SK285870B6 - Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu a transformovaný mikroorganizmus - Google Patents

Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu a transformovaný mikroorganizmus Download PDF

Info

Publication number
SK285870B6
SK285870B6 SK1205-2001A SK12052001A SK285870B6 SK 285870 B6 SK285870 B6 SK 285870B6 SK 12052001 A SK12052001 A SK 12052001A SK 285870 B6 SK285870 B6 SK 285870B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
gene
activity
wall
gly
Prior art date
Application number
SK1205-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK12052001A3 (sk
Inventor
Lothar Eggeling
Hermann Sahm
Original Assignee
Forschungszentrum J�Lich Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7898429&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK285870(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Forschungszentrum J�Lich Gmbh filed Critical Forschungszentrum J�Lich Gmbh
Publication of SK12052001A3 publication Critical patent/SK12052001A3/sk
Publication of SK285870B6 publication Critical patent/SK285870B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Opisuje sa spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu,pri ktorom je v mikroorganizme zosilnená aktivitasyntázy dihydroxykyseliny (ilvD) a/alebo expresiagénu ilvD. Alternatívne k tomu alebo v kombináciis tým sa zosilní tiež aktivita syntázy acetohydroxykyseliny (ilvBN) a izomeroreduktázy (ilvC) a/alebo expresia génu ilvBNC. Pri uvedenom spôsobe sa použijú mikroorganizmy, v ktorých aktivita aspoň jedného enzýmu, ktorý sa zúčastňuje látkovej výmeny znižujúcej tvorbu L-valínu, je oslabená alebo vypnutá a výhodne tieto mikroorganizmy obsahujú defektnú mutáciu v géne na treoníndehydratázu (ilvA) a/alebo defektnú mutáciu v jednom alebo viacerých génoch syntézy pantotenátu.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu mikrobiálnej prípravy L-valínu, ako aj trans-formovaných buniek, prípadne mikroorganizmov použiteľných v tomto spôsobe.
Doterajší stav techniky
Aminokyselina L-valín je komerčne významný produkt, ktorý nachádza uplatnenie vo výžive zvierat a ľudí a v medicíne. Je preto všeobecný záujem na tom, aby sa poskytol zdokonalený spôsob prípravy L-valínu.
Valín možno pripraviť chemickou syntézou alebo biotechnologický, fermentáciou vhodných mikroorganizmov vo vhodných živných roztokoch. Výhodou biotechnologickej prípravy pomocou mikroorganizmov je tvorba správnej stereoizomémej formy, čiže L-formy valinu bez D-valínu.
L-valín môžu produkovať rôzne druhy mikroorganizmov, napríklad Escherichia coli, Serratia marcescens, Corynebacterium glutamicum, Brevibacte-rium flavum alebo Brevibacterium lactofermentum v živnom roztoku, ktorý obsahuje glukózu. Patent US 5 658 766 opisuje, že u baktérií Escherichia coli možno dosiahnuť zvýšenú produkciu L-valínu mutáciou v aminoacyl-tRNA-syntetáze. Patent WO 96 06926 ďalej opisuje, žc auxotrofiou pre lipónovú kyselinu možno dosiahnuť zvýšenie produkcie L-valínu s baktériami Escherichia coli. Patent EP 0 694 614 opisuje kmene baktérií Escherichia coli, ktoré sú rezistentné proti kyseline α-ketomaslovej a v živnom roztoku obsahujúcom glukózu, produkujú L-valín, L-izoleucín alebo L-leucin.
V patente EP 0 477 000 sa opisuje, že mutagenézou baktérií Corynebacterium alebo Brevibacterium a selekciou na rezistenciu proti valinu možno produkciu L-valinu zvýšiť. V tom istom EP patente sa opisuje aj to, že selekciou baktérií Corynebacterium alebo Brevibacterium na rezistenciu proti rôznym analógom pyruvátu, ako je napríklad β-fluórpyruvát, β-chlórpyruvát, β-merkaptopyruvát alebo trimetylpyruvát, možno dosiahnuť zvýšenie produkcie L-valínu. Nakayama a spol. (Nakayama a spol., 1961, J. Gen. Appl. Microbiol. Jpn.) zistili, že náhodnými mutáciami indukované auxotrofíe môžu viesť k zvýšenej akumulácii L-valínu.
V patente EP 0 356 739 sa okrem toho opisuje, že amplifikáciou DNA oblasti kódujúcej syntázu acetohydroxykyseliny (ilvBN, pozri aj obrázok 1) prostredníctvom plazmidu pAJ220V3 sa zvýši produkcia L-valínu.
Úlohou tohto vynálezu je poskytnúť nové základy pre mikrobiálnu prípravu L-valínu, osobitne pomocou koryneformných baktérií.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu, v ktorom sa zosilní aktivita dchydratázy dihydroxykyseliny (ilvD) a/alebo expresia génu ilvD v mikroorganizme.
Alternatívne k tomu alebo v kombinácii s tým sa aktivita syntázy acetohydroxykyseliny (ilvBN) a izomeroreduktázy (ilvC) a/alebo expresia génu ilvBNC zosilní v mikroorganizme. V spôsobe podľa vynálezu sa okrem toho výhodne použijú mikroorganizmy, v ktorých aktivita aspoň jedného enzýmu, ktorý sa zúčastňuje látkovej výmeny znižujúcej tvorbu L-valinu, je oslabená alebo vypnutá. V spôsobe podľa vynálezu sa preto výhodne použijú mikroorganizmy s defektnou mutáciou v géne pre treonínde hydratázu (ilvA) a/alebo s defektnou mutáciou v jednom alebo viacerých génoch syntézy pantotenátu.
Výrazom „valín“ alebo „L-valín“ sa v zmysle nárokovaného vynálezu nemyslí iba voľná kyselina, ale aj jej soľ, ako je napríklad vápenatá, sodná, amónna alebo draselná soľ.
Výraz „zosilnenie“ opisuje zvýšenie vnútrobunkovej aktivity uvedených enzýmov ilvD, ilvB, ilvN a ilvC. Na zvýšenie enzýmovej aktivity sa zvyšuje osobitne endogénna aktivita v mikroorganizme. Zvýšenie enzýmovej aktivity možno dosiahnuť napríklad tým, že zmenou katalytického centra sa zvýši obrat substrátu, alebo tým, že sa zvýši pôsobenie inhibítorov enzýmov. Zvýšenú enzýmovú aktivitu možno vyvolať aj zvýšením enzýmovej syntézy, napríklad amplifikáciou génov alebo vypnutím faktorov, ktoré reprimujú biosyntézu enzýmov. Endogénna enzýmová aktivita podľa vynálezu sa zvýši výhodne mutáciou zodpovedajúceho endogénneho génu. Takéto mutácie možno získať buď klasickými spôsobmi náhodne, ako je napríklad UV ožiarenie alebo chemikáliami vyvolávajúcimi mutácií, alebo cielene, prostredníctvom spôsobov génovej technológie, ako je napríklad delécia (delécie), inzercia (inzercie) a/alebo výmena (výmeny) nukleotidov.
Zosilnenie expresie génov sa podľa vynálezu uskutočňuje výhodne zvýšením počtu kópií génov. Na tento účel sa gén, prípadne gény zabudujú do génového konštruktu, prípadne do vektora, ktorý výhodne obsahuje priradené regulačné génové sekvencie, osobitne také, ktoré zosilňujú expresiu génov. Následne sa mikroorganizmus, výhodne Corynebacterium glutamicum, so zodpovedajúcimi génovými konštruktmi transformuje.
Zistilo sa, žc zosilnenou expresiou génu ilvD pre biosyntézu valinu z baktérii Corynebacterium glutamicum, ktorý kóduje enzým dehydratázu dihydroxykyseliny, sa zdokonaleným spôsobom produkuje L-valín. Podľa vynálezu okrem zosilnenej expresie tohto génu aj zosilnená expresia génov ilvBN, ktoré kódujú enzým syntázu acetohydroxykyseliny, a génu ilvC, ktorý kóduje enzým izomeroreduktázu, spôsobuje v baktériách Corynebacterium glutamicum zvýšenú produkciu L-valínu. Ďalšie zvýšenie produkcie L-valinu sa dosiahne zvýšenou expresiou všetkých uvedených génov v Corynebacterium glutamicum. Gény alebo génové konštrukty môžu byť v hostiteľskom organizme prítomné v rôznom počte kópií, alebo môžu byť integrované a amplifikované v chromozóme.
Ďalšie zvýšenie expresie génov možno dosiahnuť - alternatívne alebo v kombinácii so zvýšením počtu kópií - zosilnením regulačných faktorov, ktoré pozitívne ovplyvňujú expresiu génov. Možno tak dosiahnuť zosilnenie regulačných elementov na úrovni transkripcie tým, že sa použijú osobitne zosilnené transkripčné signály. Možno zmutovať aj promótorovú a regulačnú oblasť, ktorá sa nachádza proti prúdu od štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom pôsobia expresné kazety, ktoré sa zabudujú proti prúdu od štruktúrneho génu. Navyše, prostredníctvom indukovateľných promótorov je možné zvýšiť expresiu aj počas fermentatívnej produkcie L-valinu. Popri tom je však možné aj zosilnenie translácie tým, že sa napríklad zdokonalí stabilita mRNA. Ďalej možno použiť gény, ktoré kódujú zodpovedajúci enzým s vysokou aktivitou. Alternatívne možno ďalej dosiahnuť zvýšenú expresiu daných génov zmenou zloženia média a spôsobu kultivácie. Odborník nájde príslušné návody napríklad v publikáciách Martin a spol. (Bio/Technology 5, 137 - 146 (1987)), Guerrero a spol. (Gene 138, 35 - 41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428 - 430 (1988)), Eikmanns a spol. (Gene 102, 93 - 98 (1991)), v Európskom patente EP
SK 285870 Β6
472 869, vUS patente 4,601,893, Schwarzer a Piihler (Bio/Technology 9, 84 - 87 (1991), Reinscheid a spol. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126 - 132 (1994)), LaBarre a spol. (Joumal ofBacteriology 175, 1001
- 1007 (1993)) a v patentovej prihláške WO 96/15246.
Na zosilnenie expresie génov sú tak isto možné aj všetky mysliteľné kombinácie uvedených opatrení.
Mikroorganizmy, ktoré sa dajú použiť v spôsobe podľa vynálezu, môžu L-valín produkovať z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerínu a etanolu. Môže ísť o Gram-pozitívne baktérie napríklad rodu Bacillus alebo o koryneformné baktérie uvádzaného rodu Coryne-bacterium, alebo o rod Arthrobacter. Pri rode Corynebacterium už bol osobitne uvedený druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je medzi odborníkmi známy svojou schopnosťou produkovať aminokyseliny. K tomuto druhu patria štandardné kmene, napríklad Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240, Corynebacterium melassecola ATCC17965 a iné.
Na izolovanie génu ilvD z baktérií Corynebacterium glutamicum alebo iných génov sa najprv založí génová banka. Zakladanie génových bánk je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad uvádzame učebnicu Winnaker: Gene und Klone, Eine Einfiihrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku Sambrook a spol.: Molecular cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Známou génovou bankou je banka W3110 kmeňa K-12 Escherichia coli, ktorú založil Kohara a spol. (Celí 50, 495 - 508 (1987)), ktorá bola umiestnená do λ-vektorov. Bathe a spol. (Molecular and Generál Genetics, 252: 255 - 265, 1996) opísali génovú banku baktérií Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, ktorá bola založená pomocou kozmidového vektoru SuperCos I (Wahl a spol., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160 - 2164) v E. coli K-12 NM554 (Raleigh a spol., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563 - 1575). Na prípravu génovej banky z baktérií Corynebacterium glutamicum v Escherichia coli možno použiť aj plazmidy, ako je napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences 25, 807 - 818 (1979)) alebo pUC19 (Norrander a spol., 1983, Gene, 26: 101 - 106). Na prípravu génovej banky baktérií Corynebacterium glutamicum v baktériách Corynebacterium glutamicum možno použiť plazmidy ako napríklad pJCl (Cremer a spol., Mol. Gen. Genet. (1990) 220: 3221 - 3229) alebo pECM2 (Jáger a spol., J. Bacteriol. (1992) 174: 5462 -
- 5465). Ako hostiteľ sú osobitne vhodné také bakteriálne kmene, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne defektné. Ako príklad uvádzame kmeň Escherichia coli DHSamcr, ktorý opísali Grant a spol. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645 - 4649), alebo kmeň Corynebacterium glutamicum R127, ktorý izolovali Liebla a spol. (FEMS Lett (1989) 65: 299 - 304).
Génová banka sa následne zabuduje do indikátorového kmeňa, a to transformáciou (Hanahan, Joumal of Molecular Biology 166, 557 - 580, 1983) alebo elektroporáciou (Tauch a spol., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343 - 347). Indikátorový kmeň sa vyznačuje tým, že v géne, o ktorý je tu záujem, sa nachádza mutácia, ktorá spôsobuje detegovateľný fenotyp, napríklad auxotrofiu. Indikátorové kmene, pripadne mutanty sa dajú získať z publikovaných zdrojov alebo zbierok kmeňov, alebo je potrebné ich v danom prípade pripraviť. V rámci tohto vynálezu sa z Corynebacterium glutamicum vyizoloval mutant R127/7, ktorý je defektný v géne ilvD kódujúcom dehydratázu di hydroxykyseliny. Po transformácii indikátorového kmeňa, napríklad mutantu ilvD R 127/7, rekombinantným plazmidom, ktorý je nositeľom daného génu, napríklad génu ilvD, a po jeho expresii sa indikátorový kmeň stane prototrofným ohľadne zodpovedajúcej vlastnosti, ako je napríklad požiadavka na L-valín.
Takýmto spôsobom vyizolovaný gén, prípadne DNA fragment, možno charakterizovať stanovením sekvencie podľa opisu Sangera a spol. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unitcd States of America USA, 74: 5463 - 5467, 1977). Následne možno publikovanými spôsobmi (Altschul a spol., 1990, Joumal of Molecular Biology 215: 403 - 410) analyzovať stupeň identity so známymi génmi, ktoré sa nachádzajú v dátových bankách, ako je napríklad GenBank (Benson a spol., 1998, Nucleic Acids Research, 26: 1 - 7).
Týmto spôsobom sa z Corynebacterium glutamicum získa sekvencia DNA kódujúca gén ilvD, ktorá je pod označením SEQ ID No. 1 súčasťou tohto vynálezu. Okrem toho sa s použitím uvedených spôsobov z tejto sekvencie DNA odvodia sekvencie aminokyselín zodpovedajúcich enzýmov. V SEQ ID No. 2 je takto získaná sekvencia aminokyselín génového produktu ilvD, menovite hydratázy dihydroxykyseliny.
Týmto spôsobom charakterizovaný gén možno nechať následne vo vhodnom mikroorganizme exprimovať jednotlivo alebo v kombinácii s inými génmi. Jeden známy spôsob exprimovania prípadne zvýšeného exprimovania génov spočíva v tom, že tieto gény sa amplifíkujú pomocou plazmidových vektorov, ktoré navyše môžu byť vybavené aj expresnými signálmi. Do úvahy prichádzajú také plazmidové vektory, ktoré sa môžu replikovať v zodpovedajúcich mikroorganizmoch. Napríklad pre Corynebacterium glutamicum prichádza do úvahy vektor pEKExl (Eikmanns a spol., Gene 102: 93 - 98 (1991)) alebo pZ8-l (Európsky patent 0 375 889) alebo pEKEx2 (Eikmanns a spol., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) alebo pECM2 (Jäger a spol., Joumal of Bacteriology 174 (16): 5462 - 5465 (1992)). Také plazmidy sú napríklad pJClilvD, pECM3ilvBNCD a pJClilvBNCD. Tieto plazmidy sú kyvadlovými vektormi Escherichia coli/Corynebacterium glutamicum, ktoré nesú gén ilvD, prípadne gén ilvD spolu s génmi ilvB, ilvN a ilvC.
Ďalej sa zistilo, že zosilnenie génu jednotlivo alebo v kombinácii s génmi ilvB, ilvN a ilvC pôsobí výhodne v takých mikroorganizmoch, v ktorých je syntéza aminokyseliny L-izoleucínu znížená. Takúto zníženú syntézu možno dosiahnuť deléciou génu ilvA, ktorý kóduje enzým treoníndehydratázu, ktorý je špecifický pre syntézu L-izoleucínu.
Deléciu možno uskutočniť cielenými spôsobmi s rekombinantnou DNA. Pomocou týchto spôsobov možno napríklad v chromozóme uskutočniť deléciu génu ilvA, ktorý kóduje treoníndehydratázu. Vhodné spôsoby opísali okrem toho napríklad Schäfer a spol. (Gene (1994) 145: 69 - 73) alebo Link a spol. (Joumal of Bacteriology (1998) 179: 6228 - 6237). Možno tiež deletovať iba časti génu, alebo možno vymeniť aj zmutované fragmenty génu pre treoníndehydratázu. Deléciou sa tak dosiahne strata treonindehydratázovej aktivity. Takým mutantom je napríklad Corynebacterium glutamicum kmeň ATCC13032AilvA, ktorý je nositeľom delécie v géne ilvA.
Ďalej sa zistilo, že zosilnenie génov ilvD, ilvB, ilvN a ilvC v ďalšej kombinácii so zníženou syntézou D-pantotenátu, výhodne v kombinácii s ďalšou deléciou génu ilvA, má v mikroorganizmoch výhodný vplyv na produkciu L-valínu, napríklad deléciami v géne panB a panC. Zníženú syntézu D-pantotenátu možno dosiahnuť oslabením alebo vypnutím zodpovedajúcich enzýmov biosyntézy, prípadne ich aktivity. Na tento účel prichádza do úvahy napríklad enzým ketopantoát-hydroxymetyltransferáza (EC 2.1.2.11), ketopantoátreduktáza, pantotenátligáza (EC 6.3.2.1) a aspartátdekarboxyláza (EC 4.1.1.11). Možnosť vypnúť alebo oslabiť enzýmy a ich aktivity sú spôsoby mutagenézy.
Patria sem spôsoby náhodnej mutagenézy, ktoré na mutagenézu využívajú chemické reagencie, ako napríklad N-metyl-.V-mtro-.V-nitrózoguanidín, alebo tiež UV ožiarenie, s následným hľadaním želaných mikroorganizmov s požiadavkou na D-pantotenát. Spôsoby na vyvolávanie mutácií a hľadanie mutantov sú všeobecne známe a možno ich nájsť medzi inými v publikácii Miller: A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Prcss, 1992) alebo v príručke „Manual of Methods for Generál Bacteriology“ spoločnosti Američan Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
Patria sem okrem toho aj spôsoby cielenej rckombinantnej DNA. Pomocou týchto spôsobov možno napríklad gény panB, panC, panE a panD, ktoré kódujú ketopanroáthydroxymetyltransferázu, pantotenátligázu, reduktázu ketopantoínovej kyseliny alebo aspartátdekarboxylázu, v chromozóme deletovať jednotlivo alebo aj spolu. Vhodné spôsoby na to opísali Schäfer a spol. (Gene (1994) 145: 69 - 73) alebo aj Link a spol. (Joumal of Bacteriology (1998) 179: 6228 - 6237). Možno tiež deletovať iba časti génov alebo možno aj vymeniť zmutované fragmenty ketopantoáthydroxymetyltransferázy, pantotenátligázy, reduktázy ketopantoínovej kyseliny alebo aspartátdekarboxylázy. Deléciou alebo výmenou sa tak dosiahne strata alebo redukcia danej enzymatickej aktivity. Takýto mutant je napríklad Corynebacterium glutamicum kmeň ATCC13032ApanBC, ktorý je nositeľom delécie v operóne panBC.
Mikroorganizmy pripravené podľa vynálezu možno kultivovať kontinuálne alebo nekontinuálne, násadovým spôsobom (batch kultivácia) alebo prísunovým spôsobom (fed batch kultivácia) alebo opakovane prísunovým spôsobom (repeated fed batch kultivácia) s cieľom produkovať L-valin. Súhrn známych kultivačných spôsobov je opísaný v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/'-Wiesbaden, 1994).
Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných mikroorganizmov. Opisy kultivačných médií rôznych mikroorganizmov sú uvedené v príručke „Manual of Methods for Generál Bacteriology“ spoločnosti Američan Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroj uhlíka možno použiť cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako je napríklad sójový olej, slnečnicový olej, arašidový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny, ako je napríklad kyselina palmitová, steárová a linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerín a etanol, a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky možno použiť jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroj dusíka možno použiť organické dusíkaté zlúčeniny, ako je napríklad peptón, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný vývar, sójová múka, a močovinu alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka možno použiť jednotlivo alebo ako zmes.
Ako zdroj fosforu možno použiť dihydrofosforečnan draselný alebo hydrofosforečnan draselný alebo zodpovedajúce sodíkové soli. Kultivačné médium musí okrem toho obsahovať soli kovov, ako je napríklad síran horečnatý alebo síran železitý, ktoré sú potrebné na rast. Nakoniec možno k uvedeným látkam dodatočne pridať esenciálne rastové látky, ako sú napríklad aminokyseliny a vitamíny. Uvedené násadové látky možno pridať do kultúry formou jednorazovej násady alebo vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.
Na kontrolu pH kultúry sa vhodným spôsobom použijú zásadité zlúčeniny, ako je napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, alebo kyslé zlúčeniny, ako je napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny možno použiť prostriedky na potláčanie peny, ako je napríklad polyglykolester mastných kyselín. Na udržanie stability plazmidov možno do média pridať vhodné látky so selektívnym účinkom, napríklad antibiotiká. Na udržanie aeróbnych podmienok sa do kultúry privádza kyslík alebo kyslík obsahujúce zmesi plynov, ako je napríklad vzduch. Teplota kultúry je obyčajne v rozpätí medzi 20 °C až 50 °C a výhodne medzi 25 °C až 45 °C. Kultúra sa udržuje dovtedy, kým sa nevyprodukuje maximálne množstvo L-valínu. Tento cieľ sa dosahuje obyčajne za 10 hodín až 160 hodín.
Koncentráciu vyprodukovaného L-valínu možno určiť známymi spôsobmi (Jones a Gilligan (1983), Joumal of Chromatography 266: 471 - 482).
Vynález sa bližšie vysvetlí prostredníctvom nasledujúcich príkladov uskutočnenia.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je znázornená bloková schéma mikrobiálnej výroby L-valínu.
Na obr. 2 je znázornená schopnosť plazmidu pRV komplementovať ilvD mutanty R127/7, pričom oblasť zodpovedná za komplementovanie mutantov R127/7 sa zúžila na 2,9 kb fragment Scal/Xhol.
Na obr. 3 je znázornená schopnosť vektora pURl komplementovať defekt panC mutantu DV39, pričom oblasť zodpovedná za komplementovanie týchto mutantov je 2,2 kb.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie, sekvenovanie a expresia génu ilvD z Corynebacterium glutamicum, ktorý kóduje dehydratázu dihydroxykyseliny
1. Izolovanie ilvD mutantu z Corynebacterium glutamicum
Kmeň Corynebacterium glutamicum R127 (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329 - 334) sa vystavil mutagénnym účinkom /V-nictyl-A'-nitro-.V-nitrózoguanidinu (Sambrook a spol., Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). 5 ml kultúry Corynebacterium glutamicum kultivovanej cez noc sa zmiešalo s 250 μΐ A'-metyl-.'V-nitro-A'-nitrózoguanidínu (5 mg/ml dimetylformamidu) a inkubovalo sa 30 minút pri 30 “C a 200 Upm (Adelberg 1958, Joumal of Bacteriology 76: 326). Bunky sa následne dvakrát premyli sterilným roztokom NaCI (0,9 %). Replikovým vysievaním na platne s minimálnym médiom CGXII s 15 g/l agaru (Keilhauer a spol., Joumal of Bacteriology 175: 5595 - 5603) sa vyizolovali mutanty, ktoré rástli iba za pridania L-valínu, L-izoleucínu a L-Ieucínu (po 0,1 g/l).
V surovom extrakte z týchto mutantov sa stanovila enzymatická aktivita dehydratázy dihydroxykyseliny. Klony sa na tento účel kultivovali v 60 ml LB média a v exponenciálnej fáze rastu sa odstredili. Bunkový pelet sa jedenkrát premyl s 0,05 M draselného fosfátového tlmivého roztoku a resuspendoval sa v tom istom tlmivom roztoku. Bunky sa rozbili 10-minútovým sonikovaním ultrazvukom (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Rozbité bunky sa potom oddelili centrifugovaním pri 13000 otáčkach/minútu a 4 °C počas 30 minút a supematant ako surový extrakt sa použil v enzýmovom teste. Reakčná násada enzýmového testu obsahovala 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,05 ml surového extraktu a 0,15 ml 65 mM a,3-dihydroxy-P-metylvalerátu. Testovacie násady sa inkubovali pri 30 °C, po 10, 20 a 30 minútach sa odobralo po 200 pl vzorky a koncentrácie ketometylvalerátu sa stanovili pomocou HPLC analýzy (Hara a spol., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167 - 173). Z tabuľky 1 vidieť, že kmeň R127/7 nemá nijakú aktivitu dehydratázy dihydroxykyseliny, kým aktivita izomeroreduktázy a syntázy acetohydroxykyseliny ako ďalších enzýmov syntézy aminokyselín s rozvetveným reťazcom sú ešte prítomné.
Tabuľka 1
Špecifické aktivity (pmol/min a mg proteínu) enzýmov biosyntézy valínu v kmeňoch Corynebacterium glutamicum
Kmeň Dehydratáza dihydroxykyseliny Izomeroreduktáza Syntáza acetohydroxykyseliny
R127 0,003 0,05 0,07
R127/7 0,000 0,06 0,09
2. Klonovanie génu ilvD z Corynebacterium glutamicum
Z Corynebacterium glutamicum R127 sa izolovala chromozómová DNA podľa Schwarzera a Plúhera (Bio/Technology 9 (1990) 84 - 87). DNA sa naštiepila pôsobením reštrikčného enzýmu Sau3A (Boehringer Mannheim) a oddelila sa centrifugovaním v sacharózovom hustotnom gradiente (Sambrook a spol., Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). Frakcia s fragmentmi v oblasti približne 6 až 10 kb sa použila na ligáciu s vektorom pJCl (Cremer a spol., Molecular and Generál Genetics 220 (1990) 478 - 480).Vektor pJCl sa preto linearizoval a defosforyloval reštrikčnou endonukleázou BamHI. 5 ng z toho sa ligovalo s 20 ng uvedenej frakcie chromozómovej DNA a tým sa mutant R127/7 elektroporáciou transformoval (Haynes a Britz, FEMS Microbiology Letter 61 (1989) 329-334. Transformanty sa testovali na schopnosť rásť na agarových platniach CGXII bez pridania aminokyselín s rozvetveným reťazcom. Z viac ako 5000 otestovaných transformantov po replikovom vysiatí a dvojdňovej inkubácii pri 30 °C rástlo na platniach s minimálnym médiom 8 klonov. Z týchto klonov sa pripravili plazmidové preparáty podľa Schwarzera a spol. (Bio/Technology (1990) 9:84 - 87). Reštrikčné analýzy plazmidovej DNA ukázali, že vo všetkých 8 klonoch sa nachádza ten istý plazmid, v ďalšom označovaný pRV. Plazmid je nositeľom inzertu obsahujúceho 4,3 kb a opakovanou transformáciou bol otestovaný na schopnosť komplementovať ilvD mutanty R127/7. Ďalším klonovaním sa oblasť zodpovedná za komplementovanie mutantov R127/7 zúžila na 2,9 kb fragment Scal/Xhol (obrázok 2).
3. Sekvenovanie génu ilvD
Sekvencia nukleovej kyseliny 2,9 kb fragmentu Scal/Xhol sa stanovila podľa dideoxy-spôsobu rozkúskovania reťazca (Sanger a spol., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463 - 5467). Použila sa na to sekvenovacia súprava Auto-Read Sequencíng Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). Analýza pomocou gélovej elektroforézy sa uskutočnila pomocou automatického laserového fluorescenčného prístroja (A.L.F.) firmy Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Švédsko). Získaná sekvencia nukleotidov sa analyzovala programovým balíčkom HUSÁR (verzia 4.0, EMBL, Cambridge, Veľká Británia). Sekvencia nukleotidov sa znázornila ako ID SEQ No. 1. Analýzou sa získal otvorený čítací raster s 1836 bázovými pármi, ktorý bol identifikovaný ako gén ilvD a ktorý kóduje jeden polypeptid so 612 aminokyselinami, ktorý je znázornený ako SEQ ID No. 2.
4. Expresia génu ilvD
Plazmid pRV sa natrávil reštrikčnými enzýmami Scal a Xhol podľa údajov výrobcu reštrikčných enzýmov (Roche, Boehringer Mannheim). Potom sa izoloval 2,9 kb fragment ilvD pomocou ionexovej kolóny (Quiagen, Hilden). Prečnievajúci koniec rezu Xhol izolovaného fragmentu sa vyplnil Klenowovou polymerázou. Vektor pJCl (Cremenr a spol., Mol. Gen. Genet. (1990) 220: 478 - 480) sa naštiepil pomocou PstI, tiež sa vystavil účinkom Klenowovej polymerázy a potom fragment a vektor sa spojili. Ligačnou násadou sa transformoval (Hanahan, Joumal of Molecular Biology 166 (1983) 557 - 580) kmeň E. coli DH5amcr (Grant a spol., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Amcrica USA, 87 (1990) 4645 - 4549). Preparáciou plazmidov (Sambrook a spol., Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) spomedzi klonov sa identifikoval kloň, ktorý obsahoval rekombinantný plazmid pJClilvD. Týmto plazmidom sa elektroporáciou transformoval Coryne-bacterium glutamicum ATCC13032 podľa Haynesa a spol. (1989, FEMS Microbiol. Lett. 61: 329 - 334). Z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pJCl a z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pJClilvD sa potom stanovila dehydratázová aktivita diydroxykyseliny, ktorú kóduje gén ilvD. Klony sa preto kultivovali v 60 ml LB média a odstredili sa v exponenciálnej fáze rastu. Bunkový pelet sa jedenkrát premyl s 0,05 M draselného tlmivého roztoku a resuspendoval sa v tom istom tlmivom roztoku. Bunky sa rozbili 10-minútovým sonikovaním ultrazvukom (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Rozbité bunky sa potom oddelili centrifugovaním pri 13000 otáčkach/minútu a 4 °C počas 30 minút a supematant ako surový extrakt sa použil v enzýmovom teste. Reakčná násada enzýmového testu obsahovala 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,05 ml surového extraktu a 0,15 ml 65 mM ajl-dihydroxy-P-metylvalerátu. Testovacie násady sa inkubovali pri 30 °C, po 10, 20 a 30 minútach sa odobralo po 200 pl vzorky a koncentrácie ketometylvalerátu sa stanovili pomocou HPLC analýzy (Hara a spol., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167 - 173). Z tabuľky 2 vidieť, že v kmeni Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pJClilvD je aktivita dehydratázy dihydroxykyseliny zvýšená v porovnaní s kontrolným kmeňom.
Tabuľka 2
Špecifická aktivita (pmol/min a mg proteínu) dehydratázy dihydroxykyseliny v kmeni Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Plazmid Dehydratáza dihydroxykyseliny
pJCl 0,008
pJClilvD 0,050
Príklad 2
Konštrukcia delečného mutantu ilvA v Corynebacterium glutamicum
Interná delécia génu ilvA v Corynebacterium glutamicum ATCC13032 sa uskutočnila spôsobom génovej výmeny, ktorý opísali Schäfer a spol. (Gcnc 145: 69 - 73 (1994)). Na konštrukciu inaktivačného vektora pK19mobsacBAilvA sa z génu ilvA na EcoRI fragmente vo vektore pBM21 (Môckel a spol., 1994, Molecular Microbiology 13: 833 - 842) najprv odstránil interný fragment 241 bp Bglll. Vektor sa naštiepil s Bglll a po oddelení interného fragmentu Bglll génu ilvA prostredníctvom elektroforézy na agarózovom géli sa opätovne spojí. Potom sa z vektoru vyizoluje nekompletný gén ako EcoRI fragment a napojí sa do vektora pK19mobsacB lincarizovaného pomocou EcoRI (Schäfer 1994, Gene 145: 69 - 73). Obsiahnutý inaktivačný vektor pK19mobsacBAilvA sa transformáciou vloží do kmeňa E. coli S 17-1 (Hanahan 1983, Joumal of Molecular Biology 166: 557 - 580) a konjugáciou sa transferuje do kmeňa Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Schäfer a spol., 1990, Joumal of Bacteriology 172: 1663 - 1666). Získali sa klony Corynebacterium glutamicum rezistentné proti kanamycínu, pri ktorých inaktivačný vektor bol integrovaný v genóme. Selekcia na excíziu vektoru sa uskutočnila tak, že klony rezistentné proti kanamycínu sa vysiali do LB média obsahujúceho sacharózu (Sambrook a spol., Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) s 15 g/1 agaru, 2 % glukózy/10 % sacharózy, aby sa získali kolónie, ktoré vektor opäť stratili v dôsledku ďalšej rckombinácie (Jäger a spol., 1992, Joumal of Bacteriology 174: 5462 - 5465). Preočkovaním na platne s minimálnym médiom (médium CGXI1 s 15 g/l agaru (Keilhauer a spol., Joumal of Bacteriology 175 (1993) 5595 - 5603) a bez 2 mM L-izoleucinu, prípadne s a bez 50 pg/ml kanamycínu) sa vyizolovalo 36 klonov, ktoré v dôsledku excíxie vektora boli proti kanamycínu senzitívne a na izoleucín boli auxotrofné, a ktoré mali teraz nekompletný gén ilvA (alela AilvA) prítomný v genóme. Jeden z kmeňov sa označil ATCC13032AilvA a použil sa ďalejPríklad 3
Klonovanie génov biosyntézy pantotenátu panB a panC z Corynebacterium glutamicum
Klonovanie operónu
Vyizolovala sa chromozómová DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 a naštiepila sa pomocou reštrikčnej endonukleázy Sau3A. Po oddelení gélovou elektroforézou sa vyextrahovali fragmenty DNA s veľkosťou 3 až 7, prípadne 9 až 20 kb a potom sa ligovali do singulámcbo štiepneho miesta BamHI vektora pBR322. Kolónie nesúce inzert sa v dôsledku citlivosti na kanamycín vyizolovali po preočkovaní na LB platne s 10 pg/ml tetracyklínu. Prostredníctvom plazmidových preparátov (Sambrook a spol., Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) sa zo zlúčených klonov vyizolovalo 8 plazmidových poolov, z ktorých každý obsahoval 400 plazmidov s veľkosťou inzertov 9 až 20 kb, a 9 plazmidových poolov, z ktorých každý obsahoval 500 plazmidov s veľkosťou inzertov 3 až 7 kb. Mutant E. coli pnaB SJ2 (Cronan a spol., 1982, J. Bacteriol. 149: 916 - 922) sa transformoval elektroporáciou (Wehrmann a spol., 1994, Microbiology 140: 3349 - 3356). Transformačné násady sa vysiali priamo do CGXII média (J. Bacteriol. (1993) 175: 5595 - 5603). Z klonov, ktoré boli schopné rásť aj bez prísunu pantotenátu, sa vyizolovala plazmidová DNA (Sambrook a spol., 1989) a opakovanou transformáciou sa získalo 8 klonov, ktorých požiadavka na D-pantotenát bola potvrdená. S 8 plazmidmi sa uskutočnila reštrikčná skartácia. Jeden z vyšetrených vektorov, v ďalšom označený pURl, obsahoval inzert veľkosti 9,3 kb (obrázok 3). Transformácia mutantu E. coli panC DV39 (Vallari a spol., 1985, J. Bacteriol. 164: 136 - 142) viedla k tomu, že aj vektor pURl bol schopný komplementovať defekt panC tohto mutantu. Fragment veľkosti 2,2 kb inzertu pUR bol sekvenovaný s použitím dideoxy-spôsobu rozkúskovania reťazca (Sanger a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463 - 5467). Analýza pomocou gélovej elektroforézy sa uskutočnila pomocou automatického laserového fluorescenčného prístroja (A.L.F.) firmy Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Švédsko). Získaná sekvencia nukleotidov sa analyzovala programovým balíčkom HUSÁR (verzia 4.0, EMBL, Cambridge, Veľká Británia). Sekvencia nukleotidov sa znázornila ako SEQ ID No. 3. Analýzou sa získali dva otvorené čítacie rastre. Jeden otvorený čítací raster zahŕňa 813 párov báz a vykazuje vysoký stupeň homológie s už známymi génmi panB z iných organizmov. Gén panB z Corynebacterium glutamicum kóduje polypeptid s 271 aminokyselinami (pozri SEQ ID No. 4). Druhý otvorený čítací raster zahŕňa 837 párov báz a vykazuje vysoký stupeň homológie s už známymi génmi panC z iných organizmov. Gén panC z Corynebacterium glutamicum kóduje polypeptid s 279 aminokyselinami (pozri SEQ ID No. 5)Príklad 4
Konštrukcia delečného mutantu panBC z Corynebacterium glutamicum
S genómovým panBC fragmentom z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, ako aj z Corynebacterium glutamicum ATCC13032AilvA sa uskutočnila výmena génov podľa systému, ktorý opísali Schäfer a spol (Gene 145: 69 73 (1994). Na konštrukciu delečného vektora pK19mobsacBApanBC sa najprv ligoval 3,95 kb dlhý fragment Sspl/Sall s panBC spUC18, ktorý sa predtým naštiepil pomocou Smal/Sall. Následne sa 1293 bp veľký fragment EcoRV/Nrul z prekrývajúcej sa oblasti génov panBC odstránil reštrikčným natrávením a opätovnou ligáciou. Aby sa umožnilo preklonovanie do pK19mobsacB, s 2 prímermi 5’-GAGAACTTAATC GAGCAACACCCCTG, 5’-GCGCCACGCCTAGCCTTGGCCCTCAA a polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) dclctovancj oblasti panBC sa amplifikoval vpUC18, aby sa tak získal 0,5 kb fragment ApanBC, ktorý na konci nesie štiepne miesto Sali, pripadne EcoRI. PCR sa uskutočnila podľa Sambrooka a spol. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Press) pri žíhacej teplote 55 °C. Získaný fragment sa ligoval s vektorom pK19 mobsac, ktorý bol predtým naštiepený pomocou EcoRI/Sall a vystavený účinku alkalickej fosfatázy. Získaný inaktivačný vektor pK19mobsacBApanBC sa transformáciou vniesol do kmeňa Escherichia coli S 17-1 (Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166: 557 - 580) a konjugáciou sa transferoval do Coryne bacterium glutamicum ATCC13032 (Schäfer a spol. (1990) J. Bacteriol. 172: 1663 - 1666). Získali sa klony Corynebacterium glutamicum rezistentné proti kanamycínu, v ktorých inaktivačný vektor bol integrovaný do genómu. Selekcia na excíziu vektoru sa uskutočnila tak, že klony rezistentné proti kanamycínu sa vysiali do LB média obsahujúceho sacharózu (Sambrook a spol., Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) s 15 g/1 agaru, 2 % glukózy/10 % sacharózy, aby sa získali kolónie, ktoré vektor opäť stratili v dôsledku ďalšej rekombinácie (Jäger a spol., 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462 - 5465). Preočkovaním na platne s minimálnym médiom (médium CGXII s 15 g/1 agaru (Keilhauer a spol., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595 - 5603) a bez 2 mM L-izoleucínu, prípadne s a bez 50 pg/ml kanamycínu) sa vyizolovalo 36 klonov, ktoré v dôsledku excíxie vektoru boli proti kanamycínu senzitívne a na izoleucín boli auxotrofhé, a ktoré mali teraz nekompletný gén ilvA (alela ApanBC) prítomný v genóme. Jeden z kmeňov sa označil ATCC13032ApanBC. Rovnakým spôsobom ako v tomto príklade, podrobne bolo opísané aj zavedenie delécie panBC do ATCC13032AilvA, aby sa získal kmeň ATCC13032AilvAApanBC.
Príklad 5
Expresia génov ilvD, ilvBN a ilvC v Corynebacterium glutamicum
Gény syntázy acetohydroxykyseliny (ilvBN) a izomeroreduktázy (ilvC) (Cordcs a spol. 1992, Gene 112: 113 -
- 116 a Keilhauer a spol. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595 - 5603) a dehydratázy dihydroxykyseliny (ilvD) (Príklad 1) boli klonovanc na expresiu vo vektore pECM3. Vektor pECM3 je derivát z pECM2 (Jäger a spol. 1992, Joumal of Bacteriology 174: 5462 - 5465), ktorý vznikol deléciou fragmentu DNA BamHI/BglII dlhého približne 1 kbp, ktorý je nositeľom génu rezistencie proti kanamycínu.
Vo vektore pKK5 (Cordes a spol. 1992, Gene 112: 113
- 116) boli gény ilvBNC klonované už vo vektore pJCl (Cremer a spol. 1990, Molecular and Generál Genetics 220: 478 - 480). Z tohto sa vyizoloval 5,7 kb dlhý fragment Xbal-ilvBNC a spolu s 3,1 kb Xbal fragmentom obsahujúcim gém ilvD vektoru pRV sa vniesol do vektoru pECM3 linearizovaného pomocou Xbal. Ligačná násada sa transformovala do kmeňa E. coli DH5amcr. Zjedného klonu sa získal plazmid pECM3ilvBNCD.
Prostredníctvom elektroporácie (Haynes 1989, FEMS Microbiology Lettcrs 61: 329 - 334) a selekcie na rezistenciu proti chloramfenikolu (3 pg/ml) sa plazmid pECM3ilvBNCD vniesol do kmeňa ATCC13032AilvA a získal sa kmeň ATCC13032AilvA/pECM3ilvBNCD.
Príklad 6
Produkcia L-valínu pomocou rôznych kmeňov Corynebacterium glutamicum
Na zistenie produkcie valínu sa kmene uvedené v tabuľke 4 predbežne kultivovali v 60 ml Brain Heart Infusion médiu (Difco Laboratories, Detroit, USA) 14 hodín pri 30 °C. Následne sa bunky jedenkrát premyli s 0,9 %ným roztokom NaCl (váha/objem) a touto suspenziou sa naočkovalo po 60 ml média tak, že OD600 bola 0,5. Médium bolo totožné s médiom, ktoré opísal Keilhauer a spol. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595 - 5603). Na kultiváciu kmeňov AilvA však médium obsahovalo dodatočne aj 250 mg/1 L-izoleucínu. Je uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Zloženie média CGXII
Zložky Koncentrácia
(NH4)2SO4 20 g/1
Močovina 5 g/1
KH2PO4 l g/1
k2hpo4 1 g/1
Mg2O4 · 7 H2O 0,25 g/1
Kyselina 3-morfolino-propánsulfónová 42 g/1
CaCl2 10 mg/1
FeSO4 7 H2O 10 mg/1
MnSO4 · H2O 10 mg/1
ZnSO4 · 7 H2O 1 mg/1
CuSO4 0,2 mg/1
NiCl, · 6 H2O 0,02 mg/1
Biotín (pH 7) 0,2 mg/1
Glukóza 40 g/1
Kyselina protokatechová 0,03 mg/1
Po 48-hodinovej kultivácií sa odobrali vzorky, bunky sa centrifugovali a supematant sa vysterilizoval filtráciou. Koncentrácia L-valínu v supematante bola stanovená pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie s integrovanou predchádzajúcou kolónovou derivatizáciou aminokyselín s o-fidialdehydom podľa Jonesa a Gilligana (J. Chromatogr. 266 (1983) 471 - 482).
Tabuľka 4
Produkcia L-valínu pomocou rôznych kmeňov Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium glutamicum L-valín (mM)
ATCC13032 0,5
ATCC13032pJClilvD 2,2
ATCC13032pJClilvBNC 20,0
ATCC13032pJClilvBNCD 26,2
ATCC13032AilvA 2,7
ATCC13032AilvApJClilvD 7,0
ATCC13032AilvApJClilvBNCD 28,5
ATCC13032ApanBC 8,2
ATCC13032AilvAApanBC 31,1
ATCC13032Ailv AApanBCpJCl OvBN'CD 72,7
Zoznam sekvencií <110> Forschungszcntrum Juelich GmbH <120> Príprava L-valínu <130>P14PCT <140>PCT/EP 00/01405 <141> 2000-02-21 <150> 199 07 567.0 <151> 1999-02-22 <160>5 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2952 <212>DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 agtacttgga gcgccaaaag gcsctgggca ccgatgggaa tacaacacaa acASaaagcg ctgaaacctc acatcgtgat aaccctgcgt accaaaggtc cacacctctg cacgagcaga etcttgacaa ccacacgccg ctcttfcagag tcgttcaaaa gtcaccaccg tcggtcgcaa caccggcacc aaggaaaatg agttcggcaa ccagttcgtg cccggacacg tccacctcaa gcgcaaagcc ggtggcgttc caaaggaatt gggacacggc ggcatgctge actccctgcc atacatggtc aacgcacaca ccjccgacgc caecccaggs atgctcaacg cagcaatgcg tggcccaatg gaagctggca aggctgtcgt cctcatcacc gcgatctccg cacccgcaag cgttgaacga tccgcacgcc cascctgtgg csatgaactgc cteaccgaag ctítgggaet aacccacgca gcacgtcgcg caítgtttga ccgccgctac tacggtgaag aagacgaatc ggcattcgaa aacgcaatgg caítggatat ccacatcctc gcagctgccc aggaaggcga actgtccaaa aacgteccct gcCtgtccaa agacgtccac cgcgceggtc gcattccagc getgaacaag gaagtccact ccgttcaetc ggatatccgc tctggcaaga ccaccgaagt tggcatccgc accaccgaag caCtctccac cgctgccaag ggctgcatcc gcgacgttga tgttcttcgi ggcaacatct ccectgaegg agagctgtgg aacttcaccg gaccagcacg agccagttca getgaacttc gacgacgac* SO ttgaatccca agagaccgga caagccgcgt 120 cacagcacta gagtgtaata agccgtccga 1B0 agctcaccca agttttcaaa gtgccgttga 240 cagatttgaa aagcgcatca tgatcccact 300 tgcagctggc gctcgcgccc tttggcgtgc 360 gccaattgtt gccatcgtaa actcctacac 420 gaacgtcggc gatattgtgg cagatgcagt 480 caacaccatc gtcgatgacg gcatcgeeat 540 atcccgtgaa atcatcgccg actccgtcga 600 catggtgtgt atctccaact gtgacaagat 660 cctgaacatc ccagtggtct tcgtttccgg 720 cgttgagcgc gttgcacacg caceaaccga 780 cgatgcagtc gacgacgcag gccttgcagc B40 ctcctgcccc ggtacgttca ccgcgaactc 900 ttetítcccg ggcaacggct ccaetctggc 960 aaaggccggc gaaaccgtcg ttgaactgtg 1020 cgttctgcca cgtggcattg ccaccaagaa 1080 ggccatgggt ggatccacca acaccatcct 1140 agttgacttc gacctcgcag acatcgacga 1200 ggctgcacca aactecgact aecacatgga 1260 aetgctcggc gagctcaacc gcggtggact 1320 caacgacctt gaaggttggt Eggatgactg 1380 agcaaccgaa ctcteccacg cagccccagg 1440 cgagaaccgc Cgggacgaac tcgacaccga 1500 acacgcctac accgccgacg gcggcctggt 1560 cgcagtgatc aagtccgcag gtatcgaaga 162Q agttgtcgaa agccaggaag aggcagtctc 1680 tgtcatcctg accaagacca tccaagctgg ateagQtgga eaaggeatgc aggaaatgct cctgggcaag aagtgtgcac tgatcaccga gtccatcggc cacgtctccc cagaagcagc cggcgacatc gtctccatcg acgttcacaa ggaactccag cgccgccgcg acgctatgaa ccgtaaccgc gttgtcacca aggcactgcg taagggtgca gtccgteagg tcgactaacc ctttgggttc cggegctttt teatgtettg gcaaatactc accacaagtt gcaggatttc agccctatgc gtgcaacttt cggaccgatt ccttgcectg gaagctttca gggaccacaa ctattcttcc gttcaagcgc ctcaaacacc cgaatcccca aacagccttc tacagcacca accctcacca ggagggtctc tttctaaaac ccgaaccacc acageagaac tgcegetgcg accagtggac gctttgccca acctcggcca aactgaagtc cgacaaccac gatagtgagg tcaccccaac caccttcatg agtgttgact gtggetaccg ctgctgccae tggggtcatc agttcaatag atggaagcag gatcgcgagg gcctcgactc ta cgaagttctg gccgtccgct acgaaggccc 1740 tcacccaacc geatteetea agggateegg 1800 eggccgtttc tccggaggtt cctcaggact 1860 aeacggcgga gtcattggtc tgatcgaaaa 1920 ccgcaagctc gaagttcagg tctccgacga 1980 cgcctccgag aagceatggc agccagtcaa 2040 cgcatacgc* aagatggcta cctccgctga 2100 ctttgtgagt gtttgagcac cggttcccta 2160 gectgtgtgg gcgtggtgga gctccccgtt 2220 tgctggttgt ggtggatttt cccgctttat 2280 ccaaagggca aagccctgtt tgtggtggat 2340 ctaccccact gaccccaaag tggataggcc 2400 tctccccaca cttgacccat taggcaatta 2460 tgccccaaae cgaacccagg catgaaaaag 2520 tttggctacg cgattgggtt cacacccgca 2560 atgccgatga caaegaagae ccacgagctc 2640 gagtcaaggg aaatcttgcc ggggccggtg 2700 atcagtgcca gcatcaatgg ctcactaagt 2760 tggtgaaggg tggtaaagga tgtcgccacc 2820 agaccaagga gcaggaagae aecagccgca 2880 atttcaggcc actggtaacc agcgaactct 2940 2952 <210>2 <211> 612 <212>PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400>2
Met Zle Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala
1 5 10 15
Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe
20 25 30
Gly Lys Pro Ile Val Ala Ile val Asn Ser Tyr Thr Gin Phe Val Pro
35 40 45
Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Val Aep Asp
65 70 75 80
Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg
85 90 95
Glu íle Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala Hla Thr Ala
100 105 110
Aep Ala Met Val Cys 11« Ser Asn Cys Aep Lye Ile Thr Pro Gly Met
115 120 12S
Leu Aen Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser Gly
130 135 140
Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala
210 215 220
Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Oly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu
245 250 255
Pro Arg 01y Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu
260 265 270
Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu Kle Ile Leu Ala
275 280 285
Ala Ala Gin Glu Gly Glu Val Αβρ Phe Asp Leu Ala Aep Ile Asp Glu
290 295 300
Leu Ser Lye Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp
305 310 315 320
Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Lea
325 330 335
Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Aen Lys Asp Val His Ser Val
340 345 350
His Ser Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp íle Arg Ser
355 360 365
Gly Lys Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Oly
370 375 380
Gly Ile Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu
3Θ5 390 395 400
Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala
405 410 415
Tyr Thr Ala Asp Cly Gly Leu val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro
420 425 430
Asp Gly Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Olu Glu Glu Leu Trp Asn
435 440 445
Phe Thr Gly Pro Ala Arg Val val Glu Ser Gin Glu Glu Ala Val Ser
450 455 460
Val Ile Leu Thr Lys Thr Ile Gin Ala Gly Olu Val Leu val val Arg
465 470 475 4B0
Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Gly Pfo Gly Met Oln Glu Met Leu His Pro
485 490 495
Thr Ala Phe Leu Lye Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lye Cys Ala Leu Ile
500 505 510
Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Oly Leu Ser íle Gly His
515 520 525
Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Íle Gly Leu Ile Glu Asn
530 535 540
Gly Asp Ile Val Ser Zle Asp Val His Asn Arg Lye Leu Olu Val Gin
545 550 555 560
val Ser Aep Glu Glu Leu Gin Arg Arg Arg Aep Ala Met Asn Ala Ser
S65 570 575
Glu Lys ΡΓΟ Trp Gin Pro Val ÄíJn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala
580 585 590
Leu Arg Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Aep Lys Gly Ala Val
595 600 605
Arg Gin Val Asp
610 <210> 3 <211> 2164 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400 3
Gly Pro Met Glu Ala aiy Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala HÍS
14 5 150 155 160
Ala pro Thr ASp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Aep Ala
165 170 175
Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala cys Pro Thr
180 1B5 190
Cye Gly Sar Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Aen Ser Met
195 200 205
Cys Leu gcttcggggt accaatteet ttaagaacca gattcagctt ttcggtaagg acgaaacact agtttetaag geaactgcaa egaggtattt cgaggtcagc aaacgccctt tgcggtttgc tcttgaggta aaaatttgac tccataacga gaatcaaatc ggaatttatt tattctgagc caggcaetg* tgeaaagaaa atccgcaccc agaaagtttc ggttctcaoc agctatgatg gcgtcgatat gctccCtgtt ggtgattccg ccttgtcgat caccttggat gagaCgattg agcgtgcgct tgtggtggtt gatctgccgt cggtggagtc cgcgatccgg gtcatgcgtg gtggcgtgga gatcgcgcag acgattcgac gccacatcgg gtacaccccg cagtccgagc gtggcgcgag ttetggaaag ctcatcgccg ttgcggttgt gttggagatg gttccagcag tcagatcaat ctgttgtaca ttctcggcca 60 ttcacttgaa tcggcagcaa agcttcttaa 120 tagaaetctc cgagaaatgg aattagttca 180 gctcacggat aaaggtcgtg agatagtagg 240 gaacttaatc gagcaacacc cctgaacagt 300 tggtcatcac atctatactc atgcccatgt 360 gtcatttccg cgaagctaaa gtaaacggcc 420 cgctttcggc gcgcattttt gatgaggctg 480 cCgccaacgc tgtgctgggt cgcgatacca 540 tgctggccaa ggcggtgacg atcgctacga 600 ttggtaccta tgaggtgagc ccaaateagg 660 aaacgggtgc ggctgcggtg aagaCegagg 720 gcattgttga tgctggaatt ccggttgtcg 780 attccttggg cggccacgtg gttcagggtc 840 atgcccgcgc gttggagcag gcgggtgcgt 900 aggcagcgcg cgaggttacc gaggatcttt 960 ccatc«ccac tatcggaetť ggtgccggca aggatgcctt cggcctcaatf cgcggcaaga tgggegattc cttgcacgaC gecgcgcagg tcccaggcga agcggagtcť ttttaatgca cgccctcctc caccacaaac ccgtcgggcc acacgcctcg ttggttaaag cagcacgcgc tgtcaatcce ctgeagtEtg aagcactcgg ccaactcgac gccgatttag cactgcttga cgatgtggag gaaatgtacŕ ccggtggctt eggaaeaaaa ttggagggtg ccageaggec ggcgaagetg ttcaaCttgí tgcgccctga gcaggttgcg gtgattcggc gattggttgc cgctccgatt attcgtggcg ccgatggcte cgcggatcag cgagcgcaa? ctctggtgct aaaagcagct ggtgaegcgC tagatatcca cggcgtgcgc ttggatcacc tggaaatcgc cgacggcctg cccacccaaC eagcgttggE gttgatcgac aatatcgagc tctagtacca acgcgtgctc agctcagtgt ttttaggtgc ctgcggtggc gtggcctcaC ccgacagegc caca atggcacaga tgggcaggtt ttggtgtggc 1020 agccacgatt cgCacgcgag tacgccacct 1080 cct.acatcgc cgatatccac gagggtacct 1140 ggtagcaacc acaaagcagg cgcttatcga 1200 cgtccccacc atgggtgcgc cacacagcgg 1360 Cgaaaacgac actgttgtag ccagtattet 1320 tgattgcgat gattaccgca actatccccg 1380 agaggcaggt gtggatattg tgttcgcacc 1440 gccactagtg tgggcgcgca ccggttccat 1500 tggccatttc gatggtgtgg ctaccgtggC 1560 tcgtgcatat tttggacaaa aagatgctca 1620 egatctagec attcccgtgg agattegtcc 1680 agccgaatee agccgcaate aacgtctttc 1740 gccgcaggtg ttgagtgggt tgcagcgtcg 1800 aggtgcgcgc gacaccttgg ccagcgccga 1860 cgacccagcc accctcgaac cattagaaat 1920 ggtcggegeg attttegtgg ggceggtgeg 1980 accetgcgtt gcagcacgca gcttcgcata 2040 gcggtgcgga tcggaaccgg gagttggcca 3100 ccatgccgcc tgacgagctg cacceaacgc 3160 3164 <210>4 <211> 271 <212>PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4
Met Pro 1 Met Ser Gly íle Asp Ala Lys Lys íle Arg Thr Arg His 15 Phe
5 10
Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gin Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ala Leu Ser Ala Arg íle Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu
35 40 45
Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr
5D 55 60
Leu Sar íle Thr Leu Asp Glu Met Zle Val Leu Ala Lys Ala Val Thr
65 70 75 80
íle Ala Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr
85 90 95
Tyr Glu Val Ser Pro Aen Gin Ala Val Glu Ser Ala íle Arg Val Met
100 105 110
Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys íle Glu Gly Gly Val Glu íle
115 120 125
Ala Gin Thr íle Arg Arg íle Val Asp Ala Gly íle Pro Val Val Gly
130 135 140
His íle Gly Tyr Thr Pro Gin Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val
145 150 155 160
Val Gin Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Tie Ala Aap Ala Arg
165 170 L75
Ala Leu Glu Gin Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met val Pro
180 185 190
Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr G1U ASP Lau Ser íle Thr Thr 118
195 200 205
Cly íle Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gin Val Leu Val Trp Gin
210 215 220
Asp Ala Phe Gly Leu Aen Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Vsi Arg Glu
225 230 235 240
Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu H18 Aap Ala Ala Gin Ala Tyr íle
245 250 255
Ala Aap íle Hla Ala Gly Thr Phe Pro Gly G1U Ala G1U Ser Phe
260 265 270
<210 >5
<211 >2' 79
<212 >P RT
<213> Corynebacterium glutamicum <400>5
Met Gin Val Ala Thr Thr Lys Gin Ala Leu íle Asp Ala Leu Leu Hie
1 5 10 15
His Lya Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Qly Ala Leu His Sar Gly
20 25 30
His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr val Val
35 40 45
Ala Ser íle Phe Val Aen Pro Leu GLn Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys
50 55 60
Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu
65 70 75 80
Leu Glu Glu Ala Gly Val ASP íle Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu
85 sa SS
Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser íle
100 105 110
Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Ph· Asp Gly val
115 120 125
Ala Thr Val Val ALa Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala
130 135 140
Tyr Phe Gly Gin Lys Asp Ala Gin Qln Val Ala Val íle Arg Arg Leu
145 150 155 160
Val Ala Asp Leu Asp íle pro Val Glu 11« Arg Pro Val Pro Zle íle
165 170 375
Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gin Arg Leu Ser
180 185 190
Ala Asp Gin Arg Ala Sln Ala Lau Val Leu Pro Gin Val Leu Ser Gly
195 200 205
Leu Gin Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp íle Gin Oly Ale
210 215 220
Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp Hla Leu Glu
225 230 235 240
11· Val Asp Yre Ma Thr Leu Glu Pro Lau Glu 11· Xap Gly Leu L»u
245 250 255
Thr Gin Pro Ala Lau val val Gly Ala 11· Phe Val Gly Pro Val Arg
260 265 270
Leu íle Asp Asn Zle Glu Leu
275

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu, vyznačujúci sa tým, že sa zosilní aktivita dehydratázy dihydroxykyseliny - ilvD a/alebo expresia génu ilvD v mikroorganizme.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa dodatočne zosilní aktivita syntázy acetohydroxykyseliny - ilvBN a izomeroreduktázy - ilvC a/alebo expresia génu ilvBNC v mikroorganizme.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m , že endogénna aktivita ilvD alebo ilvBNCD sa zvýši v mikroorganizme.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že mutáciou endogénneho génu ilvD alebo génov ilvBNCD sa zodpovedajúce enzýmy produkujú so zvýšenou aktivitou.
  5. 5. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že expresia génov ilvD alebo ilvBNCD sa zosilní zvýšením počtu kópií génov.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m , že na zvýšenie počtu kópií génov sa gén ilvD alebo gény ilvBNCD zabudujú do génového konštruktu.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že mikroorganizmus sa transformuje génovým konštruktom obsahujúcim gén ilvD alebo gény ilvBNCD.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že ako mikroorganizmus sa použije Corynebacterium glutamicum.
  9. 9. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa použije mikroorganizmus, v ktorom sa aktivita aspoň jedného enzýmu, ktorý sa zúčastňuje látkovej výmeny znižujúcej tvorbu L-valínu, oslabí alebo vypne.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že aktivita enzýmu treoníndehydratázy - ilvA, ktorý sa zúčastňuje syntézy L-izoleucínu, sa oslabí alebo vypne.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 9 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že aktivita jedného alebo viacerých enzýmov zúčastňujúcich sa špecificky syntézy D-pantotenátu, sa oslabí alebo vypne.
  12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že aktivita enzýmu kctopantoáthydroxymetyltransferázy (panB) a/alebo enzýmu pantotenátligázy - panC sa oslabí alebo vypne.
  13. 13. Mikroorganizmus transformovaný génovým konštruktom obsahujúcim gén ilvD alebo gény ilvBNCD, v ktorom aktivita jedného alebo viacerých enzýmov zúčastňujúcich sa špecificky syntézy D-pantotenátu je oslabená alebo vypnutá.
  14. 14. Transformovaný mikroorganizmus podľa nároku 13, v ktorom aktivita enzýmu ketopantoáthydroxymetyltransferázy (panB) a/alebo enzýmu pantotenátligázy - panC je oslabená alebo vypnutá.
  15. 15. Transformovaný mikroorganizmus podľa nároku 13 alebo 14, v ktorom aktivita enzýmu treoníndehydratázy - ilvA zúčastňujúceho sa syntézy L-izoleucínu je oslabená alebo vypnutá.
  16. 16. Transformovaný mikroorganizmus podľa jedného alebo viacerých z nárokov 13 až 15, kde mikroorganizmom je Corynebacterium glutamicum.
SK1205-2001A 1999-02-22 2000-02-21 Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu a transformovaný mikroorganizmus SK285870B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19907567A DE19907567B4 (de) 1999-02-22 1999-02-22 Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin
PCT/EP2000/001405 WO2000050624A1 (de) 1999-02-22 2000-02-21 Verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-valin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK12052001A3 SK12052001A3 (sk) 2002-01-07
SK285870B6 true SK285870B6 (sk) 2007-10-04

Family

ID=7898429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1205-2001A SK285870B6 (sk) 1999-02-22 2000-02-21 Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu a transformovaný mikroorganizmus

Country Status (12)

Country Link
US (1) US7632663B1 (sk)
EP (1) EP1155139B2 (sk)
JP (1) JP4638048B2 (sk)
KR (1) KR100614029B1 (sk)
AT (1) ATE236991T1 (sk)
CZ (1) CZ20013037A3 (sk)
DE (2) DE19907567B4 (sk)
DK (1) DK1155139T4 (sk)
ES (1) ES2197076T5 (sk)
PT (1) PT1155139E (sk)
SK (1) SK285870B6 (sk)
WO (1) WO2000050624A1 (sk)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19855312A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
WO2002057476A2 (en) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Aktiengesellschaft Methods and microorganisms for the production of 3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionic acid (hmbpa)
KR100442768B1 (ko) * 2001-05-21 2004-08-04 주식회사 한국표지화합물연구소 방사성동위원소 표지화합물로서 ｌ-발린의 제조방법
KR100451299B1 (ko) * 2002-03-21 2004-10-06 씨제이 주식회사 Ｌ―쓰레오닌의 제조방법
GB2391083B (en) * 2002-07-19 2006-03-01 Picochip Designs Ltd Processor array
DE102004046933A1 (de) * 2004-09-28 2006-03-30 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Valin sowie dafür geeigneter Mikroorganismus
DE102005019967A1 (de) 2005-04-29 2006-11-02 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
UA96928C2 (ru) 2005-10-26 2011-12-26 Э.И. Дю Пон Де Немур Энд Компани Ферментативное продуцирование спиртов с четырьмя атомами углерода
EP1860193A1 (en) * 2006-05-22 2007-11-28 Evonik Degussa GmbH Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR100832740B1 (ko) * 2007-01-17 2008-05-27 한국과학기술원 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법
KR20090117739A (ko) 2007-02-09 2009-11-12 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 재조합 미생물을 이용한 생물연료의 생산
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
EP2248906A4 (en) 2008-01-23 2012-07-11 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
JP5662167B2 (ja) * 2009-02-09 2015-01-28 協和発酵バイオ株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
BRPI1012007A2 (pt) * 2009-06-05 2015-09-22 Evonik Degussa Gmbh "método para a preparação de ácido 2-ceto-carboxílico"
JPWO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2013-01-10 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012223091A (ja) 2009-08-25 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR101251540B1 (ko) 2010-10-08 2013-04-08 한국과학기술원 Ｌ-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 ｗ 균주 및 이를 이용한 ｌ-발린의 제조방법
KR101117022B1 (ko) * 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
WO2013027709A1 (ja) * 2011-08-22 2013-02-28 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるバリンの製造方法
PE20150681A1 (es) 2013-05-13 2015-05-15 Ajinomoto Kk Metodo para producir l-aminoacidos
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
JP6519476B2 (ja) 2013-10-23 2019-05-29 味の素株式会社 目的物質の製造法
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
JP7124338B2 (ja) 2018-02-27 2022-08-24 味の素株式会社 変異型グルタチオン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
KR102344689B1 (ko) * 2020-09-01 2021-12-29 씨제이제일제당 주식회사 L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2023117708A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Chr. Hansen A/S Reduced pantothenic acid levels in fermentative production of oligosaccharides
WO2024096123A1 (ja) * 2022-11-04 2024-05-10 株式会社バイオパレット 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法
CN116731933B (zh) * 2023-08-03 2023-10-03 欧铭庄生物科技(天津)有限公司滨海新区分公司 一种谷氨酸棒杆菌及其在生产缬氨酸中的应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU875663A1 (ru) 1978-06-30 1982-09-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени
EP0332234B1 (en) * 1983-02-17 1993-07-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for preparing l-tyrosine
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JP2748418B2 (ja) * 1988-08-03 1998-05-06 味の素株式会社 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物
DE3942947A1 (de) * 1989-12-23 1991-06-27 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur herstellung von l-isoleucin und dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna
US5534421A (en) * 1991-05-30 1996-07-09 Ajinomoto Co., Inc. Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production
JPH05344893A (ja) * 1992-06-12 1993-12-27 Mitsubishi Petrochem Co Ltd アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用
JPH06277067A (ja) * 1993-03-26 1994-10-04 Mitsubishi Petrochem Co Ltd アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子ｄｎａ
DE4400926C1 (de) * 1994-01-14 1995-06-01 Forschungszentrum Juelich Gmbh Herstellung von L-Isoleucin mittels rekombinanter Mikroorganismen mit deregulierter Threonindehydratase
US5998178A (en) * 1994-05-30 1999-12-07 Ajinomoto Co., Ltd. L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation
DE69535674T2 (de) * 1994-08-30 2009-01-02 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur herstellung von l-valin und l-leucin
JPH0889249A (ja) * 1994-09-29 1996-04-09 Mitsubishi Chem Corp ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片
DE19855312A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien

Also Published As

Publication number Publication date
DE19907567A1 (de) 2000-08-24
JP2002537771A (ja) 2002-11-12
US7632663B1 (en) 2009-12-15
ES2197076T5 (es) 2009-05-20
EP1155139B1 (de) 2003-04-09
CZ20013037A3 (cs) 2002-01-16
ATE236991T1 (de) 2003-04-15
KR100614029B1 (ko) 2006-08-23
DE50001708D1 (de) 2003-05-15
WO2000050624A1 (de) 2000-08-31
DK1155139T4 (da) 2009-04-20
DE19907567B4 (de) 2007-08-09
EP1155139A1 (de) 2001-11-21
JP4638048B2 (ja) 2011-02-23
DK1155139T3 (da) 2003-07-28
EP1155139B2 (de) 2009-02-25
PT1155139E (pt) 2003-08-29
SK12052001A3 (sk) 2002-01-07
ES2197076T3 (es) 2004-01-01
KR20010108172A (ko) 2001-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK285870B6 (sk) Spôsob mikrobiálnej prípravy L-valínu a transformovaný mikroorganizmus
US6177264B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria
KR100758831B1 (ko) Ｌ-라이신 생산 코리네박테리아 및 ｌ-라이신의 제조방법
US7435584B2 (en) L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine
RU2262532C2 (ru) Полинуклеотид, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксикиназу, и зонд, предназначенный для его получения
SK163399A3 (en) Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms
KR100782867B1 (ko) Ｌ-리신을 생산하는 코리네박테리아 및 리신을 제조하는방법
US20100151449A1 (en) Method for poduction of l-amino acids by fermentation
US6861246B2 (en) L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of lysine
CZ428299A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií
MXPA99010768A (en) Procedure for the preparation by fermentation of d-pantothenic acid using corinefor bacteria
CZ428199A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20140221