CN116590209A - 一种产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产D‑泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明主要通过(1)增加大肠杆菌生物体内泛解酸合成途径中关键基因拷贝数，进一步使碳通量流向D‑泛酸的合成；(2)为继续增强碳通量流向D‑泛酸的合成，通过削弱氮限制负调控转录因子，激活糖酵解前端基因拉动碳流，节约磷酸烯醇式丙酮酸及减少中心碳流进入TCA，得到一株无质粒、无抗生素添加用于产D‑泛酸的工程菌株。最终使得D‑泛酸摇瓶效价相对于出发菌株提升87.2％，达到5.43g/L；运用5‑L发酵罐发酵84小时，D‑泛酸产量能够达到94.2g/L。

Description

一种产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种产D-泛酸基因工程菌及构建方法，及其在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
(二)背景技术
泛酸，也称为维生素B5，是辅酶A的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中起到关键作用。因此，作为一种重要的维生素及前体物质，D-泛酸在饲料、医药以及化妆品等方面得到广泛应用。在已知的D-泛酸合成方法中，生物发酵法生产D-泛酸具有底物廉价、易分离、毒性小等优势而受到关注。但目前利用生物法生产D-泛酸仍存在缺陷，例如发酵过程不稳定、产量不高等问题。因此，构建一株更高产的D-泛酸菌株仍是一大挑战。
(三)发明内容
本发明的目的是运用理性设计和CRISPR-Cas9基因编辑技术，提供一种高产D-泛酸的基因工程菌构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，在其基因组上增加受启动子pTrc调控的EcilvD基因拷贝数，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD，记为工程菌DPAP7；
(2)在工程菌DPAP7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBA基因拷贝数，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc-BspanBA，记为工程菌DPAP8；
(3)在工程菌DPAP8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的谷氨酸棒杆菌CgpanC基因拷贝数，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc-CgpanC，记为工程菌DPAP9；
(4)在工程菌DPAP9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌alsS基因拷贝数，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc-alsS，记为工程菌DPAP10；
(5)在工程菌DPAP10基因组上通过基因敲入方式进一步增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBB基因拷贝数，得到工程菌DPAP10derivative，ydeU::Ptrc-BspanBB，记为工程菌DPAP11；BspanBB与BspanBA相比仅仅是启动子与rbs位点间隔变小，BspanB的序 列是相同的；
(6)将工程菌DPAP11基因组中nac基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP11 derivative，nacGTG，记为工程菌DPAP12；
(7)敲除工程菌DPAP12基因组中ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5，得到工程菌DPAP12 derivative，ΔP345ptsH，记为工程菌DPAP13；
(8)将工程菌DPAP13基因组中gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP13 derivative，gltAGTG，记为工程菌DPAP14；
(9)将工程菌DPAP14基因组中gltA基因起始密码子GTG替换为TTG，得到工程菌DPAP14 derivative，gltATTG，记为工程菌DPAP15；
(10)将工程菌DPAP15基因组中pfkB基因原位启动子替换为Ptrc，得到工程菌DPAP15 derivative，PpfkB::Ptrc，记为工程菌DPAP16，即所述产D-泛酸的基因工程菌。
本发明在底盘菌ZJUTDPAL5(E.coli W3110，Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/ΔilvA/Trc-lpd/Δglk/ilvA*/Trc-pck/Trc-maeB/Trc-ilvBN/gdhA*T，已在CN113637618A中公开)的基础上，综合运用系统代谢工程策略，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过基因敲入引入异源基因，增强大肠杆菌生物体内泛解酸合成途径中关键基因表达水平，进一步使碳通量流向D-泛酸的合成。为继续增强碳通量流向D-泛酸的合成，通过削弱氮限制负调控转录因子，激活糖酵解前端基因拉动碳流，节约磷酸烯醇式丙酮酸及减少中心碳流进入TCA，最终得到一株无质粒、无抗生素添加用于产D-泛酸的工程菌株。
所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanBA、CgpanC、BspanBB、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示，所述nacGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，所述gltAGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltATTG核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述pfkB基因原位启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的EcilvD基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiV，增强EcilvD的表达强度，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD，记为工程菌DPAP7；
(2)以工程菌DPAP7为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBA基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，增强BspanBA的表达强度，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc-BspanBA，记为工程菌DPAP8；
(3)以工程菌DPAP8为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的CgpanC基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompT，增强CgpanC的表达强度，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc-CgpanC，记为工程菌DPAP9；
(4)以工程菌DPAP9为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的alsS基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiP，增强alsS的表达强度，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc-alsS，记为工程菌DPAP10；
(5)以工程菌DPAP10为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBB基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ydeU，进一步增强BspanBB的表达强度，得到工程菌DPAP10 derivative，ydeU::Ptrc-BspanBB，记为工程菌DPAP11；
(6)以工程菌DPAP11为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中nac基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP11 derivative，nacGTG，记为工程菌DPAP12；
(7)以工程菌DPAP12为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，敲除其基因组中ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5，得到工程菌DPAP12 derivative，ΔP345ptsH，记为工程菌DPAP13；
(8)以工程菌DPAP13出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP13 derivative，gltAGTG，记为工程菌DPAP14；
(9)以工程菌DPAP14出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中gltA基因起始密码子GTG替换为TTG，得到工程菌DPAP14 derivative，gltATTG，记为工程菌DPAP15；
(10)以工程菌DPAP15出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中pfkB基因原位启动子替换为Ptrc，得到工程菌DPAP15 derivative，PpfkB::Ptrc，记为工程菌DPAP16，即所述产D-泛酸的基因工程菌。
具体的，所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanBA、CgpanC、BspanBB、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示，所述nacGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述gltAGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltATTG核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述pfkB基因原位启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
所述应用为：将所述产D-泛酸的基因工程菌接种至发酵培养基中，于28～37℃、300～450rpm条件下进行发酵培养72～96h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。
具体的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/L、硫酸铵10～25g/L、无水甜菜碱1～5g/L、酵母粉1～5g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、无水硫酸镁0.5～2g/L、β-丙氨酸1～5g/L，1～5ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：10g/LCuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、10g/L ZnSO4·7H2O、0.2g/LCuSO4、0.02g/LNiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
具体的，所述方法为：在5L发酵罐中装入体积为1～3L发酵培养基，115℃灭菌30min，将所述基因工程菌菌株接种至1～3L发酵培养基中，28～37℃、初始通气量3～6L/min、初始搅拌速度300～450rpm条件下进行发酵培养，氨水调节pH，同时添加终浓度为0～0.4mM的IPTG，终浓度为5mg/L VB1、2mg/L VB12，以及10～40g/L异亮氨酸5～10mL；发酵过程中使用溶氧串联转速将溶氧维持10～30％，用氨水作中和剂维持pH 6.7～6.9，通过pH联动补料将补料培养基加入罐内，葡萄糖浓度控制在5g/L以下，28～37℃培养72～96小时，得到发酵液，取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。
所述补料培养基组成如下：葡萄糖500g/L、硫酸铵5～25g/L、无水甜菜碱2～8g/L、酵母粉1～5g/L、磷酸二氢钾10～20g/L、无水硫酸镁5～15g/L、β-丙氨酸40～100g/L，1～5ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。
本发明在异源筛选泛解酸支路基因的同时，用来源于pTrc99A的pTrc启动子和RBS序列在基因组上进一步增加了panC(编码泛酸合成酶)、panB(编码羟甲基转移酶)、alsS(编码乙酰乳酸合酶)以及ilvD(编码二羟酸脱水酶)的拷贝数，强化了泛解酸合成路径，构建了DPAP11(DPAP10 derivative，ydeU::Ptrc-BspanBB)。
本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术削弱氮限制负调控转录因子nac，弱化葡萄糖磷酸转移酶系统的基因ptsH、ptsI、Crr启动子节约磷酸烯醇式丙酮酸，敲降柠檬酸合酶gltA减少中心碳流进入TCA，最后再激活糖酵解路径前端基因pfkB拉动碳流，得到了一株发酵过程中无质粒、无抗生素添加的工程菌DPAP16。
与现有技术相比，本发明的有益之处主要体现在：
本发明运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在现有工程菌的基础上进一步强化了D-泛酸生物生成途径中关键酶的表达水平，再上调或下调糖酵解途径、TCA循环、细胞全局调控因子中一个或多个关键基因表达，得到了一株无质粒且发酵过程中无需添加抗生素的高产菌株；本发明菌株摇瓶效价达到5.43g/L，相比出发菌株提高了87.2％，最终运用5-L发酵罐发酵84小时，D-泛酸产量能够达到94.2g/L，大幅度提高D-泛酸的合成，缩短了发酵周期。
(四)附图说明
图1为D-泛酸代谢途径图和改造位点；
图2为DPAP7的OD600和D-泛酸效价变化；
图3为DPAP8的OD600和D-泛酸效价变化；
图4为DPAP9的OD600和D-泛酸效价变化；
图5为DPAP10的OD600和D-泛酸效价变化；
图6为DPAP11的OD600和D-泛酸效价变化；
图7为DPAP12的OD600和D-泛酸效价变化；
图8为DPAP13的OD600和D-泛酸效价变化；
图9为DPAP14、DPAP15的OD600和D-泛酸效价变化；
图10为DPAP16的OD600和D-泛酸效价变化；
图11为DPAP11、DPAP16在5L生物反应器发酵结果图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L。
本发明所述亲本菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli GeneticStock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135A1，US 2010/0248311 A1中公开。
实施例2-11中使用的引物序列信息如表2所示：
表1：基因编辑所涉及的基因及相应途径
表2：引物序列
实施例1：D-泛酸含量的HPLC测定
检测方法如下：
色谱条件：C18柱(250×4.6mm，particle size 5μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，CA，USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：25min。
实施例2：DPAP7(DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD)构建及摇瓶发酵
以ZJUTDPAL5(E.coli W3110，Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/ΔilvA/Trc-lpd/Δglk/ilvA*/Trc-pck/Trc-maeB/Trc-ilvBN/gdhA*T)为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的EcilvD基因(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiV，以增强EcilvD的表达强度。
(1)构建pTarget-yjiV质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-yjiV-F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳验证后，使用Dpn I消化酶在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-yjiV质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-EcilvD质粒：首先，以E.coli W3110基因组为模版，yjiV-S6F/R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，yjiV-X6F/R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)。然后，以E.coli W3110基因组为模板，使用pTrc-EcilvD-18F/R为引物扩增出带有启动子pTrc的EcilvD基因片段(F3)，通过胶回收纯化PCR片段得到F1、F2以及F3；质粒pTarget-yjiV经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-yjiV载体、片段F1、F2以及F3连接在一起，通过测序验证得到pTD-EcilvD质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入ZJUTDPAL5(E.coli W3110，Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/ΔilvA/Trc-lpd/Δglk/ilvA*/Trc-pck/Trc-maeB/Trc-ilvBN/gdhA*T)中，转接单克隆菌落到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD600 0.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3edEdition，99-102)的描述。
(4)使用移液枪吸取适量pTD-EcilvD(约200ng)质粒与事先准备好的100μl电击感受态细胞混合，一同转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1-2min左右后，使用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入800μl LB培养基并立即轻柔吸出，转移到2mL Ep管中，30℃复苏3-4h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB固体平板，30℃倒置培养12-16h，以ilvD-VF/R为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段约3500bp左右的片段，则证明是DPAP7(DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD)阳性菌落。
(5)质粒消除：使用接种环挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB液体试管中，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB固体平板，30℃培养24h，待菌体长到一定大小时，挑取部分单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落则显示其pTarget-yjiV质粒成功消除，之后挑取pTarget-yjiV质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，用于消除pCas质粒，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h后，挑取部分单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落则其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒菌株DPAP7(DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD)。
(6)摇瓶发酵：将DPAP7(DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD)，以出发菌株ZJUTDPAL5为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，以2％接种量接种1mL预培养物到装有50mL的MS培养基的500mL摇瓶中，然后在30℃、180rpm恒温摇床中培养48h进行菌株发酵；发酵结束后取1mL发酵液测定OD600值的同时，使用移液枪吸取1mL发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释5倍后，使用水系滤膜对稀释后样品进行除杂处理后，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图2所示。
由图可见，基因组上额外增加ilvD基因拷贝数后，对菌体生长并没有明显影响，同时对于D-泛酸摇瓶效价提升并没有促进作用，与出发菌株相当约为2.9g/L，可能是前面途径碳通量不足导致，考虑到后续改造需要，因此继续在此基础上对菌株进行相关改造。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；10g/L碳酸钙(单独灭菌)；微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/LCuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例3：DPAP8构建及摇瓶发酵
以DPAP7为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBA基因(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，以增强BspanBA的表达强度。
(1)构建pTarget-flik质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-flik-F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳验证后，使用Dpn I消化酶在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-flik质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-BspanBA质粒：首先，以E.coli W3110基因组为模版，flik-S8F/R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，flik-X8F/R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)。然后，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pTrc-BspanBA-9F/R为引物扩增出带有启动子pTrc的BspanBA基因片段(F3)，通过胶回收纯化PCR片段得到F1、F2以及F3；质粒pTarget-flik经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-flik载体、片段F1、F2以及F3连接在一起，通过测序验证得到pTD-BspanBA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的DPAP7感受态中，DPAP7电转感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP8阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP8。
(6)将构建的DPAP8生产菌株以实施例2构建的DPAP7为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图3所示。
由图可见，基因组上通过基因敲入方式增加异源BspanBA基因拷贝数后，没有影响菌体生长，但D-泛酸摇瓶效价提升至3.72g/L，可能是该基因引入使得一部分流向支链氨基酸碳通量转向了泛解酸的合成，从而促进了菌株D-泛酸的生物合成。
实施例4：DPAP9构建及摇瓶发酵
以DPAP8为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的CgpanC基因(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompT，以增强CgpanC的表达强度。
(1)构建pTarget-ompT质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-ompT-F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳验证后，使用Dpn I消化酶在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ompT质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-CgpanC质粒：首先，以E.coli W3110基因组为模版，ompT-S6F/R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，ompT-X6F/R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)。然后，以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，使用pTrc-CgpanC-8F/R为引物扩增出带有启动子pTrc的CgpanC基因片段(F3)，通过胶回收纯化PCR片段得到F1、F2以及F3；质粒pTarget-ompT经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-ompT载体、片段F1、F2以及F3连接在一起，通过测序验证得到pTD-CgpanC质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的DPAP8感受态中，DPAP8电转感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP9阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP9。
(6)将构建的DPAP8生产菌株以实施例3构建的DPAP8为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示。
由图可见，基因组上通过基因敲入方式增加异源CgpanC基因拷贝数后，对于菌株生长并没有显著影响，D-泛酸摇瓶效价有轻微提升为3.76g/L，但提升幅度并没有异源引入BspanB大，可能是基因组上该基因编码酶活性足够，需要进一步加大流向泛解酸合成的碳通量，才能使发酵液中D-泛酸含量显著提升。
实施例5：DPAP10构建及摇瓶发酵
以DPAP9为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的alsS基因(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiP，以增强alsS的表达强度。
(1)构建pTarget-yjiP质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-yjiP-F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳验证后，使用Dpn I消化酶在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-yjiP质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-alsS质粒：首先，以E.coli W3110基因组为模版，yjiP-S5F/R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，yjiP-X5F/R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)。然后，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pTrc-alsS-17F/R为引物扩增出带有启动子pTrc的alsS基因片段(F3)，通过胶回收纯化PCR片段得到F1、F2以及F3；质粒pTarget-yjiP经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-yjiP载体、片段F1、F2以及F3连接在一起，通过测序验证得到pTD-alsS质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的DPAP9感受态中，DPAP9电转感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP10阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP10。
(6)将构建的DPAP10生产菌株以实施例4构建的DPAP9为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图5所示。
由图可见，基因组上通过基因敲入方式增加异源alsS基因拷贝数后，D-泛酸摇瓶效价提升至3.87g/L，效果不明显，因此丙酮酸前体供应或者下游D-泛解酸途径合成能力尚有不足需进一步加强。
实施例6：DPAP11构建及摇瓶发酵
以DPAP10为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBB基因(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因ydeU，以进一步增强BspanBB的表达强度。
(1)构建pTarget-ydeU质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-ydeU-F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳验证后，使用Dpn I消化酶在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ydeU质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-BspanBB质粒：首先，以E.coli W3110基因组为模版，ydeU-S6F/R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，ydeU-X6F/R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)。然后，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pTrc-BspanBB-9F/R为引物扩增出带有启动子pTrc的BspanBB基因片段(F3)，通过胶回收纯化PCR片段得到F1、F2以及F3；质粒pTarget-ydeU经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-ydeU载体、片段F1、F2以及F3连接在一起，通过测序验证得到pTD-BspanBB质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的DPAP10感受态中，DPAP10电转感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP11阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP11。
(6)将构建的DPAP11生产菌株以实施例5构建的DPAP10为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图6所示。
由图可见，基因组上通过基因敲入方式再次增加异源BspanBB基因拷贝数后，D-泛酸产量依然出现明显提升，约4.45g/L。因此表明途径中碳通量在整合完前面几个基因后，存在部分碳通量需要进一步拉向下游D-泛酸的合成，从而促进摇瓶D-泛酸产量提升。
实施例7：DPAP12构建及摇瓶发酵
以DPAP11为出发菌株，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在菌株DPAP11基因组中上将nac起始密码子ATG替换为GTG(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，得到DPAP12(DPAP11derivative，nacGTG)。
(1)构建pTarget-nacGTG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-nac-F/pT-nac-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h；pTarget-nacGTG的PCR产物经过线性化引物pTarget-XF和pTarget-XR扩增，胶回收纯化pTarget-nacGTG线性化载体，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-nacGTG质粒：以E.coli W3110基因组为模版，nac-up-F、nac-up-R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，nac-down-F和nac-down-F为引物扩增获得donorDNA的下游部分(F2)，通过胶回收纯化PCR片段得到F1、F2；按照(One stepclone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-nacGTG线性化载体、片段F1、F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-nacGTG质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例6获得的DPAP11感受态中，DPAP11电转感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP12阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP12。
(6)将构建的DPAP12生产菌株以实施例6构建的DPAP11为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图7所示。
由图可见，基因组上通过基因编辑将nac起始密码子ATG替换为GTG，D-泛酸产量提升不明显，约为4.54g/L。大肠杆菌氮调节蛋白Nac可以抑制多个基因的表达，其中包括cycA、ilvN、ilvH、ilvM等D-泛酸生产相关基因，在氮限制条件下抑制。可能是对nac下调程度不够，使得产量提升幅度不大。
实施例8：DPAP13构建及摇瓶发酵
以DPAP12为出发菌株，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在菌株DPAP12基因组中敲除ptsH、ptsI、Crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，得到DPAP13(DPAP12 derivative，ΔP345ptsH)。
(1)构建pTarget-ΔP345ptsH质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-PptsH-F/pT-PptsH-F为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h；pTarget-ΔP345ptsH PCR产物经过线性化引物pTarget-XF和pTarget-XR扩增，胶回收纯化pTarget-ΔP345ptsH线性化载体，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-ΔP345ptsH质粒：以E.coli W3110基因组为模版，PptsH-up-F、PptsH-up-R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，PptsH-down-R和PptsH-down-R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)，通过胶回收纯化PCR片段得到F1、F2；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-ΔP345ptsH线性化载体、片段F1、F2连接在一起，通过测序验证得到pTD-ΔP345ptsH质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例7获得的DPAP12感受态中，DPAP12电转感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP13阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP13。
(6)将构建的DPAP13生产菌株以实施例7构建的DPAP12为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图8所示。
由图可见，基因组上通过基因敲除方式ptsH、ptsI、Crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5后，D-泛酸产量提升至4.70g/L。磷酸转移酶系统消耗PEP以此转运葡萄糖，轻微削弱磷酸转移酶系统来节约PEP，使得PEP尽可能通过pykAF基因作用产生丙酮酸及ATP，从而促进摇瓶D-泛酸产量提升。
实施例9：DPAP14构建及摇瓶发酵
以DPAP13为出发菌株，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在菌株DPAP13基因组将gltA起始密码子ATG替换为GTG(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，得到DPAP14(DPAP13derivative，gltAGTG)。
(1)构建pTarget-gltAGTG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-gltA-F/pT-gltA-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h；pTarget-gltAGTG的PCR产物经过线性化引物pTarget-XF和pTarget-XR扩增，胶回收纯化pTarget-gltAGTG线性化载体，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-gltAGTG质粒：以E.coli W3110基因组为模版，gltA-up-F、gltA-up-R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)、gltA-gRNA-F和gltA-gRNA-R为引物扩增获得donor DNA的中游部分(F2)，gltA-down-F1和gltA-down-R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F3)；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-gltAGTG的线性化载体、片段F1、F2、F3连接在一起，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-gltAGTG质粒。/>
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例8获得的DPAP13感受态中，DPAP13电转感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP14阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP14。
(6)将构建的DPAP14生产菌株以实施例8构建的DPAP13为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图9所示。
由图可见，基因组上通过基因编辑将gltA起始密码子ATG替换为GTG后，D-泛酸产量提升至4.85g/L。菌株生长阶段需要大量NADH，ATP和一些代谢物，致使大量碳流流入TCA循环。因此考虑弱化TCA循环加强丙酮酸积累，而gltA基因的失活会使菌株生长缓慢，对此将gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，从而弱化TCA循环促进D-泛酸产量提升。
实施例10：DPAP15构建及摇瓶发酵
以DPAP14为出发菌株，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在菌株DPAP14基因组上将gltA起始密码子GTG替换为TTG(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，得到DPAP15(DPAP14derivative，gltATTG)。
(1)构建pTarget-gltATTG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-gltA-F/pT-gltA-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h；pTarget-gltATTG的PCR产物经过线性化引物pTarget-XF和pTarget-XR扩增，胶回收纯化pTarget-gltATTG线性化载体，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTarget-gltATTG质粒：以E.coli W3110基因组为模版，gltA-up-F、gltA-up-R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)、gltA-gRNA-F和gltA-gRNA-R为引物扩增获得donor DNA的中游部分(F2)，gltA-down-F2和gltA-down-R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F3)；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-gltATTG线性化载体、片段F1、F2、F3连接在一起，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-gltATTG质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例9获得的DPAP14感受态中，DPAP14感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP15阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP15。
(6)将构建的DPAP15生产菌株以实施例9构建的DPAP13为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图9所示。
由图可见，基因组上通过基因编辑将gltA起始密码子GTG替换为TTG后，D-泛酸产量提升至5.16g/L。考虑弱化TCA循环将gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，细胞生长无明显影响，因此进一步下调gltA基因起始密码子为TTG，促进D-泛酸产量提升。
实施例11：DPAP16构建及摇瓶发酵
以DPAP15为出发菌株，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术将菌株DPAP15基因组中pfkB基因原位启动子替换为Ptrc(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，得到DPAP16(DPAP15derivative，PpfkB::Ptrc)。
(1)构建pTarget-PpfkB::Ptrc质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-PpfkB-F/pT-PpfkB-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h；pTarget-PpfkB::Ptrc的PCR产物经过线性化引物pTarget-XF和pTarget-XR扩增，胶回收纯化pTarget-PpfkB::Ptrc线性化载体，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-PpfkB::Ptrc质粒：以E.coli W3110基因组为模版，PpfkB-up-F、PpfkB-up-R为引物扩增获得donor DNA的上游部分(F1)，PpfkB-down-F和PpfkB-down-R为引物扩增获得donor DNA的下游部分(F2)，按照(One step clone kit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-PpfkB::Ptrc线性化载体、片段F1、F2连接在一起，构建步骤同实施例2
(2)，得到pTD-PpfkB::Ptrc质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例10获得的DPAP15感受态中，DPAP15感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到DPAP16阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒DPAP16。
(6)将构建的DPAP16生产菌株以实施例10构建的DPAP15为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图10所示。
由图可见，基因组上通过基因编辑将pfkB基因原位启动子替换为Ptrc后，D-泛酸产量提升至5.43g/L。原始pfkB基因表达量不足，利用强启动子提高表达量，加强糖酵解前端途径，促进D-泛酸产量提升。
实施例12：D-泛酸生产菌株DPAP11、DPAP16 5L生物反应器发酵
发酵在5L发酵罐(上海保兴，BIOTECH-5BG)中进行，包括以下步骤：
(1)种子培养：平板接种至10mL LB培养基中，于37℃、180rpm的摇床上过夜培养，之后以体积浓度1％接种量接种到两瓶分别装有100mL LB培养基中为二级种子液培养7～12h。
(2)接菌发酵：5L发酵罐中发酵培养基体积为2L，115℃灭菌30min。
25～30℃、初始通气量3～6L/min、初始搅拌速度300～450rpm，氨水调节pH。将两瓶二级种子液共200mL转接至5L发酵罐装有无抗性2L发酵培养基中，同时添加终浓度为0.2mM的IPTG，终浓度为5mg/L VB1、2mg/L VB12，以及10～40g/L异亮氨酸5～10mL，开始发酵。发酵过程中使用溶氧串联转速将溶氧维持10～30％，用氨水作中和剂pH维持6.7～6.9，通过pH联动补料将罐内葡萄糖浓度控制在5g/L以下，28～37℃培养3～4天，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。
(3)将发酵上清稀释80倍后，使用水系滤膜对稀释后样品进行除杂处理后，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图11所示。
由图可见，加强泛解酸路径后，D-泛酸生产菌株DPAP11在5L发酵罐中发酵84小时D-泛酸产量提升至63.3g/L。在此基础上，优化丙酮酸前体供应，弱化TCA循环，促使更多碳流进入泛解酸路径获得D-泛酸生产菌株DPAP16，5L发酵罐中发酵84小时D-泛酸产量提升至94.2g/L，大幅度提高D-泛酸的合成，缩短了发酵周期。
(4)所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、无水甜菜碱2g/L、酵母粉2g/L、磷酸二氢钾2g/L、无水硫酸镁0.5g/L、β-丙氨酸1.5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、10g/LZnSO4·7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
(5)所述补料培养基组成如下：葡萄糖500g/L、硫酸铵10g/L、无水甜菜碱4g/L、酵母粉2g/L、磷酸二氢钾14g/L、无水硫酸镁8g/L、β-丙氨酸60g/L，2ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。

Claims (9)

1.一种产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，在其基因组上增加受启动子pTrc调控的EcilvD基因拷贝数，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD，记为工程菌DPAP7；
(2)在工程菌DPAP7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBA基因拷贝数，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc-BspanBA，记为工程菌DPAP8；
(3)在工程菌DPAP8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的谷氨酸棒杆菌CgpanC基因拷贝数，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc-CgpanC，记为工程菌DPAP9；
(4)在工程菌DPAP9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌alsS基因拷贝数，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc-alsS，记为工程菌DPAP10；
(5)在工程菌DPAP10基因组上通过基因敲入方式进一步增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBB基因拷贝数，得到工程菌DPAP10derivative，ydeU::Ptrc-BspanBB，记为工程菌DPAP11；
(6)将工程菌DPAP11基因组中nac基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP11derivative，nacGTG，记为工程菌DPAP12；
(7)敲除工程菌DPAP12基因组中ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5，得到工程菌DPAP12 derivative，ΔP345ptsH，记为工程菌DPAP13；
(8)将工程菌DPAP13基因组中gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP13derivative，gltAGTG，记为工程菌DPAP14；
(9)将工程菌DPAP14基因组中gltA基因起始密码子GTG替换为TTG，得到工程菌DPAP14derivative，gltATTG，记为工程菌DPAP15；
(10)将工程菌DPAP15基因组中pfkB基因原位启动子替换为Ptrc，得到工程菌DPAP15derivative，PpfkB::Ptrc，记为工程菌DPAP16，即所述产D-泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanBA、CgpanC、BspanBB、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示，所述nacGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述gltAGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltATTG核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述pfkB基因原位启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的EcilvD基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiV，增强EcilvD的表达强度，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD，记为工程菌DPAP7；
(2)以工程菌DPAP7为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBA基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，增强BspanBA的表达强度，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc-BspanBA，记为工程菌DPAP8；
(3)以工程菌DPAP8为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的CgpanC基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompT，增强CgpanC的表达强度，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc-CgpanC，记为工程菌DPAP9；
(4)以工程菌DPAP9为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的alsS基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiP，增强alsS的表达强度，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc-alsS，记为工程菌DPAP10；
(5)以工程菌DPAP10为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBB基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ydeU，进一步增强BspanBB的表达强度，得到工程菌DPAP10 derivative，ydeU::Ptrc-BspanBB，记为工程菌DPAP11；
(6)以工程菌DPAP11为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中nac基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP11 derivative，nacGTG，记为工程菌DPAP12；
(7)以工程菌DPAP12为出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，敲除其基因组中ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、
P5，得到工程菌DPAP12 derivative，ΔP345ptsH，记为工程菌DPAP13；
(8)以工程菌DPAP13出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP13 derivative，gltAGTG，记为工程菌DPAP14；
(9)以工程菌DPAP14出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中gltA基因起始密码子GTG替换为TTG，得到工程菌DPAP14 derivative，gltATTG，记为工程菌DPAP15；
(10)以工程菌DPAP15出发菌株，运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，将其基因组中pfkB基因原位启动子替换为Ptrc，得到工程菌DPAP15 derivative，PpfkB::Ptrc，记为工程菌DPAP16，即所述产D-泛酸的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的基因工程菌方法，其特征在于：所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanBA、CgpanC、BspanBB、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示，所述nacGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述gltAGTG核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltATTG核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述pfkB基因原位启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
5.权利要求1或2所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述产D-泛酸的基因工程菌接种至发酵培养基中，于28～37℃、300～450rpm条件下进行发酵培养72～96h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/L、硫酸铵10～25g/L、无水甜菜碱1～5g/L、酵母粉1～5g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、无水硫酸镁0.5～2g/L、β-丙氨酸1～5g/L，1～5ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、10g/L ZnSO4·7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述方法为：在5L发酵罐中装入体积为1～3L发酵培养基，115℃灭菌30min，将所述基因工程菌菌株接种至1～3L发酵培养基中，28～37℃、初始通气量3～6L/min、初始搅拌速度300～450rpm条件下进行发酵培养，氨水调节pH，同时添加终浓度为0～0.4mM的IPTG，终浓度为5mg/L VB1、2mg/L VB12，以及10～40g/L异亮氨酸5～10mL；发酵过程中使用溶氧串联转速将溶氧维持10～30％，用氨水作中和剂维持pH6.7～6.9，通过pH联动补料将补料培养基加入罐内，葡萄糖浓度控制在5g/L以下，28～37℃培养72～96小时，得到发酵液，取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述补料培养基组成如下：葡萄糖500g/L、硫酸铵5～25g/L、无水甜菜碱2～8g/L、酵母粉1～5g/L、磷酸二氢钾10～20g/L、无水硫酸镁5～15g/L、β-丙氨酸40～100g/L，1～5ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。
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