CN117384814A - 一种高产d-泛酸的无质粒基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高产d-泛酸的无质粒基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种高产D‑泛酸的无质粒基因工程菌及其构建方法与应用。为了解决现有技术中生物发酵法生产D‑泛酸发酵过程不稳定、产量不高的技术问题，本发明以大肠杆菌为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，过表达来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE、atpFH基因，敲除ptsG、ppsA、ydiF、tdcDE、ltaEpoxB、mgsA、adhE、aroG、ygaZH、lacI、arcA基因，并异源表达来源于Bacillus subtilis的pckA基因、来源于Vitreoscilla的VHB基因，最终得到一种高产D‑泛酸的无质粒基因工程菌。

Description

一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
泛酸属于维生素B族，又称维生素B5，是一种水溶性维生素，存在D型和L型两种构型，但仅D型(D-PA)具有生物活性。泛酸的一个重要作用是以乙酰辅酶A的形式参加代谢过程，是二碳单位的载体，也是体内乙酰化酶的辅酶，它是酰基的传递者。泛酸能帮助细胞的形成，维持正常发育和中枢神经系统的发育，具制造抗体功能，能帮助抵抗传染病，缓和多种抗生素副作用及毒性，并有助于减轻过敏症状。微生物和植物自身能合成泛酸，动物不能合成泛酸，需要从外界摄取，因此泛酸被广泛用于医药、食品、饲料工业等领域。
目前，D-泛酸的生产方法包括物理诱导结晶法、化学拆分法以及微生物法，其中微生物法又包含代谢工程法、发酵法和生物酶法。物理诱导结晶法是将钙化的β-丙氨酸与D,L-泛解酸内酯缩合得到D,L-泛酸钙混合溶液，加入D-泛酸钙晶种诱导结晶拆分D-泛酸钙。物理诱导结晶法工艺成熟，但只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物的生产。化学拆分法是在D,L-泛解酸内酯消旋物中加入奎宁、氯霉胺和麻黄素等化学拆分试剂拆分得到D-泛解酸内酯，再反应得到D-泛酸钙。化学拆分法是目前最主要的合成方法，但拆分剂价格昂贵分离困难，还存在毒性和环境污染问题。酶拆分法利用特异性酶水解D,L-泛解酸内酯消旋物中的L-泛解酸内酯拆分得到D-泛解酸内酯，再反应得到D-泛酸钙。但特异性酶的生产成本较高，导致酶拆分法的生产成本相对较高。
发酵法，是利用基因编辑手段对工程菌进行代谢改造发酵生产D-泛酸。利用生物发酵法生产D-泛酸产品，可以利用葡萄糖等廉价的工业原料、经过生物体自身代谢反应而得到D-泛酸产品，通过合理运用微生物来生产D-泛酸，不仅能够保证泛酸的拆分质量而且还能降低反应成本。相较化学法，生物法具有更加绿色环保的优点。但生物发酵法存在发酵过程不稳定、产量不高等问题。
发明内容
为了解决上述生物发酵法生产D-泛酸发酵过程不稳定、产量不高的技术问题，本发明提供了一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备D-泛酸中能高效利用甘油底物，高效生产D-泛酸。
本发明的具体技术方案为：
一方面，本发明提供了一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌。该无质粒基因工程菌以大肠杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：
(1)过表达来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE、atpFH基因；
(2)敲除ptsG、ppsA、ydiF、tdcDE、ltaEpoxB、mgsA、adhE、aroG、ygaZH、lacI、arcA基因；
(3)异源表达来源于Bacillus subtilis的pckA基因、来源于Vitreoscilla的VHB基因。
泛酸的合成前体物质主要是泛解酸内酯和β-丙氨酸，因此泛酸的合成代谢途径经由两条途径而来。在泛解酸生成途径中，主要是葡萄糖进入细胞后经过糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸再经过乙酰乳酸、2,3-二羟基异戊酸、α-酮异戊酸、酮泛解酸等步骤得到泛酸。在β-丙氨酸合成途径中，糖酵解后得到磷酸烯醇式丙酮酸，接着，磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下合成草酰乙酸，然后草酰乙酸生成天冬氨酸，天冬氨酸转变为β-丙氨酸。
本发明以大肠杆菌为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备D-泛酸中能高效利用甘油底物，高效生产D-泛酸。对大肠杆菌进行改造，得到高产D-泛酸的基因工程菌的具体原理为：
(1)过表达D-泛酸合成关键基因panB、panC、panE基因，增强泛解酸途径；(2)对底盘菌大肠杆菌的PTS系统进行编辑，在其基因组上对ptsG基因进行敲除，提高糖摄取能力并减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗；(3)在其基因组上对ppsA基因进行敲除，进一步增加丙酮酸的积累；(4)在基因组上对合成乙酸相关基因ydiF、tdcDE、ltaEpoxB基因进行敲除，减弱了丙酮酸向有机酸的合成，对大肠杆菌的有机酸合成途径相关基因进行了编辑，可以积累D-泛酸合成的前体；(5)在其基因组上对mgsA基因进行敲除，阻断竞争性副产物丙酮醛合成；(6)在其基因组上对adhE基因进行敲除，阻断竞争性副产物乙醇合成；(7)敲除支链氨基酸的外运蛋白基因ygaZH，减少支链氨基酸积累；(8)在其基因组上对aroG基因进行敲除，减少副产物莽草酸合成，增加丙酮酸的积累；(9)在其基因组上插入透明颤菌血红蛋白编码基因VHB，提高细胞的呼吸强度，提高发酵过程中菌体的摄氧率，加快细胞的生长速率，增加D-泛酸产量；(10)在其基因组上对阻遏蛋白编码基因lacI进行敲除，使之充分地利用乳糖；(11)在其基因组上插入来源于Bacillus subtilis的pckA基因，提高胞内ATP水平；(12)在基因组上对arcA基因进行敲除，提高胞内ATP水平。
基于以上，本发明通过“过表达来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE、atpFH基因，敲除ptsG、ppsA、ydiF、tdcDE、ltaEpoxB、mgsA、adhE、aroG、ygaZH、lacI、arcA基因，并异源表达来源于Bacillus subtilis的pckA基因、来源于Vitreoscilla的VHB基因”，得到了一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌。本发明提供的基因工程菌摇瓶48h发酵D-泛酸产量达到4.02g/L，该菌在进行5L发酵罐的扩大培养，以甘油为碳源，72h发酵D-泛酸产量进一步提升至49.06g/L。
作为本发明上述技术方案的优选，所述底盘菌为E.coli W3110。本发明采用基因型为E.coli W3110 Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk/ilvA*的E.coli W3110作为底盘菌进行实验，对本发明技术方案进行验证。
具体地，本发明基因型为E.coli W3110 Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk/ilvA*的底盘菌，由如下方法构建获得：
(1)以E.coli W3110为出发菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将出发菌株E.coli W3110基因组中的panC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panC，记为DPA1；
(2)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA1基因组中panE基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanE，记为DPA2；
(3)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA2基因组中panB基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanB，记为DPA3；
(4)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA3基因组中ilvC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC，记为DPA4；
(5)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA4基因组中ilvG基因碱基序列第979、980位分别引入碱基A、T，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*，记为DPA5；
(6)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA5基因组中avtA基因敲除，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA，记为DPA6；
(7)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA6基因组中ilvE基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*，记为DPA7；(8)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA7基因组中coaA基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*，记为DPA8；
(9)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8基因组中ilvA基因敲除，得到重组菌株E.coliW3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA，记为DPA9；
(10)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA9基因组中lpd基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd，记为DPA10；
(11)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA10基因组中glk基因敲除，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(12)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA11基因组中ilvA基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk/ilvA*，即为本发明底盘菌。
具体地，VHB基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
另一方面，本发明提供了一种上述高产D-泛酸的无质粒基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
步骤S1：以大肠杆菌为底盘菌，在底盘菌基因组中插入来源于Corynebacteriumglutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE基因进行过表达，并敲除ptsG、ppsA、ydiF、tdcDE基因；
步骤S2：敲除底盘菌基因组中的mgsA、atpFH、adhE、ygaZH、lacI基因；
步骤S3：在底盘菌基因组中插入来源于Bacillus subtilis的pckA基因、来源于Vitreoscilla的VHB基因，并敲除aroG、ltaEpoxB基因。
本发明通过步骤S1～S3，对底盘菌的代谢途径进行了改造，具体而言，通过：(1)过表达D-泛酸合成关键基因panB、panC、panE基因，增强泛解酸途径；(2)对底盘菌大肠杆菌的PTS系统进行编辑，在其基因组上对ptsG基因进行敲除，提高糖摄取能力并减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗；(3)在其基因组上对ppsA基因进行敲除，进一步增加丙酮酸的积累；(4)在基因组上对合成乙酸相关基因ydiF、tdcDE、ltaEpoxB基因进行敲除，减弱了丙酮酸向有机酸的合成，对大肠杆菌的有机酸合成途径相关基因进行了编辑，可以积累D-泛酸合成的前体；(5)在其基因组上对mgsA基因进行敲除，阻断竞争性副产物丙酮醛合成；(6)在其基因组上对adhE基因进行敲除，阻断竞争性副产物乙醇合成；(7)敲除支链氨基酸的外运蛋白基因ygaZH，减少支链氨基酸积累；(8)在其基因组上对aroG基因进行敲除，减少副产物莽草酸合成，增加丙酮酸的积累；(9)在其基因组上插入透明颤菌血红蛋白编码基因VHB，提高细胞的呼吸强度，提高发酵过程中菌体的摄氧率，加快细胞的生长速率，增加D-泛酸产量；(10)在其基因组上对阻遏蛋白编码基因lacI进行敲除，使之充分地利用乳糖；(11)在其基因组上插入来源于Bacillus subtilis的pckA基因，提高胞内ATP水平；(12)在基因组上对arcA基因进行敲除，提高胞内ATP水平。最终使得底盘菌在发酵制备D-泛酸中能高效利用甘油底物，高效生产D-泛酸。
作为本发明上述技术方案的优选，所述底盘菌为E.coli W3110，所述E.coliW3110的基因型为E.coli W3110 Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk/ilvA*。
具体地，VHB基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
作为本发明上述技术方案的优选，所述构建方法还包括步骤S4：过表达底盘菌基因组中的atpFH基因。
本申请人在研究中发现，当敲除底盘菌的atpFH基因时，摇瓶48h发酵D-泛酸产量大大降低，而当插入用强启动子启动的atpFH基因时，摇瓶48h发酵D-泛酸产量进一步增加。因此说明，对底盘菌的atpFH基因进行过表达，可以有效提高D-泛酸的产量，其原理在于atpFH基因的过表达加快菌株的生长并提高胞内ATP水平，有利于D-泛酸代谢途径的表达。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤S1为：用来源于Corynebacteriumglutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE基因替换底盘菌基因组中的ptsG基因，同时替换ppsA、ydiF、tdcDE基因。
用来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichiacoli的panE基因替换ptsG基因，可以提高菌株的糖摄取能力并减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗；用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ppsA基因，可以减弱丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸；用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ydiF基因，可以减弱丙酮酸合成乙酸；用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换tdcDE基因，可以减弱丙酮酸合成乙酸；同时，生产D-泛酸合成关键基因的拷贝数的增加，增强了泛解酸途径。最终，使得工程菌的D-泛酸代谢途径的表达增加。
作为本发明上述技术方案的优选，步骤S3为：用来源于Bacillus subtilis的pckA基因替换底盘菌基因组中的ltaEpoxB基因；用来源于Vitreoscilla的VHB基因替换底盘菌基因组中的aroG基因。
用来源于B.subtilis的pckA基因替换ltaEpoxB基因，可以减弱丙酮酸合成乙酸并提高胞内ATP水平；用来源于Vitreoscilla的VHB基因替换aroG基因，可以减少副产物莽草酸合成并加快细胞的生长。最终，使得工程菌的D-泛酸代谢途径的表达增加。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明通过以大肠杆菌为底盘菌进行以下改造：“使底盘菌生产D-泛酸合成关键基因的拷贝数的增加，增强泛解酸途径；敲除ptsG基因提高糖摄取能力并减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗；敲除ppsA基因增加丙酮酸的积累；敲除合成乙酸相关基因ydiF、tdcDE、ltaEpoxB减弱丙酮酸向有机酸的合成，积累D-泛酸合成的前体；敲除mgsA基因阻断竞争性副产物丙酮醛合成，敲除adhE基因阻断竞争性副产物乙醇合成；敲除支链氨基酸的外运蛋白编码基因ygaZH，减少支链氨基酸积累；敲除aroG基因减少副产物莽草酸合成，增加丙酮酸的积累；过表达VHB基因，通过加快细胞的生长速率从而增加D-泛酸产量；敲除lacI基因，降低发酵成本；过表达pckA基因，并敲除arcA基因提高胞内ATP水平”，最终获得高产D-泛酸的基因工程菌，在无需质粒的情况下，摇瓶48h发酵D-泛酸产量达到4.02g/L，该菌以甘油为碳源在5L发酵罐分批补料72h发酵D-泛酸产量进一步提升至49.06g/L，生产成本低且高效。
附图说明
图1为DPA11A-1的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图2为DPA11A-2的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图3为DPA11A-3的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图4为DPA11A-4的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图5为DPA11A-5的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图6为DPA11A-6的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图7为DPA11A-7的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图8为DPA11A-8的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图9为DPA11A-9的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图10为DPA11A-10的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图11为DPA11A-11的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图12为DPA11A-12的OD600和D-泛酸效价变化结果图；
图13为菌株DPA11A-12的5L发酵罐的分批补料发酵产量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L。
菌株Escherichia.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli GeneticStockCenter)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US2009/0298135A1，US2010/0248311A1中公开。
本发明实施例所用亲本菌株为E.coli DPA11A，为E.coliW3110衍生物，其基因型为下列描述：E.coli W3110 Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk/ilvA*。菌株E.coli DPA11A由如下方法构建获得：
(1)以E.coli W3110为出发菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将出发菌株E.coli W3110基因组中的panC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panC，记为DPA1；
(2)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA1基因组中panE基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanE，记为DPA2；
(3)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA2基因组中panB基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanB，记为DPA3；
(4)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA3基因组中ilvC基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC，记为DPA4；
(5)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA4基因组中ilvG基因碱基序列第979、980位分别引入碱基A、T，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*，记为DPA5；
(6)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA5基因组中avtA基因敲除，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA，记为DPA6；
(7)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA6基因组中ilvE基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*，记为DPA7；(8)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA7基因组中coaA基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*，记为DPA8；
(9)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA8基因组中ilvA基因敲除，得到重组菌株E.coliW3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA，记为DPA9；
(10)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA9基因组中lpd基因启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd，记为DPA10；
(11)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA10基因组中glk基因敲除，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(12)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株DPA11基因组中ilvA基因起始密码子ATG突变为GTG，得到重组菌株E.coli W3110/Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk/ilvA*，记为DPA11A。
本发明实施例中，VHB基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明实施例基因编辑涉及的基因序列信息及相应的途径如表1所示。
表1
基因名称 登录号 涉及途径
ptsG 945651 糖摄取
panB 69620571 2-酮泛解酸合成
panC 69620570 D-泛酸合成
panE 945065 泛解酸合成
ppsA 946209 磷酸烯醇式丙酮酸合成
ydiF 946211 乙酸合成
tdcDE 947635、947623 乙酸合成
mgsA 945574 丙酮醛合成
atpFH 948247、948254 ATP合成
adhE 945837 乙醇合成
ygaZH 945093、945111 L-缬氨酸外运
aroG 945605 莽草酸合成
lacI 945007 乳糖操纵子
ltaEpoxB 944955、946132 乙酸合成
pckA 937235 ATP合成
arcA 948874 全局调控因子
本发明实施例中使用的引物序列信息如表2所示。
表2：引物序列
X D-sgRNA-F/R为pTatget质粒的突变引物，其中X为携带基因组的目的基因所含PAM位点(NGG)前20bp序列；X D-Arm1-F/R为目的基因的上游同源臂上下游引物；X D-Arm2-F/R为目的基因的下游同源臂上下游引物；X D-VF/VR为编辑目的基因的验证引物。
HPLC法测定发酵液中D-泛酸含量：
样品处理：取2mL发酵液离心取上清，将上清液用超纯水稀释合适倍数，保持D-泛酸含量在1.0g/L到5.0g/L之间；
色谱条件：C18柱(250×4.6mm，particle size 5μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，CA，USA)；检测波长：200nm；柱温：30℃；流速：0.80mL/min；流动相：磷酸:乙腈:水＝1％:49％:95％；
数据采集时间：13min。
实施例1用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ptsG基因的菌株DPA11A-1的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A(即E.coli W3110Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/△ilvA/Trc-lpd/△glk/ilvA*)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015.MultigeneEditing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System.AppliedEnvironmental Microbiology.81:2506-2514)，用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ptsG基因，提高菌株的糖摄取能力并减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗。具体步骤如下：
(1)构建pTrc99a-panBCE质粒：以pTrc99a质粒为模板，pTrc99a-F/pTrc99a-R为引物PCR扩增获得线性载体；以C.glutamicum基因组为模板，ptrc-panBC-F/panBC-panE-R为引物PCR扩增获得donor DNA1；以E.coli W3110基因组为模板，panE-F/panE-R为引物PCR扩增获得donor DNA2，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体、donor DNA1和donor DNA2连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，卡那霉素(kan)平板筛选，测序验证获得正确的pTrc99a-panBCE质粒。
(2)构建pT-△ptsG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以ptsG-D-sgRNA-F/ptsG-D-sgRNA-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△ptsG质粒。
(3)构建pTD-△ptsG::panBCE质粒：以pT-△ptsG质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coliW3110基因组为模版，ptsG-D-arm1-F/ptsG-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，ptsG-D-arm2-F/ptsG-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，以pTrc99a-panBCE质粒为模板，以pTrc-F/panBCE-R为引物PCR扩增获得线性扩增片段记为panBCE，以ptsG-D-arm1-F/ptsG-D-arm2-R为引物将arm1、arm2和panBCE进行融合pcr获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△ptsG::panBCE质粒。
PCR体系：2×PhantaMax Buffer 25μL，dNTP 1μL，PhantaMax DNA聚合酶1μL，正反引物各1μL(10μM)，基因组模板1μL，去离子水补至50μL。PCR程序：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min，25℃终止1s。
连接过程：运用One Step Cloning Kit(购自Vazyme)进行连接，在灭菌后的PCR管中加入Mix 1μL，线性载体0.5μL和线性扩增片段3μL，37℃反应30分钟。将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态，利用壮观霉素抗性筛选，挑选阳性转化子测序进行验证，最终得到pTD-△ptsG::panBCE质粒。
(4)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入DPA11A化转感受态中，挑取阳性克隆转接到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，并加入100μL 1mol/L的L-阿拉伯糖，200rpm、30℃过夜培养；再以体积浓度2％的接种量接种到含50mL LB培养基(含0.05mg/L卡那霉素)的250mL摇瓶中，并加入500μL 1mol/L的L-阿拉伯糖，200rpm、30℃培养OD600至0.4～0.6；于4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(5)取200～500ng pTD-△ptsG::panBCE质粒与100-200μL电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴45s左右，用电穿孔仪(MicroPluser TM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入预冷的1mL LB培养基并立即吸出，转移到2mLEP管中，200rpm、30℃复苏3～4h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养14～18h，以ptsG-D-VF和ptsG-D-VR为验证引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段3700bp左右的片段，并测序验证成功则证明该单菌落是DPA11A△ptsG::panBCE的阳性菌落，即编辑成功，得到新的菌株DPA11A-1。
(6)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养12-16h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTD-△ptsG::panBCE质粒成功消除，挑取pTD-△ptsG::panBCE质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12-16h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒菌株DPA11A△ptsG::panBCE(简称DPA11A-1)。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS发酵培养基：甘油20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO40.8 g/L、MgSO40.5 g/L、酵母提取物2g/L、β-丙氨酸2.5g/L、CaCO310 g/L(单独灭菌)、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl 2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/LZnSO4·7H2O、0.2g/LCuSO4、0.02g/LNiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
(7)将构建的DPA11A-1菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图1。
由图1可见，利用基因编辑手段用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ptsG基因，DPA11A-1菌株的生长无明显抑制，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从1.63g/L增加到1.99g/L，这说明敲除ptsG基因提高糖摄取能力并减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，增加panBCE拷贝有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例2用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ppsA基因的菌株DPA11A-2的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A-1为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ppsA基因，减弱丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。具体步骤如下：
(1)构建pT-△ppsA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以ppsA-D-sgRNA-F/ppsA-D-sgRNA-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△ppsA质粒。
(2)构建pTD-△ppsA::panBCE质粒：以pT-△ppsA质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，ppsA-D-arm1-F/ppsA-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，ppsA-D-arm2-F/ppsA-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，以pTrc99a-panBCE质粒为模板，以pTrc-F/panBCE-R为引物PCR扩增获得线性扩增片段记为panBCE，以ppsA-D-arm1-F/ppsA-D-arm2-R为引物将arm1、arm2和panBCE进行融合pcr获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△ppsA::panBCE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例1获得的菌株DPA11A-1感受态中，菌株DPA11A-1感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-2阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-2。
(6)将构建的DPA11A-2菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-1为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图2。
由图2可见，利用基因编辑手段用来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE基因替换ppsA基因，DPA11A-2菌株的生长无明显抑制，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从1.99g/L增加到2.56g/L，这说明敲除ppsA基因增加丙酮酸的积累和增加panBCE拷贝有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例3用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ydiF基因的菌株DPA11A-3的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A-2为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换ydiF基因的菌株DPA11A-3的构建及摇瓶发酵，减弱丙酮酸合成乙酸。具体步骤如下：
(1)构建pT-△ydiF质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以ydiF-D-sgRNA-F/ydiF-D-sgRNA-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△ydiF质粒。
(2)构建pTD-△ydiF::panBCE质粒：以pT-△ydiF质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coliW3110基因组为模版，ydiF-D-arm1-F/ydiF-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，ydiF-D-arm2-F/ydiF-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，以pTrc99a-panBCE质粒为模板，以pTrc-F/panBCE-R为引物PCR扩增获得线性扩增片段记为panBCE，以ydiF-D-arm1-F/ydiF-D-arm2-R为引物将arm1、arm2和panBCE进行融合pcr获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△ydiF::panBCE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的菌株DPA11A-2感受态中，菌株DPA11A-2感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-3阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-3。
(6)将构建的DPA11A-3菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-2为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图3。
由图3可见，利用基因编辑手段用来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE基因替换ydiF基因，DPA11A-3菌株的生长无明显抑制，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从2.56g/L增加到2.94g/L，这说明敲除ydiF基因减弱丙酮酸合成乙酸和增加panBCE拷贝有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例4用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换tdcDE基因的菌株DPA11A-4的构建及摇瓶发酵。
以基因工程菌DPA11A-3为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用来源于C.glutamicum的panB、panC基因和来源于E.coli的panE基因替换tdcDE基因的菌株DPA11A-4的构建及摇瓶发酵，减弱丙酮酸合成乙酸。具体步骤如下
(1)构建pT-△tdcDE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以tdcDE-D-sgRNA-F/tdcDE-D-sgRNA-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△tdcDE质粒。
(2)构建pTD-△tdcDE::panBCE质粒：以pT-△tdcDE质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，tdcDE-D-arm1-F/tdcDE-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，tdcDE-D-arm2-F/tdcDE-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，以pTrc99a-panBCE质粒为模板，以pTrc-F/panBCE-R为引物PCR扩增获得线性扩增片段记为panBCE，以tdcDE-D-arm1-F/tdcDE-D-arm2-R为引物将arm1、arm2和panBCE进行融合pcr获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△tdcDE::panBCE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的菌株DPA11A-3感受态中，菌株DPA11A-3感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-4阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-4。
(6)将构建的DPA11A-4菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-3为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图4。
由图4可见，利用基因编辑手段用来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE基因替换tdcDE基因，DPA11A-2菌株的生长无明显抑制，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从2.94g/L增加到3.49g/L，这说明敲除tdcDE基因减弱丙酮酸合成乙酸和增加panBCE拷贝有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例5敲除mgsA基因的菌株DPA11A-5的构建及摇瓶发酵。
以基因工程菌DPA11A-4为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术在基因组上将mgsA基因进行敲除，阻断竞争性副产物丙酮醛合成。具体步骤如下：
(1)构建pT-△mgsA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以mgsA-D-sgRNA-F/mgsA-D-sgRNA-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△mgsA质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-△mgsA质粒：以pT-△mgsA质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coliW3110基因组为模版，mgsA-D-arm1-F/mgsA-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，mgsA-D-arm2-F/mgsA-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，按照(One step clone kit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和arm1、arm2连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△mgsA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的菌株DPA11A-4感受态中，菌株DPA11A-4感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-5阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-5。
(6)将构建的DPA11A-5菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-4为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图5。
由图5可见，利用基因编辑手段敲除mgsA基因，DPA11A-5菌株的生长无明显抑制，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从3.49g/L增加到3.75g/L，这说明阻断竞争性副产物丙酮醛合成有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例6敲除atpFH基因的菌株DPA11A-6的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A-5为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术在基因组上将atpFH基因进行敲除，调控ATP水平。具体步骤如下：
(1)构建pT-△atpFH质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以atpFH-D-sgRNA-F/atpFH-D-sgRNA-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△atpFH质粒。
(2)构建pTD-△atpFH质粒：以pT-△atpFH质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，atpFH-D-arm1-F/atpFH-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，atpFH-D-arm2-F/atpFH-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和arm1、arm2连接在一起，导入E.coliDH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△atpFH质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的菌株DPA11A-5感受态中，菌株DPA11A-5感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-6阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-6。
(6)将构建的DPA11A-6菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-5为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图6。
由图6可见，利用基因编辑手段敲除atpFH基因，DPA11A-6菌株的生长受到抑制，使得D-泛酸效价从3.75g/L降低到2.52g/L，这说明敲除atpFH基因不利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例7敲除adhE基因的菌株DPA11A-7的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A-6为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术在基因组上将adhE基因进行敲除，阻断竞争性副产物乙醇合成。具体步骤如下：
(1)构建pT-△adhE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以adhE-D-sgRNA-F/promoter-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△adhE质粒。
(2)构建pTD-△adhE质粒：以pT-△adhE质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，adhE-D-arm1-F/adhE-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，adhE-D-arm2-F/adhE-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，按照(One step clone kit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和arm1、arm2连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△adhE质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例6获得的菌株DPA11A-6感受态中，菌株DPA11A-6感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-7阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-7。
(6)将构建的DPA11A-7菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-6为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图7。
由图7可见，利用基因编辑手段敲除adhE基因，DPA11A-7菌株的生长无明显抑制，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从2.52g/L增加到2.53g/L，这说明阻断竞争性副产物乙醇合成有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例8敲除ygaZH基因的菌株DPA11A-8的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A-7为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术在基因组上将ygaZH基因进行敲除，减少支链氨基酸积累。具体步骤如下：
(1)构建pT-△ygaZH质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以ygaZH-D-sgRNA-F/promoter-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△ygaZH质粒。
(2)构建pTD-△ygaZH质粒：以pT-△ygaZH质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，ygaZH-D-arm1-F/ygaZH-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，ygaZH-D-arm2-F/ygaZH-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和arm1、arm2连接在一起，导入E.coliDH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△ygaZH质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例7获得的菌株DPA11A-7感受态中，菌株DPA11A-7感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-8阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-8。
(6)将构建的DPA11A-8菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-7为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图8。
由图8可见，利用基因编辑手段敲除ygaZH基因，DPA11A-8菌株的生长无明显抑制作用，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从2.53g/L增加到2.88g/L，这说明减少支链氨基酸积累有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例9用来源于Vitreoscilla的VHB基因替换aroG基因的菌株DPA11A-9的构建及摇瓶发酵。
以基因工程菌DPA11A-8为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用来源于Vitreoscilla的VHB基因替换aroG基因，减少副产物莽草酸合成并加快细胞的生长。具体步骤如下：
(1)构建pTrc99a-VHB质粒：以pTrc99a质粒为模板，pTrc99a-F/pTrc99a-R为引物PCR扩增获得线性载体；以Vitreoscilla基因组为模板，VHB-F/VHB-R为引物PCR扩增获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，卡那霉素(kan)平板筛选，测序验证获得正确的pTrc99a-VHB质粒。
(2)构建pT-△aroG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以aroG-D-sgRNA-F/promoter-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△aroG质粒。
(3)构建pTD-△aroG::VHB质粒：以pT-△aroG质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，aroG-D-arm1-F/aroG-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，aroG-D-arm2-F/aroG-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，以pTrc99a-VHB质粒为模板，以pTrc-F/rrnB T2-R为引物PCR扩增获得线性扩增片段记为VHB，以aroG-D-arm1-F/aroG-D-arm2-R为引物将arm1、arm2和VHB进行融合pcr获得donor DNA，按照(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△aroG::VHB质粒。
(4)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例8获得的菌株DPA11A-8感受态中，菌株DPA11A-8感受态制备方法同实施例1(4)。
(5)构建得到菌株DPA11A-9阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(6)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-9。
(7)将构建的DPA11A-9菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-8为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，添加终浓度为0.4mM的IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图9。
由图9可见，利用基因编辑手段用来源于Vitreoscilla的VHB基因替换aroG基因，减少副产物莽草酸合成从而增加丙酮酸的积累，加快细胞的生长，提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从2.88g/L增加到3.27g/L，这说明减少副产物莽草酸合成和加快细胞的生长有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例10敲除lacI基因的菌株DPA11A-10的构建及摇瓶发酵。
以基因工程菌DPA11A-9为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术在基因组上将lacI基因进行敲除，减少支链氨基酸积累。具体步骤如下：
(1)构建pT-△lacI质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以lacI-D-sgRNA-F/promoter-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△lacI质粒。
(2)构建pTD-△lacI质粒：以pT-△lacI质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，lacI-D-arm1-F/lacI-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，lacI-D-arm2-F/lacI-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，按照(One step clone kit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和arm1、arm2连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△lacI质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例9获得的菌株DPA11A-9感受态中，菌株DPA11A-9感受态制备方法同实施例1(4)。
(4)构建得到菌株DPA11A-10阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-10。
(6)将构建的DPA11A-10菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-9为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，菌株DPA11A-9添加终浓度为0.4mM的IPTG，菌株DPA11A-10不添加IPTG，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图10。
由图10可见，利用基因编辑手段敲除lacI基因，DPA11A-10菌株的生长无明显抑制作用，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从3.27g/L增加到3.41g/L，有利于降低发酵成本。
实施例11用来源于B.subtilis的pckA基因替换ltaEpoxB基因的菌株DPA11A-11的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A-10为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用来源于B.subtilis的pckA基因替换ltaEpoxB基因，减弱丙酮酸合成乙酸并提高胞内ATP水平。具体步骤如下：
(1)构建pTrc99a-pckA质粒：以pTrc99a质粒为模板，pTrc99a-F/pTrc99a-R为引物PCR扩增获得线性载体；以B.subtilis基因组为模板，pckA-F/pckA-R为引物PCR扩增获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，卡那霉素(kan)平板筛选，测序验证获得正确的pTrc99a-pckA质粒。
(2)构建pT-△ltaEpoxB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以ltaEpoxB-D-sgRNA-F/promoter-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△ltaEpoxB质粒。
(3)构建pTD-△ltaEpoxB::VHB质粒：以pT-△ltaEpoxB质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，ltaEpoxB-D-arm1-F/ltaEpoxB-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，ltaEpoxB-D-arm2-F/ltaEpoxB-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，以pTrc99a-pckA质粒为模板，以pTrc-F/rrnB T2-R为引物PCR扩增获得线性扩增片段记为pckA，以ltaEpoxB-D-arm1-F/ltaEpoxB-D-arm2-R为引物将arm1、arm2和pckA进行融合pcr获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△ltaEpoxB::pckA质粒。
(4)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例10获得的菌株DPA11A-10感受态中，菌株DPA11A-10感受态制备方法同实施例1(4)。
(5)构建得到菌株DPA11A-11阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(6)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-11。
(7)将构建的DPA11A-11菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-10为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图11。
由图11可见，利用基因编辑手段用来源于B.subtilis的pckA基因替换ltaEpoxB基因，DPA11A-9菌株的生长无明显抑制作用，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从3.41g/L增加到3.67g/L，这说明敲除ltaEpoxB基因减弱丙酮酸合成乙酸和提高胞内ATP水平有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例12用来源于E.coliW3110的atpFH基因替换arcA基因的菌株DPA11A-12的构建及摇瓶发酵以基因工程菌DPA11A-11为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用来源于E.coli W3110的atpFH基因替换arcA基因，用trc启动子强化atpFH基因的表达，加快菌株的生长并提高胞内ATP水平。具体步骤如下：
(1)构建pTrc99a-atpFH质粒：以pTrc99a质粒为模板，pTrc99a-F/pTrc99a-R为引物PCR扩增获得线性载体；以Bacillus subtilis基因组为模板，atpFH-F/atpFH-R为引物PCR扩增获得donor DNA，按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，卡那霉素(kan)平板筛选，测序验证获得正确的pTrc99a-atpFH质粒。
(2)构建pT-△arcA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以arcA-D-sgRNA-F/promoter-R为引物PCR扩增，得到的PCR产物转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观霉素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pT-△arcA质粒。
(3)构建pTD-△arcA::atpFH质粒：以pT-△arcA质粒为模版，以pTarget-F/pTarget-R为引物PCR扩增获得线性载体；以E.coli W3110基因组为模版，arcA-D-arm1-F/arcA-D-arm1-R为引物PCR扩增获得donor DNA的上游同源臂记为arm1，arcA-D-arm2-F/arcA-D-arm2-R为引物PCR扩增获得donor DNA的下游同源臂记为arm2，以pTrc99a-atpFH质粒为模板，以pTrc-F/rrnB T2-R为引物PCR扩增获得线性扩增片段记为atpFH，以arcA-D-arm1-F/arcA-D-arm2-R为引物将arm1、arm2和atpFH进行融合pcr获得donor DNA，按照(Onestep clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性载体和donor DNA连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落PCR筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-△arcA::atpFH质粒。
(4)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例11获得的菌株DPA11A-11感受态中，菌株DPA11A-11感受态制备方法同实施例1(4)。
(5)构建得到菌株DPA11A-12阳性菌落，构建方法同实施例1(5)。
(6)质粒消除：实施方法同实施例1(6)，获得无质粒菌株DPA11A-12。
(7)将构建的DPA11A-12菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL的LB培养基中，以底盘菌株DPA11A-11为对照，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种400μL种子液到装有20mL的MS发酵培养基的250mL摇瓶中，培养至48h；发酵结束后将发酵上清根据前述方法进行HPLC检测D-泛酸含量，分光光度计检测OD600确定菌株生长情况，结果见图12。
由图12可见，利用基因编辑手段用来源于E.coli W3110的atpFH基因替换arcA基因，回补atpFH基因加快DPA11A-12菌株的生长，敲除arcA基因提高胞内ATP水平，提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从3.67g/L增加到4.02g/L，这说明加快菌株的生长并提高胞内ATP水平有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例13菌株DPA11A-12以甘油为碳源的5L发酵罐分批补料发酵(1)挑取DPA11A-12单菌落接种于10mL LB培养基中，37℃培养12h，以2％接种量接种于100mL LB液体培养基培养10～12h，将200mL种子液用于接种5L发酵罐中。
(2)5L发酵罐中装液量为1.8L，培养基配方为：酵母提取物8g/L，胰蛋白胨12g/L、K3PO44g/L、NaCl 3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、甘油10g/L、硫酸铵2.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、柠檬酸铁铵0.5g/L、β-丙氨酸1.5g/L，无水甜菜碱2g/L、消泡剂1mL/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
(3)发酵温度控制在30℃，通过50％氨水控制pH为6.8。补料培养基配方如下：500g/L甘油，10g/L硫酸铵，2g/L酵母粉，14g/LKH2PO4，2mL/L微量元素溶液，8g/L MgSO4，β-丙氨酸100g/L。
(4)测定OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量，如图9所示。
由图13所示，DPA11A-12号菌株在分批补料发酵过程中，在无质粒引入额外基因表达的情况下，以甘油为碳源，发酵72h时D-泛酸产量达到49.06g/L。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌，其特征在于：以大肠杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：
(1)过表达来源于Corynebacterium glutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE、atpFH基因；
(2)敲除ptsG、ppsA、ydiF、tdcDE、ltaEpoxB、mgsA、adhE、aroG、ygaZH、lacI、arcA基因；
(3)异源表达来源于Bacillus subtilis的pckA基因、来源于Vitreoscilla的VHB基因。
2.如权利要求1所述的一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌，其特征在于：所述底盘菌为Escherichia coli W3110。
3.如权利要求1所述的一种高产D-泛酸的无质粒基因工程菌，其特征在于：VHB基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的无质粒基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1：以大肠杆菌为底盘菌，在底盘菌基因组中插入来源于Corynebacteriumglutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE基因进行过表达，并敲除ptsG、ppsA、ydiF、tdcDE基因；
步骤S2：敲除底盘菌基因组中的mgsA、atpFH、adhE、ygaZH、lacI基因；
步骤S3：在底盘菌基因组中插入来源于Bacillus subtilis的pckA基因、来源于Vitreoscilla的VHB基因，并敲除aroG、ltaEpoxB基因。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为E.coli W3110。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：VHB基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：还包括：
步骤S4：过表达底盘菌基因组中的atpFH基因。
8.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤S1为：用来源于Corynebacteriumglutamicum的panB、panC基因和来源于Escherichia coli的panE基因替换底盘菌基因组中的ptsG基因，同时替换ppsA、ydiF、tdcDE基因。
9.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤S3为：用来源于Bacillus subtilis的pckA基因替换底盘菌基因组中的ltaEpoxB基因；用来源于Vitreoscilla的VHB基因替换底盘菌基因组中的aroG基因。
10.如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌或权利要求4～9任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在生产D-泛酸中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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