ES2197076T5 - Procedimiento para la produccion microbiana de l-valina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación microbiana de L- valina, en el que se refuerzan la actividad de la dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) y/o la expresión del gen de ilvD en un microorganismo.
Description
Procedimiento para la preparación microbiana de
L-valina.
El presente invento se refiere a un
procedimiento para la preparación microbiana de
L-valina de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
11, así como a microorganismos transformados, de acuerdo con las
reivindicaciones 12 a 15 que se pueden emplear en el
procedimiento.
El aminoácido L-valina
constituye un producto importante comercialmente, que encuentra
aplicación en la nutrición de animales, en la nutrición de seres
humanos y en la medicina. Existe por lo tanto un interés
generalizado en poner a disposición procedimientos mejorados para
la preparación de L-valina.
La valina se puede preparar por síntesis química
o por biotecnología mediante fermentación de microorganismos
apropiados en soluciones nutritivas apropiadas. La ventaja de la
preparación por biotecnología por medio de microorganismos se
encuentra en la formación de la forma
estereo-isómera correcta, a saber de la forma L de
valina exenta de D-valina.
Diferentes especies de bacterias, tales como
p.ej. Escherichia coli, Serratia marcescens, Corynebacterium
glutamicum, Brevibacterium flavum o Brevibacterium
lactofermentum, pueden producir L-valina en una
solución nutritiva, que contiene glucosa. El documento de patente
de los EE.UU. 5.658.766 muestra que en el caso de Escherichia
coli, mediante mutación en la aminoacil - tARN - sintetasa se
puede conseguir una formación aumentada de
L-valina. El documento de solicitud de patente
internacional WO 96 06926 muestra además que mediante una
auxotrofía con ácido lipónico se puede conseguir un aumento de la
formación de L-valina con Escherichia coli.
El documento de solicitud de patente europea EP 0.694.614 A1
describe cepas de Escherichia coli, que son portadoras de
resistencias frente al ácido
\alpha-ceto-butírico, y que en una solución nutritiva que contiene glucosa producen L-valina, L-isoleucina o L-leucina.
\alpha-ceto-butírico, y que en una solución nutritiva que contiene glucosa producen L-valina, L-isoleucina o L-leucina.
En el documento EP 0.477.000 se muestra que
mediante mutagénesis de Corynebacterium o Brevibacterium y selección
en cuanto a resistencia a valina se puede mejorar la formación de
L-valina. En el mismo documento EP se muestra
también que por selección de Corynebacterium o Brevibacterium en
cuanto a resistencia frente a diferentes compuestos análogos a
piruvatos, tales como
\beta-fluoro-piruvato,
\beta-cloro-piruvato,
\beta-mercapto-piruvato o
piruvato de trimetilo, se puede conseguir una mejorada formación de
L-valina. Por Nakayama y colaboradores (Nakayama y
colaboradores, 1961, J. Gen. Appl. Microbiol. Jpn) es conocido que
las auxotrofías introducidas por mutaciones no dirigidas pueden
conducir a una acumulación mejorada de L-valina.
En el documento EP 0.356.739 A1 se muestra,
además de ello, que en el caso de una amplificación de la zona de
ADN que codifica la acetohidroxiácido - sintasa (ilvBN, véase
también la Figura 1) se mejora la formación de
L-valina mediante el plásmido pAJ22OV3.
El documento
EP-A-872.547 divulga que en el caso
de microorganismos de Escherichia, se puede aumentar la
producción de L-valina mediante una modificación del
gen de H^{+}ATP. El gen puede incluir también el gen de ilvA.
La revista Journal of Bacteriology, 1993, tomo
175, Nº 17, páginas 5595-5603 divulga que la
acetohidroxiácido - sintasa y la isómero - reductasa (ilvC) son
catalizadores para reacciones consecutivas en la ruta para obtener,
entre otros compuestos, valina en el seno de Corynebacterium
glutamicum. La acetohidroxiácido - sintasa es codificada por
dos genes, ilvB e ilvN.
La cita Nucleic Acids Research, 1987, tomo 15,
Nº 5, páginas 2137-2155, divulga la secuenciación
del operón ilvGMEDA de E. coli, que contiene 5 genes, que
codifican 4 de las 5 enzimas, que son necesarias para la
biosíntesis de L-valina.
La cita de Gene, 1993, tomo 137, páginas
179-185, divulga la secuenciación del gen de ilv3 en
Saccharomyces cerevisiae, que se necesita para la
biosíntesis de la dihidroxiácido - hidratasa.
El documento de patente japonesa Tokkai Hei
8-89249 divulga un ADN que procede de bacterias
corineformes, el cual codifica la dihidroxiácido - deshidratasa y
se puede utilizar para la producción de
L-valina.
El documento de patente japonesa Tokkai Hei
5-344.893 muestra que la producción de
L-valina se puede aumentar mediante la utilización
de plásmidos, que son portadores del gen de acetohidroxiácido -
sintasa.
La publicación "Isoleucine Synthesis in
Corynebacterium glutamicum: Molecular Analysis of ilvBN -
ilvD - ilvC Operon" [Síntesis de isoleucina en
Corynebacterium glutamicum: Análisis molecular del operón de
ilvBN - ilvD - ilvC] de C. Keilhauer y colaboradores, Journal of
Bacteriology, Septiembre de 1993, páginas
5595-5603, divulga análisis estructurales del operón
de ilvBNC.
El documento EP 1.006.189 A2 divulga un
procedimiento para la preparación de ácido
D-pantoténico, en el que los genes panB y panC se
refuerzan, en particular se sobreexpresan, individualmente o
combinados uno con otro. Facultativamente, se puede llevar a cabo
una mutación por defecto de ilvA, o un refuerzo o respectivamente
una sobreexpresión de los genes ilvBN - ilvD ó ilvC.
Es misión del presente invento poner a
disposición nuevos fundamentos para la producción microbiana de
L-valina, en particular con ayuda de bacterias
corineformes.
El problema planteado por esta misión se
resuelve conforme al invento mediante el recurso de que se refuerzan
la actividad de dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) y/o la
expresión del gen de ilvD en un microorganismo, siendo debilitada o
excluida la actividad de una o varias enzimas que participan
específicamente en la síntesis de un D-pantotenato.
En combinación con esto, se refuerzan las actividades de
acetohidroxiácido - sintasa (ilvBN) y de isómero - reductasa (ilvC)
y/o la expresión del gen de ilvBNC en un microorganismo. Para el
procedimiento conforme al invento pueden pasar a emplearse
adicionalmente unos microorganismos, en los que la actividad de por
lo menos una enzima, que participa en una ruta metabólica, que
disminuye la formación de L-valina, ha sido
debilitada o excluida. Así, en los procedimientos conformes al
invento se emplean preferiblemente microorganismos con una mutación
por defecto en el gen de treonina - deshidratasa (ilvA) y/o con una
mutación por defecto en uno o varios genes de la síntesis de
pantotenatos.
Con los conceptos "valina" o
"L-valina" se entiende, en el sentido del
invento reivindicado, no solamente el ácido libre, sino también una
sal de éste, tal como p.ej. la sal de calcio, sodio, amonio o
potasio.
El concepto "refuerzo" describe el aumento
de la actividad intracelular de las mencionadas enzimas ilvD, ilvB,
ilvN e ilvC. Para el aumento de la actividad de las enzimas se
aumenta en particular la actividad endógena en el microorganismo.
Un aumento de la actividad de las enzimas se puede conseguir, por
ejemplo, mediante el recurso de que por alteración del centro
catalítico se efectúa una conversión aumentada del substrato o por
el hecho de que se suprime el efecto de agentes inhibidores de
enzimas. También se puede provocar una actividad enzimática
aumentada por aumento de la síntesis de enzimas, por ejemplo
mediante amplificación de genes o mediante exclusión de factores,
que reprimen la biosíntesis de enzimas. La actividad endógena de
enzimas se aumenta conforme al invento de modo preferido por
mutación del correspondiente gen endógeno. Tales mutaciones se
pueden generar de manera no dirigida ya sea de acuerdo con métodos
clásicos, tales como por ejemplo irradiación con rayos UV o con
productos químicos que provocan mutaciones, o deliberadamente
mediante métodos de tecnología genética, tales como
supresión(es), inserción(es) o intercambio(s)
de nucleótidos.
El refuerzo de la expresión de genes se efectúa
conforme al invento de un modo preferido por aumento del número de
copias de los genes. Para ello, el gen (o los genes) se
incorpora(n) en una estructura artificial (construcción)
génica o en un vector, que contiene preferiblemente secuencias
reguladoras de genes, asociadas con los genes, en particular las
que refuerzan la expresión de los genes. A continuación un
microorganismo, preferiblemente Corynebacterium glutamicum,
se transforma con las correspondientes estructuras artificiales
génicas.
Se comprobó que mediante expresión reforzada del
gen de ilvD para la biosíntesis de valina a partir de
Corynebacterium glutamicum, que codifica la enzima
dihidroxiácido - deshidratasa, se produce L-valina
de una manera mejorada. Conforme al invento, junto a la expresión
reforzada de este gen, también la expresión reforzada de los genes
de ilvBN, que codifican la enzima acetohidroxiácido - sintasa, y del
gen de ilvC, que codifica la enzima isómero - reductasa, produce en
Corynebacterium glutamicum una formación mejorada de
L-valina. Una mejora adicional de la formación de
L-valina se consigue por sobreexpresión de todos los
mencionados genes en Corynebacterium glutamicum. Los genes o
estructuras artificiales génicas se pueden presentar en el organismo
hospedante ya sea en plásmidos con un diferente número de copias o
se pueden integrar y amplificar en el cromosoma.
Un aumento adicional de la expresión de genes se
puede producir - de manera alternativa o combinada con un aumento
del número de copias - mediante el refuerzo de factores reguladores,
que influyen positivamente sobre la expresión de genes. Así, un
refuerzo de elementos reguladores puede efectuarse en el plano de la
transcripción, utilizándose en particular señales de transcripción
reforzadas. También la región de promotor y de regulación, que se
encuentra secuencia arriba del gen estructural, se puede mutar. De
igual manera actúan ciertas casetes de expresión, que se incorporan
secuencia arriba del gen estructural. Mediante promotores inducibles
es posible adicionalmente aumentar la expresión en el transcurso de
una formación de L-valina por fermentación. Junto a
ello, sin embargo, también es posible un refuerzo de la traducción,
mejorándose por ejemplo la estabilidad del ARN-m
(ácido ribonucleico mensajero). Además, se pueden utilizar genes que
codifican la correspondiente enzima con una alta actividad.
Alternativamente, se puede conseguir además una sobreexpresión de
los correspondientes genes por modificación de la composición de
los medios y realización de la cultivación. Instrucciones acerca de
ello las encuentra un experto en la especialidad, entre otras, en
las citas de Martín y colaboradores (Bio/Technology 5,
137-146 (1987)), de Guerrero y colaboradores (Gene
138, 35-41 (1994)), de Tsuchiya y Morinaga
(Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), de Eikmanns y
colaboradores (Gene 102, 93-98 (1991)), en el
documento de patente europea EP 0.472.869, en la patente de los
EE.UU. 4.601.893, en las citas de Schwarzer y Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)), de Reinscheid y colaboradores
(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132
(1994)), de LaBarre y colaboradores (Journal of Bacteriology 175,
1001-1007 (1993)) y en la solicitud de patente
internacional WO 96/15246.
Para un refuerzo de la expresión de genes son
posibles asimismo todas las combinaciones imaginables de las
medidas antes mencionadas.
Los microorganismos, que se pueden emplear en el
procedimiento conforme al invento, pueden producir
L-valina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa o a partir de glicerol
y etanol. Puede tratarse de bacterias
gram-positivas, p.ej. del género Bacillus, o de
bacterias corineformes del género Corynebacterium ya mencionado, o
también de Arthrobacter. En el caso del género Corynebacterium se
mencionó en particular ya la especie Corynebacterium
glutamicum, que es conocida en el sector especializado por su
capacidad de formar aminoácidos. A esta especie pertenecen cepas de
tipo salvaje, tales como p.ej. Corynebacterium glutamicum
ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869, Brevibacterium thiogenitalis
ATCC19240, Corynebacterium melassecola ATCC19765 y otras.
Para el aislamiento del gen de ilvD de
Corynebacterium glutamicum u otros genes se establece
primeramente un banco de genes. El establecimiento de bancos de
genes se describe fundamentalmente en libros de texto y manuales
generalmente conocidos. Como ejemplos se mencionarán el libro de
texto de Winnacker: Gene und Klone. Eine Einführung in die
Gentechnologie [Genes y clones. Una introducción en la tecnología
genética] (Editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual
de Sambrook y colaboradores: Molecular Cloning, A Laboratory Manual
[Clonación molecular, un manual de laboratorio] (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989). Un banco de genes conocido es el de la
cepa W3110 de E. coli K-12, que fue
establecida en vectores \lambda por Kohara y colaboradores (Cell
50, 495-508 (1987)). Bathe y colaboradores
(Molecular and General Genetics, 252: 255-265,
1996) describen un banco de genes de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032, que se estableció con ayuda del vector
cósmido SuperCos (Wahl y colaboradores, 1987, Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164) en
E. coli K-12 NM554 (Raleigh y colaboradores,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575). Para
la producción de un banco de genes de Corynebacterium
glutamicum en Escherichia coli se pueden utilizar
también plásmidos tales como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25,
807-818 (1979)) o pUC19 (Norrander y colaboradores,
1983, Gene, 26: 101-106). Para la producción de un
banco de genes de Corynebacterium glutamicum en
Corynebacterium glutamicum se pueden utilizar plásmidos
tales como pJC1 (Cremer y colaboradores, Mol. Gen. Genet. (1990)
220: 3221-3229) o pECM2 (Jäger y colaboradores, J.
Bacteriol (1992) 174: 5462-5465). Como hospedantes
son idóneas en especial las cepas de bacterias que tienen defecto
de restricción y recombinación. Un ejemplo de ello es la cepa de
Escherichia coli DH5\alphamcr, que había sido
descrita por Grant y colaboradores (Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649), o la
cepa Corynebacterium glutamicum R127, que había sido aislada
por Liebl y colaboradores (FEMS Lett (1989) 65:
299-304).
El banco de genes se incorpora a continuación en
una cepa indicadora por transformación (Hanahan, Journal of
Molecular Biology, 166, 557-580, 1983) o por
electroporación (Tauch y colaboradores, 1994, FEMS Microbiological
Letters, 123: 343-347). La cepa indicadora se
distingue por el hecho de poseer una mutación en el gen que
interesa, que provoca un fenotipo detectable, p.ej. una auxotrofía.
Las cepas indicadoras y respectivamente mutantes son obtenibles a
partir de fuentes publicadas o de colecciones de cepas o deben
eventualmente ser producidas por sí mismas. Dentro del marco del
presente invento se ha aislado la mutante R127/7 de
Corynebacterium glutamicum, que tiene defecto en el gen ilvD
que codifica la dihidroxiácido deshidratasa. Después de
transformación de la cepa indicadora, tal como p.ej. la mutante
R127/7 de ilvD, con un plásmido recombinante que lleva el gen que
interesa, tal como p.ej. el gen de ilvD y después de expresión del
mismo, la cepa indicadora es prototrofa en lo que se refiere a la
correspondiente propiedad, tal como p.ej. la necesidad de consumir
L-valina.
El gen o fragmento de ADN que se ha aislado de
esta manera se puede caracterizar por determinación de la secuencia,
tal como p.ej. se describe en la cita de Sanger y colaboradores
(Proceedings of the National of Sciences of the United States of
America USA, 74: 5463-5467, 1977). A continuación se
puede analizar el grado de identidad con genes conocidos, que están
contenidos en bancos de datos tal como p.ej. el GenBank (Benson y
colaboradores, 1998, Nucleic Acids Research, 26:
1-7), con métodos publicados (Altschul y
colaboradores, 1990, Journal of Molecular Biology 215:
403-410).
De esta manera se obtuvo la secuencia de ADN de
Corynebacterium glutamicum que codifica el gen ilvD, que es
parte componente del presente invento como SEQ ID NO 1. Además, a
partir de la secuencia de ADN presente, se dedujeron con los
métodos antes descritos las secuencias de aminoácidos de las
correspondientes enzimas. En SEQ ID NO 2 se representa la secuencia
resultante de aminoácidos del producto del gen ilvC, a saber la
dihidroxiácido deshidratasa.
El gen caracterizado de esta manera se puede
llevar a expresión a continuación individualmente o en combinación
con otros en un apropiado microorganismo. Un método conocido para
expresar o sobreexpresar genes consiste en amplificar a éstos con
ayuda de vectores de plásmidos, que además de ello pueden estar
provistos de señales de expresión. Como vectores de plásmidos
entran en cuestión aquellos que pueden replicarse en los
correspondientes microorganismos. Para el Corynebacterium
glutamicum entran en cuestión p.ej. los vectores pEKEx1
(Eikmanns y colaboradores, Gene 102: 93-98 (1991))
o pZ8-1 (documento de patente europea 0 375 889) o
pEKEx2 (Eikmanns y colaboradores, Microbiology 140:
1817-1828 (1994) o pECM2 (Jäger y colaboradores,
Journal of Bacteriology 174(16): 5462-5465
(1992)). Ejemplos de tales plásmidos son pJC1ilvD, pECM3ilvBNCD, y
pJC1ilvBNCD. Estos plásmidos son los vectores pendulantes de
Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum que son
portadores del gen ilvD y respectivamente del gen ilvD junto con
los genes ilvB, ilvN e ilvC.
Los autores del invento han encontrado además
que el refuerzo del gen individualmente o en combinación con los
genes ilvB, ilvN e ilvC repercute de manera ventajosa en aquellos
microorganismos que presentan una síntesis reducida del aminoácido
L-isoleucina. Esta síntesis reducida se puede
conseguir mediante supresión del gen ilvA, que codifica la enzima
treonina deshidratasa que es específica para la síntesis de
L-isoleucina.
\newpage
La supresión se puede efectuar mediante técnicas
de ADN recombinante dirigidas. Con ayuda de estos métodos se puede
suprimir por ejemplo en el cromosoma el gen ilvA que codifica la
treonina deshidratasa. Métodos apropiados para ello se describen en
las citas de Schäfer y colaboradores (Gene (1994) 145:
69-73) o también de Link y colaboradores (Journal
of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). También se
pueden suprimir solamente partes del gen, o también se pueden
intercambiar fragmentos mutados del gen de treonina deshidratasa.
Por supresión se consigue de esta manera una pérdida de la
actividad de treonina deshidratasa. Un ejemplo de una de tales
mutantes es la cepa ATCC13032\DeltailvA de Corynebacterium
glutamicum, que lleva una supresión en el gen de ilvA.
Los autores del invento han encontrado además
que el refuerzo de los genes ilvD, ilvB, ilvN e ilvC en una
combinación adicional con la síntesis reducida de
D-pantotenato, preferiblemente en combinación con
una supresión adicional del gen ilvA, repercute en microorganismos
de manera ventajosa sobre la formación de L-valina,
así por ejemplo mediante supresiones en el gen panB y panC. La
síntesis reducida de D-pantotenato se puede
conseguir por debilitación o exclusión de las correspondientes
enzimas de biosíntesis o de sus actividades. Para ello entran en
cuestión por ejemplo las enzimas cetopantoatohidroximetil -
transferasa (EC 2.1.2.11), cetopantoato - reductasa, pantotenato -
ligasa (EC 6.3.2.1) y aspartato - descarboxilasa (EC 4.1.1.11). Una
posibilidad de excluir o debilitar enzimas y sus actividades son
procedimientos de mutagénesis.
A éstos pertenecen procedimientos no dirigidos,
que utilizan reactivos químicos, tales como p.ej.
N-metil-N-nitro-N-nitroso-guanidina,
o también irradiación por UV para la mutagénesis, con una búsqueda
subsiguiente de los deseados microorganismos en cuanto a necesidad
de D-pantotenato. Los procedimientos para provocar
una mutación y buscar mutantes son conocidos en términos generales
y se pueden consultar, entre otras citas en las de Miller (A Short
Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1992)) o en el Manual "Manual of Methods for
General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology
(Washington D.C., EE.UU, 1981).
Además pertenecen a esto unas tecnologías de ADN
recombinante dirigidas. Con ayuda de estos métodos se pueden
suprimir, por ejemplo, los genes panB, panC, panE y panD que
codifican la cetopantoatohidroximetil - transferasa, la pantotenato
- ligasa, la cetopantoin ácido - reductasa o la aspartato -
descarboxilasa individualmente o también en común dentro del
cromosoma. Métodos apropiados para ello se describen en las citas de
Schäfer y colaboradores (Gene (1994) 145: 69-73) o
también de Link y colaboradores (Journal of Bacteriology (1998)
179: 6228-6237). También se pueden suprimir
solamente partes de los genes o también se pueden intercambiar
fragmentos mutados de la cetopantoatohidroximetil - transferasa, la
pantotenato - ligasa, la cetopantoin ácido - reductasa y la
aspartato - descarboxilasa. Por supresión o intercambio se consigue
de esta manera una pérdida o una reducción de la respectiva
actividad de enzimas. Un ejemplo de una de tales mutantes es la cepa
ATCC13032\DeltapanBC de Corynebacterium glutamicum, que es
portadora de una supresión en el operón de panBC.
Los microorganismos producidos conformes al
invento se pueden cultivar en régimen continuo o discontinuo en el
procedimiento batch (cultivación por tandas) o por el procedimiento
fed batch (procedimiento de afluencia) o repeated fed batch
(procedimiento de afluencia repetitivo) con el fin de producir
L-valina. Un resumen acerca de métodos de
cultivación conocidos se describen en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
[Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de
bioprocedimientos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991) o en
el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen [biorreactores y disposiciones periféricas]
(editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbadenm 1994)).
El método de cultivación que se ha de utilizar
debe cumplir de manera apropiada las exigencias de los respectivos
microorganismos. Descripciones de medios de cultivo de diferentes
microorganismos están contenidos en el manual "Manual of Methods
for General Bacteriology" [manual de métodos para bacteriología
general] de la American Society of Bacteriology (Washington D.C.,
EE.UU., 1981). Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e
hidratos de carbono tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas
tales como p.ej. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de
cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como p.ej. ácido
palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como
p.ej. glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como p.ej. ácido
acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o en
forma de mezclas. Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno tales como peptonas,
un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta,
agua de maceración de maíz, harina de haba de soja y urea o
compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de
amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio.
Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar de modo individual o en
forma de mezclas. Como fuente de fósforo se pueden utilizar
dihidrógeno fosfato de potasio o hidrógeno fosfato de dipotasio o
las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo
debe contener además sales de metales, tales como p.ej. sulfato de
magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente se pueden emplear sustancias hormonales
somatotropas esenciales, tales como aminoácidos y vitaminas, de
modo adicional a las sustancias antes mencionadas. Las sustancias de
partida mencionadas se pueden añadir al cultivo en forma de una
tanda para uso en una sola vez o se pueden añadir como alimento de
manera apropiada durante la cultivación.
Para el control del pH del cultivo se emplean de
manera apropiada compuestos de carácter básico tales como hidróxido
de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos de carácter
ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el
control del desarrollo de espuma, se pueden emplear agentes
antiespumantes tales como p.ej. ésteres de poliglicoles con ácidos
grasos. Para la conservación de la estabilidad de plásmidos se
pueden añadir al medio apropiadas sustancias con acción selectiva,
p.ej. antibióticos. Con el fin de conservar unas condiciones
aerobias se incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que
contienen oxígeno, tales como p.ej. aire. La temperatura del
cultivo está situada normalmente entre 20ºC y 50ºC y de modo
preferido entre 25ºC y 45ºC. La cultivación se prosigue hasta tanto
que se haya formado una cantidad máxima de L-valina.
Esta meta se alcanza normalmente en el transcurso de un período de
tiempo de 10 horas a 160 horas.
La concentración de L-valina
formada se puede determinar con procedimientos conocidos (Jones y
Gilligan (1983) Journal of Chromatography 266:
471-482).
El invento se explica con mayor detalle con
ayuda de los siguientes ejemplos de realización.
La cepa R127 de Corynebacterium
glutamicum (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61:
329-334) se mutagenizó con
N-metil-N-nitro-N-nitroso-guanidina
(Sambrook y colaboradores, Molecular cloning. A laboratory manual
(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Para ello, 5 ml de un
cultivo de Corynebacterium glutamicum que se habían hecho
crecer durante una noche, se mezclaron con 250 \mul de
N-metil-N-nitro-N-nitroso-guanidina
(5 mg/ml de dimetil-formamida) y se incubaron
durante 30 minutos a 30ºC y 200 rpm (Adelberg 1958, Journal of
Bacteriology 76: 326). Las células se lavaron a continuación dos
veces con una solución estéril de NaCl (al 0,9%). Mediante siembra
de réplicas sobre placas de medio mínimo CGXII con 15 g/l de agar
(Keilhauer y colaboradores, Journal of Bacteriology 175:
5595-5603) se aislaron mutantes, que crecieron
solamente al añadir L-valina,
L-isoleucina y L-leucina.
La actividad enzimática de la dihidroxiácido -
deshidratasa se determinó en el extracto bruto de estas mutantes.
Para ello, los clones se cultivaron en 60 ml de un medio LB y se
separaron por centrifugación en la fase de crecimiento exponencial.
El sedimento celular se lavó una vez con un tampón de fosfato de
potasio 0,05 M, y se volvió a suspender el mismo tampón. La
disgregación celular se efectuó mediante tratamiento con
ultrasonidos durante 10 minutos (Branson-Sonifier
W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, EE.UU.). A
continuación, los desechos celulares se separaron mediante una
centrifugación durante 30 minutos a 13.000 rpm y 4ºC, y el material
sobrenadante se empleó como extracto bruto en el ensayo enzimático.
La tanda de reacción del ensayo enzimático contenía 0,2 ml de
Tris/HCl 0,25 M, de pH 8, 0,05 ml de un extracto bruto, y 0,15 ml de
\alpha,\beta-dihidroxi-\beta-metil-valerato
85 mM. Las tandas de ensayo se incubaron a 30ºC, después de 10, 20
y 30 minutos se sacaron cada vez 200 \mul de muestras y se
determinó su concentración de ceto-valerato de
metilo mediante una analítica por HPLC [cromatografía de líquido de
alto rendimiento] (Hara y colaboradores, 1985, Analytica Chimica
Acta 172: 167-173). Tal como lo muestra la Tabla 1,
la cepa R127/7 no presenta ninguna actividad de dihidroxiácido
deshidratasa, al contrario de lo cual las actividades de isómero
reductasa y aceto-hidroxiácido sintasa están todavía
presentes como otras enzimas de la síntesis de los aminoácidos de
cadenas ramificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN cromosomal (ADNc) procedente de
Corynebacterium glutamicum R127 se aisló, tal como se
describe en la cita de Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9 (1990)
84-87).
Este ADN se cortó con la enzima de restricción
Sau3A (Boehringer Mannheim) y se separó mediante una centrifugación
en gradientes de densidades de sacarosa (Sambrook y colaboradores,
Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour
Laboratory Press). La fracción que tenía el intervalo de tamaños de
fragmentos de aproximadamente 6-10 kb se empleó
para la ligación con el vector pJC1 (Cremer y colaboradores,
Molecular and General Genetics 220 (1990) 478-480).
El vector pJC1 fue para ello linealizado con BamHI y desfosforilado.
Cinco nanogramos (5 ng) de éstos se ligaron con 20 ng de la
mencionada fracción del ADN cromosomal y con ello se transformó la
mutante R127/7 por electroporación (Haynes y Britz, FEMS
Microbiology Letters 61 (1989) 329-334). Las
transformantes se ensayaron en cuanto a la capacidad de poder crecer
sobre placas de agar CGXII sin la adición de los aminoácidos de
cadenas ramificadas. De las más de 5.000 transformantes, ensayadas
después de siembra de réplicas en placas y de incubación durante
dos días a 30ºC, crecieron 8 clones sobre placas de medio mínimo.
De estos clones se llevaron a cabo preparaciones con plásmidos, tal
como se describe en la cita de Schwarzer y colaboradores
(Bio/Technology (1990) 9: 84-87). Los análisis por
restricción del ADN de plásmido dieron como resultado que en la
totalidad de los 8 clones estaba contenido el mismo plásmido,
denominado en lo sucesivo pRV. El plásmido es portador de un
inserto de 4,3 kb (kilobases) y fue ensayado por retransformación
en cuanto a su capacidad para complementar a la mutante R127/7 de
ilvD. Por subclonación, la región responsable de la complementación
de la mutante R127/7 se delimitó a un fragmento de ScaI/XhoI de 2,9
kb (Figura 2).
La secuenciación del ácido nucleico del
fragmento de ScaI/XhoI de 2,9 kb se llevó a cabo de acuerdo con el
método de interrupción de cadena con didesoxi de Sanger y
colaboradores (Proceedings of the National of Sciences of the
United States of America USA (1977) 74: 5463-5467).
En tal caso se utilizó el estuche de secuenciación con lectura
automática Auto-Read Sequencing kit (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). El análisis por electroforesis
en gel se efectuó con el aparato automático de secuenciación por
fluorescencia láser (A.L.F.) de Amersham Pharmacia Biotech
(Uppsala, Suecia). La obtenida secuencia de nucleótidos se analizó
con el paquete de programas HUSAR (Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB
[Gran Bretaña]). La secuencia de nucleótidos se reproduce como SEQ
ID NO 1. El análisis dio como resultado un cuadro de lectura abierto
de 1.836 pares de bases, que fue identificado como el gen ilvD y
que codifica un polipéptido de 612 aminoácidos, que se reproduce
como SEQ ID NO 2.
El plásmido pRV se digirió con las enzimas de
restricción ScaI y XhoI, correspondiendo a los datos del fabricante
de las enzimas de restricción (Roche, Boehringer Mannheim). A
continuación, el fragmento de ilvD de 2,9 kb se aisló mediante
columnas con intercambiadores de iones (Quiagen, Hilden). El extremo
colgante de la fracción de corte con XhoI del fragmento aislado se
rellenó con la polimerasa de Klenow. El vector pJC1 (Cremer y
colaboradores, Mol. Gen. Genet. (1990) 220:
478-480) se cortó con PstI, se trató asimismo con la
polimerasa de Klenow, y a continuación se ligaron el fragmento y el
vector. Con la tanda de ligación se transformó la cepa de E. coli
DH5\alphamcr (Grant y colaboradores, Proceedings of the
National of Sciences of the United States of America USA, 87 (1990)
4645-4649) (Hanahan, Journal of Molecular Biology
166 (1983) 557-580). Mediante preparaciones con
plásmidos (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A laboratory
manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) de clones se
identificó un gen que contenía el plásmido recombinante pJC1 ilvD.
Con este plásmido se transformó mediante electroporación la cepa
Corynebacterium glutamicum ATCC13032, tal como se describe
en la cita de Haynes y colaboradores (1989, FEMS Microbiol. Lett.
61: 329-334). De los pJC1 de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032 y pJC1 ilvD de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032 se determinó a continuación la actividad
de dihidroxiácido - deshidratasa codificada por ilvD. Para ello, los
clones se cultivaron en 60 ml de un medio LB y se separaron por
centrifugación en la fase de crecimiento exponencial. El sedimento
celular se lavó una vez con 0,05 M de tampón de fosfato de potasio
y se volvió a suspender en el mismo tampón. La disgregación celular
se efectuó mediante tratamiento con ultrasonidos durante 10 minutos
(en el sonificador Branson-Sonifier
W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, EE.UU.). A
continuación, los desechos celulares se separaron por centrifugación
durante 30 minutos a 13.000 rpm y 4ºC, y el material sobrenadante
se empleó como extracto bruto en el ensayo enzimático. La tanda de
reacción del ensayo enzimático contenía 0,2 ml de Tris/HCl 0,25 M,
de pH 8, 0,05 ml de un extracto bruto, y 0,15 ml de
\alpha,\beta-dihidroxi-\beta-metil-valerato
65 mM. Las tandas de ensayo se incubaron a 30ºC, después de 10, 20
y 30 minutos se tomaron muestras cada una de 200 \mul y se
determinó su concentración de ceto-valerato de
metilo mediante una analítica por HPLC (Hara y colaboradores, 1985,
Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Tal como lo
muestra la Tabla 2, la cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 pJC1 ilvD presenta una actividad aumentada de
dihidroxiácido - deshidratasa en comparación con la cepa
testigo.
La supresión (deleción) interna del gen ilvA de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se llevó a cabo con el
sistema para el intercambio de genes que ha sido descrito en la cita
de Schäfer y colaboradores (Gene 145: 69-73
(1994)). Para la construcción del vector de desactivación
pK19mobsacB\DeltailvA en primer lugar se eliminó un fragmento
interno de BgIII con 241 pb (pares de bases) a partir del gen de
ilvA presente dentro de un fragmento de EcoRI en el vector pBM21
(Möckel y colaboradores, 1994, Molecular Microbiology 13:
833-842). Para ello, el vector se cortó con BgIII
y, después de haber separado el fragmento interno de BgIII de ilvA
mediante electroforesis en gel de agarosa, se volvió a ligar. A
continuación, a partir del vector se aisló el gen incompleto como
fragmento de EcoRI y se ligó dentro del vector pK19mobsacB
linealizado con EcoRI (Schäfer 1994, Gene 145:
69-73). El vector de desactivación
pK19mobsacB\DeltailvA obtenido se incorporó por transformación en
la cepa S 17-1 de E. coli (Hanahan 1983,
Journal of Molecular Biology 166: 557-580) y se
transfirió por conjugación hacia Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 (Schäfer y colaboradores, 1990, Journal of Bacteriology
172: 1663-1666). Se obtuvieron clones resistentes a
kanamicina de Corynebacterium glutamicum, en los cuales el
vector de desactivación se presentaba integrado en el genoma. Con el
fin de seleccionar en cuanto a la excisión del vector, clones
resistentes a kanamicina se sembraron sobre placas en un medio LB
que contenía sacarosa (Sambrook y colaboradores, Molecular cloning.
A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)
con 15 g/l de agar, 2% de glucosa y 10% de sacarosa, y se obtuvieron
colonias, que habían perdido de nuevo el vector mediante un segundo
suceso de recombinación (Jäger y colaboradores, 1992, Journal of
Bacteriology 174: 5462-5465). Mediante
sobreinoculación sobre placas con medio mínimo (medio CGXII) con 15
g/l de agar (Keilhauer y colaboradores, Journal of Bacteriology 175
(1993) 5595-5603) con y sin 2 mM de
L-isoleucina o con y sin 50 \mug/ml de
kanamicina, se aislaron 36 clones, que mediante la excisión del
vector eran sensibles a kanamicina y auxotrofos para isoleucina, y
en los que entonces se presentaba en el genoma el gen de ilvA
incompleto (alelo \DeltailvA). Una cepa fue designada como
ATCC13032\DeltailvA y se utilizó ulteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN cromosomal de C. glutamicum
ATCC13032 se aisló y se cortó con la endonucleasa de restricción
Sau3A. Después de una separación por electroforesis en gel se
extrajeron fragmentos de ADN en un intervalo de tamaños de 3 a 7, y
respectivamente de 9 a 20 kb, y seguidamente se ligaron en el sitio
de corte con BamHI singular del vector pBR322. Las colonias
portadoras de un inserto se aislaron con ayuda de su sensibilidad a
tetraciclina después de haber sobreinoculado sobre placas de LB con
10 \mug/ml de tetraciclina. Mediante preparaciones con plásmidos
(Sambrook y colaboradores, Molecular cloning. A laboratory manual
(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) de clones agrupados,
se aislaron 8 agrupaciones de plásmidos, cada una de las cuales
contenía 400 plásmidos con un tamaño de inserto de 9 a 20 kb, y 9
agrupaciones de plásmidos, cada una de las cuales contenía 500
plásmidos con un tamaño de inserto de 3 a 7 kb. La mutante SJ2 de
panB de E. coli (Cronan y colaboradores, 1982, J. Bacteriol.
149: 916-922) se transformó con este banco de genes
mediante electroporación (Wehrmann y colaboradores, 1994,
Microbiology 140: 3349-3356). Las tandas de
transformación se sembraron directamente sobre un medio CGXII (J.
Bacteriol. (1993) 175: 5595-5603). De los clones,
que estaban en situación de crecer sin suplementación con
pantotenato, se aisló el ADN de plásmido (Sambrook y colaboradores,
1989) y por retransformación se obtuvieron 8 clones, cuya necesidad
de D-pantotenato se confirmó. Con los 8 plásmidos se
llevó a cabo un cartografiado por restricción. Uno de los vectores
investigados, denominado en lo sucesivo pUR1, contenía un inserto
de 9,3 kb (Figura 3). La transformación de la mutante DV39 de E.
coli panC_ (Vallari y colaboradores, 1985, J. Bacteriol. 164:
136-142) dio como resultado que el vector pUR1
también estaba en situación de complementar el defecto de panC de
esta mutante. Un fragmento con un tamaño de 2,2 kb del inserto de
pUR1 se secuenció de acuerdo con el método de interrupción de
cadenas con didesoxi de Sanger y colaboradores (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1977) 74: 5463-5467). El análisis por
electroforesis en gel se efectuó con el aparato secuenciador
automático de fluorescencia con láser (A.L.F.) de Amersham Pharmacia
Biotech (Uppsala, Suecia). La obtenida secuencia de nucleótidos se
analizó con el paquete de programas HUSAR (Release 4.0, EMBL,
Cambridge, GB). La secuencia de nucleótidos se reproduce como SEQ
ID NO 3. El análisis proporcionó la identificación de dos cuadros
de lectura abiertos. Un cuadro de lectura abierto abarca 813 pares
de bases y tiene altas homologías con genes de panB ya conocidos,
procedentes de otros organismos. El gen de panB procedente de C.
glutamicum codifica un polipéptido de 271 aminoácidos (véase la
SEQ ID NO 4). El segundo cuadro de lectura abierto abarca 837 pares
de bases y presenta altas homologías con genes de panC ya conocidos,
procedentes de otros organismos. El gen de panC procedente de C.
glutamicum codifica un polipéptido de 279 aminoácidos (véase SEQ
ID NO 5).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento genómico de panBC de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 así como el de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032\deltailvA se trataron
con el sistema para el intercambio de genes descrito por Schäfer y
colaboradores (Gene 145: 69-73 (1994). Para la
construcción del vector de supresión pK19mobsacB\DeltapanBC, en
primer lugar el fragmento de SspI/SalI con panBC que tenía un
tamaño de 3,95 kb se ligó con pUC18, que previamente había sido
cortado con SmalI/SalI. A continuación se eliminó un fragmento de
EcoRI/NruI que tenía un tamaño de 1.293 pb a partir de la región
solapada del gen de panBC mediante digestión por restricción y
religación. Con el fin de hacer posible la transclonación en
pK19mobsacB, con los 2 cebadores
5'-GAGAACTTAATCGAGCAACACCCCTG,
5'-GCGCCACGCCTAGCCTTGGCCCTCAA y con la reacción en
cadena de polimerasa (PCR) la región de panBC suprimida se
amplificó en pUC18, para obtener de esta manera un fragmento
\DeltapanBC de 0,5 kb, que lleva junto a los extremos unos sitios
de corte con SalI y respectivamente con EcoRI. La PCR se llevó a
cabo de acuerdo con Sambrook y colaboradores (Molecular cloning. A
laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) con
una temperatura de reanillamiento de 55ºC. El fragmento obtenido fue
ligado con el vector pK19mobsac, que previamente había sido cortado
con EcoRI y SalI y había sido tratado con fosfatasa alcalina. El
vector obtenido de desactivación pK19mobsacB\DeltapanBC se
incorporó por transformación en la cepa S 17-1 de
Escherichia coli (Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166:
557-580) y se transfirió por conjugación hacia
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Schäfer y
colaboradores (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666).
Se obtuvieron clones resistentes a kanamicina de Corynebacterium
glutamicum, en los que el vector de desactivación se presentaba
integrado en el genoma. Con el fin de seleccionar en cuanto a la
excisión del vector, clones resistentes a kanamicina se sembraron
sobre un medio LB que contenía sacarosa (Sambrook y colaboradores
(Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour
Laboratory Press) con 15 g/l de agar, 2% de glucosa y 10% de
sacarosa, y se obtuvieron colonias que habían perdido de nuevo el
vector mediante un segundo suceso de recombinación (Jäger y
colaboradores, 1992, Journal of Bacteriology 174:
5462-5465). Por sobreinoculación sobre placas de
medio mínimo (medio CGXII con 15 g/l de agar (Keilhauer y
colaboradores, Journal of Bacteriology 175:
5595-5603) con y sin 2 mM de
L-isoleucina o con y sin 50 mg/ml de kanamicina, se
aislaron 36 clones que, por causa de la excisión del vector, eran
sensibles a kanamicina y auxotrófos para isoleucina, y en los que
entonces se presentaba en el genoma la secuencia de los genes de
pan incompletos (alelos \DeltapanBC). Una cepa fue designada como
ATCC13032\DeltapanBC. De la misma manera que se describe
detalladamente en este Ejemplo, se introdujo también la supresión
(deleción) de panBC en ATCC13032\DeltailvA, para obtener la cepa
ATCC13032\DeltailvA\DeltapanBC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes de la acetohidroxiácido - sintasa
(ilvBN) y de la isómero - reductasa (ilvC) (Cordes y colaboradores,
Gene 112: 113-116 y Keilhauer y colaboradores,
Journal of Bacteriology 175: 5595-5603) y de la
dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) (Ejemplo 1) se clonaron para
la expresión en el vector pECM3. El vector pECM3 es un derivado de
pECM2 (Jäger y colaboradores, 1992, Journal of Bacteriology 174:
5462-5465), que resultó por supresión (deleción)
del fragmento de ADN para BamH/BgIII con una longitud de
aproximadamente 1 kpb (kilo pares de bases), que lleva el gen de
resistencia a kanamicina.
En el vector pKK5 (Cordes y colaboradores, 1992,
Gene 112: 113-116) los genes de ilvBNC se
presentaban ya clonados en el vector pJC1 (Cremer y colaboradores,
1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480).
A partir de este vector, se aisló un fragmento para
XbaI-ilvBNC de 5,7 kb, y conjuntamente con un
fragmento para XbaI de 3,1 kb del vector pRV, que contenía el gen
de ilvD, se incorporó en el vector pECM3 linealizado con XbaI. La
tanda de ligación se transformó en este caso en el seno de la cepa
DH5\alphamcr de E. coli. A partir de un clon se
obtuvo el plásmido pECM3ilvBNCD.
Mediante electroporación (Haynes 1989, FEMS
Microbiology Letters 61: 329-334) y selección en
cuanto a resistencia a cloramfenicol (3 \mug/ml) se incorporó el
plásmido pECM3ilvBNCD en la cepa ATCC13032\DeltailvA, y se obtuvo
la cepa ATCC13032\DeltailvA/pECM3ilvBNCD.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la investigación de la formación de valina
por ellas, las cepas indicadas en la Tabla 4 se cultivaron
previamente durante 14 h a 30ºC en 60 ml de un medio Brain Heart
Infusion [infusión de corazón y cerebro] (Difco Laboratories,
Detroit, EE.UU.). A continuación, las células se lavaron una vez con
0,9% (p/v) de una solución de NaCl y se inocularon con esta
suspensión cada vez 60 ml de un medio CGXII, de tal manera que la
densidad óptica OD600 fue de 0,5. El medio era idéntico al medio
descrito en la cita de Keilhauer y colaboradores, (Journal of
Bacteriology (1993) 175: 5595-5603). Para la
cultivación de las cepas \DeltailvA, el medio contenía sin
embargo adicionalmente 250 mg/l de L-isoleucina.
Éste se representa en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de una cultivación durante 48 horas se
tomaron muestras, las células se separaron por centrifugación y el
material sobrenadante se filtró en condiciones estériles. La
concentración de L-valina en el material
sobrenadante se determinó con ayuda de la cromatografía de líquido a
alta presión (HPLC) con derivatización integrada de los aminoácidos
en una columna preliminar con o-ftalodialdehído, tal
como se establece en la cita de Jones y Gilligan (J. Chromatogr.
266 (1983) 471-482). Los resultados se representan
en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Forschungszentrum Juelich GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Apartado de Correos 1913
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Juelich
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 52425
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 02461/614480
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 02461/612860
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESIGNACIÓN DEL INVENTO: Preparación de valina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS:5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE:
\vskip0.500000\baselineskip
- Patentin Release n1 1.0, versión n1 1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.952 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 612 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.164 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 271 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 279 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Procedimiento para la preparación microbiana
de L-valina, en el que se refuerzan la actividad de
la dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) y/o la expresión del gen de
ilvD en un microorganismo,
caracterizado porque
se debilita o excluye la actividad de una o
varias enzima(s), que participa(n) específicamente en
la síntesis de D-pantotenato.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que se refuerzan adicionalmente la actividad
de la acetohidroxiácido - sintasa (ilvBN) y la de la isómero
reductasa (ilvC) y/o la expresión del gen de ilvBNC en el
microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque
se aumenta la actividad endógena de ilvD o de
ilvBNCD en el microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3,
caracterizado porque
por mutación del gen de ilvD endógeno o de los
genes de ilvBNCD se producen correspondientes enzimas con una
actividad más alta.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque
la expresión de los genes de ilvD o de ilvBNCD
se refuerza por aumento del número de copias de los genes.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5,
caracterizado porque
para aumentar el número de copias de los genes,
el gen de ilvD o los genes de ilvBNCD se incorporan en una
estructura artificial génica.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6,
caracterizado porque
un microorganismo se transforma con la
estructura artificial génica que contiene el gen de ilvD o los genes
de ilvBNCD.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7,
caracterizado porque
como microorganismo se utiliza
Corynebacterium glutamicum.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las precedentes reivindicaciones,
caracterizado porque
se utiliza un microorganismo, en el que se
debilita o excluye la actividad de por lo menos una enzima que
participa en un proceso de metabolismo, que disminuye la formación
de L-valina.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9,
caracterizado porque
se debilita o excluye la actividad de la enzima
treonina - deshidratasa (ilvA), que participa en la síntesis de
L-isoleucina.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-10,
caracterizado porque
se debilita o excluye la actividad de la enzima
cetopantoatohidroximetil - transferasa (panB) y/o de la enzima
pantotenato - ligasa (panC).
\vskip1.000000\baselineskip
12. Microorganismo transformado con una
estructura artificial génica que contiene el gen de ilvD o los
genes de ilvBNCD, en el que se debilita o excluye la actividad de
una o varias enzimas que participan específicamente en la síntesis
de D-pantotenato.
13. Microorganismo transformado de acuerdo con
la reivindicación 12, en el que se debilita o excluye la actividad
de la enzima cetopantoatohidroximetil - transferasa (panB) y/o de la
enzima pantotenato - ligasa (panC).
14. Microorganismo transformado de acuerdo con
la reivindicación 12 ó 13, en el que se debilita o excluye la
actividad de la enzima treonina -deshidratasa (ilvA) que participa
en la síntesis de L-isoleucina.
15. Microorganismo transformado de acuerdo con
una o varias de las reivindicaciones 12 a 14,
caracterizado por
ser Corynebacterium glutamicum.
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