CZ20003156A3 - Způsob fermentativní výroby kyseliny Dpantotenové za použití koryneformních bakterií - Google Patents

Abstract

Popisuje se způsob výroby kyseliny D-pantotenové fermentací koryneformních bakterií, při kterém se použijí bakterie, ve kterých se zesílí, zejména nadměrně exprimuje sekvence nukleotidu (pyc-gen) kódující pyruvátkarboxylázu (ECčíslo6.4.1.1), přičemž se provádí následující kroky: a) fermentace bakterií produkujících kyselinu d-pantotenovou, ve kterých je přinejmenším zesílen gen kódující pyruvátkarboxylázu, b) obohacení kyseliny D-pantotenové v médiu nebo v buňkách bakterií a c) izolace produkované kyseliny D-pantotenové.

Description

Způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenové za použití koryneformních bakterií

Vynález se týká způsobu fermentativní výroby kyseliny D-pantoténové za použití koryneformních bakterií, ve kterých je při nejmenším zesílen pyc-gen.

Dosavadní_stav_techniky

Kyselina pantotenová představuje komerčně významný vitamin, který se používá v kosmetice, lékařství, lidské výživě a v krmivu pro zvířata.

Kyselina pantotenová se může vyrábět chemickou syntézou nebo biotechnicky fermentací vhodných mikroorganismů ve vhodných Živných roztocích. Při chemické syntéze je důležitým mezistupněm DL-pantolakton. Tento se vyrábí několikastupňovým způsobem z formaldehydu, isobutyraldehydu a kyanidu. Při dalších stupních způsobu se racemická směs rozdělí, D-pantolakton se kondenzuje © /b-alaninem a tak se získá požadovaná kyselina pantotenová.

Přednost výroby fermentací mikroorganismů spočívá v přímé tvorbě požadované stereoisomerní D-formy, která neobsahuje kyselinu L-pantotenovou.

Různé druhy bakterií, jako například B. Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes a rovněž kvasinky, jako například B. Debaromyces castellii, mohou jak je to uvedeno v EP-A 0 493 Ο6θ, produ/kovat ,v Živném roztoku, který obsahuje glukózu, kyselinu DL-panto-2 lnovou a 6-alanin, kyselinu D-pantotenovou. EP-A-0 493 060 dále uvádí, že se u Escherichia coli pomocí amplifikace biosyntéznťch genů kyseliny pantotenové z E. coli, které jsou obsaženy na plasmidech pFV3 a pFV5, v Živném roztoku, který obsahuje glukózu, kyselinu DL-pantoinovou a ^>-alanin, zlepší tvorba kyseliny pantotenové.

EP-A- 0 590 857 a US patent 5, 518 906 popisují mutanty odvozené od kmene IF03547 Escherichia coli, jako například FV5714, FV525, FV521, FV221, FV6O51 a FV5O69, které nesou rezistenty vůči různým metabolitům jako například kyselině salicylové, kyselině oó-ketoisovalerové, kyselině ^-hydroxyasparagové, O-methylthreoninu a kyselině oC-ketoisovalerové. Tyto produkují v živém roztoku, který obsahuje glukózu, kyselinu pantoinovou, a v Živném roztoku, obsahujícím glukózu a - alanin. kyselinu D-pantotenovou. V EP-A O 590 857 a v US patentu 5, 518 906 se dále uvádí, Že po amplifikaci biosyntézních genů kyseliny pantotenové, které jsou obsaženy na plasmidu pFV31, se ve shora uvedených kmenech v živných roztocích obsahujících glukózu, zlepší produkce kyseliny D-pantoinové a v živném roztoku, který obsahuje glukózu a -alanin, se zlepší produkce kyseliny D-pantotenové,

Základní úlohou vynálezu je dát k dispozici nové základy pro zlepšený způsob výroby kyseliny pantoténové za využití koryneformních bakterií.

Poústata_v^nálezu

Vitamin kyselina pantotenové představue^komerčně významný produkt, který se používá v kosmetice, lékař* · • · · • · · ·

-3ství, humánní výživě a v krmivech pro zvířata. Všeobecně se přikládá velký význam tomu, aby byl k dispozici zlepšený způsob výroby kyseliny pantotenové,

Jestliže se dále mluví o kyselině D-pantotenové nebo kyselině pantotenové nebo o pantotenátu, jsou tím míněny nejen volné kyseliny, nýbrž i sole kyseliny Dpantotenové, jako například vápenatá sůl, sodná sůl, amonná sůl nebo draselná sůl.

Předmětem vynálezu je způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenové za použití koryneformních bakterií, ve kterých se zesiluje sekvence nukleotidu kódující enzym pyruvatkarboxylázu /EC-číslo 6.4.1.1·/, a zejména se nadměrně exprimuje.

Použité kmeny produkují popřípadě již před zesílením pyc-genu kyselinu D-pantotenovou.

Výhodné formy provedení jsou popsány v nárocích.

Pojem ‘'zesílení popisuje v této souvislosti zvýšení intracelulární aktivity jednoho nebo několika enzymů v mikroorganismu, které se kódují vhodnou DNA, tím žw se například zvýší počet kcúií genu popřípadě genů,použije se silný promotor nebo se použije gen, který kóduje odpovídající enzym vysokou aktivitou a popřípadě kombinuje tato opatření.

Mikroorganismy, které jsou předmětem předloženého vynálezu, mohou kyselinu D-pantotenovou vyrábět z glukózy, sacharózy, laktózy, frůktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy nebo z glycerinu a ethanolu. Jedná se o zástupce koryneformních bakterií, zejména druhu Corynebacterium. U druhu Corynebacterium je třeba uvést především druh Corynebacterium glutamicum, o němž je odbornému světu známo, Že produkuje L-aminokyseliny.

4Vhodné kmeny druhu Corynebacterium , zejména druhu Corynebacterium glutamicum, jsou například známé typy divokých kmenů.

Corynebacterium glutamicum ATCC13O32

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC158O6 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC1387O Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14O67

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vyrobené mutanty produkující kyselinu D-pantotenovou.

Bylo nalezeno, koryneformní bakterie po nadměrné expresi pyc-genu kódujícího pro pyruvatkarboxylázy /ECčíslo 6.4.1.1./ produkují zlepšeným způsobem kyselinu oantotenovou.

Pyc-gen kóduje oro enzym pyruváatkarboxylázu /ECčíslo 6.4.1.1./, který katalyzuje karboxylaci pyruvatu na octan kyseliny oxalové. Sekvence nukleotidu pyc-genu je zveřejněna v DE-A-198 31 609 a byla rovněž popsána Koffas et al. /Applied Microbiology and Biotechnology 50, 346-352 /1998// a Peters-Wendisch et al. /Microbiology 144, 915-927 /1998//. Tato je obecně k dispo zici u Nukleotidsequenzdaten-Bank des National Center for Biotechnology Information /NCBI, Bethesda, MD,USA/ pod accession number Y09548. Pyc-gen popsaný na uvedených místech textu se může používat podle vynálezu. Dále se mohou používat alely pyc-genu, které vyplývají z degenerace genetického kódu nebo se získají z funkčně neutrálních odpovídajících mutací / sense mutation/.

Pro dosažení uesílení / například nadměrnou axpre-5• · · · ··

sí/ se zvýší například počet kopií příslušných genů nebo mutuje region promotoru a regulační region nebo vazební místo místo ribosomů, které se nachází ve směru proti proudu struktury genu. Pomocí indukovatelných promotorů je dále možné zvýšit expresi během fermentační tvorby kyseliny pantotenové. Pomocí opatření sloužících k prodloužení životnosti m-RNA se rovněž zlepší exprese. Dále se zabráněním odbourání proteinu enzymu rovněž zesílí aktivita enzymu. Geny nebo konstrukce genů jsou při tom přítomny bud v plasmidech s různým počtem kopií nebo jsou integrovány v chromosomech a amplifikovány v chromosomech. Alternativně se může dále dosáhnout nadměrné exprese dotyčných genů změnou složení médií a vedením kultivace.

Návody k tomu najde odborník mimo jiné u Martin et al. /Bio/Technology 5, 137-146 /1987//, u Guerrero et al.,/Gene 138, 35-41 /1994/, Tsuchiya a Morinaga /Bio/Technology 6, 428-430 /1988//,, u Eikmanna et al. /Gene 102, 93-98 /1991//, v evropském patentovém spisu EPS 0 472 869, v US patentu 4, 601 893, u Schwarzer a Ptlhler /Bio/Technology 9, 84-87 /1991/, u Reinscheid et al. /Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 /1994/. u Lassarre et al., /Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 /1993/, v patentové přihlášce WO 96/15246, u Malubres et al. /Gene 134, 15-24 /1993/, v japonském zveřejňovacím spisu JP-A-10-229891, u Jensen und Hammer /Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 /1998/ a ve známých učebnicích genetiky a molekulární biologie.

Příklad plasmidu s jehož pomocí se pyruvatkarboxyláza nadměrně exprimuje, je plasmid pVWExlpyc, který • 4· · 4 4 • 4

je zveřejněn v DE-A-198 31 609, a spočívá na výchozím vektoru pVWExl. Plasmid pVWExl obsahuje jako složky mimo jiné sekvence plasmidu pHLl, tac-promotor a lacl^-alelu. Jiné v C. glutamicum replikovatelné vektory plasmidu, jako například pEKExl /Eik manns et al., Gene 102:93-98 /1991/ / nebo pZ8-l evropský patentový spis 0 375 889/, se mohou používat stejným způsobem.

Dále může být pro produkci kyseliny pantotenové výhodné, vedle genu kodukícího pyruvátkarboxylázu, zesilovat nebo zejména nadměrně exprimovat jeden nebo několik genů kódujících biosyntézní cestou enzymy kyseliny pantotenové, jako například panD-gen kódující aspartatdekarboxylázu /Dusch et al., Applied and Environmental Microbiology 65, 1530-1539 /1999/ nebo nanB-gen kódující ketopantoáthydroxymethyltrans ferázu /Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 /1999/ nebo panC-gen kódující pantotenátsynthetasu /Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology 65, 1973-1979 /1999/ nebo ilvD-gen kódující dehydratázu dihydroxykyseliny

Dále může být pro produkci kyseliny pantotenové výhodné, když se vedle nadměrné exprese zabrání průběhu nežádoucích vedlejších reakcí pyruvátkarboxylázy. /Nakayama: ”Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, v : Overprodukction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vaněk /eds./, Academie Press, London, UK, 1982/,

-7·♦ ·· « ♦ · * « · · * • · · · • ♦ · 9 • » · ·

Mikroorganismy vyrobené podle vynálezu se mohou kultivovat kontinuálně nebo diskontinuálně způsobem batoh vsázkové kultivace/ nebo fed batoh /přítokový způsob/ nebo repeated fed batoh způsobem / opakovaný přítokový způsob/ pro produkci kyseliny pantotenové.

Souhrn známých kultivačních metod je v učebnici

Chmiel /Bioprozesstechnik 1. Einfůhrung in die bioverfahrenstechnik /Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991/ nebo v učebnici Storhas /Bioreaktoren und periphere Einrichtungen /Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesenbach, 1994/.

Kultivační médium které se má používat, musí vhodným způsobem odpovídat nárokům stávajících mikroorgamismů.

Popisy kultivačních médií různých mikroorganismů jsou obsaženy v příručce Manual of Methods for General Bacteriology der American Society for Bacteriology/ Washington D.C., USA, 1981/. Jako zdroj uhlíku se mohou používat cukr a uhlohydráty, jako například glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, Škroby a celulóza, oleje a tuky, jako například sojový olej, slunečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej, mastné kyseliny, jako například kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linciová, alkoholy jako například glycerin a ethanol a organické kyseliny jako například kyselina octová. Tyto látky se mohou používat jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroj dusíku se mohou používat organické sloučeniny, obsahující dusík, jako například peptony, extrakt kvasnic, masový extrakt, sladový extrakt, pramenitá vpda z kukuřice, moučka ze sojových bobů a močovina nebo anorganické sloučeniny jako například síran amonný,chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný a dusičnan amonný. Zdroje dusíku ae mohou používat jednotlivé nebo jako směs. Jako ·· 0 0 · 0 « • · 00 ···· ·· • ·

00

-8zdroj fosforu se mohou používat dihydrogenfosforečnan draselný nebo hydrogenfosforečnan dvojdraselný nebo odpovídající sole obsahující sodík.Kultivační médium musí dále obsahovat sole kovů, jako například síran hořečnatý nebo síran železa, které jsou nezbytné pro růst. Konečně se mohou používat esencielní růstové látky, jako aminy a vitaminy přídavně ke shora uvedeným látkám.

Ke.kultivačnímu_médiu se pro další zvýšení produkce kyseliny pantotenové mohou přidávat předstupně kyseliny pantotenové, jako například aspartát, fy -alanin, ketoisovalerát, kyselina ketopantoinová nebo kyselina pantoinová a popřípadě jejich sole. Uvedené přídavné látky se mohou přidávat ke kultuře ve formě jednorázové vsázky nebo se mohou vhodným způsobem přidávat během kultivace.

Pro kontrolu pH kultury se přidávají vhodným způsobem zásadité sloučeniny jako například hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak nebo kyselé sloučeniny jako například kyselina fosforečná nebo kyselina sírová, Pro kontrolu vývoje pěny se mohou přidávat odpěňovací prostředky jako například polyglykolester mastné kyseliny. Pro udržení stability plasmidů se mohou k médiu přidávat vhodné, selektivně účinné látky, například antibiotika. Aby se udržely aerobní podmínkyzavádí se do kultury kyslík nebo plynné směsi, obsahující kyselík, jako například vzduch. Teplota kultury se pohybuje normálně okolo 20 ⁰ až 45 °C a s výhodou okolo 25 °C až 40 °C. V kultivaci se pokračuje tak dlouho dokud se nevytvoří maximum kyseliny pantotenové. Tento cíl se obvykle dosáhne během 10 hodin až 160 hodin.

Koncentrace vytvořené kyseliny pantotenové se může stanovit známými způsoby /Velisek: Chromatographic Scien9ce 60, 515-560 /1992/.

Následující mikroorganismus byl uložen bei der Detschen Sammlung ťíir Mikroorganismen und Zellkulturen /DSMZ, Braunschweig, Deutschland/ podle budapešstké úmluvy 1. července 1999i

Corynebacterium glutamicum DG52-5/pVWExlpyc jako DSM12893.

Předložený vynález je dále blíže vysvětlen pomocí příkladů provedení.

Za tímto účelem byly provedeny pokusy s kmenem ATCC132AilvA chudým na isoleucin, který byl uložen jako DSM12455 bei der Deutschen Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig /Deutschland/ podle budapeštsté úmluvy.

Příklad 1

Výroba kmene ATCCI3O32 ivA/pVWfilpyc

Pomocí elektroporace /Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 1231343-347/ plasmidů pVWExlpyc /DE-A-198 31 609/ do kmene C. glutamicum ATCC13O32Z^ilvA s následující selekcí na LB-agaru /Lennox, 1955, Virology, 1:190-206/ + 25 /Ug/ml kanamycinu se získal kmen ATCC13032tilvA/pVWExlpyc.

Příklad 2

Výroba kyseliny pantotenové

Tvorba pantotenétu pomocí kmenů C.glutamicum ATCC13 032ůilvA a ATCC13032AilvA/pVWExlpyc byla zkoušena v médiu CGXII /Keilhauer et al., 1993, Journal ofBacteriology, 17515595-5603; tabulka 4/, které bylo suplementováno s 2 5/ug/mlkanamycinu a 25/ug/ml isoleucinu. Toto médium se

-10»··· ·· φ * dále označuje jako C. glutamicum testovací médium. Po 50 ml čerstvě nasazeného Ct glutamicum testovacího média b(ylo naočkovánoló hodin starou předkulturou stejného média, tak, aby optická hustot® suspense kultury/o.D.^θθύ byla na začátku inkubaceO,l. Po 24hodinové inkubaci při 30 °C a 175 ot/minbyla určována optická hustota /^q»^»^qq/ kultury a nakonec byly buňky odstraněny lOminutovým odstřelováním při 5000 g a přesah byl sterilizován.

Pro stanovení optické hustotyse použil Novaspec II fotometr firmy Pharmacia /Freiburg, Deutschland/ při délce měřených vln 580 nm.

Kvantifikace D-pantotenátu v přesahu kultury se prováděla pomocí Lactobacillus plantarum ATCC 8014 podle údajů v příručce firmy DIFCO /DIFCO MáNUAL, 10^th Edition, s. 1100-1102; Michigan, USA/. Pro kalibraci byla použita hemivápenatá sůl pantotenátu firmy Sigma /Deisenhofen, Deutschland/.

Výsledky produkce pantotenátu pomocí kmenů ATCC13032AilvA a ATCC13032úilvA/pVWExlpyc jsou shrnuty v tabulce 1 .

Tabulka 1

	kmen	gen	hustota buněk οΰ^θθ	koncentrace /ng/ml/
ATCC13032	ilvA	-	11,3	3,8
ATCC13032	ilvA/pVWWxlpyc	pyc	9,3	8,5

-11♦ *·<** »·- * * · * * * # · ♦ ♦ » * · * · * *

9 9 9 ♦ * · Λ · ♦ ♦ • « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Příklad 3

Výroba plasmidu pXT-panD

3.1 Výroba kolísavého vektoru E. coli-C-glutamicum OEC-XT99A

Jako výchozí vektor pro konstrukci Shuttle-expresního vektoru E. coli-C-glutamicum pEC-XT99A byl použit expresní vektor E.coli pTRC99A /Amann et al., 1988,

Gene 69:301-315/« Po BspHI restrikčním štěpení /Roche Diagnostics GmbH,. Mannheim, Deutschland, Produktionsbeschreibung BspHI, Product No. 1467123/ a následujícím zpracování podle Klenowa /Amersham Pharmacia Biotech Freiburg, Deutschland, Produktionsbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989,- Molecular Cloning:

A laboratory Manual, Cold Spring Harbor/ byl resistentní gen ampicilinu /bia/ vyměněn za tetracyklonový resistentní gen C-glutamicum plasmidu pAGl /GenBank Accession No. AF121000/. Za tím účelem byla oblast nesoucí rezistentní gen jako Alul fragment /Amerham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktionsbeschreibung Alul No. 27-0884-01/ klonována v linearizovaném expresním vektoru E. coli pTRC99A. Ligace byla provedena tak, jak to bylo popsáno Sambrookem et al.,/1989, Moleculac Cloning: A laboratory Manual, Cod Spring Harbor/, přičemž směs DNA s T4-ligázou /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktionsbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04/ byla inkubována přes noc. Tato ligaění směs byla potom elektroporirována do kmene E. coli /Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,87:4645-4649/ /Tauch et al. 1994,FEMS Microbiology Letters, 123:3437/. Zkonstruovaný expresní vektor E. coli byl označen • ··· ·· ·· ·· 99 99

9 9 9 9 9 9 « · 9 · *·ί ϊ · : i »·*· . ί ί ΐ * • 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

-12ρΧΤ99Α.

Jako báze pro klonování minimálního replikonu z Corynebacterium glutamicum se použil plasmid pGAl Sonnen et al., 1991, Gene, 107: 69-74/. BalI/Pstl-restrunkěním štěpením /Promega GbmH, Mannheim, Deutschland,Produktbeschreibung Balí, Produkt No. R6691? Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland Produktbeschreibung Pstl, Produkt No. 27-0976-01/ vektoru pGAl se mohl klonovat 3484 bp velký fragment do vektoru pK18mob2 /Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169:303312/ fragmentováného Smál a Pstl /amarsham Pharmacia Biotech, Freiburg Deutschland, Produktbeschreibung Smál, Produkt No. 27-0942-02, Produktbeschreibung Pátí, Produtet No. 27.0876-01/. Pomocí BamHIPXhoI restrinkčního štěpení /Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt No. 27-0950-01/ a následujícím zpracováním podle Klenowa /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Proďuctbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01/; Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor/se deletoval 839 bp velký fragment. Z konstruktu religovanému T4-ligasou /Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produkt! onsbeschreibung T4-DNA-ligase, Product No. 27-0870-04/ se mohl klonovat C.glutamicum minimální replikon jako 2645 bp velký fragment do expresního vektoru E. coli pXT 99A. Za tím účelem se DNA konstruktu nesoucťcho minimální replikon štěpila restrinkěními enzymy KpnI / Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produkt beschreibung KpnI, Product No. 27-0908-01/ a Pstl /Amarsham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Pstl, Product No, 27-0886-03/ a pfctom se pomocí Klenový

999 9« ♦ · 9

9 9

9 9 9

99

9 9 • 9 9 9

9 99

9 9 9

99

99 « 9 9 9 « · 9 9 • 9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

-13polymerázy /Amersham Pharmacia Biotech., Freibunrh,/ Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01/ provedlo zpracování 3- 5- exonukleázou /sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbory/.

V paralelní vsázce byl expresní vektor E. coli nXT 99A rozštěpen restrinkčním enzymem Rsrll / Roche Diagnostice, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung Rsrll, Product No. 1292587 a s Klenovou polymerážou /Amerham Pharmacia Biotech.,Freiburg, Deutschland, Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No, 27-0928-01/ připraven k ligaci. Ligace minimálního replikonu s konstruktem vektoru pXT99A byla provedena , jak je to popsáno Sambrrokem et al., /1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual,

Cold, Spring, Harbor/, přičemž směs DNA a T4-ligasóu /Amersham Pharmacia Biotech., Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA Ligase , Product No. 27-0870-04/ se inkubovala přes noc.

CTakto zkonstruovaný E.coli-^glutamicum Shuttleův expresní vektor pEC-XT99A se transformoval pomocí elektroporace do C-glutamicum DSM5715. Selekce transformantů se prováděla na LBHIS agaru, sestávajícího z 18,5 g/1'.boullionu mozku a srdce, 0,5 M sorbitolu, 5 g/lbacto-tnptonu, 2,5 g/1 bacto-yeset extraktu, 5 g/1 NaCl a 18 g/ϊ bactoagaru, který byl doplněn 5 mgťXtetracyklinu, Inkubace se prováděla dva dny při 33 °C.

Plasmid DNA byl izolován z transformantů obvyklými metodami /Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927/ řezán restrikční endonukleázou HindlII a plasmid byl přezkouěen následující elektroforézou s agarózovým gelem.

-14···· fcfc fcfc ·· fcfc «· • · ♦ ♦ ·♦ · ♦ · fc fc ♦ ·· · fc fcfc fc « « « fc* fc· · * fc* · · fcfc

Takto získaný konstrukt plasmidu byl označen jako pEC-XT99A, a je znázorněn na obr. 1. Kmen, získaný elektroporací plasmidu pEC-XT99A v do kmene Corynebacterium glutamicum DSM5715, ,byl^názván DSM5715/pEC-XT99A a uložen jako DSM12967 >4 bei der Deutschen Sammlung ftlr Mikroorganismen und Zellkulturen /DSMZ, Braunschweig, Deutschland/ podle budapešťské úmluvy.

3,2 Výroba plasmidu pXT-panD

Vycházeje ze sekvencí nukleotidůgenu panD C.glutamicum ATCC13O32 /Dusch et al., /Applied and Environmental Microbiology 65/4/, 1530-1539 /1999/ a DE 1985313.7/ biosyntézy pantotenátu, byly PCR-primery vybrány tak, aby amplifikovaný fragment obsahoval gen s jeho nativními vazebními místy ribosomů. 4Ο5 bp velký fragment amplifikovaný s PCR-primerem panD-Cgl/5'-CATCTCACGTATGAATTCT-37 a oanD-Cg2 /5'-ACGAGGCTTGCAGCAATA-3/ byl v důsledku údajů výrobce ligován vektoru pCR^R2.1 /Originál TA Cloning Kit, Invitrogene /Lesk, Niederlande/, Produktbeschreibung Originál TA Cloning^R Kit, Cat. no KNM2O3O-O1/ a potom transformován do kmene E. coli TOPÍOF7Katalog Invitrogen 2000 firmy Invitrogen, Groningen, Niederlande/. Selekce na transformantech se prováděla inkubací při 37 °C po 24 hodin na LB-agarových deskách se 100 ^ug/mlampicilinu a 40 ug/ml X-Gal /5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fa-D-galaktosid/.

DNA takto zkonstruovaného plasmidu pCR-D2 se izoloval obvyklou metodou z transformantů, byl stráven ekstrinkčními endonukleázami Sací a Xbal a ligován do rovněž rozštěpeného vektoru pEC-XT99A. Vzhledem k tomu, že druhé 2bařezné místo, které leží v panD-kodujícím regionu,, je v ho titeli E. coli \ToplOF přítomno methylované, nerozřízlo se toto Štěpné místo a gen se následovně vyřízl intaktně pomocí bočních Sací a Xbal řezných míst z plasmidu pCR-D2.

···· ·· ·· ·0 ·· «4 • · · · »4 t 0 *9 0 • 00 · 0 0· 0 » « · 0 · 9 8 8 8 9 8 8 9 8 8 · • 0 0 0 · «0 0 0 0 0 0 00 0· 00 ♦ « · 0 » ·

-15Po ligaci se vsázka elektroporovala do kmene E. coli

DH5 rocr. Selekce se prováděla na LB agarových deskách s 50yůg/ml kanamycinu. Plasmid DNA z tokto získaných transformantů se izoloval, štěpil s restrikčními endonukleázami Sací a Xbal a fragmenty byly potom přezkoušeny elektroforézou na agarozovém galu. Takto zkonstruovaný plasmid byl označen jako pXT-panDa je znázorněn na obr. 2.

Příklad 4

Výroba produkcentů kyseliny pantotenové ATCC13O32 ilvA/p VWxlpyc, pXT-oanD

V příkladu 3 popsaný plasmid pXT-panD byl elektroporírován do kmene C. glutamicum ATCC13O32AilvA/pVWxlpyc. Po dvoudenní selekci při 30 °C na LB-agaru, který byl doolněn 10 ^ug/ml tetracyklinu a 25 ;pg/ml kanamycinu, se získal kmen ATCCl-3O32QilvA/pVWExlpyc,pXT-panD.

Příklad 5

Výroba kyseliny pantotenové

Tvorba pantotenátu pomocí kmenů C. glutamicum ATCC13032Ailpyc,pXT-oan-D a ATCC13O32.4ilvA/pXTpanD bylo zkoušeno v médiu CGXTI / Keilhauer et al., 1993,

Journalof Bacteriology, 175:5595-5603, tabulka 2/, které tylo doplněno 10/ag/ml tetracyklinu, 2 mM isoleucinu a v případě kmene ATCC13O32 ilvA/pVWExlpyc,pXTpanD dodatečně 25 /ug/ml kanamycinu.

Toto médium bylo dále označeno jako testovací médium C-glutamicum. Po 50 ml čerstvě nasazenéhotestovacího médiaC. glutamicum bylo naočkováno 16 hodin starou předkulturou stejného média tak, aby optická hustota kultivační suspense /o,D.^g^ byla na začátku inkubace ··

0000 0« • · 0

0 0

0 » 0 « 0 0 0 «0 00

0 0

0

0 0 t «

0«

00

0 0 0

0 0 0

0 « «

0 0 0 «0 0*

-160.1. Kultury byly inkubovány při 30 °C a 130 ot./min. Po pětihodinové inkubaci byl přidán IPTG /isopropyl-$D-thiogalaktosid/ v konečné koncentraci 1 mM. Po 48hodinové inkubaci byla určovány optická hustota /o.D.^qq/ kultury a potom byly buňky odstraněny pomocí lOtiminutové inkubace při 5000 g a přesah byl sterilizován.

Pro stanovení optické hustoty byl použit Novaspec II fotometr firmy Pharmacia / Freiburg, Deutschland / při délce měřených vln 580 nm.

Kvantifikace D-pantotenátu v kultivačním přesahu se prováděla pomocí Lactobacillus plantarum ATCC 8014 podle údajů v příručce firmy DIFCO /DIFCO MANUAL, 10^ Edition, s. 1100-1102; Michigan, USA/. Pro kalibraci by la použita hemivápenatá sůl pantotenátu firmy Sigma /Deisénhofen, Deutschland/.

Výsledek je znázorněn v tabulce 3.

···· ·· • fr • · • fr frfr fr· frfr fr frfrfrfr ···· • frfr·· frfrfr·

• frfr frfr frfr	frfrfr • fr	• fr frfr·· ·· frfr frfr
	-17-
Tabulka 2
látka	množství na litr	poznámka
/nh4/2so2	20 g
močovina	5 g
KHoP0. 2 4	1 g
KoHP0. 2 4	1 g
MgSO4 x 7 H2O	0,25 g
MOPS	42 g
CaCl2	10 mg
FeSO4 x 7 H20	10 mg
MnSO4 x H2O	10 mg
ZnSO4 x 7 H2O	1 mg
CuSO4	0,2 mg
NiCl2 x 6 H20	0,02 mg
biotin	0,5 mg
glukóza	40 g		autoklávováno odděleně
kyselina protokatechová	0,03 mg		sterilizováno
Tabulka 3
kmen	gen	hustota koncentrace
		buňky	oD580
ATCC13O32 ilvA/pVWxlpyc	pyc	17	θ,3
ATCC13O32 ilvA/pVWSxlpy<	2 pyc	19	172
pxT-panD	panD

···· φφ φ» φ · φφ φφ φ* · · φφ φ · φφ φ • ΦΦ φφφφ φφφ φ φφ φφφ φφ φφφ φφ φ • φφφ φ φ · φ φφφφ ♦ « φφ φφ φφ ·· φφ

-18?ÍÉhled_obrázků_na_výkrese

Jsou připojeny následující obr.:

obr. 1; restrikční karta plasmidu pEC-XT99A obr. 2: restrikční karta plasmidu pXT-panD

U údajů párových čísel bází se jedná o přibližné hodnoty, které se získají v rámci reprodukovatelnosti.

Použité zkratky a označení mají básledující význam:

'lacZ	3z-termin fragmentu genu lacZN
laclq:	Laclq alela lac represního orgánu
1 ac Zz:	5z-termin lacZsl· fragmentu genu
oriV:	původ replikace V
panD:	gen aspartatdekarboxylázy
per:	gen pro kontrolu počtu kopií
Ptrc:	trc-promotor
rep:	replikační region pro C. glutamicum
Tl:	transkripční terminátor Tl
T2:	transkripční terminátor T2
Tet:	rezistentní gen tetracyklinu
BamHI:	řezné místo restrikčního enzymu BamHI
Dral:	řezné místo restrikčního enzymu Dral
EcoRI:	řezné místo restrikčního enzymu EcoRI
Ec oRV:	řezné místo restrikčního enzymu EcoRV

·»*· 44 • 4 44 ·* ·*

4 * 44 4 4 4 4 4

4 4 4 4 44 4 4 4 4

4*4 44 444 4 4 4 • 44 4 4 4« 4 4 4 4 4

4« 44 44 4· 44

HindlII:	řezné místo restrikčního HindlII	enzymu
KpnI:	řezné místo restrikčního	enzymu KpnI
Ndel:	řezné místo restrikčního	enzymu Hdel
Notl:	řezné místo restrikčního	enzymu Notl
Nrulí	řezné místo restrikčního	enzymu Nrul
Pátí:	režné místo restrikčního	enzymu Pátí
Sací:	řezné místo restrikčního	enzymu Sací
Sáli:	řezné místo restrikčního	enzymu Sáli
Smál: Xbal**	řezné místo restrikčního enzymu Smál methylované řezné místo Xbal
Xbal:	řezné místo restrikčního	enzymu Xbal

·· ··

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenovéza použití koryneformních bakterií, vyznačuj íc í se t í m, že se použijí bakterie, ve kterých se zesílí sekvence nukleotidu /pyc-gen/, kódující pyruvátkarboxylázu /EC-číslo 6.4.1.1./, a zejména se nadměrně exprimuje.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použijí bakterie, ve kterých se dále zesílí další geny cesty biosyntšzy kyseliny D-pantotenové.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použijí bakterie, ve kterých jsou při nejmenším částečně vyřazeny cesty látkové výměny, které zmenšuje tvorba kyseliny D-pantotenové.
4. 4. Zoůsob podle jednoho nebo několika předcházejících nároků, vyznačující se tím, Že se použije kmen transformovaný vektorem plasmidu, a vektor plasmidu nese sekvenci nukleotidu kódující pyruvátkarboxylázu.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se použijí bakterie transformované plasmidem pVWExlpyc.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se současně zesílí panD-gen kódující aspartátdekarboxylázu.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se současně zesílí panB-genkodující ketopantoáthydroxymethyltransferázu.

   -21•••fc fcfc fc · • fc • fc fcfc • fcfc · • fc fcfc fc fcfc « fc* fcfc fc « ► fcfc « • fc fcfc
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se současně zesílí paC-gen kódující pantotenátsyntetážu.
9. 9. Způsob nodle nároku 1,vyznačující s tím, že se současně zesíli ilvD-gen kódující dehydratázu dihydroxykyseliny.
10. 10. Způsob podle jednoho nebo několika předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se uvedené geny zesílí v koryneformních bakteriích, které již produkují kyselinu D-pantotenovou.
11. 11. Způsob fermentativní výroby kyseliny D-pantotenové podle jednoho nebo několika předcházejících nároků, vyznačující se tím, Že se provedou následující kroky:

    a/ fermentace bakterií produkujících kyselinu D-pan totenovou, ve kterých se při nejmenším zesílí gen kódující pyruvatkarboxylázu, b/ obohacení kyseliny D-pantotenové v médiu nebo v buňkách bakterií a c/ izolace produkované kyselinyD-pantotenové.
12. 12. Koryneformní bakterie, ve kterých jsou zesíleny zejména nadměrně exprimovány sekvence nukleotidu /pycgen/ kódující pyruvatkarboxylázu /EC-číslo 6.4.1.1./.
13. 13« Corynebacterium glutamicum DG 52-5/pVWExlpyc uložené pod číslem DSM 12893 u DSMZ, Braunschweig.