CN113278569B - 无质粒、无诱导剂使用的产d-泛酸基因工程菌及构建方法 - Google Patents

无质粒、无诱导剂使用的产d-泛酸基因工程菌及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过对大肠杆菌的有机酸合成途径相关基因进行了阻断，减少有机酸的副作用及增加丙酮酸池的积累，加强丙酮酸合成途径基因pykA，加强丙酮酸积累，解除关键酶的负反馈抑制，解决D‑泛酸合成的瓶颈步骤，改善糖摄取能力，增加了前体丙酮酸的积累，过表达基因lpd、ilvD改善主路合成途径基因的表达情况，最终获得更高产D‑泛酸工程菌，无需质粒引入外源酶增强关键酶酶活，摇瓶发酵产量达到3.99g/L；敲除阻遏蛋白编码基因lacI后形成组成型表达，并进行培养基优化后，摇瓶发酵产量达到4.72g/L；在5L发酵罐中分批补料发酵，产量达到34.28g/L。

Description

无质粒、无诱导剂使用的产D-泛酸基因工程菌及构建方法
(一)技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及无质粒、无诱导剂使用的高产D-泛酸基因工程菌及其构建方法和应用。
(二)背景技术
泛酸属于维生素B族，又称维生素B5，是一种水溶性维生素，存在D型和L型两种构型，但仅D-型(D-PA)具有生物活性。泛酸在生物体内可作为辅酶A(CoA)的前体，在几乎所有的生物过程中发挥关键作用，推动生物体内的能源代谢和能量交换。泛酸的磷酸化产物巯基乙胺可以合成4-磷酸泛酰巯基乙胺，为辅酶A(CoA)及酰基载体蛋白(ACP)的组成部分，而CoA及ACP构成酰基转移酶的辅酶，广泛参与糖、脂类、蛋白质代谢及肝脏的生物转化作用，对生物体的生长起到显著的促进作用，但目前发现泛酸只能由植物和微生物合成。动物不能合成泛酸，需要从外界摄取，因此泛酸广泛地应用于食品工业、化妆品以及食品添加剂和饲料添加剂，具有良好的市场价值。
目前，D-泛酸的生产方法包括物理诱导结晶法、拆分法以及微生物法，其中微生物法又包含代谢工程法、发酵法和生物酶法。鉴于绿色发展的兴起与需要，物理诱导结晶法、拆分法存在毒性和环境污染、拆分试剂贵的问题，亟需对此方法做出转变，随着生物技术的不断深入研究，许多化学产品可以通过生物法生产。对于D-泛酸的生物生产，现在生物酶法虽然取得较大进步，但依然需要昂贵的前体，是不经济的，而发酵法缺乏合适的菌株，故通过代谢工程的方法构建一株高产D-泛酸的生产菌株。
工业上常用的生产宿主菌株包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，但是谷氨酸棒杆菌因工程改造较为复杂、周期较长，菌株改进难度大。目前利用谷氨酸棒杆菌生产D-泛酸产量尚不足 2g/L，不利于工业化生产D-泛酸。大肠杆菌是另一种常用的氨基酸生产菌，大肠杆菌具有遗传背景清晰，操作简便等优点。
在大肠杆菌中，泛酸是由β-丙氨酸及泛解酸合成的，分别由β-丙氨酸代谢、泛解酸代谢以及泛酸合成三部分组成。β-丙氨酸是由天门冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-alpha-decarboxylase) 立体特异性地脱去L-Asp的α位羧基而成，同时释放CO2；泛解酸代谢途径中，来源于直接前体-丙酮酸，首先在乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸异构还原酶、2-羟基脱水酶作用形成α-酮异戊酸，然后α-酮异戊酸在羟甲基转移酶(ketopantoatehydroxymethyltransferase，KPHMT)作用下生成酮泛解酸，后者在酮泛解酸还原酶作用下还原生成泛解酸。最后β-丙氨酸和泛解酸在泛酸合成酶(pantothenate synthetase，PS)的作用下合成泛酸。
大肠杆菌W3110中泛酸的合成途径可分为泛解酸和β-丙氨酸两个模块，可把这两个模块途径看成是整个D-PA代谢途径中的“并联路线”。首先胞外葡萄糖经糖运输系统进入胞内(PTS 系统和非PTS系统)，后经糖酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸(以下简称PEP)，在泛解酸模块中，PEP在丙酮酸激酶(由pykAF编码表达)的作用下反应生成丙酮酸(以下简称PYR)， PYR在乙酰乳酸合酶(由ilvGM、ilvIH、ilvBN编码表达)的作用下反应生成乙酰乳酸，再经两步反应生成α-酮异戊酸(以下简称2-KIV)，2-KIV在α-酮异戊酸羟甲基转移酶(由panB 编码表达)、2-脱氢泛解酸还原酶(由panE、ilvC编码表达)的作用下生成泛解酸。在β-丙氨酸模块中，PEP在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(由ppc编码表达)作用下与HCO3-反应产生草酰乙酸(以下简称OAA)，OAA在天冬氨酸转氨酶(由aspC编码表达)作用下发生转氨反应生成天冬氨酸(以下简称ASP)，ASP在天冬氨酸脱羧酶(由panD编码表达)作用下发生脱羧反应生成β-丙氨酸。最后，泛解酸和β-丙氨酸在泛酸合成酶(由panC编码表达)的作用下消耗一分子ATP反应生成一分子D-泛酸。
(三)发明内容
本发明的目的是通过代谢工程技术，在生产泛酸的基因工程菌的基础上继续改造代谢途径中的关键基因，提供一种无质粒、无诱导剂使用的高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案：
一种高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以E.coli DPA8(即E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*)为底盘菌，将其基因组中的 poxB基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB，记为DPA8-1；
(2)敲除菌株DPA8△poxB中的pta基因，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta，记为DPA8-2；
(3)将菌株DPA8△poxB/△pta基因组中ldhA基因敲除，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA，记为DPA8-3；
(4)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA基因组中plfB基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB，记为DPAN9；
(5)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc 启动子，得到DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA，记为DPAN10；
(6)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA基因组中的ilvN基因使用ilvN突变基因(G59A+C60T+T62A+A63C+A64T+G66C)替换，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*，记为DPAN10-1；
(7)菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*基因组中的ilvH基因使用ilvH 突变基因(G41A+C50T)替换，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ ilvN*/ilvH*，记为DPAN10-2或者DPAN11；
(8)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/Trc-pykF/ilvN*/ilvH*基因组中的 spoT基因用spoT突变基因(C868G+G869A+C870A+A874G+A876T)替换并使用trc启动子替换原生启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA//ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*，记为DPAN12；
(9)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/Trc-pykF/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd，记为DPAN13； (10)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/trc-lpd基因组中的ilvD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD，记为 DPAN14；
(11)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD基因组中的lacI基因敲除，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/ Trc-lpd/Trc-ilvD/△lacI，记为DPAN15，即所述无质粒、无诱导剂使用的高产D-泛酸的基因工程菌。
本发明通过：(1)对大肠杆菌的有机酸合成途径相关基因进行了编辑，并采用CRISPR-Cas9基因编辑技术将基因组上合成乙酸，乳酸，甲酸相关基因poxB、pta、ldhA、plfB基因进行敲除，减弱了丙酮酸向有机酸的合成，积累了D-泛酸合成的前体；(2)使用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上pykA基因的原有启动子，增强了丙酮酸底物池的积累强；(3)解除关键酶小亚基编码基因ilvN、ilvH的负反馈抑制，提高了D-泛酸合成能力；(4)在基因组上对双功能(p)ppGpp合酶/水解酶基因spoT进行突变(C868G+G869A+C870A+A874G+A876T)，并使用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上突变后spoT基因的原有启动子，提高了糖摄取能力及进一步增强丙酮酸的积累；(5)使用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列加强基因lpd、ilvD 的表达以改善D-泛酸的合成；(6)使用CRISPR-Cas9基因编辑技术将基因lacI敲除，最终构建一株更高产的D-泛酸生产基因工程菌——DPAN15，摇瓶发酵产量达到4.13g/L。 (7)通过培养基优化，DPAN15号菌株摇瓶发酵产量提升至4.72g/L。(8)对DPAN15 号菌株进行5L发酵罐的扩大扩大培养，产量进一步提升至34.28g/L。
本发明还涉及构建所述高产D-泛酸的基因工程菌的方法，所述方法如下：
(1)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将底盘菌E.coli DPA8基因组中的poxB基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB，记为DPA8-1；
(2)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除菌株DPA8△poxB中的pta基因，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta，记为DPA8-2；
(3)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta基因组中ldhA基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA，记为DPA8-3；
(4)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA基因组中plfB 基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB，记为DPAN9；
(5)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA，记为DPAN10；
(6)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA基因组中的ilvN基因用ilvN突变基因 (G59A+C60T+T62A+A63C+A64T+G66C)替换，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*，记为DPAN10-1；
(7)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*基因组中的ilvH基因用ilvH突变基因(G41A+C50T)替换，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*，记为或者DPAN11；
(8)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/Trc-pykF/ilvN*/ilvH*基因组中的spoT基因用spoT突变基因 (C868G+G869A+C870A+A874G+A876T)替换并使用trc启动子替换原生启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA//ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*，记为DPAN12；
(9)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/Trc-pykF/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd，记为 DPAN13；
(10)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/trc-lpd基因组中的ilvD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD，记为DPAN14；
(11)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD基因组中的lacI基因敲除，得到重组菌株 DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/ Trc-lpd/Trc-ilvD/△lacI，记为DPAN15，即所述无质粒无诱导剂添加得高产D-泛酸的基因工程菌。
所述底盘菌E.coli DPA8可由如下方法构建获得：
(1)以Escherichia.coli W3110为出发菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将出发菌株Escherichia.coli W3110基因组中的panC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panC，记为DPA1；
(2)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA1基因组中panE基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanE，记为DPA2；
(3)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA2基因组中panB基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanB，记为DPA3；
(4)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA3基因组中ilvC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC，记为DPA4；
(5)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA4基因组中ilvG基因碱基序列第979、 980位分别引入碱基A、T，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*，记为DPA5；
(6)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA5基因组中avtA基因敲除，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA，记为DPA6；
(7)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA6基因组中ilvE基因起始密码子ATG 突变为GTG，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*，记为DPA7；
(8)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA7基因组中coaA基因起始密码子ATG 突变为GTG，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*，记为DPA8。
所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1序列如下：tgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattgtgagcggata acaatttcac acaggaaaca gacc。
本发明还涉及所述高产D-泛酸的基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述高产D-泛酸的基因工程菌接种至发酵培养基中，于28～30℃、 150～200rpm条件下进行发酵培养至OD600＝0.8～1.0，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/L、硫酸铵10～20g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.1～1.0g/L、酵母提取物1～3 g/L、碳酸钙5～20g/L，0.5～2ml/L微量金属盐溶液，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/LCuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母提取物2g/L、碳酸钙10g/L，1ml/L微量金属盐溶液，溶剂为去离子水。
更优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖24g/L、硫酸铵12g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母提取物2g/L、碳酸钙10g/L，1ml/L微量金属盐溶液，溶剂为去离子水。
通常，所述基因工程菌株发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明有益效果主要体现在：本发明通过对大肠杆菌的有机酸合成途径相关基因进行了阻断，减少有机酸的副作用及增加丙酮酸池的积累，加强丙酮酸合成途径基因pykA，加强丙酮酸积累，解除关键酶的负反馈抑制，解决D-泛酸合成的瓶颈步骤，改善糖摄取能力，增加了前体丙酮酸的积累，过表达基因lpd、ilvD改善主路合成途径基因的表达情况，最后敲除阻遏蛋白编码基因lacI，最终获得更高产D-泛酸工程菌，在无需质粒引物外源酶增强关键酶酶活，无诱导剂添加的情况下，优化发酵培养基后摇瓶发酵产量达到4.72g/L，5L发酵罐分批补料发酵产量达到34.28g/L。
(四)附图说明
图1为基因组编辑操作流程；
图2为D-泛酸代谢途径图和改造位点；
图3为DPAN8-1的OD600和D-泛酸效价变化；
图4为DPAN9的OD600和D-泛酸效价变化；
图5为DPAN10的OD600和D-泛酸效价变化；
图6为DPAN10-1的OD600和D-泛酸效价变化；
图7为DPAN11的OD600和D-泛酸效价变化；
图8为DPAN12的OD600和D-泛酸效价变化；
图9为DPAN13的OD600和D-泛酸效价变化；
图10为DPAN14的OD600和D-泛酸效价变化；
图11为DPAN15的OD600和D-泛酸效价变化；
图12为培养基通过四因素三水平方法优化结果；
图13为使用优化后培养基部分菌株D-泛酸效价变化；
图14为菌株DPA15的5L发酵罐的分批补料发酵产量。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L。
菌株Escherichia.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli Genetic StockCenter)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135 A1，US2010/0248311A1中公开。
本发明所述亲本菌株E.coli DPA8来自实验室保藏，为E.coliW3110衍生物，其基因型为下列描述(E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*)
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
Figure RE-GDA0003171447110000071
实施例2～13中使用的引物序列信息如表2所示：
表2：引物序列
Figure RE-GDA0003171447110000081
Figure RE-GDA0003171447110000091
Figure RE-GDA0003171447110000101
Figure RE-GDA0003171447110000111
Figure RE-GDA0003171447110000121
Figure RE-GDA0003171447110000131
pT-X-F/R为pTatget质粒的突变引物，其中X为携带基因组的目的基因所含PAM位点 (NGG)前20bp序列；X P1/P2为目的基因的上游同源臂上下游引物；pTD-X P3/P4为目的基因的下游同源臂上下游引物；X VF/VR为编辑目的基因的验证引物。
HPLC法测定发酵液中D-泛酸含量：
样品处理：取1ml发酵液离心取上清，将上清液用超纯水稀释合适倍数，保持D-泛酸含量在0.1g/L到1.0g/L之间；
色谱条件：C18柱(250×4.6mm，particle size 5μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，CA，USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃、流速：0.75ml/min；流动相：乙腈：1‰磷酸：(7％：93％)；
数据采集时间：25min。
实施例1：底盘菌DPA8(E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*)的构建
(1)以Escherichia.coli W3110为出发菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将出发菌株Escherichia.coli W3110基因组中的panC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panC，记为DPA1；
(2)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA1基因组中panE基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanE，记为DPA2；
(3)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA2基因组中panB基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanB，记为DPA3；
(4)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA3基因组中ilvC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC，记为DPA4；
(5)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA4基因组中ilvG基因碱基序列第979、 980位分别引入碱基A、T，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*，记为DPA5；
(6)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA5基因组中avtA基因敲除，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA，记为DPA6；
(7)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA6基因组中ilvE基因起始密码子ATG 突变为GTG，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*，记为DPA7；
(8)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA7基因组中coaA基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株Escherichia.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*，记为DPA8。
实施例2：敲除poxB基因的菌株DPA8-1的构建及摇瓶发酵
以基因工程菌DPA8(即E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9 介导的基因编辑技术(YuJiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via theCRISPR-Cas9 System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，在基因组上将乙酸合成基因poxB进行敲出，以减弱丙酮酸合成乙酸：
(1)构建pTarget-poxB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pT-△poxB F/pT-△poxB R为引物PCR扩增，得到的PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化30min，再转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-poxB质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-poxB质粒：以E.coli W3110基因组为模版，△poxB P1与△poxB P2为引物扩增获得donor DNA的上游同源臂记为L，△poxB P3和△poxB P4为引物扩增获得donor DNA的下游同源臂记为R，胶回收纯化PCR片段得到同源臂A和C融合片段记为L+R；pTarget-poxB质粒经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照
Figure RE-GDA0003171447110000141
(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-poxB 质粒、同源臂A+C连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△poxB质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入DPA8化转感受态中，挑取阳性克隆转接到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养OD600至0.4～0.6；于4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200～500ng pTD-poxB质粒与100-200μl电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm 电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入预冷的1mL LB培养基并立即吸出，转移到2mLEP管中，30℃复苏3～4h 后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养14～18h，以△poxB VF和△poxB VR为验证引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段750bp左右的片段，并测序验证成功则证明该单菌落是DPA8/ΔpoxB的阳性菌落，即编辑成功，得到新的菌株DPA8-1。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-poxB质粒成功消除，挑取pTarget-poxB质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，42℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒菌株DPA8/△poxB(简称DPA8-1)。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS发酵培养基：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、β-丙氨酸2.5g/L、CaCO3 10g/L(单独灭菌)、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
(6)将构建的DPAN8-1菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以野生型菌株E.coli W3110(DE3)为对照，37℃、200rpm培养用作种子液； 8～12h后，接种1mL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在30℃、 150rpm培养发酵至菌株生长到OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h；发酵结束后取1mL发酵液测定OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心2min，将发酵上清稀释5～10倍，根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图3。
由图3可见，利用基因编辑手段阻断乙酸合成途径基因poxB，DPAN8-1菌株的生长无明显抑制作用，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从1.59g/L增加到1.88g/L，这说明poxB基因的敲除有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例3：敲除pta基因的菌株DPA8-2的构建
(1)构建pTarget-△pta质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-△pta F/pTarget-△pta R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-pta质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-pta质粒：以E.coli W3110基因组为模版，△pta P1、△ptaP2、△ptaP3 和△pta P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-△pta质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的菌株DPA8-1感受态中，菌株DPA8-1感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA11阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA8-2。
实施例4：敲除plfB基因的菌株DPA8-3的构建
(1)构建pTarget-△plfB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-△plfB F/pTarget-△plfB R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化 3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-△plfB质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-△plfB质粒：以E.coli W3110基因组为模版，△plfB P1、△plfB、△plfBP3 和△plfB P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-△plfB质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的菌株DPA8-2感受态中，菌株DPA8-2感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA8-3阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA8-3。
实施例5：敲除ldhA基因的菌株DPAN9的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-△ldhA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pTarget-△ldhA F/pTarget-△ldhA R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget- △ldhA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-△ldhA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，△ldhA P1、△ldhA P2、△ ldhA P3和△ldhA P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-△ldhA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的菌株DPA8-3感受态中，菌株DPA8-3感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN9阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPAN9。
(6)将构建的菌株DPAN9生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL 的LB培养基中，以实施例2构建的菌株DPAN8-1为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。发酵结果OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示。
由图可见，在菌株DPAN8-1基因组上继续阻断有机酸的合成，包括继续敲除乙酸，甲酸，乳酸的合成基因，得到菌株DPAN9，显示阻断有机酸的合成，对细胞生长略有影响，并发现 D-泛酸效价从1.88g/L增加到2.08g/L，这说明有机酸合成途径的阻断可以减少丙酮酸的消耗及有机酸对细胞的不利影响，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例6：加强丙酮酸转化的菌株DPAN10的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-Trc-pykA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pTarget-Trc-pykA F/pTarget-Trc-pykA R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-Trc-pykA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-Trc-pykA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，Trc-pykA P1、Trc-pykAP2、 Trc-pykA P3和Trc-pykA P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-trc-pykA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的菌株DPAN9感受态中，菌株DPAN9感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN10阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPAN10。
(6)将构建的菌株DPAN10生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL 的LB培养基中，以实施例5构建的菌株DPAN9为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。发酵结果OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图5所示。
由图可见，在菌株DPAN9基因组上使用强启动子加强基因pykA的表达，加强了丙酮酸的合成，得到菌株DPAN10，发酵结果显示，加强基因pykA的表达对细胞生长无明显影响，但D-泛酸效价从2.08g/L增加到2.48g/L，这说明加强丙酮酸池的积累，从而有利于大肠杆菌 D-泛酸的合成。
实施例7：解除关键酶的负反馈抑制(ilvN G59A，C60T，T62A，A63C，A64T，G66C)DPAN10-1) 的构建及摇瓶发酵。
(1)构建pTarget-ilvN*质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pTarget-ilvN F/pTarget-ilvN R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化1h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ilvN*质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvN*质粒：以E.coli W3110基因组为模版，ilvN P1、ilvN P2、ilvNP3 和ilvN P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvN*质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例6获得的菌株DPAN10感受态中，菌株DPAN10感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN10-1阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPAN10-1。
(6)将构建的菌株DPAN10-1生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到 10mL的LB培养基中，以实施例6构建的菌株DPAN10为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。发酵结果OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图6所示。
由图可见，在菌株DPAN10基因组上利用引物引入突变碱基解除ilvN的反馈抑制，并通过基因编辑手段在基因组上将内生片段替换为突变片段以达到在基因组水平解除关键酶的反馈抑制，如图所示，解除反馈抑制后，细胞生长无明显影响，并发现D-泛酸效价从2.48g/L 增加到2.84g/L，这说明解除关键酶的反馈抑制打通主要合成路径，有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例8：解除关键酶的负反馈抑制(ilvH G41A，C50T)，DPAN10-2或者DPAN11的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-ilvH*质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pTarget-ilvH F/pTarget-ilvH R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化1h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget- ilvH*质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvH*质粒：以E.coli W3110基因组为模版，ilvH P1、ilvH P2、ilvHP3 和ilvH P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvH*质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例7获得的菌株DPAN10-1感受态中，菌株DPAN10-1感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN10-1或者DPAN11阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPAN10-1或者DPAN11。
(6)将构建的菌株DPAN11生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10 mL的LB培养基中，以实施例7构建的菌株DPAN10-1为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。发酵结果OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图7所示。
由图可见，在菌株DPAN10-1基因组上继续利用引物引入突变碱基解除ilvH的反馈抑制，并通过基因编辑手段在基因组上将内生片段替换为突变片段以达到在基因组水平解除关键酶的反馈抑制，如图所示，解除反馈抑制后，细胞生长无明显影响，并发现D-泛酸效价从2.84g/L 增加到3.09g/L，这说明解除关键酶的反馈抑制打通主要合成路径，有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例9：改善糖摄取能力，对双功能(p)ppGpp合酶/水解酶基因spoT进行突变(C868G+G869A+C870A+A874G+A876T)构建菌株DPAN11-1及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-spoT*质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pTarget-spoT F/pTarget-spoT R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化1h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-spoT质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-spoT*质粒：以E.coli W3110基因组为模版，spoT P1、spoT P2、spoTP3 和spoT P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-spoT*质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例8获得的菌株DPAN11感受态中，菌株DPAN11感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN12阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPAN12。
(6)将构建的菌株DPAN12生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10 mL的LB培养基中，以实施例8构建的菌株DPAN11为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。发酵结果OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图8所示。
由图可见，在菌株DPAN11基因组上利用引物引入突变碱基获得spoT基因突变体增强糖摄取能力，并使用强启动子Trc加强该突变体的表达，获得菌株DPAN12，发酵结果显示，spoT基因的修饰，菌株的生长得到改善，而且D-泛酸效价从3.09g/L增加到3.32g/L，这说明糖摄取能力的改善，有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例10：加强丙酮酸合成，基因组上过表达基因lpd，菌株DPAN13的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-Trc-lpd质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pTarget-Trc-lpd F/pTarget-Trc-lpd R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3 h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-Trc-lpd质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-Trc-lpd质粒：以E.coli W3110基因组为模版，Trc-lpd P1、Trc-lpdP2、Trc-lpd P3和Trc-lpd P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-Trc-lpd质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例9获得的菌株DPAN12感受态中，菌株DPAN12感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN13阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPAN13。
(6)将构建的菌株DPAN13生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL 的LB培养基中，以实施例9构建的菌株DPAN12为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。发酵结果OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图9所示。
由图可见，在菌株DPAN12基因组上利用基因编辑手段通过强启动子过表达基因lpd，构建得到菌株DPAN13，发酵结果显示，lpd基因的过表达，菌株的生长略有下降，但D-泛酸效价从3.32g/L增加到3.77g/L，提高了13.6％，这说明增强lpd基因的表达提高丙酮酸的积累，有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例11：加强二羟基酸脱水酶的表达，基因组上过表达基因ilvD，菌株DPAN14的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-Trc-ilvD质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以 pTarget-Trc-ilvD F/pTarget-Trc-ilvD R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化 3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-Trc-ilvD质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-Trc-ilvD质粒：以E.coli W3110基因组为模版，Trc-ilvD P1、Trc-ilvD P2、Trc-ilvD P3和Trc-ilvD P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-Trc-ilvD质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例10获得的菌株DPAN13感受态中，菌株DPAN13感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN14阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPAN14。
(6)将构建的菌株DPAN14生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL 的LB培养基中，以实施例10构建的菌株DPAN13为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。发酵结果OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图10所示。
由图可见，在菌株DPAN13基因组上利用基因编辑手段通过强启动子过表达基因ilvD，构建得到菌株DPAN14，发酵结果显示，ilvD基因的加强，菌株的生长无显著影响，但D-泛酸效价从3.77g/L增加到3.99g/L这说明增强D-泛酸途径合成将前体有效的向下游转化，有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例12：无诱导剂添加的D-泛酸菌株构建，基因组上基因lacI的敲除，菌株DPAN15的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-△lacI质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget- △lacI F/pTarget-△lacI R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-△lacI 质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-△lacI质粒：以E.coli W3110基因组为模版，△lacI P1、△lacI P2、△lacI P3 和△lacI P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到△lacI质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例11获得的菌株DPAN14感受态中，菌株DPAN14感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPAN15阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得菌株DPAN15。
(6)将构建的菌株DPAN15生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL 的LB培养基中，以实施例11构建的菌株DPAN14为对照，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测，但DPAN15号菌株不添加诱导剂IPTG。发酵结果OD600及发酵液上清中的D- 泛酸含量如图11所示。
由图可见，在菌株DPAN14基因组上利用基因编辑手段敲除lacI基因，构建得到菌株 DPAN15，发酵结果显示，敲除lacI基因后，菌株的生长有略微改善，DPAN14、DPAN15的 D-泛酸效价分别为3.99g/L、4.13g/L，这说明敲除lacI基因对菌株的生产无明显影响，但发酵过程中无需诱导剂添加。
实施例13：发酵培养基的正交实验及摇瓶发酵
(1)以DPAN14号菌株为测试菌株，DPAN14生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，作为培养基优化过程发酵的种子液。对MS发酵培养基中部分成分的含量进行优化组合，包括葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁；正交试验因素与水平设计如表3所示：
表3：正交试验因素与水平设计
Figure RE-GDA0003171447110000211
(2)在MS培养基的基础上，所选四种可能影响D-泛酸生产的培养基成分作为四种因素，选择进行正交实验以优化D-泛酸生产。按照实施案例2(6)所述方法进行发酵实验，除所选因素改变，其他营养成分的添加不变。
(3)测定OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量，培养基成分正交试验组合结果如表4所示。根据R值的大小，确定影响程度大小的因素依次为葡萄糖>硫酸铵>KH2PO4>MgSO4。
表4：培养基成分正交试验组合结果
Figure RE-GDA0003171447110000221
(4)由图12可见，四因素三水平的正交实验发酵结果。从结果上看，葡萄糖的添加量与菌株的生长关联密切，7-9号组合的培养基与对照组相比，菌株的生长得到了改善，7号组合的发酵结果显示，D-泛酸的产量为4.24g/L，相对于对照菌3.99g/L，提高了0.25g。确定最优葡萄糖添加为24g/L，硫酸铵为12g/L,KH2PO4为1.0g/L，MgSO4 0.5g/L。更优地发酵培养基定义为MS2，具体成分包括：葡萄糖24g/L、硫酸铵12g/L、KH2PO4 1.0g/L、MgSO4 0.5 g/L、酵母提取物2g/L、β-丙氨酸2.5g/L、CaCO3 10g/L(单独灭菌)、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1 g/LZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例14：使用MS2培养基部分菌株的摇瓶发酵
(1)选取菌株DPAN10、DPAN13、DPAN15使用MS2培养基进行发酵测试；DPAN10、DPAN13、DPAN15生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中。使用MS2培养基，按照实施案例2(6)所述方法进行发酵实验；特别地，DPAN15 发酵过程中无需添加IPTG。
(2)发酵结果如图13所示，使用MS2培养基进行发酵与使用MS培养基发酵相比，产量均有所提高，DPAN10、DPAN13、DPAN15产量分别达到2.94g/L，4.15g/L，4.72g/L；特别地，DPAN15发酵过程中无需添加IPTG。
实施例15：菌株DPAN15的5L发酵罐的分批补料发酵
(1)挑取DPAN15单菌落接种于10mL LB培养基中，37℃培养12h，以10％接种量接种于100mL LB液体培养基培养10～12h中，将300mL种子液用于接种5L发酵罐中。
(2)5L发酵罐中装液量为3L，培养基配方为：葡萄糖24g/L、硫酸铵12g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L，1mL/L微量元素溶液，β-丙氨酸1.5g/L，消泡剂1mL/L，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
(3)发酵温度控制在30℃，通过40％氨水控制pH在6.8左右，通过补料培养基控制葡萄糖浓度在5g/L以下。补料培养基配方如下：500g/L葡萄糖，10g/L硫酸铵，2g/L酵母粉，14g/L KH2PO4，1mL/L微量元素溶液，8g/L MgSO4，β-丙氨酸40g/L。
(4)测定葡萄糖浓度、OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量，如图14所示。
由图14所示，DPAN15号菌株在分批补料发酵过程中，在无质粒引入额外基因表达，无诱导剂添加的情况下，保持较低糖浓度发酵80h左右，D-泛酸产量达到34.28g/L。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 无质粒、无诱导剂使用的产D-泛酸基因工程菌及构建方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 60
caggaaacag acc 73
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
taatactagt tatcgccaaa acactcgaat gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gctctaaaac attcgagtgt tttggcgata actagtatta tacctaggac 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
taatactagt attattatgc tgatccctac gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
gctctaaaac gtagggatca gcataataat actagtatta tacctaggac 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
taatactagt aaacgtgctc ttatcccgtt gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
gctctaaaac aacgggataa gagcacgttt actagtatta tacctaggac 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
taatactagt attttttgac tttctgctga gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
gctctaaaac tcagcagaaa gtcaaaaaat actagtatta tacctaggac 50

Claims (8)

1.一种高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
（1）以E. coli DPA8为底盘菌，将其基因组中的poxB基因敲除，得到重组菌株DPA8 △poxB，记为DPA8-1；
（2）敲除菌株DPA8 △poxB中的pta基因，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta，记为DPA8-2；
（3）将菌株DPA8△poxB/△pta基因组中ldhA基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA，记为DPA8-3；
（4）将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA基因组中plfB基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB，记为DPAN9；
（5）将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA，记为DPAN10；
（6）将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA基因组中的ilvN基因用ilvN突变基因（G59A+C60T+T62A+A63C+A64T+G66C）替换，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*，记为DPAN10-1；
（7）菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*基因组中的ilvH基因用ilvH突变基因（G41A+C50T）替换，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc- pykA/ilvN*/ilvH*，记为DPAN10-2或者DPAN11；
（8）将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ Trc-pykF/ilvN*/ilvH*基因组中的spoT基因用spoT突变基因（C868G+G869A+C870A+A874G+A876T）替换并使用trc启动子替换原生启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA// ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*，记为DPAN12；
（9）将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ Trc-pykF/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd，记为DPAN13；
（10）将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/trc-lpd基因组中的ilvD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD，记为DPAN14；
（11）将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD基因组中的lacI基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/△lacI，记为DPAN15，即所述高产D-泛酸的基因工程菌。
2.构建权利要求1所述高产D-泛酸的基因工程菌的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将底盘菌E. coli DPA8基因组中的poxB基因敲除，得到重组菌株DPA8 △poxB，记为DPA8-1；
（2）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除菌株DPA8 △poxB中的pta基因，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta，记为DPA8-2；
（3）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta基因组中ldhA基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA，记为DPA8-3；
（4）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA基因组中plfB基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB，记为DPAN9；
（5）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc- pykA，记为DPAN10；
（6）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc- pykA基因组中的ilvN基因用ilvN突变基因（G59A+C60T+T62A+A63C+A64T+G66C）替换，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*，记为DPAN10-1；
（7）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc- pykA/ilvN*基因组中的ilvH基因用ilvH突变基因（G41A+C50T）替换，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*，记为或者DPAN11；
（8）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△glk/△pta/△ldhA△plfB/ Trc- pykA/ Trc-pykF/ilvN*/ilvH*基因组中的spoT基因用spoT突变基因（C868G+G869A+C870A+A874G+A876T）替换并使用trc启动子替换原生启动子，得到重组菌株DPA8△glk/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA//ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*，记为DPAN12；
（9）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc- pykA/Trc-pykF/ilvN*/ilvH* /Trc-spoT*基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd，记为DPAN13；
（10）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc- pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/trc-lpd基因组中的ilvD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc- lpd/Trc-ilvD，记为DPAN14；
（11）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc- pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD基因组中的lacI基因敲除，得到重组菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhA△plfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc- ilvD/△lacI，记为DPAN15，即所述高产D-泛酸的基因工程菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述底盘菌E. coli DPA8由如下方法构建获得：
（1）以Escherichia . coli W3110 为出发菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将出发菌株Escherichia . coli W3110基因组中的panC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panC，记为DPA1；
（2）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA1基因组中panE基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panCpanE，记为DPA2；
（3）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA2基因组中panB基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panCpanEpanB，记为DPA3；
（4）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA3基因组中ilvC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC，记为DPA4；
（5）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA4基因组中ilvG基因碱基序列第979、980位分别引入碱基A、T，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*，记为DPA5；
（6）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA5基因组中avtA基因敲除，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA，记为DPA6；
（7）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA6基因组中ilvE基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*，记为DPA7；
（8）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA7基因组中coaA基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株Escherichia . coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*，记为DPA8。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.权利要求1所述高产D-泛酸的基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述高产D-泛酸的基因工程菌接种至发酵培养基中，于28~30 ℃、150~200 rpm条件下进行发酵培养至OD600=0.8~1.0，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~30 g/L、硫酸铵10~20g/L、磷酸二氢钾 0.5~1.5 g/L、硫酸镁 0.1~1.0g/L、酵母提取物 1~3 g/L、碳酸钙 5~20g/L，0.5~2 ml/L微量金属盐溶液，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10 g/L CuCl2、10 g/L FeSO4·7H2O、1 g/LZnSO4·7H2O、0.20 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖 20 g/L、硫酸铵16 g/L、磷酸二氢钾 0.8 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、酵母提取物 2 g/L、碳酸钙 10 g/L，1ml/L微量金属盐溶液，溶剂为去离子水。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖 24 g/L、硫酸铵12 g/L、磷酸二氢钾 1.0 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、酵母提取物 2 g/L、碳酸钙 10 g/L，1ml/L微量金属盐溶液，溶剂为去离子水。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350585B (zh) * 2022-01-24 2023-08-18 浙江工业大学 一种高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法其应用
CN115109737B (zh) * 2022-06-02 2024-04-12 浙江工业大学 基于ilvC突变体高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002072855A2 (en) * 2001-03-14 2002-09-19 Degussa Ag Process for the preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
CN109868254A (zh) * 2019-03-14 2019-06-11 浙江工业大学 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN109913398A (zh) * 2019-03-14 2019-06-21 浙江工业大学 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19846499A1 (de) * 1998-10-09 2000-04-20 Degussa Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen
DE10116519A1 (de) * 2001-04-03 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002072855A2 (en) * 2001-03-14 2002-09-19 Degussa Ag Process for the preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
CN109868254A (zh) * 2019-03-14 2019-06-11 浙江工业大学 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN109913398A (zh) * 2019-03-14 2019-06-21 浙江工业大学 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
代谢工程改造大肠杆菌合成 β-丙氨酸;梁姗姗等;《食品与发酵工业》;20170531;第43卷(第5期);13-18 *
泛酸激酶的克隆鉴定及其与泛酸类似物的作用;沈丹等;《清华大学学报(自然科学版)》;20080331;第48卷(第3期);403-407 *

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