达质粒导入WC196ΔcadAΔldcCΔmezadhE*/pCABD2株
在WC196ΔcadAΔldcCΔmezadhE*/pCABD2株中，通过电穿孔分别导入pMW-PL-tac-MmPS、比较对照用载体pMW-PL-tac，以氨苄青霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶基因表达增强株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac-MmPS，对照株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac。
<18-2>海藻甲烷球菌来源丙酮酸合酶基因表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-赖氨酸生产能力的效果
将WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac、WC196ΔcadAΔldcCΔmezPL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac-MmPS这两个菌株接种于LB平板培养基，于37℃预培养过夜。将相当于1/8平板的菌体接种于500mL容量坂口烧瓶中的20mL下述组成的乙醇培养基，37℃、搅拌速度120rpm、需氧条件下培养96小时培养。培养第96小时，取样1mL，使用生物传感器BF-5(王子计测机器)测定了培养基中蓄积的L-赖氨酸。此外，还测定了培养液的浊度。两次培养的平均值如表12所示。海藻甲烷球菌来源的丙酮酸合酶基因表达增强株中，与对照相比，可以观察到L-赖氨酸蓄积的提高。
〔乙醇培养基组成〕
乙醇20mL/L
MgSO4·7H2O1g/L
(NH4)2SO412g/L
KH2PO40.5g/L
酵母提取物1g/L
FeSO4·7H2O0.01g/L
MnSO4·5H2O0.01g/L
氨苄青霉素100mg/L
链霉素20mg/L
碳酸钙30g/L
pH70(用KOH进行调整)灭菌条件：115℃、10分钟
MgSO4·7H2O与碳酸钙分别单独灭菌，然后再添加。乙醇、氨苄青霉素、链霉素也单独添加。
【表12】
表12
菌株 Lys (g/L) EtOH (％V/V) OD620
WC196ΔcadAΔldcCΔmez PL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac WC196ΔcadAΔldcCΔmez PL-tacadhE*/pCABD2/pMW-PL-tac-MmPS 2.19 2.67 0.10 0.14 13.9 12.0
〔实施例19〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因高表达质粒pPL-ydbK3的构建>
<19-1>大肠杆菌MG1655cat-PL-ydbK株的构建
为了制作大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因的高表达质粒，将基因组上的ydbK基因的启动子更换为PL启动子。启动子取代利用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko，K.A.andWanner，B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)以及λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.etal.2002.J.Bacteriol.184：5200-5203)来进行。制备了ydbK-attR(SEQIDNO：78)和PL-ydbK(SEQIDNO：79)作为引物，所述ydbK-attR具有attR、ydbK基因的上游序列、以及BW25113cat-PL-yddG株基因组上的Cmr基因的相邻区域的序列，所述PL-ydbK具有ydbK基因的上游区域和存在于BW25113cat-PL-yddG株基因组中的PL启动子的下游区域的序列。关于BW25113cat-PL-yddG株，在欧洲专利申请公开EP1449918A1或者俄罗斯专利申请公开RU2222596中有具体记载。以BW25113cat-PL-yddG株基因组为模板，使用SEQIDNO：78以及79所示的合成寡核苷酸作为引物进行了PCR。将所得PCR产物通过电穿孔导入大肠杆菌MG1655/pKD46株，选择Cm抗性重组体。为了除去pKD46，将其涂布在含Cm的LB平板培养基上，42℃进行两轮培养后，选择出氨苄青霉素敏感型株。将这样得到的菌株命名为MG1655cat-PL-ydbK株。
<19-2>质粒pPL-ydbK3的构建
使用GenEluteBacterialGenomicDNAKit(Sigma-Aldrich公司)制备了MG1655cat-PL-ydbK株的基因组。将基因组DNA和质粒pMW119用SalI切割后，进行混合并连接。用反应液转化MG1655株，选择Cm抗性株。对于cat-PL-ydbK的构建，通过以质粒DNA为模板，以ydbKC1(SEQIDNO：80)和ydbKCH2(SEQIDNO：81)为引物，通过PCR进行了确认。得到了包含长度11.2kb的插入的质粒pMW119cat-PL-ydbKbig-1。将质粒pMW119cat-PL-ydbKbig-1用限制酶SmlI(NewEnglandBiolabs公司)消化后，用克列诺片段进行标准处理(Sambrook，J.etal.1989.MolecularCloningALaboratoryManual/SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork)。将pMW119用SmaI消化后，将两质粒的切割产物混合并进行连接。用反应液转化MG1655株，选择Cmr株。从Cm抗性株抽提出质粒，通过BamHI消化确认了其长度。这样得到了具有所得6.7kb的cat-PL-ydbK片段的质粒pPLydbK3。
〔实施例20〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因的表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-苏氨酸生产能力的效果>
为了研究大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因的扩增对L-苏氨酸生产能力的效果，将实施例1中制作的MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE*用质粒pVIC40转化。质粒pVIC40是美国专利第5,705,371号所述的L-苏氨酸生产质粒。将MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE*/pVIC40进一步用pPLydbK3转化，得到了MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE*/pVIC40/pPLydbK3株。将所述菌株用营养培养液(nutrientbroth)于37℃培养18小时后，将0.1ml的培养液添加到20×200mm的试管中的2mlL-苏氨酸生产用乙醇培养基中，32℃回旋培养72小时。对于第48小时和第72小时的培养基中的L-苏氨酸量，通过纸层析进行了考察，所述纸层析的流动相由丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。使用含2％茚三酮的丙酮溶液作为显现试剂。切取包含L-苏氨酸的点，在0.5％的CdCl2水溶液中洗脱后，依据540nm处的吸收进行了定量。10根试管的培养结果如表13所示。与非增强株MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE*/pVIC40相比，大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达增强的MG1655ΔtdhrhtA*PL-tacadhE*/pVIC40/pPLydbK3显示了更高的L-苏氨酸蓄积。
〔L-苏氨酸生产用乙醇培养基组成〕
乙醇20g/L
(NH4)2SO422g/L
K2HPO42g/L
MgSO4·7H2O0.8g/L
MnSO4·5H2O0.02g/L
FeSO4·7H2O0.02g/L
维生素B10.002g/L
酵母提取物1.0g/L
CaCO330g/L
pH7.0、K2HPO4和CaCO3分别单独灭菌后再添加。乙醇也单独添加。
【表13】
表13
〔实施例21〕<大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因的表达增强对以乙醇作为碳源进行培养时的L-缬氨酸生产能力的效果>
为了考察大肠杆菌来源的丙酮酸合酶基因表达增强对L-缬氨酸生产能力的效果，从MG1655::PL-tacadhE*株对L-缬氨酸生产菌H-81株进行P1转导，得到了H-81PL-tacadhE*株。进一步，将H-81PL-tacadhE*株用pPLydbK3转化，得到了H-81PL-tacadhE*/pPLydbK3株。将这些菌株用营养培养液(nutrientbroth)于37℃培养18小时后，将0.1ml的培养液添加到20×200mm的试管中的2mlL-缬氨酸生产用乙醇培养基中，32℃转动培养72小时。第48小时和第72小时，通过TLC对培养基中的L-缬氨酸量进行了定量。使用包被有0.11mmSorbfil硅胶的不含荧光试剂的10×15cmTLC平板(StockCompanySorbpolymer，Krasnodar，Russia)，利用由异丙醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝40∶40∶7∶16(v/v)构成的流动相进行展开后，以2％茚三酮丙酮溶液作为显现试剂来进行定量。10根试管的培养结果如表14所示。与非增强株H-81PL-tacadhE*株相比，大肠杆菌来源丙酮酸合酶基因表达增强的H-81PL-tacadhE*/pPLydbK3株显示了更高的L-缬氨酸蓄积。
L-缬氨酸生产用乙醇培养基
乙醇20g/L
(NH4)2SO415g/L
KH2PO41.5g/L
MgSO4·7H2O1g/L
豆浓(mameno)(以总氮计)0.4g/L
CaCO325g/L
pH7.0、CaCO3单独灭菌。乙醇也单独添加。
【表14】
表14
〔序列表的说明〕
SEQIDNO：1：绿硫菌的丙酮酸合酶基因的碱基序列
SEQIDNO：2：绿硫菌的丙酮酸合酶的氨基酸序列
SEQIDNO：3：大肠杆菌的丙酮酸合酶基因(ydbK)的碱基序列
SEQIDNO：4：大肠杆菌的丙酮酸合酶(YdbK)的氨基酸序列
SEQIDNO：5：纤细裸藻的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因的碱基序列
SEQIDNO：6：纤细裸藻的丙酮酸:NADP+氧化还原酶的氨基酸序列
SEQIDNO：7：大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因(fpr)的碱基序列
SEQIDNO：8：大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因(fpr)编码的氨基酸序列
SEQIDNO：9：大肠杆菌的铁氧还蛋白基因(fdx)的碱基序列
SEQIDNO：10：大肠杆菌的铁氧还蛋白基因(fdx)编码的氨基酸序列
SEQIDNO：11：大肠杆菌的铁氧还蛋白基因(yfhL)的碱基序列
SEQIDNO：12：大肠杆菌的铁氧还蛋白基因(yhfL)编码的氨基酸序列
SEQIDNO：13：大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因(fldA)的碱基序列
SEQIDNO：14：大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因(fldA)编码的氨基酸序列
SEQIDNO：15：大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因(fldB)的碱基序列
SEQIDNO：16：大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因(fldB)编码的氨基酸序列
SEQIDNO：17：绿硫菌的铁氧还蛋白I基因的碱基序列
SEQIDNO：18：绿硫菌的铁氧还蛋白I基因编码的氨基酸序列
SEQIDNO：19：绿硫菌的铁氧还蛋白II基因的碱基序列
SEQIDNO：20：绿硫菌的铁氧还蛋白II基因编码的氨基酸序列
SEQIDNO：21：大肠杆菌的醇脱氢酶基因(adhE)的碱基序列
SEQIDNO：22：大肠杆菌的醇脱氢酶(AdhE)的氨基酸序列
SEQIDNO：23：PL-tac和氯霉素抗性(CmR)基因扩增引物1
SEQIDNO：24：PL-tac和氯霉素抗性(CmR)基因扩增引物2
SEQIDNO：25：PL-tac的碱基序列
SEQIDNO：26：PL-tac和氯霉素抗性(CmR)基因扩增引物3
SEQIDNO：27：PL-tac和氯霉素抗性(CmR)基因扩增引物4
SEQIDNO：28：卡那霉素抗性(KmR)基因扩增引物1
SEQIDNO：29：卡那霉素抗性(KmR)基因扩增引物2
SEQIDNO：30：卡那霉素抗性(KmR)基因扩增引物3
SEQIDNO：31：卡那霉素抗性(KmR)基因扩增引物4
SEQIDNO：32：大肠杆菌的突变型醇脱氢酶基因扩增引物1
SEQIDNO：33：大肠杆菌的突变型醇脱氢酶基因扩增引物2
SEQIDNO：34：大肠杆菌的突变型醇脱氢酶基因扩增引物3
SEQIDNO：35：绿硫菌的丙酮酸合酶基因扩增引物1
SEQIDNO：36：绿硫菌的丙酮酸合酶基因扩增引物2
SEQIDNO：37：大肠杆菌的苏氨酸操纵子启动子序列
SEQIDNO：38：大肠杆菌的丙酮酸合酶基因扩增引物1
SEQIDNO：39：大肠杆菌的丙酮酸合酶基因扩增引物2
SEQIDNO：40：纤细裸藻的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因扩增引物1
SEQIDNO：41：纤细裸藻的丙酮酸:NADP+氧化还原酶基因扩增引物2
SEQIDNO：42：大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因扩增用引物1
SEQIDNO：43：大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因扩增用引物2
SEQIDNO：44：大肠杆菌的fdx基因扩增用引物1
SEQIDNO：45：大肠杆菌的fdx基因扩增用引物2
SEQIDNO：46：大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶Ep1亚基基因(aceE)的碱基序列
SEQIDNO：47：大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶Ep1亚基的氨基酸序列
SEQIDNO：48：大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶E2亚基基因(aceF)的碱基序列
SEQIDNO：49：大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶E2亚基的氨基酸序列
SEQIDNO：50：大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶E3亚基基因(1pdA)的碱基序列
SEQIDNO：51：大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶E3亚基的氨基酸序列
SEQIDNO：52：编码大肠杆菌的NAD型苹果酸酶的基因(sfcA)的碱基序列
SEQIDNO：53：大肠杆菌的sfcA基因编码的苹果酸酶的氨基酸序列
SEQIDNO：54：编码大肠杆菌的NADP型苹果酸酶的基因(b2463)的碱基序列
SEQIDNO：55：大肠杆菌的b2463基因编码的苹果酸酶的氨基酸序列
SEQIDNO：56：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶γ亚基基因(porA)的碱基序列
SEQIDNO：57：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶γ亚基的氨基酸序列
SEQIDNO：58：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶δ亚基基因(porB)的碱基序列
SEQIDNO：59：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶δ亚基的氨基酸序列
SEQIDNO：60：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶α亚基基因(porC)的碱基序列
SEQIDNO：61：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶α亚基的氨基酸序列
SEQIDNO：62：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶β亚基基因(porD)的碱基序列
SEQIDNO：63：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶β亚基的氨基酸序列
SEQIDNO：64：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶porE基因的碱基序列
SEQIDNO：65：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶PorE的氨基酸序列
SEQIDNO：66：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶porF基因的碱基序列
SEQIDNO：67：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶PorF的氨基酸序列
SEQIDNO：68：fadR基因破坏用PCR引物1
SEQIDNO：69：fadR基因破坏用PCR引物2
SEQIDNO：70：sfcA基因破坏用PCR引物1
SEQIDNO：71：sfcA基因破坏用PCR引物2
SEQIDNO：72：b2463基因破坏用PCR引物1
SEQIDNO：73：b2463基因破坏用PCR引物2
SEQIDNO：74：大肠杆菌的丙酮酸合酶基因扩增引物1
SEQIDNO：75：大肠杆菌的丙酮酸合酶基因扩增引物2
SEQIDNO：76：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶基因扩增引物1
SEQIDNO：77：海藻甲烷球菌的丙酮酸合酶基因扩增引物2
SEQIDNO：78：大肠杆菌的丙酮酸合酶基因启动子取代用扩增引物1
SEQIDNO：79：大肠杆菌的丙酮酸合酶基因启动子取代用扩增引物2
SEQIDNO：80：cat-PL-ydbK结构确认用引物1
SEQIDNO：81：cat-PL-ydbK结构确认用引物2
SEQIDNO：82：大肠杆菌的fadR基因的碱基序列
SEQIDNO：83：大肠杆菌的FadR的氨基酸序列
SEQIDNO：84：PL-tac扩增引物1
SEQIDNO：85：PL-tac扩增引物2
工业实用性
通过使用本发明的微生物，能够高效地发酵生产L-氨基酸。此外，在本发明的方法的优选实施方式中，通过抑制脱碳酸、利用碳酸固定反应，能够降低二氧化碳排放，是环境友好的方法。
序列表
<110>味之素株式会社(AjinomotoCo.，Inc.)0
<120>生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
<130>C985-C8187
<150>JP2007-228733
<151>2007-09-04
<150>RU2007147434
<151>2007-12-21
<160>85
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>3558
<212>DNA
<213>绿硫菌(Chlorobiumtepidum)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3558)
<400>1
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<212>PRT
<213>绿硫菌
<400>2
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202530
aaaatcttccgcgccgccgctctggctgctgcagatgctcgaatccca144
LysIlePheArgAlaAlaAlaLeuAlaAlaAlaAspAlaArgIlePro
354045
ctcgcgaaaatggccgttgccgaatccggcatgggtatcgtcgaagat192
LeuAlaLysMetAlaValAlaGluSerGlyMetGlyIleValGluAsp
505560
aaagtgatcaaaaaccactttgcttctgaatatatctacaacgcctat240
LysValIleLysAsnHisPheAlaSerGluTyrIleTyrAsnAlaTyr
65707580
aaagatgaaaaaacctgtggtgttctgtctgaagacgacacttttggt288
LysAspGluLysThrCysGlyValLeuSerGluAspAspThrPheGly
859095
accatcactatcgctgaaccaatcggtattatttgcggtatcgttccg336
ThrIleThrIleAlaGluProIleGlyIleIleCysGlyIleValPro
100105110
accactaacccgacttcaactgctatcttcaaatcgctgatcagtctg384
ThrThrAsnProThrSerThrAlaIlePheLysSerLeuIleSerLeu
115120125
aagacccgtaacgccattatcttctccccgcacccgcgtgcaaaagat432
LysThrArgAsnAlaIleIlePheSerProHisProArgAlaLysAsp
130135140
gccaccaacaaagcggctgatatcgttctgcaggctgctatcgctgcc480
AlaThrAsnLysAlaAlaAspIleValLeuGlnAlaAlaIleAlaAla
145150155160
ggtgctccgaaagatctgatcggctggatcgatcaaccttctgttgaa528
GlyAlaProLysAspLeuIleGlyTrpIleAspGlnProSerValGlu
165170175
ctgtctaacgcactgatgcaccacccagacatcaacctgatcctcgcg576
LeuSerAsnAlaLeuMetHisHisProAspIleAsnLeuIleLeuAla
180185190
actggtggtccgggcatggttaaagccgcatacagctccggtaaacca624
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195200205
gctatcggtgtaggcgcgggcaacactccagttgttatcgatgaaact672
AlaIleGlyValGlyAlaGlyAsnThrProValValIleAspGluThr
210215220
gctgatatcaaacgtgcagttgcatctgtactgatgtccaaaaccttc720
AlaAspIleLysArgAlaValAlaSerValLeuMetSerLysThrPhe
225230235240
gacaacggcgtaatctgtgcttctgaacagtctgttgttgttgttgac768
AspAsnGlyValIleCysAlaSerGluGlnSerValValValValAsp
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tctgtttatgacgctgtacgtgaacgttttgcaacccacggcggctat816
SerValTyrAspAlaValArgGluArgPheAlaThrHisGlyGlyTyr
260265270
ctgttgcagggtaaagagctgaaagctgttcaggatgttatcctgaaa864
LeuLeuGlnGlyLysGluLeuLysAlaValGlnAspValIleLeuLys
275280285
aacggtgcgctgaacgcggctatcgttggtcagccagcctataaaatt912
AsnGlyAlaLeuAsnAlaAlaIleValGlyGlnProAlaTyrLysIle
290295300
gctgaactggcaggcttctctgtaccagaaaacaccaagattctgatc960
AlaGluLeuAlaGlyPheSerValProGluAsnThrLysIleLeuIle
305310315320
ggtgaagtgaccgttgttgatgaaagcgaaccgttcgcacatgaaaaa1008
GlyGluValThrValValAspGluSerGluProPheAlaHisGluLys
325330335
ctgtccccgactctggcaatgtaccgcgctaaagatttcgaagacgcg1056
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ValGluLysAlaGluLysLeuValAlaMetGlyGlyIleGlyHisThr
355360365
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370375380
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405410415
ctgactctgggttgtggttcttggggtggtaactccatctctgaaaac1296
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gttggtccgaaacacctgatcaacaagaaaaccgttgctaagcgagct1344
ValGlyProLysHisLeuIleAsnLysLysThrValAlaLysArgAla
435440445
gaaaacatgttgtggcacaaacttccgaaatctatctacttccgccgt1392
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GlySerLeuProIleAlaLeuAspGluValIleThrAspGlyHisLys
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ttcttcgaagtagaagcggacccgaccctgagcatcgttcgtaaaggt1584
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515520525
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545550555560
catccggaaactcacttcgaagagctggcgctgcgctttatggatatc1728
HisProGluThrHisPheGluGluLeuAlaLeuArgPheMetAspIle
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IleAlaValThrThrThrSerGlyThrGlySerGluValThrProPhe
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gacatgccgaagtccctgtgtgctttcggtggtctggacgcagtaact1968
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cacgccatggaagcttatgtttctgtactggcatctgagttctctgat2016
HisAlaMetGluAlaTyrValSerValLeuAlaSerGluPheSerAsp
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ggtcaggctctgcaggcactgaaactgctgaaagaatatctgccagcg2064
GlyGlnAlaLeuGlnAlaLeuLysLeuLeuLysGluTyrLeuProAla
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SerTyrHisGluGlySerLysAsnProValAlaArgGluArgValHis
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agtgcagcgactatcgcgggtatcgcgtttgcgaacgccttcctgggt2160
SerAlaAlaThrIleAlaGlyIleAlaPheAlaAsnAlaPheLeuGly
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gtatgtcactcaatggcgcacaaactgggttcccagttccatattccg2208
ValCysHisSerMetAlaHisLysLeuGlySerGlnPheHisIlePro
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cacggtctggcaaacgccctgctgatttgtaacgttattcgctacaat2256
HisGlyLeuAlaAsnAlaLeuLeuIleCysAsnValIleArgTyrAsn
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gcgaacgacaacccgaccaagcagactgcattcagccagtatgaccgt2304
AlaAsnAspAsnProThrLysGlnThrAlaPheSerGlnTyrAspArg
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ccgcaggctcgccgtcgttatgctgaaattgccgaccacttgggtctg2352
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AlaLysAlaGluLysLysAlaLysLysSerAla
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<210>22
<211>891
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>22
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202530
LysIlePheArgAlaAlaAlaLeuAlaAlaAlaAspAlaArgIlePro
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LeuAlaLysMetAlaValAlaGluSerGlyMetGlyIleValGluAsp
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65707580
LysAspGluLysThrCysGlyValLeuSerGluAspAspThrPheGly
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100105110
ThrThrAsnProThrSerThrAlaIlePheLysSerLeuIleSerLeu
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LysThrArgAsnAlaIleIlePheSerProHisProArgAlaLysAsp
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AlaThrAsnLysAlaAlaAspIleValLeuGlnAlaAlaIleAlaAla
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<210>23
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
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tcatcgcag69
<210>24
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
attagtaacagccataatgctctcctgataatgttaaaccgctcacaattccacacat58
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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aat183
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
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<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
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<210>28
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
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<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
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tgatg65
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
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<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
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<210>32
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
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ggatatccg69
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
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<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
aagacgcgctgacaatacgccttt24
<210>35
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ttttctagataaggaggaatgacgtatgacccggacattcaagacaatgga51
<210>36
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
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<211>344
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>37
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aactggtcgactggttacaacaacgcctggggcttttagagcaacgagacacggcaatgt120
tgcaccgtttgctgcatgatattgaaaaaaatatcaccaaataaaaaacgccttagtaag180
tatttttcagcttttcattctgactgcaacgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaa240
agagtgtctgatagcagcttctgaactggttacctgccgtgagtaaattaaaattttatt300
gacttaggtcactaaatactttaaccaatataggcgactctaga344
<210>38
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
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<210>39
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
gagagaccgggtaccttaatcggtgttgcttttttccgct40
<210>40
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
aattggtacctaaggaggaatgacgtatgaccagtggcccaaaaccggc49
<210>41
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
gcgacgcctagcttagggtaccttaccatgcctcgatattgt42
<210>42
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
ctctctggccccgggctgattgatttgatcgattg35
<210>43
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
gagagaccccgggttaccagtaatgctccgctg33
<210>44
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
gcgcgaattcgggcgatgatgttgacgcca30
<210>45
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
gcgcgaattcgtcccatactaacctctgtt30
<210>46
<211>2664
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2664)
<400>46
atgtcagaacgtttcccaaatgacgtggatccgatcgaaactcgcgac48
MetSerGluArgPheProAsnAspValAspProIleGluThrArgAsp
151015
tggctccaggcgatcgaatcggtcatccgtgaagaaggtgttgagcgt96
TrpLeuGlnAlaIleGluSerValIleArgGluGluGlyValGluArg
202530
gctcagtatctgatcgaccaactgcttgctgaagcccgcaaaggcggt144
AlaGlnTyrLeuIleAspGlnLeuLeuAlaGluAlaArgLysGlyGly
354045
gtaaacgtagccgcaggcacaggtatcagcaactacatcaacaccatc192
ValAsnValAlaAlaGlyThrGlyIleSerAsnTyrIleAsnThrIle
505560
cccgttgaagaacaaccggagtatccgggtaatctggaactggaacgc240
ProValGluGluGlnProGluTyrProGlyAsnLeuGluLeuGluArg
65707580
cgtattcgttcagctatccgctggaacgccatcatgacggtgctgcgt288
ArgIleArgSerAlaIleArgTrpAsnAlaIleMetThrValLeuArg
859095
gcgtcgaaaaaagacctcgaactgggcggccatatggcgtccttccag336
AlaSerLysLysAspLeuGluLeuGlyGlyHisMetAlaSerPheGln
100105110
tcttccgcaaccatttatgatgtgtgctttaaccacttcttccgtgca384
SerSerAlaThrIleTyrAspValCysPheAsnHisPhePheArgAla
115120125
cgcaacgagcaggatggcggcgacctggtttacttccagggccacatc432
ArgAsnGluGlnAspGlyGlyAspLeuValTyrPheGlnGlyHisIle
130135140
tccccgggcgtgtacgctcgtgctttcctggaaggtcgtctgactcag480
SerProGlyValTyrAlaArgAlaPheLeuGluGlyArgLeuThrGln
145150155160
gagcagctggataacttccgtcaggaagttcacggcaatggcctctct528
GluGlnLeuAspAsnPheArgGlnGluValHisGlyAsnGlyLeuSer
165170175
tcctatccgcacccgaaactgatgccggaattctggcagttcccgacc576
SerTyrProHisProLysLeuMetProGluPheTrpGlnPheProThr
180185190
gtatctatgggtctgggtccgattggtgctatttaccaggctaaattc624
ValSerMetGlyLeuGlyProIleGlyAlaIleTyrGlnAlaLysPhe
195200205
ctgaaatatctggaacaccgtggcctgaaagatacctctaaacaaacc672
LeuLysTyrLeuGluHisArgGlyLeuLysAspThrSerLysGlnThr
210215220
gtttacgcgttcctcggtgacggtgaaatggacgaaccggaatccaaa720
ValTyrAlaPheLeuGlyAspGlyGluMetAspGluProGluSerLys
225230235240
ggtgcgatcaccatcgctacccgtgaaaaactggataacctggtcttc768
GlyAlaIleThrIleAlaThrArgGluLysLeuAspAsnLeuValPhe
245250255
gttatcaactgtaacctgcagcgtcttgacggcccggtcaccggtaac816
ValIleAsnCysAsnLeuGlnArgLeuAspGlyProValThrGlyAsn
260265270
ggcaagatcatcaacgaactggaaggcatcttcgaaggtgctggctgg864
GlyLysIleIleAsnGluLeuGluGlyIlePheGluGlyAlaGlyTrp
275280285
aacgtgatcaaagtgatgtggggtagccgttgggatgaactgctgcgt912
AsnValIleLysValMetTrpGlySerArgTrpAspGluLeuLeuArg
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<210>55
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<212>PRT
<213>大肠杆菌
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202530
ArgAspLeuAlaLeuAlaTyrSerProGlyValAlaAlaProCysLeu
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505560
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AsnIleGlyAlaLeuAlaGlyLysProValMetGluGlyLysGlyVal
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LeuPheLysLysPheAlaGlyIleAspValPheAspIleGluValAsp
100105110
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165170175
GlyLeuArgValValGluLysAsnIleSerAspValArgMetValVal
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260265270
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GlnArgGlyGluAlaAspAlaMetIleCysGlyThrValGlyAspTyr
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LeuAlaGluIleThrLeuMetAlaAlaGluThrValArgArgPheGly
610615620
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AspCysProSerSerSerLysMetArgGlnAlaLeuGluLeuValArg
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690695700
IleSerTyrAsnLeuLeuArgValSerSerSerGluGlyValThrVal
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caagcttttccattctttggtgtggaaagaagaggggctcccgtaatg144
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tacgaaccaaattacgtaattgtgcaggatccaacattgatggattca240
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gtagatgttacaagcgggatcaaagacggcggaataattttgataaac288
ValAspValThrSerGlyIleLysAspGlyGlyIleIleLeuIleAsn
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acgttaaaagacataaaactcaatggctacgacgttaaaacaatagac336
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100105110
gctacaggaatagcattggaagttcttggagttccgattgtaaatacg384
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115120125
acactttgtggagcttttgctgggcttactggagaagttactatcgaa432
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85
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<213>海藻甲烷球菌
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85
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<212>DNA
<213>海藻甲烷球菌
<220>
<221>CDS
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<400>60
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202530
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505560
gcaagtattggagcaagtgcggcaggtgcaagagcatttactgcaaca240
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100105110
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115120125
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130135140
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325330335
AspValAlaSerHisLeuLysAspLysLysThrValAsnTyrIleVal
340345350
GlyLeuGlyGlyArgAspIleThrProGluAspIleLeuGlyIleTyr
355360365
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370375380
LysGluGlu
385
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<213>海藻甲烷球菌
<220>
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<213>海藻甲烷球菌
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<213>海藻甲烷球菌
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tcatcaccctgtatggaagtatgtcctgtttcggctatcgaatcaaag192
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gatggtgtaatttatcttgacaaagaatcctgcattggatgtggactc240
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65707580
tgtgcaatggcatgcccctttggtgcaatatacataagcggaaagact288
CysAlaMetAlaCysProPheGlyAlaIleTyrIleSerGlyLysThr
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gcacacaagtgtgatttgtgttttggaagagacgaacaagcatgtgtt336
AlaHisLysCysAspLeuCysPheGlyArgAspGluGlnAlaCysVal
100105110
aaagcatgcagtaaaagatgtctcgaagttgtaaacgttgatgaatta384
LysAlaCysSerLysArgCysLeuGluValValAsnValAspGluLeu
115120125
gtaatggataaaaagttgaataatattgaaaatttaacagttttgggt432
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130135140
tctaaaggaaaatccaaaaagaaaaaaggactcctttctttagttact480
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145150155160
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165
<210>66
<211>417
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<213>海藻甲烷球菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(417)
<400>66
atgaaggtaatgccaaatattgacttgtgcgtagattgcaaaaagtgt48
MetLysValMetProAsnIleAspLeuCysValAspCysLysLysCys
151015
gaacgggcatgtcctataaacgcaattcacgtttttgatgggattccc96
GluArgAlaCysProIleAsnAlaIleHisValPheAspGlyIlePro
202530
attaggtgtatgcactgtgaagatgcaccctgtcttaatgtatgtccc144
IleArgCysMetHisCysGluAspAlaProCysLeuAsnValCysPro
354045
gaagatgcaattgagaaaatagctgataaagtagtagtacaccctgaa192
GluAspAlaIleGluLysIleAlaAspLysValValValHisProGlu
505560
aagtgtgttggatgtgcattatgtgctgaagtttgccctgttggggcc240
LysCysValGlyCysAlaLeuCysAlaGluValCysProValGlyAla
65707580
atacagattgatagaggtacaaaagtcgcagtaaaatgtgatggatgt288
IleGlnIleAspArgGlyThrLysValAlaValLysCysAspGlyCys
859095
atcgaaagaggcagtgaagtatgtcttgaagtgtgtcctacaaaggca336
IleGluArgGlySerGluValCysLeuGluValCysProThrLysAla
100105110
ctcgactactacgaaaatacaattgaaaacaaaagagcggaacttgtt384
LeuAspTyrTyrGluAsnThrIleGluAsnLysArgAlaGluLeuVal
115120125
tcaaaacttaagaaattaacttcaagaaaataa417
SerLysLeuLysLysLeuThrSerArgLys
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<210>67
<211>138
<212>PRT
<213>海藻甲烷球菌
<400>67
MetLysValMetProAsnIleAspLeuCysValAspCysLysLysCys
151015
GluArgAlaCysProIleAsnAlaIleHisValPheAspGlyIlePro
202530
IleArgCysMetHisCysGluAspAlaProCysLeuAsnValCysPro
354045
GluAspAlaIleGluLysIleAlaAspLysValValValHisProGlu
505560
LysCysValGlyCysAlaLeuCysAlaGluValCysProValGlyAla
65707580
IleGlnIleAspArgGlyThrLysValAlaValLysCysAspGlyCys
859095
IleGluArgGlySerGluValCysLeuGluValCysProThrLysAla
100105110
LeuAspTyrTyrGluAsnThrIleGluAsnLysArgAlaGluLeuVal
115120125
SerLysLeuLysLysLeuThrSerArgLys
130135
<210>68
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
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tat63
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caaaaaacccctcgtttgaggggtttgctctttaaacggaagggacgctcaagttagtat60
aaa63
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<400>70
ccgacgccctggcggtaaagcaaagacgataaaagccccccagggtgaagcctgcttttt60
tat63
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<223>引物
<400>71
agggagagggaaatagcccggtagccttcactaccgggcgcaggccgctcaagttagtat60
aaa63
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<211>63
<212>DNA
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<220>
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<400>72
gcccacacactttatttgtgaacgttacgtgaaaggaacaaccaatgaagcctgcttttt60
tat63
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<211>63
<212>DNA
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<220>
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ctgcttaccctgaatattcagggtaagcgtgagagttaaaaaaaacgctcaagttagtat60
aaa63
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<212>DNA
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<220>
<223>引物
<400>74
ttggtaccaataattttgtttaactttaagaaggagatataatgattactattgacggta60
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gcgacgcctagcttagggtaccttaatcggtgttgcttttttccgcttttcc52
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catagagctctaaggaggaatgacgtatgaaagaagttagattcca46
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caaaagcgaaaatgcagaagaaagccatttgctaaacgctcaagttagtataaaaaagct60
gaac64
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<220>
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aagcaaccgcgccattaccgtcaatagtaatcatatagctgtttccttctagacggccaa60
tgct64
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cttcctctgatcttcaagcca21
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(720)
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atggtcattaaggcgcaaagcccggcgggtttcgcggaagagtacatt48
MetValIleLysAlaGlnSerProAlaGlyPheAlaGluGluTyrIle
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attgaaagtatctggaataaccgcttccctcccgggactattttgccc96
IleGluSerIleTrpAsnAsnArgPheProProGlyThrIleLeuPro
202530
gcagaacgtgaactttcagaattaattggcgtaacgcgtactacgtta144
AlaGluArgGluLeuSerGluLeuIleGlyValThrArgThrThrLeu
354045
cgtgaagtgttacagcgtctggcacgagatggctggttgaccattcaa192
ArgGluValLeuGlnArgLeuAlaArgAspGlyTrpLeuThrIleGln
505560
catggcaagccgacgaaggtgaataatttctgggaaacttccggttta240
HisGlyLysProThrLysValAsnAsnPheTrpGluThrSerGlyLeu
65707580
aatatccttgaaacactggcgcgactggatcacgaaagtgtgccgcag288
AsnIleLeuGluThrLeuAlaArgLeuAspHisGluSerValProGln
859095
cttattgataatttgctgtcggtgcgtaccaatatttccactattttt336
LeuIleAspAsnLeuLeuSerValArgThrAsnIleSerThrIlePhe
100105110
attcgcaccgcgtttcgtcagcatcccgataaagcgcaggaagtgctg384
IleArgThrAlaPheArgGlnHisProAspLysAlaGlnGluValLeu
115120125
gctaccgctaatgaagtggccgatcacgccgatgcctttgccgagctg432
AlaThrAlaAsnGluValAlaAspHisAlaAspAlaPheAlaGluLeu
130135140
gattacaacatattccgcggcctggcgtttgcttccggcaacccgatt480
AspTyrAsnIlePheArgGlyLeuAlaPheAlaSerGlyAsnProIle
145150155160
tacggtctgattcttaacgggatgaaagggctgtatacgcgtattggt528
TyrGlyLeuIleLeuAsnGlyMetLysGlyLeuTyrThrArgIleGly
165170175
cgtcactatttcgccaatccggaagcgcgcagtctggcgctgggcttc576
ArgHisTyrPheAlaAsnProGluAlaArgSerLeuAlaLeuGlyPhe
180185190
taccacaaactgtcggcgttgtgcagtgaaggcgcgcacgatcaggtg624
TyrHisLysLeuSerAlaLeuCysSerGluGlyAlaHisAspGlnVal
195200205
tacgaaacagtgcgtcgctatgggcatgagagtggcgagatttggcac672
TyrGluThrValArgArgTyrGlyHisGluSerGlyGluIleTrpHis
210215220
cggatgcagaaaaatctgccgggtgatttagccattcaggggcgataa720
ArgMetGlnLysAsnLeuProGlyAspLeuAlaIleGlnGlyArg
225230235
<210>83
<211>239
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>83
MetValIleLysAlaGlnSerProAlaGlyPheAlaGluGluTyrIle
151015
IleGluSerIleTrpAsnAsnArgPheProProGlyThrIleLeuPro
202530
AlaGluArgGluLeuSerGluLeuIleGlyValThrArgThrThrLeu
354045
ArgGluValLeuGlnArgLeuAlaArgAspGlyTrpLeuThrIleGln
505560
HisGlyLysProThrLysValAsnAsnPheTrpGluThrSerGlyLeu
65707580
AsnIleLeuGluThrLeuAlaArgLeuAspHisGluSerValProGln
859095
LeuIleAspAsnLeuLeuSerValArgThrAsnIleSerThrIlePhe
100105110
IleArgThrAlaPheArgGlnHisProAspLysAlaGlnGluValLeu
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TyrHisLysLeuSerAlaLeuCysSerGluGlyAlaHisAspGlnVal
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225230235
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<223>引物
<400>84
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<212>DNA
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<220>
<223>引物
<400>85
atcctctagagtcgacgcggccgctcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccaca60
cattatac68

Claims (11)

1.一种生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸的方法，其包括在含有乙醇或脂肪酸作为碳源的培养基中培养微生物，使该培养基中或菌体内生成并蓄积所述L-氨基酸，并从该培养基或菌体收集所述L-氨基酸，其中所述微生物是具有生产所述L-氨基酸的能力，且经过修饰而增强了丙酮酸合酶或丙酮酸：NADP+氧化还原酶的活性的微生物，其中丙酮酸合酶或丙酮酸：NADP+氧化还原酶的活性是通过提高编码丙酮酸合酶或丙酮酸：NADP+氧化还原酶的基因的拷贝数或修饰所述基因的表达调节序列而增强的，其中所述微生物是大肠杆菌，且其中所述编码丙酮酸合酶的基因来源于绿硫菌、大肠杆菌或海藻甲烷球菌，并且所述编码丙酮酸：NADP+氧化还原酶的基因来源于纤细裸藻。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因编码下述(A)或(C)所示的多肽，或下述(E1)、(F1)、(G1)和(H1)的多肽，或下述(E1)、(F1)、(G1)、(H1)、(I1)和(J1)的多肽：
(A)由SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成的多肽；
(C)由SEQIDNO：4所示的氨基酸序列组成的多肽；
(E1)由SEQIDNO：57所示的氨基酸序列组成的多肽；
(F1)由SEQIDNO：59所示的氨基酸序列组成的多肽；
(G1)由SEQIDNO：61所示的氨基酸序列组成的多肽；
(H1)由SEQIDNO：63所示的氨基酸序列组成的多肽；
(I1)由SEQIDNO：65所示的氨基酸序列组成的多肽；
(J1)由SEQIDNO：67所示的氨基酸序列组成的多肽。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因包含下述(a)或(c)的DNA，或下述(e1)、(f1)、(g1)和(h1)的DNA，或下述(e1)、(f1)、(g1)、(h1)、(i1)和(j1)的DNA：
(a)由SEQIDNO：1所示的碱基序列组成的DNA；
(c)由SEQIDNO：3所示的碱基序列组成的DNA；
(e1)由SEQIDNO：56所示的碱基序列组成的DNA；
(f1)由SEQIDNO：58所示的碱基序列组成的DNA；
(g1)由SEQIDNO：60所示的碱基序列组成的DNA、
(h1)由SEQIDNO：62所示的碱基序列组成的DNA、
(h1)由SEQIDNO：64所示的碱基序列组成的DNA；
(j1)由SEQIDNO：66所示的碱基序列组成的DNA。
4.权利要求1所述的方法，其中，编码丙酮酸：NADP+氧化还原酶的基因编码下述(A)所示的多肽：
(A)由SEQIDNO：6所示的氨基酸序列组成的多肽。
5.权利要求1所述的方法，其中，编码丙酮酸：NADP+氧化还原酶的基因包含下述(a)的DNA：
(a)由SEQIDNO：5所示的碱基序列组成的DNA。
6.权利要求1所述的方法，其中所述微生物经过修饰而增强了铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性。
7.权利要求1所述的方法，其中所述微生物经过修饰而提高了产生铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的能力。
8.权利要求1所述的方法，其中所述微生物经过修饰而降低了苹果酸酶的活性。
9.权利要求1所述的方法，其中所述微生物经过修饰而降低了丙酮酸脱氢酶活性。
10.权利要求1所述的方法，其中所述微生物经过修饰从而能够以需氧方式同化乙醇。
11.权利要求8所述的方法，其中，该微生物的NAD型苹果酸酶和NADP型苹果酸酶二者的活性均已降低。
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