CN113913478B

CN113913478B - 一种发酵黄色短杆菌产l-缬氨酸的方法

Info

Publication number: CN113913478B
Application number: CN202111425367.4A
Authority: CN
Inventors: 陈修来; 赵阔; 郭亮; 刘立明; 高聪; 刘佳; 柳亚迪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2041-11-26
Also published as: CN113913478A

Abstract

本发明公开了一种发酵黄色短杆菌产L‑缬氨酸的方法。本发明将gapA和ilvBNC基因通过表达载体导入黄色短杆菌中，筛选获得高产L‑缬氨酸菌株的黄色短杆菌工程菌；利用该工程菌进行有氧‑厌氧分段发酵，并在厌氧发酵中后期添加V_B3以及采用流加葡萄糖的方式，将发酵时间缩短到72h，L‑缬氨酸产率达到了95.00±1.50g/L，转化率达到33％，生产强度为1.32g/L/h，优化了L‑缬氨酸的发酵工艺，极大地提高了菌株的生产力和产酸效率。本发明所得高产L‑缬氨酸菌株，后续改造潜力巨大，且发酵工艺简单易行，成本低廉，适用于工业化生产。

Description

一种发酵黄色短杆菌产L-缬氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵黄色短杆菌产L-缬氨酸的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，属于分支链氨基酸(branched chain amino acids,BCAA)，是人体必需氨基酸之一，分子式C₅H₁₁NO₂，密度1.316g/cm³，白色结晶或粉末，溶于水，缬氨酸分子是手性分子，根据偏振光的旋转方向分为D型和L型，天然的缬氨酸都为L-缬氨酸。

L-缬氨酸是人体必需氨基酸之一，自身不能合成，必须通过膳食来源来补充，其具有多种生理功能，因此广泛应用于食品、医药、饲料等领域。如在食品行业，添加L-缬氨酸的能量饮料具有促进肌肉形成、减轻肌肉疲劳等作用。在面包糕点中添加L-缬氨酸能极大地提高食品风味、改善口感；在医药行业，L-缬氨酸是制造复合氨基酸药物的重要原料，主要用于血脑、肝脏、代谢缺陷、创伤愈合、营养支持等的治疗，效果显著；在饲料行业中，L-缬氨酸可用于饲料添加剂，在促进乳腺组织发育、改善泌乳功能、调节糖代谢等方面有重要作用。

目前，L-缬氨酸的工业生产方法分为直接提取法、化学合成法和微生物发酵法。微生物发酵法的原料易得、反应条件温和、生产成本低，因此目前世界上L-缬氨酸的工业化生产大多采用微生物发酵法。黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)作为食品安全级的微生物，具有易培养、不产孢子等优点，因此是一类重要的工业生产菌株，可用于生产包括L-缬氨酸在内的多种氨基酸。黄色短杆菌是一种无芽孢的、细胞为短小棒状呈八字排列的革兰氏阳性细菌，属于放线菌目棒状杆菌属。

黄色短杆菌中L-缬氨酸的生物合成路径已经明确。葡萄糖经过糖酵解途径生成L-缬氨酸合成的重要前体--丙酮酸，丙酮酸再通过4步反应即可合成L-缬氨酸：首先由ilvBN基因编码的乙酰羟酸合酶将两分子的丙酮酸缩合成2-乙酰羟酸，然后在ilvC基因编码的乙酰羟酸还原异构酶催化下转化为2,3-二羟基异戊酸，再由ilvD基因编码的二羟酸脱水酶将2,3-二羟基异戊酸脱水形成2-酮基异戊酸，最后ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶将2-酮基异戊酸转化成L-缬氨酸。胞内积累的L-缬氨酸由brnFE编码的转运蛋白复合体BrnFE转运至胞外。

徐庆阳等人以黄色短杆菌XV0505为生产菌株，通过优化发酵条件，10L罐发酵72h，L-缬氨酸产量达到53.4g/L。张伟国等人以L-缬氨酸产生菌黄色短杆菌XQ-2为出发菌株，经诱变处理及定向筛选，获得一株L-缬氨酸高产菌黄色短杆菌XQ-8，其摇瓶发酵72h后，L-缬氨酸产量达64-66g/L。专利201910349690.4“一株产L-缬氨酸的黄色短杆菌及其应用”经筛选获得一株高产L-缬氨酸的黄色短杆菌B.flavum FMME447，通过对培养基进行优化，发酵90h，其产率达到了80-90g/L。

其中，专利201910349690.4中L-缬氨酸能够达到较高的产量，但是其中培养基的成本相对较高，且发酵时间相对较长，发明人预更换培养基，并采用一种有氧与厌氧联合发酵的方法进行发酵，但是采用201910349690.4中的菌株进行发酵时，72h产量仅达到31±0.5g/L，转化率和生产强度都很低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种发酵黄色短杆菌产L-缬氨酸的方法，一方面对菌株进行了改造，在产L-缬氨酸的黄色短杆菌中过表达乙酰羟酸合酶ilvBN和乙酰羟酸还原异构酶ilvC(乙酰羟酸合酶ilvBN和乙酰羟酸还原异构酶ilvC的编码基因为基因簇ilvBNC)，并采用强启动子gapA启动表达关键基因ilvBNC，获得能够高表达L-缬氨酸的黄色短杆菌，另一方面对发酵工艺进行优化，进一步提升L-缬氨酸的产量、转化率及生产强度。

本发明的第一个目的是提供一种发酵黄色短杆菌产L-缬氨酸的方法，所述方法采用黄色短杆菌工程菌为发酵菌株，按照如下步骤进行发酵：

S1、制备黄色短杆菌工程菌种子液；

S2、将所述的黄色短杆菌工程菌种子液接种至发酵培养基中进行有氧发酵，并采用两阶段溶氧控制有氧发酵过程；

其中，所述的两阶段溶氧控制为：阶段一、发酵至OD在10-12时，溶氧降为0，阶段二、OD₆₁₀达到45-50时，停止通气，并降低转速；

S3、至S2步骤中残糖接近0时，转为厌氧发酵至发酵结束，在厌氧发酵过程中，流加葡萄糖控制发酵液中葡萄糖的质量百分比浓度为7％-9％，并在厌氧发酵到15-30h时添加V_B3；

其中，所述的黄色短杆菌工程菌是在产L-缬氨酸的黄色短杆菌中过表达乙酰羟酸合酶ilvBN和乙酰羟酸还原异构酶ilvC，并采用强启动子gapA启动乙酰羟酸合酶ilvBN编码基因和乙酰羟酸还原异构酶ilvC编码基因表达。

进一步地，所述的发酵培养基由以下组分构成：(NH₄)₂SO₄ 8-15g/L，KH₂PO₄ 1-1.5g/L，K₂HPO₄ 1-1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-0.8g/L，酵母浸出粉3-6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2-20mg/L，MnSO₄·H₂O 4-20mg/L，生物素0.02-0.2mg/L，维生素B1 0.2-2mg/L，消泡剂0.5-1mL/L，葡萄糖60-100g/L，卡那霉素30-60mg/L，V_B3 10-20mg/L。

进一步地，有氧发酵的初始发酵条件为：温度30-33℃，pH 7.5±0.5，罐压0.02-0.05mpa，风量0.3-0.5m³/h，转速280-320rpm，溶氧不低于10％。

进一步地，在溶氧控制的阶段二中，OD₆₁₀达到45-50时，转速降低至100-200rpm。

进一步地，在厌氧发酵时，所述的V_B3添加浓度为10-20mg/L。

进一步地，厌氧发酵的条件为：温度30-33℃，pH 7.5±0.5，转速100-200rpm，罐压0mpa，不通风。

进一步地，所述的产L-缬氨酸的黄色短杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2019053。

进一步地，所述的强启动子gapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的乙酰羟酸合酶ilvBN编码基因和所述的乙酰羟酸还原异构酶ilvC编码基因组成的基因簇ilvBNC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，将所述的黄色短杆菌工程菌种子液接种至发酵培养基中的接种量为质量浓度8-12％。

进一步地，所述的种子液制备包括斜面培养、一级摇瓶种子培养和二级种子培养。

进一步地，所述的斜面培养为将冻干管中的菌体划线活化于斜面培养基，在30-33℃恒温培养20-30h。

进一步地，所述的一级摇瓶种子培养为将斜面培养得到的菌株接种于一级种子培养基，100-140rpm，30-33℃恒温培养6-8h，OD₆₁₀*25在8.0-10.0之间，得到一级种子液。

进一步地，所述的二级摇瓶种子培养为将所述一级种子液按1-3％的接种量接种于二级培养基，10-1400rpm，30-33℃恒温培养6-8h，4-5.5h时加入20-30％的氨水维持pH在7.5±0.1，OD₆₁₀*25在8.0-12.0之间，得到所述的种子液。

进一步地，所述一级种子培养基由以下组分构成：尿素1-3g/L，(NH₄)₂SO₄ 6-10g/L，KH₂PO₄ 0.5-0.8g/L，K₂HPO₄ 0.5-0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-0.8g/L，酵母浸出粉(OXOID)1-3g/L，蛋白胨(OXOID)7-9g/L，FeSO₄·7H₂O 4-10mg/L，MnSO₄·H₂O 4-10mg/L，生物素0.25-0.5mg/L，维生素B1 0.25-0.5mg/L，葡萄糖20-50g/L，卡那霉素30-60mg/L；pH 7.5±0.1。

进一步地，所述二级种子培养基由以下组分构成：(NH₄)₂SO₄ 8-10g/L，KH₂PO₄ 0.8-1.0g/L，K₂HPO₄ 0.8-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-0.8g/L，酵母浸出粉3-6g/L，FeSO₄·7H₂O20-40mg/L，MnSO₄·H₂O 4-10mg/L，生物素0.02-0.2mg/L，维生素B1 0.2-2mg/L，消泡剂0.5-1mL/L，葡萄糖20-50g/L，卡那霉素30-60mg/L，V_B3 10-20mg/L；pH 7.5±0.1。

本发明的第二个目的是提供一种黄色短杆菌工程菌，所述的黄色短杆菌工程菌是在保藏编号为CCTCC NO：M 2019053的黄色短杆菌中过表达乙酰羟酸合酶ilvBN和乙酰羟酸还原异构酶ilvC，并采用强启动子gapA启动乙酰羟酸合酶ilvBN编码基因和乙酰羟酸还原异构酶ilvC编码基因表达；其中，强启动子gapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，乙酰羟酸合酶ilvBN编码基因和乙酰羟酸还原异构酶ilvC编码基因组成的基因簇ilvBNC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供所述的黄色短杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将gapA和ilvBNC基因片段连接至表达载体上，得到重组载体；

(2)将所述重组载体转化至宿主菌中，筛选获得所述黄色短杆菌工程菌。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明利用L-缬氨酸合成途径上的两个关键基因gapA和ilvBNC，将其导入到黄色短杆菌内，使得黄色短杆菌内过表达合成L-缬氨酸，有效提高了L-缬氨酸的产量，最终获得了一株高产L-缬氨酸的黄色短杆菌工程菌；

通过采用有氧-厌氧分段发酵，以及厌氧发酵期间进行VB3补料并采用流加葡萄糖的方式，进一步优化了L-缬氨酸的发酵工艺，极大地提高了菌株的生产力和产酸效率，并将发酵时间缩短到了72h，L-缬氨酸产量达到了95.00±1.50g/L，转化率达到了33％-35％，生产强度为1.32-1.34g/L/h；

本发明所得工程菌后续改造潜力巨大，且发酵方法操作简便、设备要求低，发酵时间短，生产成本低，可进行自动化控制，适用于工业化规模生产。

附图说明：

图1是本发明黄色短杆菌FMME 33的发酵过程曲线图。

图2是本发明黄色短杆菌FMME 33的菌落形态图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明实施例所采用的试剂和药品均为市售原料。

本发明实施例的培养基类型及组成：

(1)斜面培养基：尿素2.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 7g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，酵母浸出粉(OXOID)2g/L，蛋白胨(OXOID)7g/L，FeSO₄·7H₂O 6mg/L，MnSO₄·H₂O 4mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 0.2mg/L，琼脂粉15g/L，葡萄糖40g/L，卡那霉素50mg/L，pH为7.5±0.1；

(2)一级种子培养基：尿素2.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 7g/L，KH2PO4 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H2O 0.5g/L，酵母浸出粉(OXOID)2g/L，蛋白胨(OXOID)7g/L，FeSO₄·7H₂O 6mg/L，MnSO₄·H₂O 4mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 0.2mg/L，葡萄糖40g/L，卡那霉素50mg/L，pH为7.5±0.1。

(3)二级种子培养基：(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 0.8g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，酵母浸出粉3g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 4mg/L，生物素0.02mg/L，维生素B1 2mg/L，消泡剂0.5mL/L，葡萄糖40g/L，卡那霉素50mg/L，V_B3 13mg/L，pH为7.5±0.1。

序列表中相关核苷酸序列信息：

SEQ ID NO.1序列信息为gapA基因的核苷酸序列；SEQ ID NO.2序列信息为ilvBNC基因的核苷酸序列。

菌体浓度测定：

取发酵液适当稀释，使用紫外-可见分光光度计在波长为610nm下测定OD₆₁₀值。

L-缬氨酸含量的测定：

(1)发酵液预处理：取发酵液12000rpm离心10min后取上清，用0.22μm滤膜过滤；

(2)高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中L-缬氨酸含量：流动相A为0.01mol/LKH₂PO₄溶液，用KOH调pH至5.3；流动相B为乙腈、甲醇与流动相A按5:3:1的体积比混合后用乙酸调pH至5.3。色谱柱为Aglient ZORBAX SB-Aq 250×4.6mm，5μm。利用柱前在线衍生方法，衍生剂为OPA，柱温：35℃，流速为1.0mL/min进行梯度洗脱，检测波长：UV 254nm；FLD：激发波长330nm/发射波长465nm。。

实施例1：B.flavum FMME 33的构建

为了在黄色短杆菌内过表达合成路径上的关键基因，故以B.flavum FMME 447的基因组为出发菌株，将两个基因片段导入菌体中，分别是强启动子gapA和合成路径关键基因ilvBNC。

对于gapA片段，设计gapA-F和gapA-R引物，对于ilvBNC片段，设计ilvBNC-F和ilvBNC-R引物。

引物序列信息：

gapA-F：5’-GAAGATCTGAAGATTCCTGA-3’；(SEQ ID NO.3)

gapA-R：5’-TCATGGTGTGTCTCCTCTAA-3’；(SEQ ID NO.4)

其中上游引物gapA-F带有BglII酶切位点，酶切位点如下划线序列，下游引物gapA-R带有NcoI和BspHI同尾酶酶切位点，酶切位点如下划线序列。

引物序列信息：

ilvBNC-F：5’-CCATGAATGTGGCAGCTTCT-3’；(SEQ ID NO.5)

ilvBNC-R：5’-AGATCTTTAAGCGGTTTCTG-3’；(SEQ ID NO.6)

其中上游引物ilvBNC-F带有NcoI和BspHI同尾酶酶切位点，酶切位点如下划线序列，下游引物ilvBNC-R带有BglII酶切位点，酶切位点如下划线序列。

PCR分别扩增gapA和ilvBNC基因，进行PCR扩增后得到其扩增片段，扩增反应体系如表1所示，反应条件如表2和表3所示。按照购自上海生工的PCR产物凝胶回收试剂盒，PCR扩增产物跑电泳确定目的条带后切胶回收进行纯化。

表1 PCR扩增反应体系

表2 gapA基因PCR扩增反应条件

表3 ilvBNC基因PCR扩增反应条件

以穿梭质粒pZ81-3为载体，采用BglII单酶切并用去磷酸化酶FastAP酶进行末端去磷酸化得到载体片段，将上述纯化回收的两段基因片段和载体片段采用T4 DNALigase进行连接得到表达载体，连接体系如表4所示；转化感受态的JM109细胞，采用质粒提取试剂盒进行重组质粒的抽提和验证，进而确定重组质粒。

表4连接体系

将构建成功的外源表达载体电击转化B.flavum FMME 447，采用含卡那霉素抗性平板进行筛选，对培养基上长出的转化子进行验证，获得目的菌株，将其命名为Brevibacterium flavum FMME 33，菌落图如图2所示。

实施例2：B.flavum FMME 33发酵生产L-缬氨酸

上罐流程：冷冻甘油管→活化斜面→摇瓶一级种子→发酵增殖罐→厌氧生物催化。

(1)斜面培养：把冻干管中的菌体划线活化于新鲜斜面培养基，30℃恒温培养24h左右；

(2)一级摇瓶种子培养：接一只活化斜面于装有100mL一级种子培养基的500mL三角瓶中，往复式摇床100rpm，30℃恒温培养6-8h左右，OD₆₁₀*25在6.0-8.0之间即可；

(3)发酵罐发酵：接种量为8％，发酵初始条件：温度30℃，pH 7.5，罐压0.02mpa，风量0.5m³/h，转速300rpm，溶氧不低于10％；两阶段溶氧控制：维持初始条件，当OD在8-10时，溶氧降为0，维持条件不变，流加氨水维持pH在7.5±0.1，当OD₆₁₀达到45-50时，停止通气，转速降为100rpm，其他条件不变，维持2h左右；当残糖降至接近0时，厌氧催化开始：厌氧催化条件温度33℃，pH 7.5，转速150rpm，罐压0，不通风，流加葡萄糖至9％，每2h检测残糖，残糖降至1％以下，发酵结束。

结果表明，采用本实施例的方法利用B.flavum FMME 33发酵生产L-缬氨酸，经过72h发酵，L-缬氨酸产量可以达到54.16g/L。而采用201910349690.4中的菌株B.flavumFMME 447进行发酵时，72h产量仅达到31±0.5g/L。

本实施例所用发酵培养基由以下组分构成：(NH₄)₂SO₄ 8g/L，KH₂PO₄ 0.8g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，酵母浸出粉3g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O4mg/L，生物素0.02mg/L，维生素B1 2mg/L，消泡剂0.5mL/L，葡萄糖60g/L，卡那霉素50mg/L，pH为7.5±0.1。

实施例3：B.flavum FMME 33生产L-缬氨酸的发酵优化

上罐流程：冷冻甘油管→活化斜面→摇瓶一级种子→摇瓶二级种子→发酵增殖罐→厌氧生物催化。

(2)一级摇瓶种子培养：接一只活化斜面于装有100mL一级种子培养基的500mL三角瓶中，往复式摇床120rpm，30℃恒温培养6-8h左右，OD₆₁₀*25在8.0-10.0之间即可；

(3)二级摇瓶种子培养：将一级种子按2％的接种量接种于装有100mL培养基的500mL三角瓶中，往复式摇床120rpm，30℃恒温培养6-8h左右，并在4.5h时加入100μL 25％的氨水，OD₆₁₀*25(净值)在8.0-12.0之间即可；

(4)发酵罐发酵：接种量为10％，发酵初始条件：温度30℃，pH 7.5，罐压0.02mpa，风量0.5m³/h，转速320rpm，溶氧不低于10％。两阶段溶氧控制：维持初始条件，当OD在10-12时，溶氧降为0，维持条件不变。流加氨水维持pH在7.5±0.1。当OD₆₁₀达到45-50时，停止通气，转速降为100rpm，其他条件不变，维持2h左右当残糖降至接近0时，厌氧催化开始；厌氧催化条件温度33℃，pH 7.5，转速150rpm，罐压0，不通风。流加葡萄糖至9％，每2h检测残糖，残糖降至1％以下，发酵结束；

(5)补料：发酵厌氧催化培养到24h，补小料V_B3 10mg/L；发酵生产L-缬氨酸的结果如图1所示。

本实施例中，

一级种子培养基由以下组分构成：尿素2.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 7g/L，KH2PO4 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H2O 0.5g/L，酵母浸出粉(OXOID)2g/L，蛋白胨(OXOID)7g/L，FeSO₄·7H₂O 6mg/L，MnSO₄·H₂O 4mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 0.2mg/L，葡萄糖40g/L，卡那霉素50mg/L，pH为7.5±0.1；

二级种子培养基由以下组分构成：(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 0.8g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，酵母浸出粉3g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 4mg/L，生物素0.02mg/L，维生素B1 2mg/L，消泡剂0.5mL/L，葡萄糖40g/L，卡那霉素50mg/L，V_B3 13mg/L，pH为7.5±0.1；

发酵培养基由以下组分构成：(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，酵母浸出粉3g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 4mg/L，生物素0.02mg/L，维生素B1 2mg/L，消泡剂0.5mL/L，葡萄糖90g/L，卡那霉素50mg/L，小料V_B3 13mg/L，pH为7.5±0.1。

图1的HPLC检测结果表明，采用本实施例B.flavum FMME 33发酵生产L-缬氨酸的方法，经过72h发酵，L-缬氨酸产量可以达到95.00±1.50g/L，产量较优化前提高了75.41％，转化率达到33％，生产强度为1.32g/L/h。

对比例1-6：

在实施例1的基础上，将合成路径关键基因ilvBNC替换为来源于Escherichiacoli、Caulobacter vibrioides或Saccharolobus solfataricus的乙酰羟酸合酶或乙酰羟酸还原异构酶编码的基因对菌株进行改造。

研究结果发现对比例1-6采用来源于Escherichia coli、Caulobactervibrioides或Saccharolobus solfataricus的乙酰羟酸合酶或乙酰羟酸还原异构酶编码的基因所制备的工程菌生产L-缬氨酸的效率明显低于本实施例1制备的工程菌B.flavumFMME 33。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种发酵黄色短杆菌产L-缬氨酸的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

agatctgaag attcctgata caaattctgt tgtgacggaa gatttgttgg aagaaatcta 60

gtcgctcgtc tcataaaaac gaccgagcct attgggatta ccattgaagc cagtgtgagt 120

tgcatcacac tggcttcaaa tctgagactt tactttgtgg atcacggggg tgtagtgcaa 180

ttcataatta gccccattcg ggggagcaga tcgcggcgcg aacgatttca ggttcgttcc 240

ctgcaaaaac tatttagcgc aagtgttgga aatgcccccg tctggggtca atgtctattt 300

ttgaatgtgt ttgtatgatt ttgaatccgc tgcaaaatct ttgtttcccc gctaaagttg 360

gggacaggtt gacacggagt tgactcgacg aattatccaa tgtgagtagg tttggtgcgt 420

gagttggaaa atttcgccat actcgccctt gggttctgtc agctcaagaa ttcttgagtg 480

accgatgctc tgattgacct aactgcttga cacattgcat ttcctacaat ctttagagga 540

gacacacc 548

<210> 2

<211> 3608

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60

gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120

gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180

tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgtct tggtgcgcca cgagcagggc 240

gcaggccacg cagcaaccgg ctacgcgcag gttactggac gcgttggcgt ctgcattgca 300

acctctggcc caggagcaac caacttggtt accccaatcg ctgatgcaaa cttggactcc 360

gttcccatgg ttgccatcac cggccaggtc ggaagtggcc tgctgggtac cgacgctttc 420

caggaagccg atatccgcgg catcaccatg ccagtgacca agcacaactt catggtcacc 480

gaccccaacg acattccaca ggcattggct gaggcattcc acctcgcgat tactggtcgc 540

cctggccctg ttctggtgga tattcctaag gatgtccaga acgctgaatt ggatttcgtc 600

tggccaccaa agatcgacct gccaggctac cgcccagttt caacaccaca tgctcgccag 660

atcgagcagg cagtcaagct gatcggtgag gccaagaagc ccgtccttta cgttggaggc 720

ggcgttatca aggctgacgc acacgaagag cttcgtgcgt tcgctgagta caccggcatc 780

ccagttgtca ccaccttgat ggctttgggt actttcccag agtctcacga gctgcacatg 840

ggtatgccag gcatgcatgg cactgtgtcc gctgttggtg cactgcagcg cagcgacctg 900

ctgattgcta tcggctcccg ctttgatgac cgcgtcaccg gtgacgttga caccttcgcg 960

cctgacgcca agatcattca cgccgatatg atcctgccga aatcggaaag atcaagcagg 1020

ttgaggttcc aatcgtgggc gatgcccgcg aagttcttgc tcgtctgctg gaaaccacca 1080

aggcaagcaa ggcagagacc gaggacatct ccgagtgggt tgactacctc aagggcctca 1140

aggcacgttt cccacgtggc tacgacgagc agccaggcga tctgctggca ccacagtttg 1200

tcattgaaac cctgtccaag gaagttggcc ccgacgcaat ttactgcgcc ggcgtcggac 1260

agcaccaaat gtgggcagct cagttcgttg actttgaaaa gccacgcacc tggctcaact 1320

ccggtggact gggcaccatg ggctacgcag ttcctgcggc ccttggagca aaggctggcg 1380

cacctgacaa ggaagtctgg gctatcgacg gcgacggctg tttccagatg accaaccagg 1440

aactcaccac cgccgcagtt gaaggtttcc ccattaagat cgcactaatc aacaacggaa 1500

acctgggcat ggttcgccaa tggcagaccc tattctatga aggacggtac tcaaatacta 1560

aacttcgtaa ccagggcgag tacatgcccg actttgttgc cctttctgag ggacttggct 1620

gtgttgccat ccgcgtcacc aaagcggagg aagtactgcc agccatccaa aaggctcgag 1680

aaatcaacga ccgcccagta gtcatcgact tcatcgtcgg tgaagacgca caggtatggc 1740

caatggtgtc tgctggatca tccaactccg atatccagta cgcactcgga ttgcgcccat 1800

tctttgacgg cgacgaatca gctgcagaag accctgcaga cattcatgct tccgttgatt 1860

cgaccgaggc ctaaggagag acccaagatg gctaattctg acgtcacccg ccacatcctg 1920

tccgtactcg ttcaggacgt agacggaatc atttcccgcg tatcaggtat gttcacccga 1980

cgcgcattca acctcgtgtc cctcgtgtct gcaaagaccg aaacacacgg catcaaccgc 2040

atcacggttg ttgtcgacgc cgacgagctc aacattgagc agatcaccaa gcagctcaac 2100

aagctgatcc cggtgctcaa agtcgtgcga cttgatgaag agaccactat cgcccgcgca 2160

atcatgctgg ttaaggtctc tgcggacagc accaaccgtc cgcagatcgt cgacgccgcg 2220

aacatcttcc gcgcccgagt cgtcgacgtg gctccagact ctgtggttat tgaatccaca 2280

ggcaccccag gcaagctccg cgctctgctt gatgtgatgg aaccattcgg aatccgcgaa 2340

ctgatccaat ccgaacagat tgcactcaac cgcggtccga agaccatggc tccggccaag 2400

atctaaacag caattaatct gattgcacct gctgcataaa tgtgactagt caaacaccgt 2460

ctaattacat gtgtgtggta gaacaataat gtagttgtct gcccaaccga gtgacactcc 2520

cacgatttac agtgggggca gacatctttt caccaaaatt tttacgaaag gcgagatttt 2580

ctcccatggc tattgaactg ctttatgatg ctgacgctga cctctccttg atccagggcc 2640

gtaaggttgc catcgttggc tacggctccc agggccacgc acacggccag aacctccgcg 2700

attctggcgt tgaggttgtc attggtgagt tcgagggctc caagtccgca gagaaggcaa 2760

aggaagcagg cttcgaagtc aagaccaccg ctgaggctgc agcttgggct gacgtcatca 2820

tgctcctggc tccagacacc tcccaggcag aaatcttcac caacgacatc gagccaaacc 2880

tgaacgcagg cgacgcactg ctgttcggcc acggcctgaa cattcacttc gacctgatca 2940

agccagctga cgacatcatc gttggcatgg ttgcgccaaa gggcccaggc cacttggttc 3000

gccgtcagtt cgttgatggc aagggtgttc cttgcctcat cgcagtcgac caggacccaa 3060

ccggaaccgc acaggctctg accctgtcct acgcagcagc aatcggtggc gcacgcgcag 3120

gcgttatccc aaccaccttc gaagctgaga ccgtcaccga cctcttcggc gagcaggctg 3180

ttctctgcgg tggcaccgag gaactggtca aggttggctt cgaggttctc accgaagctg 3240

gctacgagcc agagatggca tacttcgagg ttcttcacga gctcaagctc atcgttgacc 3300

tcatgttcga aggtggcatc agcaacatga actactctgt ttctgacacc gctgagttcg 3360

gtggctacct ctccggccca cgcgtcatcg atgcagacac caagtcccgc atgaaggaca 3420

tcctgaccga tatccaggac ggcaccttca ccaagcgcct catcgcaaac gttgagaacg 3480

gcaacaccga gcttgagggt cttcgtgctt cctacaacaa ccacccaatc gaggagaccg 3540

gcgctaagct ccgcgacctc atgagctggg tcaaggttga cgctcgcgca gaaaccgctt 3600

aaagatct 3608

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gaagatctga agattcctga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tcatggtgtg tctcctctaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

ccatgaatgt ggcagcttct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

agatctttaa gcggtttctg 20

Claims

1.一种发酵黄色短杆菌产L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法采用黄色短杆菌工程菌为发酵菌株，按照如下步骤进行发酵：

S1、制备黄色短杆菌工程菌种子液；

S3、至S2步骤中残糖接近0时，转为厌氧发酵至发酵结束，在厌氧发酵过程中，流加葡萄糖控制发酵液中葡萄糖的质量百分比浓度为7%-9%，并在厌氧发酵到15-30 h时添加V_B3；

其中，所述的黄色短杆菌工程菌是在产L-缬氨酸的黄色短杆菌中过表达乙酰羟酸合酶ilvBN和乙酰羟酸还原异构酶ilvC，并采用强启动子gapA启动乙酰羟酸合酶ilvBN编码基因和乙酰羟酸还原异构酶ilvC编码基因表达；

所述的发酵培养基由以下组分构成：(NH₄)₂SO₄ 8-15 g/L，KH₂PO₄ 1-1.5 g/L，K₂HPO₄ 1-1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-0.8 g/L，酵母浸出粉3-6 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2-20 mg/L，MnSO₄·H₂O 4-20 mg/L，生物素 0.02-0.2 mg/L，维生素B1 0.2-2 mg/L，消泡剂 0.5-1 mL/L，葡萄糖 60-100 g/L，卡那霉素 30-60 mg/L，V_B3 10-20 mg/L；

有氧发酵的初始发酵条件为：温度30-33 ℃，pH 7.5±0.5，罐压0.02-0.05 mpa，风量0.3-0.5 m³/h，转速280-320 rpm，溶氧不低于10%；

厌氧发酵的条件为：温度30-33 ℃，pH 7.5±0.5，转速100-200 rpm，罐压0 mpa，不通风；

所述的产L-缬氨酸的黄色短杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2019053；

所述的强启动子gapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的乙酰羟酸合酶ilvBN编码基因和所述的乙酰羟酸还原异构酶ilvC编码基因组成的基因簇ilvBNC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在溶氧控制的阶段二中，OD₆₁₀达到45-50时，转速降低至100-200 rpm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在厌氧发酵时，所述的V_B3添加浓度为10-20mg/L。