CZ20003156A3 - Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií - Google Patents
Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20003156A3 CZ20003156A3 CZ20003156A CZ20003156A CZ20003156A3 CZ 20003156 A3 CZ20003156 A3 CZ 20003156A3 CZ 20003156 A CZ20003156 A CZ 20003156A CZ 20003156 A CZ20003156 A CZ 20003156A CZ 20003156 A3 CZ20003156 A3 CZ 20003156A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pantothenic acid
- bacteria
- fcfc
- acid
- gene
- Prior art date
Links
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 65
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 10
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 50
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 27
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 23
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 claims description 6
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 5
- 101150076071 panD gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108010005694 Aspartate 4-decarboxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 108010036575 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims 1
- 101150111388 pac gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150081585 panB gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 21
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- -1 fractionose Chemical compound 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N (R)-pantoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(O)=O OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N Isopropylaldehyde Chemical compound CC(C)C=O AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 2
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 101100242684 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) panD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N (R)-pantolactone Chemical compound CC1(C)COC(=O)[C@@H]1O SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKVVTUWHANFMQC-UHFFFAOYSA-N 2-dehydropantoic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(=O)C(O)=O PKVVTUWHANFMQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-YGEXGZRRSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl alpha-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-YGEXGZRRSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- FYCWLJLGIAUCCL-DMTCNVIQSA-N O-methyl-L-threonine Chemical compound CO[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O FYCWLJLGIAUCCL-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 208000025174 PANDAS Diseases 0.000 description 1
- 208000021155 Paediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 241001524178 Paenarthrobacter ureafaciens Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- PLGPSDNOLCVGSS-UHFFFAOYSA-N Tetraphenylcyclopentadienone Chemical compound O=C1C(C=2C=CC=CC=2)=C(C=2C=CC=CC=2)C(C=2C=CC=CC=2)=C1C1=CC=CC=C1 PLGPSDNOLCVGSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008147 nanB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 101150019254 panC gene Proteins 0.000 description 1
- OTOIIPJYVQJATP-UHFFFAOYSA-N pantoic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(O)C(O)=O OTOIIPJYVQJATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SERHXTVXHNVDKA-UHFFFAOYSA-N pantolactone Chemical compound CC1(C)COC(=O)C1O SERHXTVXHNVDKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003551 pantothenate synthetase Proteins 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Popisuje se způsob výroby kyseliny D-pantotenové fermentací
koryneformních bakterií, při kterém se použijí bakterie, ve
kterých se zesílí, zejména nadměrně exprimuje sekvence
nukleotidu (pyc-gen) kódující pyruvátkarboxylázu (ECčíslo6.4.1.1),
přičemž se provádí následující kroky: a)
fermentace bakterií produkujících kyselinu d-pantotenovou, ve
kterých je přinejmenším zesílen gen kódující
pyruvátkarboxylázu, b) obohacení kyseliny D-pantotenové v
médiu nebo v buňkách bakterií a c) izolace produkované
kyseliny D-pantotenové.
Description
Způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenové za použití koryneformních bakterií
Vynález se týká způsobu fermentativní výroby kyseliny D-pantoténové za použití koryneformních bakterií, ve kterých je při nejmenším zesílen pyc-gen.
Dosavadní_stav_techniky
Kyselina pantotenová představuje komerčně významný vitamin, který se používá v kosmetice, lékařství, lidské výživě a v krmivu pro zvířata.
Kyselina pantotenová se může vyrábět chemickou syntézou nebo biotechnicky fermentací vhodných mikroorganismů ve vhodných Živných roztocích. Při chemické syntéze je důležitým mezistupněm DL-pantolakton. Tento se vyrábí několikastupňovým způsobem z formaldehydu, isobutyraldehydu a kyanidu. Při dalších stupních způsobu se racemická směs rozdělí, D-pantolakton se kondenzuje © /b-alaninem a tak se získá požadovaná kyselina pantotenová.
Přednost výroby fermentací mikroorganismů spočívá v přímé tvorbě požadované stereoisomerní D-formy, která neobsahuje kyselinu L-pantotenovou.
Různé druhy bakterií, jako například B. Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes a rovněž kvasinky, jako například B. Debaromyces castellii, mohou jak je to uvedeno v EP-A 0 493 Ο6θ, produ/kovat ,v Živném roztoku, který obsahuje glukózu, kyselinu DL-panto-2 lnovou a 6-alanin, kyselinu D-pantotenovou. EP-A-0 493 060 dále uvádí, že se u Escherichia coli pomocí amplifikace biosyntéznťch genů kyseliny pantotenové z E. coli, které jsou obsaženy na plasmidech pFV3 a pFV5, v Živném roztoku, který obsahuje glukózu, kyselinu DL-pantoinovou a ^>-alanin, zlepší tvorba kyseliny pantotenové.
EP-A- 0 590 857 a US patent 5, 518 906 popisují mutanty odvozené od kmene IF03547 Escherichia coli, jako například FV5714, FV525, FV521, FV221, FV6O51 a FV5O69, které nesou rezistenty vůči různým metabolitům jako například kyselině salicylové, kyselině oó-ketoisovalerové, kyselině ^-hydroxyasparagové, O-methylthreoninu a kyselině oC-ketoisovalerové. Tyto produkují v živém roztoku, který obsahuje glukózu, kyselinu pantoinovou, a v Živném roztoku, obsahujícím glukózu a - alanin. kyselinu D-pantotenovou. V EP-A O 590 857 a v US patentu 5, 518 906 se dále uvádí, Že po amplifikaci biosyntézních genů kyseliny pantotenové, které jsou obsaženy na plasmidu pFV31, se ve shora uvedených kmenech v živných roztocích obsahujících glukózu, zlepší produkce kyseliny D-pantoinové a v živném roztoku, který obsahuje glukózu a -alanin, se zlepší produkce kyseliny D-pantotenové,
Základní úlohou vynálezu je dát k dispozici nové základy pro zlepšený způsob výroby kyseliny pantoténové za využití koryneformních bakterií.
Poústata_v^nálezu
Vitamin kyselina pantotenové představue^komerčně významný produkt, který se používá v kosmetice, lékař* · • · · • · · ·
-3ství, humánní výživě a v krmivech pro zvířata. Všeobecně se přikládá velký význam tomu, aby byl k dispozici zlepšený způsob výroby kyseliny pantotenové,
Jestliže se dále mluví o kyselině D-pantotenové nebo kyselině pantotenové nebo o pantotenátu, jsou tím míněny nejen volné kyseliny, nýbrž i sole kyseliny Dpantotenové, jako například vápenatá sůl, sodná sůl, amonná sůl nebo draselná sůl.
Předmětem vynálezu je způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenové za použití koryneformních bakterií, ve kterých se zesiluje sekvence nukleotidu kódující enzym pyruvatkarboxylázu /EC-číslo 6.4.1.1·/, a zejména se nadměrně exprimuje.
Použité kmeny produkují popřípadě již před zesílením pyc-genu kyselinu D-pantotenovou.
Výhodné formy provedení jsou popsány v nárocích.
Pojem ‘'zesílení popisuje v této souvislosti zvýšení intracelulární aktivity jednoho nebo několika enzymů v mikroorganismu, které se kódují vhodnou DNA, tím žw se například zvýší počet kcúií genu popřípadě genů,použije se silný promotor nebo se použije gen, který kóduje odpovídající enzym vysokou aktivitou a popřípadě kombinuje tato opatření.
Mikroorganismy, které jsou předmětem předloženého vynálezu, mohou kyselinu D-pantotenovou vyrábět z glukózy, sacharózy, laktózy, frůktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy nebo z glycerinu a ethanolu. Jedná se o zástupce koryneformních bakterií, zejména druhu Corynebacterium. U druhu Corynebacterium je třeba uvést především druh Corynebacterium glutamicum, o němž je odbornému světu známo, Že produkuje L-aminokyseliny.
4Vhodné kmeny druhu Corynebacterium , zejména druhu Corynebacterium glutamicum, jsou například známé typy divokých kmenů.
Corynebacterium glutamicum ATCC13O32
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC158O6 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC1387O Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14O67
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vyrobené mutanty produkující kyselinu D-pantotenovou.
Bylo nalezeno, koryneformní bakterie po nadměrné expresi pyc-genu kódujícího pro pyruvatkarboxylázy /ECčíslo 6.4.1.1./ produkují zlepšeným způsobem kyselinu oantotenovou.
Pyc-gen kóduje oro enzym pyruváatkarboxylázu /ECčíslo 6.4.1.1./, který katalyzuje karboxylaci pyruvatu na octan kyseliny oxalové. Sekvence nukleotidu pyc-genu je zveřejněna v DE-A-198 31 609 a byla rovněž popsána Koffas et al. /Applied Microbiology and Biotechnology 50, 346-352 /1998// a Peters-Wendisch et al. /Microbiology 144, 915-927 /1998//. Tato je obecně k dispo zici u Nukleotidsequenzdaten-Bank des National Center for Biotechnology Information /NCBI, Bethesda, MD,USA/ pod accession number Y09548. Pyc-gen popsaný na uvedených místech textu se může používat podle vynálezu. Dále se mohou používat alely pyc-genu, které vyplývají z degenerace genetického kódu nebo se získají z funkčně neutrálních odpovídajících mutací / sense mutation/.
Pro dosažení uesílení / například nadměrnou axpre-5• · · · ··
sí/ se zvýší například počet kopií příslušných genů nebo mutuje region promotoru a regulační region nebo vazební místo místo ribosomů, které se nachází ve směru proti proudu struktury genu. Pomocí indukovatelných promotorů je dále možné zvýšit expresi během fermentační tvorby kyseliny pantotenové. Pomocí opatření sloužících k prodloužení životnosti m-RNA se rovněž zlepší exprese. Dále se zabráněním odbourání proteinu enzymu rovněž zesílí aktivita enzymu. Geny nebo konstrukce genů jsou při tom přítomny bud v plasmidech s různým počtem kopií nebo jsou integrovány v chromosomech a amplifikovány v chromosomech. Alternativně se může dále dosáhnout nadměrné exprese dotyčných genů změnou složení médií a vedením kultivace.
Návody k tomu najde odborník mimo jiné u Martin et al. /Bio/Technology 5, 137-146 /1987//, u Guerrero et al.,/Gene 138, 35-41 /1994/, Tsuchiya a Morinaga /Bio/Technology 6, 428-430 /1988//,, u Eikmanna et al. /Gene 102, 93-98 /1991//, v evropském patentovém spisu EPS 0 472 869, v US patentu 4, 601 893, u Schwarzer a Ptlhler /Bio/Technology 9, 84-87 /1991/, u Reinscheid et al. /Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 /1994/. u Lassarre et al., /Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 /1993/, v patentové přihlášce WO 96/15246, u Malubres et al. /Gene 134, 15-24 /1993/, v japonském zveřejňovacím spisu JP-A-10-229891, u Jensen und Hammer /Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 /1998/ a ve známých učebnicích genetiky a molekulární biologie.
Příklad plasmidu s jehož pomocí se pyruvatkarboxyláza nadměrně exprimuje, je plasmid pVWExlpyc, který • 4· · 4 4 • 4
je zveřejněn v DE-A-198 31 609, a spočívá na výchozím vektoru pVWExl. Plasmid pVWExl obsahuje jako složky mimo jiné sekvence plasmidu pHLl, tac-promotor a lacl^-alelu. Jiné v C. glutamicum replikovatelné vektory plasmidu, jako například pEKExl /Eik manns et al., Gene 102:93-98 /1991/ / nebo pZ8-l evropský patentový spis 0 375 889/, se mohou používat stejným způsobem.
Dále může být pro produkci kyseliny pantotenové výhodné, vedle genu kodukícího pyruvátkarboxylázu, zesilovat nebo zejména nadměrně exprimovat jeden nebo několik genů kódujících biosyntézní cestou enzymy kyseliny pantotenové, jako například panD-gen kódující aspartatdekarboxylázu /Dusch et al., Applied and Environmental Microbiology 65, 1530-1539 /1999/ nebo nanB-gen kódující ketopantoáthydroxymethyltrans ferázu /Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 /1999/ nebo panC-gen kódující pantotenátsynthetasu /Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology 65, 1973-1979 /1999/ nebo ilvD-gen kódující dehydratázu dihydroxykyseliny
Dále může být pro produkci kyseliny pantotenové výhodné, když se vedle nadměrné exprese zabrání průběhu nežádoucích vedlejších reakcí pyruvátkarboxylázy. /Nakayama: ”Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, v : Overprodukction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vaněk /eds./, Academie Press, London, UK, 1982/,
-7·♦ ·· « ♦ · * « · · * • · · · • ♦ · 9 • » · ·
Mikroorganismy vyrobené podle vynálezu se mohou kultivovat kontinuálně nebo diskontinuálně způsobem batoh vsázkové kultivace/ nebo fed batoh /přítokový způsob/ nebo repeated fed batoh způsobem / opakovaný přítokový způsob/ pro produkci kyseliny pantotenové.
Souhrn známých kultivačních metod je v učebnici
Chmiel /Bioprozesstechnik 1. Einfůhrung in die bioverfahrenstechnik /Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991/ nebo v učebnici Storhas /Bioreaktoren und periphere Einrichtungen /Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesenbach, 1994/.
Kultivační médium které se má používat, musí vhodným způsobem odpovídat nárokům stávajících mikroorgamismů.
Popisy kultivačních médií různých mikroorganismů jsou obsaženy v příručce Manual of Methods for General Bacteriology der American Society for Bacteriology/ Washington D.C., USA, 1981/. Jako zdroj uhlíku se mohou používat cukr a uhlohydráty, jako například glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, Škroby a celulóza, oleje a tuky, jako například sojový olej, slunečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej, mastné kyseliny, jako například kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linciová, alkoholy jako například glycerin a ethanol a organické kyseliny jako například kyselina octová. Tyto látky se mohou používat jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroj dusíku se mohou používat organické sloučeniny, obsahující dusík, jako například peptony, extrakt kvasnic, masový extrakt, sladový extrakt, pramenitá vpda z kukuřice, moučka ze sojových bobů a močovina nebo anorganické sloučeniny jako například síran amonný,chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný a dusičnan amonný. Zdroje dusíku ae mohou používat jednotlivé nebo jako směs. Jako ·· 0 0 · 0 « • · 00 ···· ·· • ·
00
-8zdroj fosforu se mohou používat dihydrogenfosforečnan draselný nebo hydrogenfosforečnan dvojdraselný nebo odpovídající sole obsahující sodík.Kultivační médium musí dále obsahovat sole kovů, jako například síran hořečnatý nebo síran železa, které jsou nezbytné pro růst. Konečně se mohou používat esencielní růstové látky, jako aminy a vitaminy přídavně ke shora uvedeným látkám.
Ke.kultivačnímu_médiu se pro další zvýšení produkce kyseliny pantotenové mohou přidávat předstupně kyseliny pantotenové, jako například aspartát, fy -alanin, ketoisovalerát, kyselina ketopantoinová nebo kyselina pantoinová a popřípadě jejich sole. Uvedené přídavné látky se mohou přidávat ke kultuře ve formě jednorázové vsázky nebo se mohou vhodným způsobem přidávat během kultivace.
Pro kontrolu pH kultury se přidávají vhodným způsobem zásadité sloučeniny jako například hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak nebo kyselé sloučeniny jako například kyselina fosforečná nebo kyselina sírová, Pro kontrolu vývoje pěny se mohou přidávat odpěňovací prostředky jako například polyglykolester mastné kyseliny. Pro udržení stability plasmidů se mohou k médiu přidávat vhodné, selektivně účinné látky, například antibiotika. Aby se udržely aerobní podmínkyzavádí se do kultury kyslík nebo plynné směsi, obsahující kyselík, jako například vzduch. Teplota kultury se pohybuje normálně okolo 20 0 až 45 °C a s výhodou okolo 25 °C až 40 °C. V kultivaci se pokračuje tak dlouho dokud se nevytvoří maximum kyseliny pantotenové. Tento cíl se obvykle dosáhne během 10 hodin až 160 hodin.
Koncentrace vytvořené kyseliny pantotenové se může stanovit známými způsoby /Velisek: Chromatographic Scien9ce 60, 515-560 /1992/.
Následující mikroorganismus byl uložen bei der Detschen Sammlung ťíir Mikroorganismen und Zellkulturen /DSMZ, Braunschweig, Deutschland/ podle budapešstké úmluvy 1. července 1999i
Corynebacterium glutamicum DG52-5/pVWExlpyc jako DSM12893.
Předložený vynález je dále blíže vysvětlen pomocí příkladů provedení.
Za tímto účelem byly provedeny pokusy s kmenem ATCC132AilvA chudým na isoleucin, který byl uložen jako DSM12455 bei der Deutschen Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig /Deutschland/ podle budapeštsté úmluvy.
Příklad 1
Výroba kmene ATCCI3O32 ivA/pVWfilpyc
Pomocí elektroporace /Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 1231343-347/ plasmidů pVWExlpyc /DE-A-198 31 609/ do kmene C. glutamicum ATCC13O32Z^ilvA s následující selekcí na LB-agaru /Lennox, 1955, Virology, 1:190-206/ + 25 /Ug/ml kanamycinu se získal kmen ATCC13032tilvA/pVWExlpyc.
Příklad 2
Výroba kyseliny pantotenové
Tvorba pantotenétu pomocí kmenů C.glutamicum ATCC13 032ůilvA a ATCC13032AilvA/pVWExlpyc byla zkoušena v médiu CGXII /Keilhauer et al., 1993, Journal ofBacteriology, 17515595-5603; tabulka 4/, které bylo suplementováno s 2 5/ug/mlkanamycinu a 25/ug/ml isoleucinu. Toto médium se
-10»··· ·· φ * dále označuje jako C. glutamicum testovací médium. Po 50 ml čerstvě nasazeného Ct glutamicum testovacího média b(ylo naočkovánoló hodin starou předkulturou stejného média, tak, aby optická hustot® suspense kultury/o.D.^θθύ byla na začátku inkubaceO,l. Po 24hodinové inkubaci při 30 °C a 175 ot/minbyla určována optická hustota /q»^»^qq/ kultury a nakonec byly buňky odstraněny lOminutovým odstřelováním při 5000 g a přesah byl sterilizován.
Pro stanovení optické hustotyse použil Novaspec II fotometr firmy Pharmacia /Freiburg, Deutschland/ při délce měřených vln 580 nm.
Kvantifikace D-pantotenátu v přesahu kultury se prováděla pomocí Lactobacillus plantarum ATCC 8014 podle údajů v příručce firmy DIFCO /DIFCO MáNUAL, 10th Edition, s. 1100-1102; Michigan, USA/. Pro kalibraci byla použita hemivápenatá sůl pantotenátu firmy Sigma /Deisenhofen, Deutschland/.
Výsledky produkce pantotenátu pomocí kmenů ATCC13032AilvA a ATCC13032úilvA/pVWExlpyc jsou shrnuty v tabulce 1 .
Tabulka 1
| kmen | gen | hustota buněk οΰ^θθ | koncentrace /ng/ml/ | |
| ATCC13032 | ilvA | - | 11,3 | 3,8 |
| ATCC13032 | ilvA/pVWWxlpyc | pyc | 9,3 | 8,5 |
-11♦ *·<** »·- * * · * * * # · ♦ ♦ » * · * · * *
9 9 9 ♦ * · Λ · ♦ ♦ • « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Příklad 3
Výroba plasmidu pXT-panD
3.1 Výroba kolísavého vektoru E. coli-C-glutamicum OEC-XT99A
Jako výchozí vektor pro konstrukci Shuttle-expresního vektoru E. coli-C-glutamicum pEC-XT99A byl použit expresní vektor E.coli pTRC99A /Amann et al., 1988,
Gene 69:301-315/« Po BspHI restrikčním štěpení /Roche Diagnostics GmbH,. Mannheim, Deutschland, Produktionsbeschreibung BspHI, Product No. 1467123/ a následujícím zpracování podle Klenowa /Amersham Pharmacia Biotech Freiburg, Deutschland, Produktionsbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989,- Molecular Cloning:
A laboratory Manual, Cold Spring Harbor/ byl resistentní gen ampicilinu /bia/ vyměněn za tetracyklonový resistentní gen C-glutamicum plasmidu pAGl /GenBank Accession No. AF121000/. Za tím účelem byla oblast nesoucí rezistentní gen jako Alul fragment /Amerham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktionsbeschreibung Alul No. 27-0884-01/ klonována v linearizovaném expresním vektoru E. coli pTRC99A. Ligace byla provedena tak, jak to bylo popsáno Sambrookem et al.,/1989, Moleculac Cloning: A laboratory Manual, Cod Spring Harbor/, přičemž směs DNA s T4-ligázou /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktionsbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04/ byla inkubována přes noc. Tato ligaění směs byla potom elektroporirována do kmene E. coli /Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,87:4645-4649/ /Tauch et al. 1994,FEMS Microbiology Letters, 123:3437/. Zkonstruovaný expresní vektor E. coli byl označen • ··· ·· ·· ·· 99 99
9 9 9 9 9 9 « · 9 · *·ί ϊ · : i »·*· . ί ί ΐ * • 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
-12ρΧΤ99Α.
Jako báze pro klonování minimálního replikonu z Corynebacterium glutamicum se použil plasmid pGAl Sonnen et al., 1991, Gene, 107: 69-74/. BalI/Pstl-restrunkěním štěpením /Promega GbmH, Mannheim, Deutschland,Produktbeschreibung Balí, Produkt No. R6691? Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland Produktbeschreibung Pstl, Produkt No. 27-0976-01/ vektoru pGAl se mohl klonovat 3484 bp velký fragment do vektoru pK18mob2 /Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169:303312/ fragmentováného Smál a Pstl /amarsham Pharmacia Biotech, Freiburg Deutschland, Produktbeschreibung Smál, Produkt No. 27-0942-02, Produktbeschreibung Pátí, Produtet No. 27.0876-01/. Pomocí BamHIPXhoI restrinkčního štěpení /Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt No. 27-0950-01/ a následujícím zpracováním podle Klenowa /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Proďuctbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01/; Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor/se deletoval 839 bp velký fragment. Z konstruktu religovanému T4-ligasou /Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produkt! onsbeschreibung T4-DNA-ligase, Product No. 27-0870-04/ se mohl klonovat C.glutamicum minimální replikon jako 2645 bp velký fragment do expresního vektoru E. coli pXT 99A. Za tím účelem se DNA konstruktu nesoucťcho minimální replikon štěpila restrinkěními enzymy KpnI / Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produkt beschreibung KpnI, Product No. 27-0908-01/ a Pstl /Amarsham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Pstl, Product No, 27-0886-03/ a pfctom se pomocí Klenový
999 9« ♦ · 9
9 9
9 9 9
99
9 9 • 9 9 9
9 99
9 9 9
99
99 « 9 9 9 « · 9 9 • 9 9 9 • 9 9 9
9 9 9
-13polymerázy /Amersham Pharmacia Biotech., Freibunrh,/ Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01/ provedlo zpracování 3- 5- exonukleázou /sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbory/.
V paralelní vsázce byl expresní vektor E. coli nXT 99A rozštěpen restrinkčním enzymem Rsrll / Roche Diagnostice, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung Rsrll, Product No. 1292587 a s Klenovou polymerážou /Amerham Pharmacia Biotech.,Freiburg, Deutschland, Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No, 27-0928-01/ připraven k ligaci. Ligace minimálního replikonu s konstruktem vektoru pXT99A byla provedena , jak je to popsáno Sambrrokem et al., /1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual,
Cold, Spring, Harbor/, přičemž směs DNA a T4-ligasóu /Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA Ligase , Product No. 27-0870-04/ se inkubovala přes noc.
CTakto zkonstruovaný E.coli-^glutamicum Shuttleův expresní vektor pEC-XT99A se transformoval pomocí elektroporace do C-glutamicum DSM5715. Selekce transformantů se prováděla na LBHIS agaru, sestávajícího z 18,5 g/1'.boullionu mozku a srdce, 0,5 M sorbitolu, 5 g/lbacto-tnptonu, 2,5 g/1 bacto-yeset extraktu, 5 g/1 NaCl a 18 g/ϊ bactoagaru, který byl doplněn 5 mgťXtetracyklinu, Inkubace se prováděla dva dny při 33 °C.
Plasmid DNA byl izolován z transformantů obvyklými metodami /Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927/ řezán restrikční endonukleázou HindlII a plasmid byl přezkouěen následující elektroforézou s agarózovým gelem.
-14···· fcfc fcfc ·· fcfc «· • · ♦ ♦ ·♦ · ♦ · fc fc ♦ ·· · fc fcfc fc « « « fc* fc· · * fc* · · fcfc
Takto získaný konstrukt plasmidu byl označen jako pEC-XT99A, a je znázorněn na obr. 1. Kmen, získaný elektroporací plasmidu pEC-XT99A v do kmene Corynebacterium glutamicum DSM5715, ,byl^názván DSM5715/pEC-XT99A a uložen jako DSM12967 >4 bei der Deutschen Sammlung ftlr Mikroorganismen und Zellkulturen /DSMZ, Braunschweig, Deutschland/ podle budapešťské úmluvy.
3,2 Výroba plasmidu pXT-panD
Vycházeje ze sekvencí nukleotidůgenu panD C.glutamicum ATCC13O32 /Dusch et al., /Applied and Environmental Microbiology 65/4/, 1530-1539 /1999/ a DE 1985313.7/ biosyntézy pantotenátu, byly PCR-primery vybrány tak, aby amplifikovaný fragment obsahoval gen s jeho nativními vazebními místy ribosomů. 4Ο5 bp velký fragment amplifikovaný s PCR-primerem panD-Cgl/5'-CATCTCACGTATGAATTCT-37 a oanD-Cg2 /5'-ACGAGGCTTGCAGCAATA-3/ byl v důsledku údajů výrobce ligován vektoru pCRR2.1 /Originál TA Cloning Kit, Invitrogene /Lesk, Niederlande/, Produktbeschreibung Originál TA CloningR Kit, Cat. no KNM2O3O-O1/ a potom transformován do kmene E. coli TOPÍOF7Katalog Invitrogen 2000 firmy Invitrogen, Groningen, Niederlande/. Selekce na transformantech se prováděla inkubací při 37 °C po 24 hodin na LB-agarových deskách se 100 ^ug/mlampicilinu a 40 ug/ml X-Gal /5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fa-D-galaktosid/.
DNA takto zkonstruovaného plasmidu pCR-D2 se izoloval obvyklou metodou z transformantů, byl stráven ekstrinkčními endonukleázami Sací a Xbal a ligován do rovněž rozštěpeného vektoru pEC-XT99A. Vzhledem k tomu, že druhé 2bařezné místo, které leží v panD-kodujícím regionu,, je v ho titeli E. coli \ToplOF přítomno methylované, nerozřízlo se toto Štěpné místo a gen se následovně vyřízl intaktně pomocí bočních Sací a Xbal řezných míst z plasmidu pCR-D2.
···· ·· ·· ·0 ·· «4 • · · · »4 t 0 *9 0 • 00 · 0 0· 0 » « · 0 · 9 8 8 8 9 8 8 9 8 8 · • 0 0 0 · «0 0 0 0 0 0 00 0· 00 ♦ « · 0 » ·
-15Po ligaci se vsázka elektroporovala do kmene E. coli
DH5 rocr. Selekce se prováděla na LB agarových deskách s 50yůg/ml kanamycinu. Plasmid DNA z tokto získaných transformantů se izoloval, štěpil s restrikčními endonukleázami Sací a Xbal a fragmenty byly potom přezkoušeny elektroforézou na agarozovém galu. Takto zkonstruovaný plasmid byl označen jako pXT-panDa je znázorněn na obr. 2.
Příklad 4
Výroba produkcentů kyseliny pantotenové ATCC13O32 ilvA/p VWxlpyc, pXT-oanD
V příkladu 3 popsaný plasmid pXT-panD byl elektroporírován do kmene C. glutamicum ATCC13O32AilvA/pVWxlpyc. Po dvoudenní selekci při 30 °C na LB-agaru, který byl doolněn 10 ^ug/ml tetracyklinu a 25 ;pg/ml kanamycinu, se získal kmen ATCCl-3O32QilvA/pVWExlpyc,pXT-panD.
Příklad 5
Výroba kyseliny pantotenové
Tvorba pantotenátu pomocí kmenů C. glutamicum ATCC13032Ailpyc,pXT-oan-D a ATCC13O32.4ilvA/pXTpanD bylo zkoušeno v médiu CGXTI / Keilhauer et al., 1993,
Journalof Bacteriology, 175:5595-5603, tabulka 2/, které tylo doplněno 10/ag/ml tetracyklinu, 2 mM isoleucinu a v případě kmene ATCC13O32 ilvA/pVWExlpyc,pXTpanD dodatečně 25 /ug/ml kanamycinu.
Toto médium bylo dále označeno jako testovací médium C-glutamicum. Po 50 ml čerstvě nasazenéhotestovacího médiaC. glutamicum bylo naočkováno 16 hodin starou předkulturou stejného média tak, aby optická hustota kultivační suspense /o,D.^g^ byla na začátku inkubace ··
0000 0« • · 0
0 0
0 » 0 « 0 0 0 «0 00
0 0
0
0 0 t «
0«
00
0 0 0
0 0 0
0 « «
0 0 0 «0 0*
-160.1. Kultury byly inkubovány při 30 °C a 130 ot./min. Po pětihodinové inkubaci byl přidán IPTG /isopropyl-$D-thiogalaktosid/ v konečné koncentraci 1 mM. Po 48hodinové inkubaci byla určovány optická hustota /o.D.^qq/ kultury a potom byly buňky odstraněny pomocí lOtiminutové inkubace při 5000 g a přesah byl sterilizován.
Pro stanovení optické hustoty byl použit Novaspec II fotometr firmy Pharmacia / Freiburg, Deutschland / při délce měřených vln 580 nm.
Kvantifikace D-pantotenátu v kultivačním přesahu se prováděla pomocí Lactobacillus plantarum ATCC 8014 podle údajů v příručce firmy DIFCO /DIFCO MANUAL, 10^ Edition, s. 1100-1102; Michigan, USA/. Pro kalibraci by la použita hemivápenatá sůl pantotenátu firmy Sigma /Deisénhofen, Deutschland/.
Výsledek je znázorněn v tabulce 3.
···· ·· • fr • · • fr frfr fr· frfr fr frfrfrfr ···· • frfr·· frfrfr·
| • frfr frfr frfr | frfrfr • fr | • fr frfr·· ·· frfr frfr | |
| -17- | |||
| Tabulka 2 | |||
| látka | množství na litr | poznámka | |
| /nh4/2so2 | 20 g | ||
| močovina | 5 g | ||
| KHoP0. 2 4 | 1 g | ||
| KoHP0. 2 4 | 1 g | ||
| MgSO4 x 7 H2O | 0,25 g | ||
| MOPS | 42 g | ||
| CaCl2 | 10 mg | ||
| FeSO4 x 7 H20 | 10 mg | ||
| MnSO4 x H2O | 10 mg | ||
| ZnSO4 x 7 H2O | 1 mg | ||
| CuSO4 | 0,2 mg | ||
| NiCl2 x 6 H20 | 0,02 mg | ||
| biotin | 0,5 mg | ||
| glukóza | 40 g | autoklávováno odděleně | |
| kyselina protokatechová | 0,03 mg | sterilizováno | |
| Tabulka 3 | |||
| kmen | gen | hustota koncentrace | |
| buňky | oD580 | ||
| ATCC13O32 ilvA/pVWxlpyc | pyc | 17 | θ,3 |
| ATCC13O32 ilvA/pVWSxlpy< | 2 pyc | 19 | 172 |
| pxT-panD | panD |
···· φφ φ» φ · φφ φφ φ* · · φφ φ · φφ φ • ΦΦ φφφφ φφφ φ φφ φφφ φφ φφφ φφ φ • φφφ φ φ · φ φφφφ ♦ « φφ φφ φφ ·· φφ
-18?ÍÉhled_obrázků_na_výkrese
Jsou připojeny následující obr.:
obr. 1; restrikční karta plasmidu pEC-XT99A obr. 2: restrikční karta plasmidu pXT-panD
U údajů párových čísel bází se jedná o přibližné hodnoty, které se získají v rámci reprodukovatelnosti.
Použité zkratky a označení mají básledující význam:
| 'lacZ | 3z-termin fragmentu genu lacZN |
| laclq: | Laclq alela lac represního orgánu |
| 1 ac Zz: | 5z-termin lacZsl· fragmentu genu |
| oriV: | původ replikace V |
| panD: | gen aspartatdekarboxylázy |
| per: | gen pro kontrolu počtu kopií |
| Ptrc: | trc-promotor |
| rep: | replikační region pro C. glutamicum |
| Tl: | transkripční terminátor Tl |
| T2: | transkripční terminátor T2 |
| Tet: | rezistentní gen tetracyklinu |
| BamHI: | řezné místo restrikčního enzymu BamHI |
| Dral: | řezné místo restrikčního enzymu Dral |
| EcoRI: | řezné místo restrikčního enzymu EcoRI |
| Ec oRV: | řezné místo restrikčního enzymu EcoRV |
·»*· 44 • 4 44 ·* ·*
4 * 44 4 4 4 4 4
4 4 4 4 44 4 4 4 4
4*4 44 444 4 4 4 • 44 4 4 4« 4 4 4 4 4
4« 44 44 4· 44
| HindlII: | řezné místo restrikčního HindlII | enzymu |
| KpnI: | řezné místo restrikčního | enzymu KpnI |
| Ndel: | řezné místo restrikčního | enzymu Hdel |
| Notl: | řezné místo restrikčního | enzymu Notl |
| Nrulí | řezné místo restrikčního | enzymu Nrul |
| Pátí: | režné místo restrikčního | enzymu Pátí |
| Sací: | řezné místo restrikčního | enzymu Sací |
| Sáli: | řezné místo restrikčního | enzymu Sáli |
| Smál: Xbal** | řezné místo restrikčního enzymu Smál methylované řezné místo Xbal | |
| Xbal: | řezné místo restrikčního | enzymu Xbal |
·· ··
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenovéza použití koryneformních bakterií, vyznačuj íc í se t í m, že se použijí bakterie, ve kterých se zesílí sekvence nukleotidu /pyc-gen/, kódující pyruvátkarboxylázu /EC-číslo 6.4.1.1./, a zejména se nadměrně exprimuje.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použijí bakterie, ve kterých se dále zesílí další geny cesty biosyntšzy kyseliny D-pantotenové.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použijí bakterie, ve kterých jsou při nejmenším částečně vyřazeny cesty látkové výměny, které zmenšuje tvorba kyseliny D-pantotenové.
- 4. Zoůsob podle jednoho nebo několika předcházejících nároků, vyznačující se tím, Že se použije kmen transformovaný vektorem plasmidu, a vektor plasmidu nese sekvenci nukleotidu kódující pyruvátkarboxylázu.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se použijí bakterie transformované plasmidem pVWExlpyc.
- 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se současně zesílí panD-gen kódující aspartátdekarboxylázu.
- 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se současně zesílí panB-genkodující ketopantoáthydroxymethyltransferázu.-21•••fc fcfc fc · • fc • fc fcfc • fcfc · • fc fcfc fc fcfc « fc* fcfc fc « ► fcfc « • fc fcfc
- 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se současně zesílí paC-gen kódující pantotenátsyntetážu.
- 9. Způsob nodle nároku 1,vyznačující s tím, že se současně zesíli ilvD-gen kódující dehydratázu dihydroxykyseliny.
- 10. Způsob podle jednoho nebo několika předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se uvedené geny zesílí v koryneformních bakteriích, které již produkují kyselinu D-pantotenovou.
- 11. Způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenové podle jednoho nebo několika předcházejících nároků, vyznačující se tím, Že se provedou následující kroky:a/ fermentace bakterií produkujících kyselinu D-pan totenovou, ve kterých se při nejmenším zesílí gen kódující pyruvatkarboxylázu, b/ obohacení kyseliny D-pantotenové v médiu nebo v buňkách bakterií a c/ izolace produkované kyselinyD-pantotenové.
- 12. Koryneformní bakterie, ve kterých jsou zesíleny zejména nadměrně exprimovány sekvence nukleotidu /pycgen/ kódující pyruvatkarboxylázu /EC-číslo 6.4.1.1./.
- 13« Corynebacterium glutamicum DG 52-5/pVWExlpyc uložené pod číslem DSM 12893 u DSMZ, Braunschweig.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20003156A CZ20003156A3 (cs) | 2000-08-30 | 2000-08-30 | Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20003156A CZ20003156A3 (cs) | 2000-08-30 | 2000-08-30 | Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20003156A3 true CZ20003156A3 (cs) | 2001-03-14 |
Family
ID=5471764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20003156A CZ20003156A3 (cs) | 2000-08-30 | 2000-08-30 | Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ20003156A3 (cs) |
-
2000
- 2000-08-30 CZ CZ20003156A patent/CZ20003156A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102471758B (zh) | 利用具有来源于外源物种的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的棒状杆菌属生产l-赖氨酸的方法 | |
| US6355454B1 (en) | Process for the fermentative production of L-amino acids using coryneform bacteria | |
| SK163399A3 (en) | Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms | |
| DE10031999A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien | |
| SK285870B6 (sk) | Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu a transformovaný mikroorganizmus | |
| AU770187B2 (en) | Process for the fermentative production of L-amino Acids using coryneform bacteria | |
| US20100151449A1 (en) | Method for poduction of l-amino acids by fermentation | |
| HUP0002584A2 (en) | Coryneform bacteria producing l-lysine and process for producing l-lysine | |
| EP1320586B1 (en) | Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria | |
| US6911329B2 (en) | Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria | |
| JP2000270888A (ja) | Ｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| SK13202000A3 (sk) | Spôsob fermentatívnej výroby kyseliny d-pantoténovej za použitia koryneformných baktérií | |
| US6379934B1 (en) | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using coryneform bacteria | |
| US20020028490A1 (en) | Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria | |
| CZ20003156A3 (cs) | Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií | |
| US6667166B2 (en) | Processes for preparing D-pantothenic acid using coryneform bacteria | |
| US20020042104A1 (en) | Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria | |
| US20020076770A1 (en) | Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria | |
| US20020176884A1 (en) | Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid and/or salts thereof | |
| CZ428199A3 (cs) | Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech | |
| CZ427799A3 (cs) | Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriacae | |
| MXPA00001638A (en) | Process for the fermentative production of l-amino acids using coryneform bacteria | |
| MXPA00004870A (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids using coryneform bacteria | |
| CZ428299A3 (cs) | Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií |