CN112195143B - 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法 - Google Patents

一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112195143B
CN112195143B CN202011015874.6A CN202011015874A CN112195143B CN 112195143 B CN112195143 B CN 112195143B CN 202011015874 A CN202011015874 A CN 202011015874A CN 112195143 B CN112195143 B CN 112195143B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pantothenic acid
fermentation
escherichia coli
culture
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011015874.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112195143A (zh
Inventor
柳志强
邹树平
郑裕国
牛坤
周海岩
王之见
赵阔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN202011015874.6A priority Critical patent/CN112195143B/zh
Publication of CN112195143A publication Critical patent/CN112195143A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112195143B publication Critical patent/CN112195143B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于发酵法生产D‑泛酸的菌株及发酵法生产D‑泛酸的方法。所述菌株由将大肠杆菌serA基因、glyA基因中的至少一个克隆到保藏号为CCTCC NO：M2018914的大肠杆菌中进行过表达所得。本发明首次利用单因素实验及响应面法优化方法对D‑泛酸的发酵培养基进行优化，以D‑泛酸产量为响应值，优化得到最佳的丝氨酸添加量以及最显著的影响D‑泛酸浓度的因素浓度。该方法拟合度好，实验结果可靠。使用优化后的最佳培养基进行D‑泛酸发酵，D‑泛酸的产量提高至6.73g/L，是优化前的2.1倍。

Description

一种用于发酵法生产D-泛酸的菌株及发酵法生产D-泛酸的 方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种用于发酵法生产D-泛酸的菌株及发酵法生产D-泛酸的方法。
背景技术
D-泛酸又称维生素B5，化学分子式C9H17NO5，相对分子量219.24，是一种重要的水溶性维生素，广泛的应用于医药、食品、饲料、以及化妆品等领域。D-泛酸普遍存在于生物体内，是酰基载体蛋白(ACP)和辅酶A(CoA)的重要合成前体之一，为所有细胞中的TCA循环提供了主要底物，并控制细胞生长，增殖和整体组蛋白乙酰化，以及在碳水化合物，脂肪酸，脂质和磷脂等多种重要物质的合成代谢和分解代谢途径中起关键作用。D-泛酸可以提高机体免疫力并可与其他组分构成的复方制剂则用于治疗神经炎、神经衰弱、术后肠绞痛、胃肠道疾病、呼吸道疾病、红斑狼疮、亨廷顿舞蹈病等皮肤疾病；同时D-泛酸还应用于多种保健食品，如成长快乐、施尔康和21金维他等，在食品领域，D-泛酸用于增强烧酒和威士忌风味；还具有防止冬天蜂蜜结晶和缓解咖啡因、糖精苦味等作用。对畜禽养殖业至关重要，若缺乏D-泛酸，家禽、家畜可能出现生长迟缓、适应性和抗病性下降、生殖系统障碍、毛发脱落色泽暗淡等现象。
现有的D-泛酸的工业化生产方法主要是化学-酶法，异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛，再添加氢氰酸，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯，DL-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯水解酶水解，留下D-泛解酸内酯，产生的L-泛解酸再经化学内酯、外消旋转为DL-泛解酸内酯。得到的D-泛解酸内酯与β-氨基丙酸钙缩合直接制得D-泛酸钙。现有的生产工艺对设备要求高、合成过程中存在的环境污染问题无法避免。随着环保问题日益严峻，以绿色可再生资源为原料的微生物发酵法生产D-泛酸受到越来越多的关注。微生物发酵法条件温和、环境友好、产品质量稳定，具有发展前途，同时由微生物进行酶促生产的优点是直接形成所需的立体异构体形式，即D-形式，其不含L-泛酸。现有的以微生物直接发酵法生产D-泛酸生产菌主要包括大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。
微生物发酵法通过微生物的代谢合成D-泛酸或其衍生物并分泌到发酵液中，发酵菌株主要代谢糖类物质(葡萄糖、麦芽糖等)。将含有碳源物质与无机氮源，无机盐等物质的发酵培养基高温杀菌后进行接种，发酵后分离纯化发酵液得到D-泛酸钙。现有的对微生物发酵法的研究主要集中于菌种构建以及代谢研究，但大肠杆菌生产D-泛酸仍然存在重大障碍。例如，虽然已经提出了许多可行的工程细菌构建方案，但是葡萄糖生产D-泛酸的转化率仍然较低。
目前D-泛酸的发酵培养基培养基组分的组成与配比不合理。生物发酵所必须的碳源、氮源、无机盐，代谢调节物质等的优化研究能进一步的提高菌体浓度与生物产物的合成。因此，本领域迫切需要改良D-泛酸生产菌的发酵培养基。
申请人前期的专利申请(公开号为CN109868254A的发明申请)中公开了一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用，通过强化D-泛酸生物生成途径中关键酶panB，panC、panE和IlvC的表达，通过修复ilvG基因削弱反馈调控和强化泛解酸合成途径，提高D-泛酸产量，使D-泛酸和缬氨酸在积累分别达到0.48g/L和0.51g/L，通过敲除avtA和敲降ilvE对竞争支路进行削弱得到一株无质粒高产菌，D-泛酸效价从0.48g/L提高到1.54g/L。但该技术方案中D-泛酸产量仍然较低。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的D-泛酸产量较低的问题，提供了一种用于发酵法生产D-泛酸的菌株及发酵法生产D-泛酸的方法，提高大肠杆菌发酵产D-泛酸产量和时空产率。
本发明首先提供了一种用于发酵法生产D-泛酸的菌株，将大肠杆菌serA基因或glyA基因中的至少一个与谷氨酸棒杆菌panB基因、panC基因一起克隆到保藏号为CCTCCNO：M2018914的大肠杆菌中进行过表达所得。
优选的，各基因分别克隆到质粒pTrc99A中获得重组质粒后，将重组质粒转染到保藏号为CCTCC NO：M2018914的大肠杆菌中。
本发明又提供了所述的菌株在发酵法生产D-泛酸中的应用。
本发明还提供了一种发酵法生产D-泛酸的方法，使用所述菌株进行发酵培养生产D-泛酸。
优选的，所述的方法，先将菌株接种至平板培养基进行活化培养，获得活化菌；再将活化菌接种至种子培养基进行种子培养，获得种子液；最后再将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
优选的，所述平板培养基为：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
优选的，所述种子培养基为：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L，pH＝6.8-7.0。
优选的，发酵培养使用的培养基为：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB12 0.001g/L，VB10.001g/L，盐溶液1ml/L，异丙基硫代半乳糖苷0.1mmol/L；
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO40.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
更优选的，发酵培养使用的培养基为：葡萄糖56g/L，硫酸铵11.8g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB12 0.001g/L，VB1 0.001g/L，盐溶液1ml/L，丝氨酸100mg/L，异丙基硫代半乳糖苷0.1mmol/L；
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO40.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
本发明的有益效果：本发明首次利用单因素实验及响应面法优化方法对D-泛酸的发酵培养基进行优化，以D-泛酸产量为响应值，优化得到最佳的丝氨酸添加量以及最显著的影响D-泛酸浓度的因素浓度。该方法拟合度好，实验结果可靠。使用优化后的最佳培养基进行D-泛酸发酵，D-泛酸的产量提高至6.73g/L，是优化前的2.1倍。
附图说明
图1为丝氨酸添加对D-泛酸合成的影响检测结果图。
图2为在大肠杆菌中的亚甲基四氢叶酸(“MTHF”)生物合成途径的示意图。
图3为质粒pTrc99A-panBCserA的结构示意图。
图4为质粒pTrc99A-panBCglyA的结构示意图。
图5为不同碳源对D-泛酸产量的影响检测结果图。
图6为不同氮源对D-泛酸产量的影响检测结果图。
图7为各因素之间的响应面曲面图，其中图A为β-丙氨酸与葡萄糖交互影响的响应面；图B为硫酸铵与葡萄糖交互影响的响应面；图C为β-丙氨酸与硫酸铵交互影响的响应面。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
在下文中使用术语“D-泛酸”时，应理解为不仅指游离酸，还指D-泛酸的盐，例如钙，钠，铵或钾盐。
术语“增强”在本发明中描述了例如通过增加一个或多个基因的拷贝数来提高由相应DNA编码的微生物中一种或多种酶和/或蛋白质的细胞内活性。使用强启动子或编码具有高活性的相应酶和/或蛋白质的基因或等位基因，并可选地组合使用这些措施。
通过这些增强措施，特别是过表达，通常将相应蛋白质的活性或浓度提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或相对于野生型蛋白质而言，或相对于起始微生物中蛋白质的活性或浓度，为500％，至多1000％或2000％。
本发明提供的微生物可从葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉，纤维素或由甘油和乙醇产生D-泛酸。微生物是肠杆菌科，特别是埃希氏菌属的成员。在埃希氏菌属中大肠杆菌是特别优选的。种内大肠杆菌，即所谓的K-12菌株，例如MG1655或W3110菌株(Neidhard等：大肠杆菌和沙门氏菌。细胞和分子生物学(ASM出版社，华盛顿特区)或大肠杆菌野生型菌株IF03547(日本大阪发酵研究所)和衍生自其的突变体是合适的，并且能够产生D-泛酸。
已经发现肠杆菌科在增强并且特别是过表达编码3-磷酸丝氨酸氨基转移酶的serA基因或编码丝氨酸羟甲基转移酶的glyA基因后，提高了D-泛酸的产量。serA基因与glyA基因来自底盘菌大肠杆菌W3110。serA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述glyA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其他菌属来源的所描述的serA基因与glyA基因也可以用于本发明。另外，可以使用由于遗传密码的简并性或通过功能中性有义突变而产生的serA基因与glyA基因的等位基因。
为了实现过表达，可以增加相应基因的拷贝数，或者可以使位于结构基因上游的启动子和调控区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以相同的方式起作用。通过可诱导的启动子，还可以在酶促产生D-泛酸的过程中提高表达。通过旨在延长mRNA寿命的措施也改善了表达。此外，通过防止酶蛋白的分解，还增强了酶活性。基因或基因构建体可以存在于具有不同拷贝数的质粒中，或者可以在染色体中整合和扩增。或者，可在大肠杆菌科中复制的质粒载体，例如衍生自pACYC184的克隆载体(Bartolomé等；Gene 102，75-78(1991))，pTrc99A(Amann等；Gene 69：301-315(1988))或可以使用pSC101衍生物(Vocke和Bastia，美国国家科学院院刊80(21)：6557-6561(1983))。在根据本发明的方法中，可以使用质粒载体转化的菌株，该质粒载体至少携带编码serA基因的核苷酸序列。
所使用的培养基必须以适当的方式满足各个菌株的要求。关于各种微生物的培养基的描述包含在美国细菌学会普通细菌学方法手册中。作为碳源，可以使用糖和碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油脂，例如大豆油，葵花籽油，花生油和椰子油，脂肪酸，例如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸。这些物质可以单独使用或混合使用。
作为氮源，可以使用有机含氮化合物，例如蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素，或无机化合物，例如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，铵碳酸和硝酸铵。氮源可以单独使用或混合使用。
作为磷源，可以使用磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
根据本发明产生的微生物可以分批过程，分批补料过程或重复的分批补料过程培养。
培养基还必须含有生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除上述物质外，还可使用必需的生长促进剂，例如氨基酸和维生素。此外，可以将D-泛酸的前体例如天冬氨酸，β-丙氨酸，酮异戊酸酯，酮戊酸或泛酸以及任选地它们的盐添加到培养基中。可以将上述起始物质以单批形式添加到培养物中，或者可以在培养期间以合适的方式计量加入。
为了控制培养物的pH，以适当的方式使用碱性化合物，例如氢氧化钠，氢氧化钾，氨水或氨水，或酸性化合物，例如磷酸或硫酸。
实施例1：丝氨酸对D-泛酸发酵的影响
申请人之前的专利技术(公开号为“CN109868254A”、发明名称为“一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用”、申请日为2019年3月14日)已经证明了D-泛酸途径基因panB与panC基因的增强尤其是过表达对D-泛酸发酵生产的有益作用，以相同的方法在质粒pTrc99A上过表达panB(序列如SEQ ID NO.1所示)与panC基因(序列如SEQ ID NO.2所示)，构建质粒pTrc99A-panBC，并将质粒转化入Escherichia coli ZJB 18003菌株中，菌株命名为Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBC。此基础上进行后续步骤。
(1)活化培养：将大肠杆菌Escherichia coli ZJB 18003/DTrc99A-panBC接种至平板培养基上，培养箱中30℃活化培养12h，得到活化菌；
平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌，接种至含有10ml种子培养基的试管中进行培养，种子培养的条件为30℃，200r/min摇床培养12h，得到种子液；
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L，pH＝6.8-7.0。
(3)发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有发酵培养基的250ml摇瓶中，装液量为20ml/250ml，培养温度为30″C，搅拌转速150-200rpm/min。
由M-1为发酵培养基，对产D-泛酸大肠杆菌进行丝氨酸的单因素优化。设计丝氨酸的浓度梯度为0、20、40、80、100、200、1500mg/L。
M-1培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB12 0.001g/L，VB1 0.001g/L，盐溶液1ml/L，丝氨酸100mg/L，
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO40.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
结果如图1所示。当丝氨酸浓度为0～100mg/L之间时，随着丝氨酸浓度的升高，菌体生物量与D-泛酸产量均略有提高。但高于200mg/L后呈下降趋势。此结果说明丝氨酸的添加确实对D-泛酸的合成有正向影响，但是过高的添加量会抑制菌体生长与D-泛酸的合成来自丝氨酸或甘氨酸的碳单元与四氢叶酸(THF)反应形成亚甲基四氢叶酸(图2为在大肠杆菌中的亚甲基四氢叶酸(“MTHF”)生物合成途径的示意图)。为了进一步提高D-泛酸的合成，在后续的实施例中尝试对丝氨酸或甘氨酸的碳单元与四氢叶酸(THF)模块相关基因进行优化。
产D-泛酸大肠杆菌的最佳丝氨酸添加量为100mg/L。
实施例2：表达质粒ptrc99A-panBCserA的构建
申请人之前的专利技术“CN109868254A”已经证明了D-泛酸途径基因panB与panC基因的增强尤其是过表达对D-泛酸发酵生产的有益作用，以相同的方法在质粒上过表达panB与panC质粒，构建质粒pTrc99A-panBC。在此基础上进行后续步骤。
将来自大肠杆菌K12 W3110的serA基因使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增。PCR引物从serA基因的核苷酸序列开始合成。大肠杆菌K12 MG1655 serA NCBI登录号：EG10944(EcoCyc)
片段F1扩增引物：
serAl：5′-GAATTGTGAGCGGATAACAAATGGCAAAGGTATCGCTGGA-3′，
serA2：5′-GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTAGTACAGCAGACGGGCGC-3′。
pTrc99A-panBC质粒线性化扩增引物：
克隆载体正向扩增：5′-TTTCACACAGGAAACAGACCATG-3′，
克隆载体反向扩增：5′-TTGTTATCCGCTCACAATTCCA-3′。
可以在标准PCR条件下用特异性引物通过Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(Vazyme，中国)进行特异性扩增。然后通过Clean up试剂盒回收DNA片段；按照ClonExpress″(One step clone kit，Vazyme Biot ech，Nanjing，China)说明书将pTrc99A-panBC质粒、片段F1连接在一起，质粒命名为pTrc99A-panBCserA，通过测序验证得到pTrc99A-panBCserA质粒(质粒结构如图3所示)。
实施例3：表达质粒ptrc99A-panBCglyA的构建
申请人之前的专利技术“CN109868254A”已经证明了D-泛酸途径基因panB与panC基因的增强尤其是过表达对对D-泛酸发酵生产的有益作用，以相同的方法在质粒上过表达panB与panC质粒，构建质粒pTrc99ApanBC。在此基础上进行后续步骤。
然后将来自大肠杆菌K12的glyA基因使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增。PCR引物从glyA基因的核苷酸序列开始合成。大肠杆菌K12 MG1655 glyA NCBI登录号：EG10408(EcoCyc).
片段F2扩增引物：
glyAl：5′-TTTCACACAGGAAACAGACCATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTG-3′
glyA2：5′-GTACCGAGCTCGAATTCCATTTATGCGTAAACCGGGTAACG-3′
pTrc99A-panBC质粒线性化扩增引物：
克隆载体正向扩增：5′-ATGGAATTCGAGCTCGGTACCG-3′
克隆载体反向扩增：5′-GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3′
可以在标准PCR条件下用特异性引物通过Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(Vazyme，中国)进行特异性扩增。然后通过Clean up试剂盒回收DNA片段；按照ClonExpress(One step clone kit，Vazyme Biot ech，Nanjing，China)说明书将pTrc99A质粒、片段F2连接在一起，质粒命名为pTrc99A-panBCglyA，通过测序验证得到pTrc99A-panBCglyA质粒(质粒结构如图4所示)。
实施例4：Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCserA菌株的构建
大肠杆菌Escherichia coli ZJB 18003菌株是K12 W3110的敲除了缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸副产物途径的突变体。将质粒pTrc99A-panBCserA转化到Escherichia coliZJB 18003菌株中，并在LB琼脂上中加入20μg/ml卡那霉素选择携带质粒的细胞。获得的菌株命名为Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCserA。其中试验菌株Escherichiacoli ZJB 18003，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏日期：2018年12月21日，保藏编号：CCTCC NO：M2018914。
实施例5：Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCglyA菌株的构建
大肠杆菌Escherichia coli ZJB 18003菌株是K12 W3110的敲除了缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸副产物途径的突变体。将质粒pTrc99A-panBCglyA转化到Escherichia coliZJB 18003菌株中，并在LB琼脂上中加入20μg/ml卡那霉素选择携带质粒的细胞。获得的菌株命名为Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCglyA。
其中试验菌株Escherichia coli ZJB 18003，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072，保藏日期：2018年12月21日，保藏编号：CCTCC NO：M2018914。
实施例6：用Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCserA菌株生产D-泛酸
泛酸的生产大肠杆菌在250ml锥形瓶中以20ml分批培养的形式检查Escherichiacoli ZJB 18003，Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99ApanBC与Escherichia coliZJB18003/pTrc99A-panBCserA菌株。为此，需使用10ml LB培养基作为种子培养基，挑取单个菌落接种，并在恒温震荡培养箱中在37℃和200rpm下孵育12小时。然后按10％接种量将这种预培养物重新接种到20毫升生产培养基中(葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB120.001g/L，VB10.001g/L，盐溶液1ml/L，丝氨酸100mg/L)在30℃下孵育48小时。孵育后，用分光光度计在600nm的测量波长下测量培养物悬浮液的光密度(OD)。
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO40.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
然后通过无菌过滤确定无菌过滤培养上清液中形成的D-泛酸的浓度。D-泛酸含量的HPLC测定：检测方法如下：
色谱条件：C18柱(250X4.6mm，particle size 5μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，CA，USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：18min。
实施例7：用Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCglyA菌株生产D-泛酸
泛酸的生产大肠杆菌在250ml锥形瓶中以20ml分批培养的形式检查Escherichiacoli ZJB 18003，Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99ApanBC与Escherichia coliZJB18003/pTrc99A-panBCglyA菌株。为此，需使用10ml LB培养基作为种子培养基，挑取单个菌落接种，并在恒温震荡培养箱中在37℃和200rpm下孵育12小时。然后按10％接种量将这种预培养物重新接种到20毫升生产培养基中(葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB120.001g/L，VB10.001g/L，盐溶液1ml/L，丝氨酸100mg/L)在30℃下孵育48小时。孵育后，用分光光度计在600nm的测量波长下测量培养物悬浮液的光密度(OD)。
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO40.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
然后通过无菌过滤确定无菌过滤培养上清液中形成的D-泛酸的浓度。D-泛酸含量的HPLC测定：检测方法如下：
色谱条件：C18柱(250X4.6mm，particle size 5μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，CA，USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：18min。
实验结果示于表1。
表1
Figure GDA0003697318770000091
实施例8：一种发酵生产D-泛酸的方法
试验菌株为实施例4中得到的菌株Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCserA。
(1)活化培养：将大肠杆菌接种至平板培养基上，培养箱中30℃活化培养12h，得到活化菌；
平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌，接种至含有10ml种子培养基的试管中进行培养，种子培养的条件为30℃，200r/min摇床培养12h，得到种子液；
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L，pH＝6.8-7.0。
(3)发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有发酵培养基的250ml摇瓶中，装液量为20ml/250ml，培养温度为30″C，搅拌转速150-200rpm/min。
(3)碳源与氮源
以M-1培养基作为基础发酵培养基，用单因素方法分别对碳源、氮源进行筛选定，测定不同的碳源与氮源的的影响；所述的筛选碳源范围为：乳糖、蔗糖、甘油、果糖、山梨醇、葡萄糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇，浓度均为20g/L；所述的筛选氮源范围为：蛋白胨、氯化铵、磷酸氢二胺、硫酸铵、尿素、豆粕、牛肉膏，浓度均为16g/L。
M-1培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB12 0.001g/L，VB1 0.001g/L，盐溶液1ml/L，丝氨酸100mg/L，
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO40.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
由图5与图6可知，最适合用于D-泛酸发酵的碳源与氮源分别是葡萄糖与硫酸铵。
(4)响应面实验
在PB实验与最陡爬坡试验的基础上，以葡萄糖(X1)、β-丙氨酸(X2)、硫酸铵(X3)为3个因素自变量，分别对每个因素选取低、中、高3个水平，大肠杆菌的D-泛酸的产量分别为响应值Y，通过Design-expert软件设计3因素3水平的BOX-Behnken试验。设计的响应面实验方案及其实验结果如表2所示。
表2 BBD实验设计及结果
Figure GDA0003697318770000101
根据响应面设计的实验组进行试验，共设计出17组实验。为确保实验的准确性，同时进行3组平行组对照实验。试验设计和结果如表2所示。
D-泛酸产量响应面分析
经Design expert 8.0.6拟合分析，得到的回归方程为(1)：
Figure GDA0003697318770000102
表3为D-泛酸响应面实验方差分析结果。
表3方差分析
Figure GDA0003697318770000103
Figure GDA0003697318770000111
注：R2＝0.9606，Adequate precision＝12.265*识别的变量对响应有显著影响(p值＜0.05)(p-value＜0.05)。
回归方程中各变量对响应值Y(D-泛酸的产量)影响的显著性由F检验法来判定，概率P越小，则相应变量的显著性越高。由表3可知，当p值小于0.01时，表明实验所设置的模型非常显著；当p值小于0.05时，表明实验所设置的模型比较显著。由表3可知，在所设置的模型中，因素X1(葡萄糖)，X2(β-丙氨酸)，X1 2(葡萄糖2)，X2 2(β-丙氨酸2)对肽转化率影响极显著；因素X1X2(葡萄糖与β-丙氨酸的相互关系)对D-泛酸的产量影响比较显著，R2＝0.9606，说明方程拟合度较好。D-泛酸生产的概率p值为0.0004，这进一步证明了模型项在99％的置信水平上具有统计学意义。确定的比率为9.047，表明信号足够，表明这些模型可用于导航设计空间。预测变量的最佳值如下：葡萄糖，X1＝56.0g/L，β-丙氨酸，X2＝2.25g/L，和硫酸铵，X3＝11.8g/L。根据回归分析结果做响应面如图7A-C所示。从图中可以得到3个因素X1(葡萄糖)，X2(β-丙氨酸)，X3(硫酸铵)对发酵D-泛酸产量均存在极值。
如图7所示，D-泛酸的产生随葡萄糖的增加而增加。在大肠杆菌中，葡萄糖是D-泛酸合成的碳骨架。与低葡萄糖浓度相比，足够的葡萄糖浓度既可以满足细菌的生长，又可以满足D-泛酸的产生，这大大降低了引起葡萄糖饥饿的风险。结果还表明，适当的葡萄糖和β-丙氨酸浓度可提高D-泛酸的产生。表3和图7A，C显示β-丙氨酸浓度和β-丙氨酸与初始葡萄糖之间的相互作用对D-泛酸的产生具有重要影响。因此，为了获得大量的D-泛酸，必须同时将这些因素保持在适当的水平。AcCoA和CoA的反馈会抑制细胞中β-丙氨酸的合成，这可能导致β-丙氨酸在细胞内的可用性不足，有必要添加适量的β-丙氨酸以确保充足的前体供应。但是，β-丙氨酸浓度过高会导致原料浪费并抑制细菌的生长。D-泛酸浓度随葡萄糖或β-丙氨酸浓度的增加而增加，然后在葡萄糖和β-丙氨酸浓度分别为56g/L和2.25g/L时达到峰值，进一步增加后开始降低。
实施例9：一种发酵生产D-泛酸的方法
根据实施例1培养基的配置，优化前的初始培养基配方如下所示：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB12 0.001g/L，VB1 0.001g/L，盐溶液1ml/L，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)0.1mmol/L；其中碳酸钙，VB1，VB12分开灭菌，接种时混入。
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO40.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
优化后的发酵培养基配方如下所示：葡萄糖56g/L，硫酸铵11.8g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB120.001g/L，VB10.001g/L，盐溶液1ml/L，丝氨酸100mg/L，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)0.1mmol/L；其中碳酸钙，VB1，VB12，丝氨酸分开灭菌，接种时混入。
实施例10：摇瓶验证试验
试验菌株为实施例4中得到的菌株Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCserA。
(1)活化培养：将大肠杆菌接种至平板培养基上，培养箱中30℃活化培养12h，得到活化菌；
平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌，接种至含有10ml种子培养基的试管中进行培养，种子培养的条件为30℃，200r/min摇床培养12h，得到种子液；
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L，pH＝6.8-7.0。
(3)发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有初始发酵培养基或优化后的发酵培养基的250ml摇瓶中，装液量为20ml/250ml，培养温度为30″C，搅拌转速150-200rpm/min。每组试验设置3组平行。
结果初始发酵培养基产量3.21g/L±0.10g/L，优化后发发酵培养基产量达到6.73g/L±0.12g/L。
本发明的有益效果：本发明通过以葡萄糖，硫酸铵，酵母提取物，磷酸二氢钾，硫酸镁，β-丙氨酸，碳酸钙，VB12，VB1，盐溶液，丝氨酸，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)为实验辅助材料，以葡萄糖为原材料，通过单因素法和响应面优化法，将实验体系的目标响应值作为实验因素进行记录，利用响应面法拟合的回归方程模型和回执的响应曲面及等高线，可以求出实验因素相应水平的响应值，在此基础上优化最优响应值以及最佳实验条件，提高产D-泛酸重组大肠杆菌发酵产D-泛酸的产量，而响应变量依常规处理，响应面方面并没有进行优化。
实施例11：优化培养基分批补料发酵对D-PA生产的影响
试验菌株为实施例4中得到的菌株Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCserA。
(1)活化培养：将大肠杆菌接种至平板培养基上，培养箱中30℃活化培养12h，得到活化菌；
平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为100mL/500mL，种子培养的条件为30℃，200r/min摇床培养12h，得到种子液；
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L，pH＝6.8-7.0。
(3)发酵培养：按照15％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为2L/5L，培养温度为30℃，初始搅拌转速400rpm/min，维持溶氧值15％，利用生物传感分析仪检测发酵液残糖的含量，每2小时调整一次葡萄糖进料速率，该葡萄糖消耗速率是根据2小时内葡萄糖浓度的变化计算得出的。控制残余葡萄糖浓度为1g/L。结果优化后发酵培养基D-泛酸产量达到16.89g/L±0.12g/L。
实施例12：异亮氨酸添加对D-PA生产的影响
试验菌株为实施例4中得到的菌株Escherichia coli ZJB 18003/pTrc99A-panBCserA。
(1)活化培养：将大肠杆菌接种至平板培养基上，培养箱中30℃活化培养12h，得到活化菌；
平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为100mL/500mL，种子培养的条件为30℃，200r/min摇床培养12h，得到种子液；
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L，pH＝6.8-7.0。
(3)发酵培养：按照15％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为2L/5L，培养温度为30℃，初始搅拌转速400rpm/min，维持溶氧值15％，利用生物传感分析仪检测发酵液残糖的含量，每2小时调整一次葡萄糖进料速率，该葡萄糖消耗速率是根据2小时内葡萄糖浓度的变化计算得出的。控制残余葡萄糖浓度为1g/L。恒速流加异亮氨酸策略：在开始补料后，通过计算机耦合补料泵以10mL/h的喂入速度开始喂入浓异亮氨酸溶液(40g/L)。
发酵培养前后，用高效液相色谱法测定D-泛酸含量；利用生物传感分析仪检测发酵液残糖的含量。结果显示当将异亮氨酸进料速度控制为10mL/h时，最大D-PA产量和D-PA生产率分别为对照组的2.06和1.96倍。并且发酵过程中的葡萄糖消耗增加，同时减少了乙酸的积累，乙酸的累积量从29.79g/L降低到8.55g/L，这使乙酸的累积量降低了71.3％。同时，作为培养基中唯一的碳源，增加的葡萄糖消耗增加了细胞内丙酮酸的利用率。丙酮酸作为D-PA的重要前体直接决定了D-PA的实验产率。这表明该发酵模式更适合于D-PA的生产。
本发明的有益效果：本发明通过以葡萄糖，硫酸铵，酵母提取物，磷酸二氢钾，硫酸镁，β-丙氨酸，碳酸钙，VB12，VB1，盐溶液，丝氨酸，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)为实验辅助材料，以葡萄糖为原材料，通过单因素法和响应面优化法，将实验体系的目标响应值作为实验因素进行记录，利用响应面法拟合的回归方程模型和回执的响应曲面及等高线，可以求出实验因素相应水平的响应值，在此基础上优化最优响应值以及最佳实验条件，提高产D-泛酸重组大肠杆菌发酵产D-泛酸的产量，而响应变量依常规处理，响应面方面并没有进行优化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种用于发酵法生产D-泛酸的菌株及发酵法生产D-泛酸的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
ttaaaaggac tccgcttcgc ctgggaaggt acccgcgtgg atatcagcga tgtaggcctg 60
cgcggcgtcg tgcaaggaat cgcccaaggt ggcgtactcg cggacgaagc gtggcttctt 120
gccgcggttg aggccgaagg catcctgcca caccaaaacc tgcccatctg tgccattgcc 180
ggcaccgatt ccgatagtgg tgatggataa atcctccgta acttcacgcg cggcctctgc 240
cggaaccatc tctagcacaa ccgcaaacgc acccgcctgc tccaccgcgc gggcatcggc 300
gatgagcttt ccagaactcg cgccacgacc ctgaaccacg tggccaccca aagaatgctc 360
ggactgcggg gtgtaaccaa tgtggccgac aaccggaatt ccagcatcaa caatacgacg 420
gatcgtctgc gcgatctcca cgccaccctc gatcttcacc gcagccgcac ccgtttcacg 480
catgattcgg atcgcggact ccaccgcctg atttgggctc acctcatagg taccaaacgg 540
cagatcaacc accacaagcg cacgcttcgt agcgatcgtc accgccttgg ccagcacaat 600
catctcatcc aaggtgatcg acaaggtggt gtcgcggccc aacacaacgt tggcggcgga 660
atcaccaaca aggagcatat cgacgccagc ctcatcaaaa atgcgcgccg aaagcgcatc 720
atagctggtg agaaccgaaa ctttctggcc gtttacttta gcttcgcgga aatgacgggt 780
gcggattttc tttgcatcaa tgcctgacat 810
<210> 2
<211> 840
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
ctagagctcg atattgtcga tcaaccgcac cggtcctacg aaaatcgccg cgactaccaa 60
cgctggttgg gtaagcggtc catcgatttc taatggttcg agggtcgctg gatcgacaat 120
ctccagatga tccaagcgca cgccgtcggc gcaggccaag gtgtcgcgcg caccttggat 180
atctagtgct tcaccagctg cttttcgacg ctgcaaccca ctcaacacct gcggcagcac 240
cagagcttgc gctcgctgat ccgcagaaag acgttggttt ctactagatt cggccaaccc 300
atcagcgcca cgaataatcg gaacggggcg gatctctacg ggaatgtcca gatcagcaac 360
caaacgtcga atcaccgcaa cttgttgagc atccttttgt ccaaaatatg cacgatcagg 420
gcgcaccaaa ttgaacagtt tccccaccac ggtagccaca ccatcgaaat ggccaggcct 480
gctggcacct tccaactttg ttccaatgga accggtgcgc acccacacta gtggcaagcc 540
accggggtac atttcttcca catcgggtgc gaacacaata tccacacctg cctcttcaag 600
cagtgctaaa tcggcgtcga gttggcgggg atagttgcgg taatcatcgc aatcaccgag 660
tgcttcaaac tgcaggggat tgacaaaaat actggctaca acagtgtcgt tttcagcgcg 720
tgctgcttta accaacgagg cgtgtccgct gtgtagcgca cccatggtgg ggacaagccc 780
gacggattcg tggtggagga gggcgtcgat aagcgccttc tttgtggttg ctaactgcat 840
<210> 3
<211> 1233
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60
caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120
gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180
tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240
tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300
gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360
ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420
aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480
catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540
gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600
ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660
atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720
ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780
gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840
ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900
caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960
acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacggtgg gcgtcgtctg 1020
atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080
cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140
attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200
ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233
<210> 4
<211> 1254
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
atgttaaagc gtgaaatgaa cattgccgat tatgatgccg aactgtggca ggctatggag 60
caggaaaaag tacgtcagga agagcacatc gaactgatcg cctccgaaaa ctacaccagc 120
ccgcgcgtaa tgcaggcgca gggttctcag ctgaccaaca aatatgctga aggttatccg 180
ggcaaacgct actacggcgg ttgcgagtat gttgatatcg ttgaacaact ggcgatcgat 240
cgtgcgaaag aactgttcgg cgctgactac gctaacgtcc agccgcactc cggctcccag 300
gctaactttg cggtctacac cgcgctgctg gaaccaggtg ataccgttct gggtatgaac 360
ctggcgcatg gcggtcacct gactcacggt tctccggtta acttctccgg taaactgtac 420
aacatcgttc cttacggtat cgatgctacc ggtcatatcg actacgccga tctggaaaaa 480
caagccaaag aacacaagcc gaaaatgatt atcggtggtt tctctgcata ttccggcgtg 540
gtggactggg cgaaaatgcg tgaaatcgct gacagcatcg gtgcttacct gttcgttgat 600
atggcgcacg ttgcgggcct ggttgctgct ggcgtctacc cgaacccggt tcctcatgct 660
cacgttgtta ctaccaccac tcacaaaacc ctggcgggtc cgcgcggcgg cctgatcctg 720
gcgaaaggtg gtagcgaaga gctgtacaaa aaactgaact ctgccgtttt ccctggtggt 780
cagggcggtc cgttgatgca cgtaatcgcc ggtaaagcgg ttgctctgaa agaagcgatg 840
gagcctgagt tcaaaactta ccagcagcag gtcgctaaaa acgctaaagc gatggtagaa 900
gtgttcctcg agcgcggcta caaagtggtt tccggcggca ctgataacca cctgttcctg 960
gttgatctgg ttgataaaaa cctgaccggt aaagaagcag acgccgctct gggccgtgct 1020
aacatcaccg tcaacaaaaa cagcgtaccg aacgatccga agagcccgtt tgtgacctcc 1080
ggtattcgtg taggtactcc ggcgattacc cgtcgcggct ttaaagaagc cgaagcgaaa 1140
gaactggctg gctggatgtg tgacgtgctg gacagcatca atgatgaagc cgttatcgag 1200
cgcatcaaag gtaaagttct cgacatctgc gcacgttacc cggtttacgc ataa 1254
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattgtgag cggataacaa atggcaaagg tatcgctgga 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtctgtttc ctgtgtgaaa ttagtacagc agacgggcgc 40
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttcacacag gaaacagacc atg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgttatccg ctcacaattc ca 22
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tttcacacag gaaacagacc atgttaaagc gtgaaatgaa cattg 45
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtaccgagct cgaattccat ttatgcgtaa accgggtaac g 41
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggaattcg agctcggtac cg 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtctgtttc ctgtgtgaaa ttgt 24

Claims (3)

1.一种发酵法生产D-泛酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化培养：将大肠杆菌接种至平板培养基上活化培养，得到活化菌；
(2)种子培养：将步骤(1)得到的活化菌接种至种子培养基中进行培养，得到种子液；
(3)发酵培养：按照发酵培养基体积的15％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至发酵培养基中发酵培养生产D-泛酸，初始搅拌转速400rpm/min；维持溶氧值为15％；每2小时调整一次葡萄糖进料速率，控制残余葡萄糖浓度为1g/L；在开始补料葡萄糖后，同时往发酵罐中以10mL/h的喂入速度开始喂入40g/L异亮氨酸溶液；
步骤(1)中所述大肠杆菌为将大肠杆菌serA基因与panB基因、panC基因分别克隆到质粒pTrc99A中获得重组质粒后，将重组质粒转染到保藏号为CCTCC NO：M2018914的大肠杆菌中进行过表达所得，其中，panB基因序列如SEQ ID NO.1所示，panC基因序列如SEQ ID NO.2所示，serA基因序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤(3)中发酵培养基为：葡萄糖56g/L，硫酸铵11.8g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，β-丙氨酸1.5g/L，碳酸钙10g/L，VB12 0.001g/L，VB1 0.001g/L，盐溶液1ml/L，丝氨酸100mg/L，异丙基硫代半乳糖苷0.1mmol/L；
所述盐溶液为：CuCl2 10g/L，FeSO4·7H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO4 0.20g/L，NiCl2·7H2O 0.02g/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平板培养基为：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L，pH＝6.8-7.0。
CN202011015874.6A 2020-09-24 2020-09-24 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法 Active CN112195143B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011015874.6A CN112195143B (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011015874.6A CN112195143B (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112195143A CN112195143A (zh) 2021-01-08
CN112195143B true CN112195143B (zh) 2022-10-14

Family

ID=74016189

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011015874.6A Active CN112195143B (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112195143B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113652383B (zh) * 2021-06-29 2023-08-18 浙江工业大学 一种高产d-泛酸的基因工程菌及其应用
CN114990002B (zh) * 2022-04-11 2023-10-20 浙江工业大学 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法
CN115747268B (zh) * 2022-11-28 2024-03-26 黑龙江新和成生物科技有限公司 D-泛酸的发酵方法
CN116024278B (zh) * 2022-12-16 2024-05-07 黑龙江新和成生物科技有限公司 一种发酵法制备d-泛酸的方法
CN116240253B (zh) * 2023-05-12 2023-07-21 江苏亨瑞生物医药科技有限公司 一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺
CN117327747B (zh) * 2023-12-01 2024-05-03 内蒙古金达威药业有限公司 采用微生物发酵生产d-泛酸的方法
CN117946984A (zh) * 2024-03-26 2024-04-30 内蒙古金达威药业有限公司 泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6682915B2 (en) * 2001-02-13 2004-01-27 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid and/or its salts
CN1571837A (zh) * 2001-01-19 2005-01-26 巴斯福股份公司 用于提高泛酸产量的微生物和方法
CN1809631A (zh) * 2003-06-18 2006-07-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用不能形成芽孢的微生物来生产泛酸盐/酯的方法
CN109868254A (zh) * 2019-03-14 2019-06-11 浙江工业大学 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10128780A1 (de) * 2001-06-13 2002-12-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
US8765426B2 (en) * 2011-04-07 2014-07-01 E I Du Pont De Nemours And Company Pantothenic acid biosynthesis in zymomonas
CN111100834B (zh) * 2019-12-31 2023-03-31 浙江工业大学 一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株
CN111088206A (zh) * 2020-01-07 2020-05-01 江南大学 一种酶法生产d-泛酸的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1571837A (zh) * 2001-01-19 2005-01-26 巴斯福股份公司 用于提高泛酸产量的微生物和方法
US6682915B2 (en) * 2001-02-13 2004-01-27 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid and/or its salts
CN1809631A (zh) * 2003-06-18 2006-07-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用不能形成芽孢的微生物来生产泛酸盐/酯的方法
CN109868254A (zh) * 2019-03-14 2019-06-11 浙江工业大学 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rational design of a Corynebacterium glutamicum pantothenate production strain and its characterization by metabolic flux analysis and genome-wide transcriptional profiling;Andrea et al.;《Appl Environ Microbiol》;20050604;第71卷(第6期);第3255-3268页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112195143A (zh) 2021-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112195143B (zh) 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法
CN109913398B (zh) 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用
JP6961819B2 (ja) Ｌ−リジンを生産する組換え菌、その構築方法およびｌ−リジンの生産方法
CN109868254B (zh) 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN1256314A (zh) 通过在微生物中扩增pand基因制备d-泛酸的发酵方法
CN112625985B (zh) 一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸
CN100543143C (zh) 提高泛酸产量的方法
CN111100834A (zh) 一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株
RU2681475C1 (ru) Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием
CN1128882C (zh) 用肠杆菌科菌株制备d－泛酸的发酵方法
SK30598A3 (en) Process for producing d-pantoic acid and d-pantothenic acid or salts thereof
CN112126662B (zh) 一种发酵生产d-泛酸的方法
CN110205347A (zh) 一种生物催化合成含单甲基半环的烷基吡嗪方法
CN113462630B (zh) 一种高产d-泛酸基因工程菌及其构建与应用
CN105143440B (zh) 具有l-色氨酸生产力的微生物以及使用所述微生物生产l-色氨酸的方法
CN113652383B (zh) 一种高产d-泛酸的基因工程菌及其应用
KR102149044B1 (ko) 2-히드록시 감마 부티로락톤 또는 2,4-디히드록시-부티레이트 의 제조 방법
Zou et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for improved d-pantothenic acid biosynthesis by enhancing NADPH availability
CN117384814A (zh) 一种高产d-泛酸的无质粒基因工程菌及其构建方法与应用
CN110317767B (zh) 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法
CN113462669B (zh) 酮泛解酸羟甲基转移酶突变体、编码基因及其应用
EP4174185A1 (en) Methods for preparing pantoic acid, pantothenic acid and panthenol as well as salts thereof
CN113881611A (zh) 一种提高谷氨酸棒杆菌合成l-谷氨酸产量的方法
CN114350585B (zh) 一种高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法其应用
CN1288061A (zh) 使用棒状细菌发酵制备d－泛酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant