CN1288061A - 使用棒状细菌发酵制备d－泛酸的方法 - Google Patents

使用棒状细菌发酵制备d－泛酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及过发酵棒状细菌制备D－泛酸的方法,其中采用编码丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被扩增,特别是过量表达的细菌。所述方法包括如下步骤:a)发酵至少扩增了编码丙酮酸羧化酶的基因的生产D－泛酸的细菌,b)在培养基或细菌细胞中浓缩D－泛酸,和c)分离所产生的D－泛酸。

Description

使用棒状细菌发酵制备D-泛酸的方法
本发明涉及使用至少扩增了pyc基因的棒状细菌发酵制备D-泛酸的方法。
泛酸是用于化妆品，药品，人类营养和动物营养的商业上重要的维生素。
泛酸可经过化学合成，或经过在合适的营养溶液中发酵合适的微生物经过生物技术来制备。在化学合成中，DL-泛内酯是重要的中间阶段。它在多步过程中从甲醛，异丁醛和氰化物制备。在另外加工步骤中，分离外消旋混合物，将D-泛内酯与β-丙氨酸进行缩合反应，以这种方式获得所需的D-泛酸。
以微生物进行发酵制备的优势在于直接形成所需的立体异构D-型，它游离于L-泛酸。
许多类型的细菌，例如，大肠杆菌，产脲节杆菌，产红棒杆菌，产氨短杆菌，还有酵母，如Debaromyces castellii可在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中产生D-泛酸，如在EP-A0493060中所示。EP-A0493060还表明对于大肠杆菌，经过扩增包含在质粒pFV3和pFV5中的大肠杆菌泛酸生物合成基因可在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中促进D-泛酸的形成。
EP-A0590857和美国专利5518906描述了来自大肠杆菌菌株IFO3547的突变体，例如，FV5714，FV525，FV814，FV521，FV221，FV6051和FV5069，它们携带对各种抗代谢物，例如，水杨酸，α-丁酮酸，β-羟基天冬氨酸，O-甲基苏氨酸和α-酮异戊酸的抗性。它们在含有葡萄糖，和D-泛酸的营养溶液中和在含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中产生泛解酸。在EP-A0590857和美国专利5518906中还表明扩增包含在质粒pFV31中的泛酸生物合成基因后促进上述菌株在含有葡萄糖的营养溶液中产生D-泛解酸和在含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中生产D-泛酸。
本发明人的目的是为用棒状细菌发酵制备泛酸的改进方法提供新的措施。
维生素泛酸是用于化妆品，药品，人类营养和动物营养的商业上重要的产品。对于提供制备泛酸的改进方法普遍感兴趣。
在下文中提到D-泛酸或泛酸或泛酸盐时，不仅指D-泛酸的游离酸，还指其盐，例如，钙，钠，铵或钾盐。
本发明提供了使用棒状细菌发酵制备D-泛酸的方法，其中编码丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被扩增，特别是过量表达。
采用的菌株任选在扩增pyc基因前已能产生D-泛酸。
优选的实施方案参见权利要求书。
本文中术语“扩增”描述了微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性增加，例如，经过增加一个或多个基因的拷贝数，使用有效启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，和任选组合这些方法。
本发明提供的微生物可从葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖浆，淀粉，纤维素或从甘油和乙醇产生D-泛酸。它们是棒状细菌的代表，特别是棒杆菌属。在棒杆菌属中，特别提及的是谷氨酸棒杆菌种，本领域技术人员已知其产生L-氨基酸的能力。
棒杆菌属特别是谷氨酸棒杆菌种中合适的菌株是，例如，已知的野生型菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒状细菌ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒状细菌ATCC13870
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539
黄色短杆菌ATCC14067
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020
和从它们制备的产D-泛酸的突变体。
已发现棒状细菌在过量表达编码丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)的pyc基因后以增加的方式产生泛酸。
pyc基因编码催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)。pyc基因的核苷酸序列在DE-A-19831609中公开并且也被Koffas等(应用微生物学和生物技术50,346-352(1998))和Peters-Wendisch等(微生物学144,915-927(1998))描述。它一般可从国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)核酸序列数据库中以登记号Y09548获得。根据本发明可使用所述参考文献描述的pyc基因。还可使用由于遗传密码的简并性或由于中性功能的有意义突变产生的pye基因的等位基因。
为了实现扩增(例如，过量表达)，例如，可增加相应基因的拷贝数或突变结构基因的启动子和调节区或核糖体结合位点上游。以这种方式作用插入了结构基因上游的表达盒。通过可诱导的启动子，还可增加发酵泛酸形成过程中的表达。通过延长m-RNA寿命的方法同样可提高表达。另外，还可通过防止酶蛋白降解增加酶活性。基因或基因构建体或者以不同的拷贝数存在于质粒中，或者在染色体中整合并扩增。另外，所述基因的过量表达还可通过改变培养基组成和培养方法来实现。
本领域技术人员可在下列文献中发现对本文的说明，特别是在Martin等(生物/技术5,137-146(1987))，Guerrero等(基因138,35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4601893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991))，Reinscheid等(应用和环境微生物学60,126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175,1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本公开说明书JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58,191-195(1998))和在已知的遗传学和分子生物学教科书中。
帮助丙酮酸羧化酶过量表达的质粒的一个例子是质粒pVWExlpyc，它在DE-A-19831609中公开且以起始载体pVWExl为基础。质粒pVWExl含有特别是作为组成成分的质粒pBLl的序列，tac启动子和lacIq等位基因。可以相同的方式使用能在谷氨酸棒杆菌中复制的其它质粒载体，例如，pEKExl(Eikmanns等，基因102：93-98(1991))或pZ8-1(欧洲专利说明书0375889)。
为了生产泛酸，除了编码丙酮酸羧化酶的基因外，扩增，特别是过量表达编码泛酸生物合成途径或酮异戊酸生物合成途径的酶的一个或多个其它基因也具有优势，例如，下列基因：
·编码天冬氨酸脱羧酶的panD基因(Dusch等，应用和环境微生物学65,1530-1539(1999))或
·编码酮泛解酸羟甲基转移酶的panB基因(Sahm等，应用和环境微生物学，65,1973-1979(1999))或
·编码泛酸合成酶的panC基因(Sabm等，应用和环境微生物学，65,1973-1979(1999))或
·编码二羟酸脱水酶的ilvD基因。
除了过量表达丙酮酸脱羧酶外，消除不需要的副反应对于产生泛酸也具有优势(Nakayama：“繁殖产生氨基酸的微生物”，在：微生物产物的过度生产，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编)，英国伦敦学院出版，1982)。
根据本发明制备的微生物可在分批方法(分批培养)或在补料分批(补料方法)或重复补料分批方法(重复补料方法)中连续或不连续培养以生产泛酸。已知培养方法的综述在Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik[生物学方法技术1，生物学方法技术的引言](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或在Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen[生物反应器和外周设备](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中描述。
所用的培养基必须以合适的方式满足特定微生物的需要。对于各种微生物的培养基的描述参见美国细菌学协会的手册“普通细菌学方法手册”(美国华盛顿区，1981)。可使用诸如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖浆，淀粉和纤维素的糖类和碳水化合物，诸如大豆油，葵花籽油，落花生油和椰子油的油和脂肪，诸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸的脂肪酸，诸如甘油和乙醇的醇类和诸如乙酸的有机酸作为碳源。这些物质可单独或作为混合物使用。可使用诸如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素的含有机氮的化合物，或诸如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵的无机化合物作为氮源。氮源可单独或作为混合物使用。可使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。培养基必须还含有为生长所必需的金属盐，例如，硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质外，可采用诸如氨基酸和维生素的必需生长物质。而且可向培养基中添加泛酸的前体，如天冬氨酸，β-丙氨酸，酮异戊酸，酮泛解酸或泛解酸及其任选的盐以进一步增加泛酸产量。上述起始物质可以单批的形式加入培养基中，或可在培养期间以合适的方式添加。
可采用诸如氢氧化钠，氢氧化钾，氨的碱性化合物，或诸如磷酸，硫酸的酸性化合物以合适的方式控制pH值。可采用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的抗泡剂来控制泡沫形成。可向培养基中加入诸如抗生素的具有选择性作用的合适物质以维持质粒的稳定性。为了维持需氧条件，可向培养基中导入氧气或含氧气体混合物，例如，空气。培养温度通常是20℃至45℃，优选25℃至40℃。培养持续到形成最大量的泛酸。通常在10小时至160小时达到该目标。
可用已知的方法测定所形成的泛酸的浓度(Velisek；色谱科学60,515-560(1992))。
下面的微生物根据布达佩斯条约于1999年7月1日保藏在Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ=德意志微生物保藏中心，不伦瑞克，德国)。
谷氨酸棒杆菌DG52-5/pVWExlpyc，保藏号为DSM12893。
实施例
下面借助于实施例更详细地解释本发明。
为达到目的，用异亮氨酸需求型菌株ATCC13032△ilvA进行实验，该菌株根据布达佩斯条约以保藏号DSM12455保藏在DeutscheSammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ=德意志微生物保藏中心，不伦瑞克，德国)。
实施例1
菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc的制备
将质粒pVWExlpyc(DE-A-19831609)电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通讯，123：343-347)进谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032△ilvA并随后在LB-琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190-206)+25μg/ml卡那霉素上选择，获得菌株ATCCl3032△ilvA/pVWExlpyc。
实施例2
泛酸的制备
在补充了25μg/ml卡那霉素和25μg/ml异亮氨酸的培养基CGXII(Keilhauer等，1993，细菌学杂志，175：5595-5603；表4)中检测谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032△ilvA和ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc形成的泛酸。该培养基下文称为谷氨酸棒杆菌检测培养基。在各例中，用相同培养基的16小时预培养物接种50ml新鲜制备的谷氨酸棒杆菌检测培养基使培养开始时培养物悬液的光密度(OD580)为0.1。30℃和175rpm下培养24小时后，测定培养物的光密度(OD580)，然后经过以5000g离心10分钟去掉细胞并对上清液进行无菌过滤。
在580nm的测量波长下测定光密度时采用来自Pharmacia(Freiburg，德国)的NovaspecⅡ光度计。
根据DIFCO手册(DIFCO手册，第10版，第1100-1102页；Michigan，USA)的说明借助于植物乳芽孢杆菌ATCC8014定量培养物上清中的D-泛酸盐。使用Sigma(Deisenhofen，德国)的泛酸全钙盐用于校准。
菌株ATCC13032△ilvA和ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc的泛酸生产结果在表1中概括：
表1
菌株 基因 细胞密度OD580 浓度(ng/ml)
ATCC13032△ilvA - 11.3 3.8
ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc pyc 9.3 8.5
实施例3
质粒pXT-panD的制备
3．1大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XT99A的制备
大肠杆菌表达载体pTRC99A(Amann等，1988，基因69：301-315)用作起始载体用于构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-XT99A。BspHⅠ-限制性裂解(Roche Diagnostics GmbH，Mammheim，德国，产品描述BspHI，产品号1467123)和随后的Klenow(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，产品号27-0928-01；Sambrook等的方法，1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港)处理后用谷氨酸棒杆菌质粒pAGl(GenBank保藏号AF121000)的四环素抗性基因取代氨苄青霉素抗性基因(bla)。为此，将携带抗性基因的区域以AluⅠ片段(AmershamPharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述AluⅠ，产品号27-0884-01)克隆进线型化的大肠杆菌表达载体pTRC99A中。按Sambrook等(1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港)所述进行连接，DNA混合物与T4连接酶(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，产品号27-0870-04)培养过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通讯，123：343-7)进大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant，1990，美国科学院学报，87：4645-4649)。构建的大肠杆菌表达载体称为pXT99A。
质粒pGAl(Sonnen等，1991，基因，107：69-74)用作从谷氨酸棒杆菌克隆最小复制子的基础。经过以BalⅠ/PstⅠ限制性裂解(Promega GmbH，Mannheim，德国，产品描述BalⅠ，产品号R6691；Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述PstⅠ，产品号27-0976-01)载体pGAl，可在用SmaⅠ和PstⅠ(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg，德国，产品描述SmaⅠ，产品号27-0942-02，产品描述PstⅠ，产品号27-0976-01)片段化的载体pK18mob2(Tauch等，1998，微生物学学报169：303-312)中克隆3484bp大小的片段。借助于BamHⅠ/XhoⅠ限制性裂解(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，产品号27-086803，产品描述XhoⅠ，产品号27-0950-01)和随后的Klenow(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，产品号27-0928-01；Sambrook等的方法，1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港)处理，删除839bp大小的片段。经过用T4连接酶(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，产品号27-0870-04)再连接的构建，可在大肠杆菌表达载体pXT99A中以2645bp大小的片段克隆谷氨酸棒杆菌最小复制子。为此，携带最小复制子的DNA构建体用限制性酶KpnⅠ(AmershamPharmacia Biotech,Freiburg，德国，产品描述KpnⅠ，产品号27-0908-01)和PstI(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德国，产品描述PstⅠ，产品号27-0886-03)裂解，然后，借助于Klenow聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，产品号27-0928-01)，进行3’-5’核酸外切酶处理(Sambrook等的方法，1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港)。
在平行的批次中，用限制性酶RsrⅡ(Roche Diagnostics,Mannheim，德国，产品描述RsrⅡ，产品号1292587)裂解大肠杆菌的表达载体pXT99A并用Klenow聚合酶(Amersham PharmaciaBiotech,Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，产品号27-0928-01)进行连接。最小复制子与载体构建体pXT99A的连接按Sambrook等(1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港)所述进行，DNA混合物与T4连接酶(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，产品号27-0870-04)培养过夜。
以这种方式构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-XT99A借助于电穿孔(Liebl等，1989，FEMS微生物通讯，53：299-303)转移进谷氨酸棒杆菌DSM5715。在添加了5mg/l四环素且含有18.5g/l脑心浸液培养基，0.5M山梨糖醇，5g/l细菌用胰蛋白胨，2.5g/l细菌用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l细菌培养用琼脂的LBHIS琼脂上进行转化子的选择。在33℃下培养2天。
用常规方法(Peter-Wendisch等，1998，微生物学，144,915-927)从转化子中分离质粒DNA并用限制性内切酶HindⅢ裂解，随后用琼脂糖凝胶电泳检测质粒。
由此获得的质粒构建体称为pEC-XT99A且在图1中显示。由质粒pEC-XT99A电穿孔进谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715获得的菌株称为DSM5715/pEC-XT99A且根据布达佩斯条约以保藏号DSM12967保藏在Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen undZellkulturen(DSMZ=德意志微生物保藏中心，不伦瑞克，德国)。
3．2质粒pXT-panD的制备
从谷氨酸棒杆菌ATCC13032的泛酸生物合成基因panD的核苷酸序列开始(Dusch等(应用和环境微生物学65(4)，1530-1539(1999))和DE19855313.7)，选择PCR引物使扩增片段含有携带其天然核糖体结合位点的基因。按照厂家说明书将用PCR引物panD-Cg1(5’-CATCTCACGCTATGAATTCT-3’)和panD-Cg2(5’-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3’)扩增的405bp大小的片段连接进载体pCR_2.1(起始TA克隆试剂盒，Invitrogene(Leek,TheNetherlands)，产品描述起始TA克隆_试剂盒，目录号KNM2030-01)，然后转化进大肠杆菌菌株TOP10F(Invitrogen,Groningen,TheNetherlands的目录“Invitrogen 2000”)。经过在含100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的LB-琼脂平板上37℃培养24小时进行转化子的选择。
用常规方法从转化子中分离以这种方式构建的质粒pCR-D2的DNA并用限制性核酸内切酶SacⅠ和XbaⅠ消化，连接进也被裂解过的载体pEC-XT99A中。由于位于panD编码区的第二个XbaⅠ裂解位点在大肠杆菌宿主Top10F中以甲基化形式存在，该裂解位点不被裂解，因此该基因在SacⅠ和XbaⅠ裂解位点的侧翼完整地从质粒pCR-D2中被裂解出来。连接后，混合物电穿孔进大肠杆菌菌株DH5αmcr中。在含有50μg/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上进行选择。分离以这种方式获得的转化子的质粒DNA并用限制性核酸内切酶SacⅠ和XbaⅠ裂解，然后以琼脂糖凝胶电泳检查该片段。以这种方式构建的质粒称为pXT-panD并在图2中表示。
实施例4
泛酸生产菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD的制备
将实施例3中所述的质粒pXT-panD电穿孔进谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc中。在补充了10μg/ml四环素和25μg/ml卡那霉素的LB-琼脂中30℃选择2天后，获得菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD。
实施例5
泛酸的制备
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD和ATCC13032△ilvA/pXT-panD形成的泛酸在补充了10μg/ml四环素，2mM异亮氨酸且对于菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD还添加25μg/ml卡那霉素的培养基CGXII(Keilhauer等，1993，细菌学杂志，175：5595-5603；表2)中检测。
该培养基在下文称为谷氨酸棒杆菌检测培养基。用相同培养基的16小时预培养物接种各50ml新鲜制备的谷氨酸棒杆菌检测培养基使培养开始时培养物悬液的光密度(OD580)为0.1。培养物在30℃和130rpm下培养。培养5小时后，以1mM的终浓度加入IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)。培养48小时后，测定培养物的光密度(OD580)，然后经过以5000g离心10分钟去掉细胞并对上清液进行无菌过滤。
在580nm的测量波长下测定光密度时采用来自Pharmacia(Freiburg，德国)的NovaspecⅡ光度计。
根据DIFCO手册(DIFCO手册，第10版，第1100-1102页；Michigan,USA)的说明借助于植物乳芽孢杆菌ATCC8014定量培养物上清中的D-泛酸盐。使用Sigma(Deisenhofen，德国)的泛酸偏钙盐用于校准。
结果在表3中显示。
表2
物质 每升含量 备注
(NH4)SO2 20g
尿素 5g
KH2PO4 1g
K2HPO4 1g
MgSO4·7H2O 0.25g
MOPS 42g
CaCl2 10mg
FeSO4·7H2O 10mg
MnSO4·H2O 10mg
ZnSO4·7H2O 1mg
CuSO4 0.2mg
NiCl2·6H2O 0.02mg
生物素 0.5mg
葡萄糖 40g 单独高压灭菌
原儿茶酸 0.03mg 过滤灭菌
表3
菌株 基因 细胞密度OD580 浓度(ng/ml)
ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc pyc 17 8.3
ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD pyc,panD 19 172
附上如下附图：
图1：质粒pEC-XT99A的限制性图谱
图2：质粒pXT-panD的限制性图谱
所示的碱基对数字为可重复获得的大约值。
所用的缩写和命名具有如下含义：
′lacZ：lacZα基因片段3’端
lacIq：lac阻遏蛋白基因的lacIq等位基因
lacZ’：lacZα基因片段5’端
oriV：复制原点V
panD：天冬氨酸脱羧酶基因
per：控制拷贝数的基因
ptrc：trc启动子
rep：谷氨酸棒杆菌的复制区
T1：转录终止子T1
T2：转录终止子T2
Tet：四环素抗性基因
BamHⅠ：限制性酶BamHⅠ的裂解位点
DraⅠ：限制性酶DraⅠ的裂解位点
EcoRⅠ：限制性酶EcoRⅠ的裂解位点
EcoRⅤ：限制性酶EcoRⅤ的裂解位点
HindⅢ：限制性酶HindⅢ的裂解位点
KpnⅠ：限制性酶KpnI的Ⅰ裂解位点
NdeⅠ：限制性酶NdeⅠ的裂解位点
NotⅠ：限制性酶NotⅠ的裂解位点
NruⅠ：限制性酶NruⅠ的裂解位点
PstⅠ：限制性酶PstⅠ的裂解位点
SacI：限制性酶SacI的裂解位点
SalⅠ：限制性酶SalⅠ的裂解位点
SmaⅠ：限制性酶SmaⅠ的裂解位点
XbaⅠ**：甲基化的XbaⅠ的裂解位点
XbaⅠ：限制性酶XbaⅠ的裂解位点

Claims (13)

1、经发酵棒状细菌制备D-泛酸的方法，其特征在于采用编码丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被扩增，特别是过量表达的细菌。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于采用还扩增了D-泛酸生物合成途径的其它基因的细菌。
3、根据权利要求1的方法，其特征在于采用至少部分消除了减少D-泛酸形成的代谢途径的细菌。
4、根据上述权利要求中一项或多项的方法，其特征在于采用质粒载体转化的菌株，且该质粒载体携带编码丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。
5、根据权利要求4的方法，其特征在于采用被质粒pVWExlpyc转化的细菌。
6、根据权利要求1的方法，其特征在于同时扩增编码天冬氨酸脱羧酶的panD基因。
7、根据权利要求1的方法，其特征在于同时扩增编码酮泛解酸羟甲基转移酶的panB基因。
8、根据权利要求1的方法，其特征在于同时扩增编码泛酸合成酶的panC基因。
9、根据权利要求1的方法，其特征在于同时扩增编码二羟酸脱水酶的ilvD基因。
10、根据上述权利要求中一项或多项的方法，其特征在于在已经产生D-泛酸的棒状细菌中扩增所述的基因。
11、根据上述权利要求中一项或多项的发酵制备D-泛酸的方法，其特征在于进行如下步骤：
a)发酵至少扩增了编码丙酮酸羧化酶的基因的生产D-泛酸的细菌，
b)在培养基或细菌细胞中浓缩D-泛酸，和
c)分离所产生的D-泛酸。
12、编码丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被扩增，特别是过量表达的棒状细菌。
13、以保藏号DSMl2893保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)的谷氨酸棒杆菌DG52-5/pVWExlpyc。
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