CN112852773B - 一种发酵生产d-氨基酸氧化酶的方法 - Google Patents

一种发酵生产d-氨基酸氧化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵生产D‑氨基酸氧化酶的方法，属于生物酶制备技术领域。所述方法包括：以表达D‑氨基酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，接种于发酵培养基中进行发酵培养，当溶解氧下降到1％以后采用DO‑STAT模式分批补料，DO设定值为10％～50％；发酵过程中添加10g/L‑50g/L的乳糖作为诱导剂，同时添加D‑氨基酸至发酵液中，继续培养至发酵结束后，收集胞内含有D‑氨基酸氧化酶的菌体。本发明通过分批补料发酵过程中添加高浓度乳糖作为诱导剂提高DAAO的酶活，同时添加适量D‑氨基酸减小DAAO对宿主细胞生长的抑制，大大提高了DAAO的生产效率，为工业化生产提供了条件。

Description

一种发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法
技术领域
本发明涉及生物酶制备技术领域，具体涉及一种利用基因工程菌发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法。
背景技术
D-氨基酸氧化酶(DAAO，EC 1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的黄酮酶，可在氧分子存在的情况下，催化具有绝对立体特异性的D-氨基酸的氧化脱氨反应，产生α-酮酸，氨和过氧化氢(H2O2)。由于其严格的立体选择性，DAAO已被用于生产非天然的L-氨基酸。
L-氨基酸是药物合成中重要的中间体化合物。目前DAAO已经广泛用于工业催化制备L-氨基酸。例如，DAAO作为催化剂将头孢菌素C转化为7-氨基头孢菌酸(7-ACA)，7-ACA是合成许多β-内酰胺药物的关键化合物，这对工业生产7-ACA提供了便利。草铵膦(PPT)作为一种有机磷除草剂，具有低毒，安全性高和光谱广的优点。但是现在市场上售卖的草铵膦通常是外消旋的混合物，其中具有除草活性的只有L-异构体(L-PPT)，所以将外消旋草铵膦中的D-异构体(D-PPT)去除，将会提高除草效率，降低成本。DAAO作为一种高效的特异性反应催化剂，可以用于制备L-PPT生物合成过程中的中间产物。随着草甘膦和百草枯的售卖市场减小，草铵膦的市场需求巨大，前景广阔。
由于DAAO催化的反应具有重大生物技术意义，所以大规模生产DAAO是当前研究的热点，通过不断优化发酵条件，或者通过分子改造，利用基因工程菌高效生产DAAO是提高DAAO工业生产的最有效方法。但是有研究表明宿主细胞的生长会受到产物DAAO的抑制，导致细胞生长受到限制。而DAAO对细胞生长的毒性作用的原因在于DAAO干扰了宿主细胞细胞壁的合成。此外，在DAAO催化D-氨基酸的这个过程中还会产生对大肠杆菌细胞有毒的H2O2，这也是影响细胞生长的一个关键问题。
目前，针对解除DAAO对宿主细胞生长的抑制提出了不同的方法。Zheng等，通过在N末端修饰改造使酶活性和生物量水平达到平衡，但在7.5L发酵罐中分批补料发酵过程中，酶活提高后生物量水平依然下降了40％，最后仅获得22g DCW/L。Sae-Jin Kim等，通过推后诱导时间来增加生物量，OD600约为40时添加诱导剂是最佳的诱导时机，通过这种方法在30L发酵罐中发酵48h后测得最终的OD600达到80.0。虽然该方法大幅度提高了生物量，但是发酵周期过长，并不利于工业化生产DAAO。
因此，开发一种能够得到高生物量并且表达高酶活DAAO的基因工程菌发酵方法是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术中，高表达DAAO的菌株由于在发酵过程中DAAO的表达对细胞生长的抑制作用，发酵所得的生物量低，若降低诱导剂浓度得到高浓度菌体所得的菌体酶活性低，无法获得大量高酶活的菌体的不足，本发明的目的是通过优化发酵方法，获得高生物量并且表达出高酶活的D-氨基酸氧化酶。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，包括以下步骤：
(1)以表达D-氨基酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，活化后扩大培养，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，当溶解氧下降到1％以后采用DO-STAT模式分批补料，DO设定值为10％～50％；发酵过程中添加10g/L-50g/L的乳糖作为诱导剂，同时添加D-氨基酸至发酵液中，继续培养至发酵结束，收集胞内含有D-氨基酸氧化酶的菌体。
本发明采用的生产菌株为采用基因工程技术构建的含有D-氨基酸氧化酶编码基因的重组大肠杆菌，表达质粒采用pET-24a，宿主细胞采用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
作为优选，生产菌株采用公布号为CN 109576236 A的专利文献中构建的表达D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。本发明中通过发酵生产DAAO方法中的基因工程菌为上述但不仅限于上述基因工程菌，本发明中所述方法适用于各种氨基酸氧化酶。
步骤(1)中，将基因工程菌活化并扩大培养用于后续的发酵培养。
所述扩大培养包括：将活化后的生产菌株接种于一级种子培养基中，一级种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，37℃振荡培养至OD600＝2，得到一级种子液，再将一级种子液按1％的接种量接种于二级种子培养基中，二级种子培养基组成为：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO4·3H2O 12.54g/L，37℃振荡培养OD600＝3，得到二级种子液。
在进行20L及20L以上体系的种子液培养时，培养条件为：温度37℃，通气量2.0vvm，转速250rpm，pH由50％(v/v)的磷酸和50％(v/v)的氨水调节至7.0。
步骤(2)中，将种子液接种于发酵培养基中发酵培养，发酵过程中添加诱导剂诱导表达D-氨基酸氧化酶。
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，(NH4)2SO45g/L，K2HPO4·3H2O 2.28g/L，KH2PO4 1.36g/L，MgSO4·7H2O0.375g/L，甘油12g/L，消泡剂1mL/L。
在进行20L及20L以下体系的初发酵培养条件为：温度37℃，通气量2vvm，转速600rpm，预先用50％(v/v)的磷酸和50％(v/v)的氨水将pH调节至7.0。
在进行2000L发酵体系的初发酵培养条件为：温度37℃，通气量270m3/h，转速180rpm，预先用50％(v/v)的磷酸和50％(v/v)的氨水将pH调节至7.0。
本发明通过分批补料发酵培养技术提高DAAO的酶活和宿主细胞的生物量，降低生产成本，有利于DAAO的工业化生产以满足市场的需求。分批补料发酵指在微生物分批发酵过程中，间歇或连续地补加含有一些限制性营养成分的新鲜培养基，而不从发酵罐体系中放出发酵液的发酵技术。与分批发酵的培养技术相比，分批补料发酵培养技术具有很多显著优势，包括更有利于提高菌体密度，能够使菌体长时间处于适宜生长的状态，维持有利的发酵条件，对发酵中后期细胞生长分裂、细胞活力的维持起到了重要的作用，也能够减缓高浓度营养物和分解代谢副产物引起的阻遏作用。
所述DO-STAT模式为当DO超出设定值的0.1％时开始补料，DO控制值的范围在10％-50％。DO为相对溶氧水平，即：在发酵培养基未接种之前通气使培养基达到饱和溶氧水平，此时DO标定为100％。
补料采用的培养基组成是：甘油500g/L，蛋白胨75g/L，酵母粉50g/L，MgSO4·7H2O5g/L，(NH4)2SO4 20g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 3g/L，NaCl 5g/L。
作为优选，DO设定值为30％。
研究表明，宿主细胞的生长会受到产物DAAO的抑制，原因为DAAO干扰了宿主细胞细胞壁的合成，细胞壁的合成与肽聚糖(PG)的形成有关，肽聚糖是合成细胞壁的一种刚性且必不可少的结构，其是由含D-氨基酸的短肽交联的聚糖链组成的。在细胞生长的过程中D-氨基酸被DAAO消耗从而抑制了细胞的生长。因此，本发明在发酵过程中添加高浓度乳糖作为诱导剂的同时添加适量D-氨基酸，实现提高DAAO的酶活的同时不降低菌体的生物量。
诱导剂添加的时机为菌体浓度达到OD600为10～20，作为优选，将种子液按10％的接种量接种于发酵培养基，37℃培养5～6h，将温度调至28℃，并添加乳糖作为诱导剂。
具体地，在5000L发酵罐中装液量为2000L的发酵体系中，菌体浓度达到OD600为10～12，添加乳糖诱导，发酵体系中添加乳糖的浓度为15g/L～20g/L。
在50L发酵罐装液量为20L及20L以下的发酵体系中，采用分次诱导方式，作为优选，发酵培养至OD600为18～20时，将温度调至28～30℃，并添加15g/L～20g/L的乳糖作为诱导剂；培养至OD600为42～45时，添加12.5g/L～20g/L的乳糖进行第二次诱导。
作为优选，在添加乳糖的同时添加1g/L～2g/L的D-氨基酸至发酵液中。
将D-氨基酸配制成溶液后需利用0.22μm的滤膜除菌后添加。所述D-氨基酸包含但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-谷氨酸(D-Glu)和D-蛋氨酸(D-Met)。
步骤(3)中，发酵培养22～24h后结束发酵。
本发明具备的有益效果：
本发明通过分批补料发酵培养表达DAAO的重组大肠杆菌，发酵过程中添加高浓度乳糖作为诱导剂提高DAAO的酶活，同时添加适量D-氨基酸解除发酵产物DAAO对大肠杆菌细胞壁合成的抑制从而减小DAAO对宿主细胞生长的抑制，在表达出高酶活的DAAO的同时提高了表达DAAO菌株的生物量，大大提高了DAAO的生产效率，为工业化生产提供了条件。
利用本发明能够得到酶活力为390.0U/g DCW的DAAO，获得菌体生物量为26.03g/DCW，达到了国内外较高水平，除此之外，该方法发酵周期短，从而提高了发酵罐利用效率，降低了生产成本，操作简单，易于工业化生产。
附图说明
图1为5L分批补料发酵DO-STAT模式DO设定为30％的发酵参数图。
图2为表达DAAO的基因工程菌补料发酵结果示例图。
图3为表达DAAO的基因工程菌5000L补料发酵结果示例图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
实施例中采用的基因工程菌为课题组前期研究构建获得，为表达D-氨基酸氧化酶突变体的重组大肠杆菌，公开于申请号为201811618942.0的中国专利文献。所述D-氨基酸氧化酶突变体为野生型D-氨基酸氧化酶(NCBI登录号为ALM 22233.1)的突变体M213S-N54V-F58Q，即氨基酸序列的第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，菌株编号为E4。
实施例中培养基配方如下：
一级种子培养基组成是：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L；
二级种子培养基组成是：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO4·3H2O 12.54g/L；
发酵培养基组成是：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，K2HPO4·3H2O 2.28g/L，KH2PO4 1.36g/L，MgSO4·7H2O 0.375g/L，甘油12g/L，消泡剂1mL/L；
补料培养基组成是：甘油500g/L，蛋白胨75g/L，酵母粉50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，(NH4)2SO4 20g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 3g/L，NaCl 5g/L。
实施例1
基因工程菌经斜面活化，挑起菌落接种至装有一级种子培养基的摇瓶中进行培养作为一级种子液，一级种子液的培养条件为：将单菌落挑入含0.05g/L硫酸链霉素作为抗生素的装液量为50mL的250mL摇瓶中，置于37℃的恒温振荡培养箱中，180rpm振荡培养12h。
将一级种子液接种至装有二级种子培养基的摇瓶中进行培养作为二级种子液，二级种子液的培养条件为：将一级种子液按1％的接种量接种至含0.05g/L硫酸链霉素作为抗生素的装液量为100mL的500mL摇瓶中，置于37℃的恒温振荡培养箱中，180rpm振荡培养10-12h。
以接种量为10％将二级种子液接种至5L发酵罐中2L发酵培养基中初发酵，培养条件为：温度37℃，通气量2vvm，转速600rpm，预先用50％(v/v)的磷酸和50％(v/v)的氨水将pH调节至7.0。当发酵时间约5-6h，OD600为18-20时，第一次添加诱导剂开始诱导，第一次诱导的条件为温度调至28℃，乳糖浓度为15g/L，D-Ala浓度为2g/L，当发酵时间约10-12h，OD600为43-45时，第二次添加诱导剂诱导，第二次诱导的条件为乳糖浓度为15g/L，D-Ala浓度为1g/L。当发酵时间约为6h，此时DO降至最低水平，且会有上升趋势，此时将补料模式设置为DO-STAT，DO设定值为10％，当DO超出0.1％自动补料。发酵时间为22-24h，当菌体生物量增长减慢时，停止发酵。
上述方法中涉及的溶氧(DO)、pH、温度采用电极在线自动控制，DO为相对溶氧水平，即：在发酵培养基未接种之前通气使培养基达到饱和溶氧水平，此时DO标定为100％。
发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为21.6g DCW/L，菌体的比酶活为381.0U/gDCW。
上述方法中涉及的离线参数测定：
生物量测定：通过取样口取得发酵液样品后，适当稀释后取2mL于比色管中，用紫外分光光度计在600nm处测定吸光值(OD600)，并对照标准曲线计算菌体干重。标准曲线的制作方法为：将不同发酵时间取得的发酵液样品适当稀释后测定其OD600，并取5mL的发酵液用冷冻干燥离心机离心后弃去上清液后反复清洗后放置于烘箱中至恒重。以OD600的值为横坐标，菌体烘干后得到的干重为纵坐标绘制标准曲线。
酶活的测定：称取15g/L菌体，底物为400mM DL-PPT，反应在30℃，用50％的氨水和50％磷酸将pH调节至8.0，通气量3vvm，转速500rpm的条件下进行，反应体积为300mL。反应1h后取样通过液相测定D-PPT的含量，
Figure BDA0002919705210000071
一个酶活力单位U的定义：在pH 8，30℃条件下，每分钟内消耗1μM D-PPT所需要的酶量为一个酶活力单位，记为U。
Figure BDA0002919705210000072
液相检测方法：在30℃下用衍生试剂(2.01g O-邻苯二甲醛(OPA)和2.43g N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)溶解在1L硼酸缓冲液(100mM，pH9.8)中)衍生化5分钟。然后通过高效液相色谱仪的荧光检测器(UltiMate FLD-3100，λEx＝340nm和λEm＝450nm)在C18柱(5μm，100A，4.6mm×250mm)上测定DL-PPT的浓度和对应体过量值(e.e)。柱温保持在35℃。D-PPT的保留时间为13.6分钟。硼酸缓冲液：称取38g四硼酸钠于1000mL烧杯中，用水稀释至900mL，超声波溶解，用6M NaOH调pH至9.8，定容至1000mL。流动相：0.05M乙酸铵水溶液(pH5.7)：甲醇＝90：10，配成之后，过膜，超声30min。
实施例2
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。将补料模式设置为DO-STAT，其中DO设定值为30％，当DO超出0.1％自动补料。发酵时间为22-24h，当菌体生物量增长减慢时，停止发酵。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为23.4g DCW/L，菌体的比酶活为388.3U/gDCW。发酵过程参数图如图1。
实施例3
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。将补料模式设置为DO-STAT，其中DO设定值为50％，当DO超出0.1％自动补料。发酵时间为22-24h，当菌体生物量增长减慢时，停止发酵。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为20.4g DCW/L，菌体的比酶活为377.3U/gDCW。
实施例4
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导的乳糖浓度为15g/L，第二次诱导乳糖浓度为12.5g/L。补料模式设置为DO-STAT，DO设定值为30％，当DO超出0.1％自动补料。发酵时间为22-24h，当菌体生物量增长减慢时，停止发酵。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为25.91g DCW/L，菌体的比酶活为394.3U/g DCW。
实施例5
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导的乳糖浓度为20g/L，第二次诱导乳糖浓度为15g/L。补料模式设置为DO-STAT，DO设定值为30％，当DO超出0.1％自动补料。发酵时间为22-24h，当菌体生物量增长减慢时，停止发酵。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为24.62g DCW/L，菌体的比酶活为392.1U/g DCW。
实施例6
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导的乳糖浓度为20g/L，第二次诱导乳糖浓度为20g/L。补料模式设置为DO-STAT，DO设定值为30％，当DO超出0.1％自动补料。发酵时间为22-24h，当菌体生物量增长减慢时，停止发酵。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为20.13g DCW/L，菌体的比酶活为397.6U/g DCW。
实施例7
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导添加的乳糖浓度为15g/L，D-Ala浓度为1g/L，第二次诱导的乳糖浓度为12.5g/L，不添加D-Ala。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为22.6g DCW/L，菌体的比酶活为392.0U/g DCW。
实施例8
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导添加的乳糖浓度为15g/L，D-Ala浓度为1g/L，第二次诱导的乳糖浓度为12.5g/L，D-Ala浓度为1g/L。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为26.03g DCW/L，菌体的比酶活为390.0U/g DCW。发酵结果如图2。
实施例9
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导添加的乳糖浓度为15g/L，D-Ala浓度为2g/L，第二次诱导的乳糖浓度为12.5g/L，D-Ala浓度为2g/L。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为23.7g DCW/L，菌体的比酶活为373.2U/g DCW。
实施例10
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导添加的乳糖浓度为15g/L，D-Met的浓度为1g/L，第二次诱导的乳糖浓度为12.5g/L，D-Met的浓度为1g/L。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为21.6g DCW/L，菌体的比酶活为377.2U/g DCW。
实施例11
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1。第一次诱导添加的乳糖浓度为15g/L，D-Glu的浓度为1g/L，第二次诱导的乳糖浓度为12.5g/L，D-Glu的浓度为1g/L。发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为23.6g DCW/L，菌体的比酶活为386.4U/g DCW。
实施例12
基因工程菌经斜面活化，通过装有一级种子培养基的50mL，100mL摇瓶扩大培养后以10％接种量接入2L一级种子培养基中37℃培养8-10h，再以10％接种量转接至50L发酵罐中作为一级种子液。一级种子液的培养条件为：温度37℃，250rpm，通气量2.0vvm，预先用50％(v/v)的磷酸和50％(v/v)的氨水将pH调节至7.0，培养3-5h。
通过连接两个发酵罐的管道将一级种子液注入500L发酵罐中培养作为二级种子液，二级种子液的培养条件与一级种子液的培养条件相同。再通过连接发酵罐的管道将二级种子液接种至5000L发酵罐中初发酵，培养条件为：温度37℃，通气量270m3/h，转速180rpm，预先用50％(v/v)的磷酸和50％(v/v)的氨水将pH调节至7.0。
当发酵时间约5-6h，OD600为10-12时，添加诱导剂开始诱导，导的条件为温度调至28℃，乳糖浓度为15g/L，D-Ala浓度为2g/L，将补料模式设置为DO-STAT，DO设定值为30％，当DO超出0.1％自动补料。发酵时间为22-24h，当菌体生物量增长减慢时，停止发酵。
发酵完毕后，将发酵液用冷冻干燥离心机8000rpm离心10min后收集菌体。经实验测定，所述方法补料发酵获得的菌体生物量为18.43g DCW/L，菌体的比酶活为347.1U/gDCW。
对比例1
参考现有报道的发酵方法在5L发酵罐中进行2L发酵体系的发酵培养，具体如下：
一级种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L。
二级种子培养基组成为：蛋白胨32g/L，酵母粉20g/L，NaCl 10g/L。
发酵培养基组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO4·3H2O 2.28g/L，KH2PO4 1.36g/L，MgSO4·7H2O 0.375g/L，甘油12g/L。
一级种子液和二级种子液均过夜培养至OD600约为3后，以接种量为10％将二级种子液接种至发酵培养基中初发酵，培养条件为：温度37℃，通气量2L/min，转速500rpm，预先用0.47M的H2SO4和0.625M的NaOH将pH调节至7.5，当DO下降至30％时，将转速改为700rpm。发酵7.5h后加入终浓度为0.1mM的IPTG作为诱导剂诱导表达DAAO，并将pH调至7.1，诱导16h后停止发酵。
最终获得16.17g DCW/L对应于OD600的值为21，获得发酵液的酶活为15.1U/g DCW。

Claims (3)

1.一种发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以表达D-氨基酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，活化后扩大培养，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，当溶解氧下降到1%以后采用DO-STAT模式分批补料，所述DO-STAT模式为当DO超出设定值的0.1%时开始补料，DO设定值为30%；在发酵培养至OD600为18~20时，将温度调至28~30℃，并添加15 g/L~20 g/L的乳糖作为诱导剂，培养至OD600为42~45时，添加12.5 g/L~20 g/L的乳糖进行第二次诱导，在添加乳糖的同时添加1g/L~2g/L 的D-氨基酸至发酵液中，所述D-氨基酸为D-丙氨酸、D-谷氨酸或D-蛋氨酸，培养至发酵结束，收集胞内含有D-氨基酸氧化酶的菌体；
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨 15 g/L，酵母粉 12 g/L，NaCl 10 g/L，(NH4)2SO4 5g/L，K2HPO4·3H2O 2.28 g/L，KH2PO4 1.36 g/L，MgSO4·7H2O 0.375 g/L，甘油 12 g/L，消泡剂1mL/L；
补料采用的培养基组成是：甘油500 g/L，蛋白胨75 g/L，酵母粉50 g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，(NH4)2SO4 20 g/L，KH2PO4 3 g/L，K2HPO4 3 g/L，NaCl 5 g/L。
2.如权利要求1所述的发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩大培养包括：将活化后的生产菌株接种于一级种子培养基中，一级种子培养基组成为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，37℃振荡培养得到一级种子液，再将一级种子液按1%的接种量接种于二级种子培养基中，二级种子培养基组成为：蛋白胨12 g/L，酵母粉24g/L，甘油5 g/L，KH2PO4 2.31 g/L，K2HPO4·3H2O 12.54 g/L，37℃振荡培养得到二级种子液。
3.如权利要求1所述的发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，将种子液按10%的接种量接种于发酵培养基，37℃培养5~6 h，将温度调至28℃，并添加乳糖作为诱导剂。
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