ES2400360T3

ES2400360T3 - Nitrilo hidratasa procedente de rhodococcus

Info

Publication number: ES2400360T3
Application number: ES05715626T
Authority: ES
Inventors: Steffen Osswald; Stefan Verseck; Uta Deiting; Christoph Weckbecker; Klaus Huthmacher; Michael Binder; Maria-Regina Kula; Konrad Odendahl
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2004-03-20
Filing date: 2005-03-01
Publication date: 2013-04-09
Anticipated expiration: 2025-03-01
Also published as: WO2005093080A3; JP2007529231A; US7491521B2; US7288402B2; EP1730291B1; CN1930299B; WO2005093080A2; US20080057549A1; BRPI0509023A; RU2006137033A; JP5080240B2; EP1730291A2; DE102004013824A1; RU2385932C2; US20060068467A1; CN1930299A

Abstract

Racimo aislado de polinucleótidos procedente de Rhodococcus opacus, que contiene cuatro secuencias de nucleótidos, que codifican cuatro polipéptidos con unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas en cada caso en por lo menos un 90 % con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, poseyendo los polipéptidos las actividades de una nitrilo hidratasa, que se compone de las subunidades α y ß, de la proteína auxiliadora P15K y de un transportador de cobalto

Description

Nitrilo hidratasa procedente de Rhodococcus

El invento se refiere a un racimo de polinucleótidos procedente de Rhodococcus, que codifica unos polipéptidos con la actividad de una nitrilo hidratasa, a una proteína auxiliadora P15K, que activa a esta enzima, y a unas secuencias de nucleótidos, que codifican un transportador de cobalto, a unos microorganismos transformados con ellas, en los que las secuencias de nucleótidos que codifican estas proteínas se presentan de manera reforzada, y a la utilización de los microorganismos transformados para la preparación de amidas a partir de nitrilos.

Las nitrilo hidratasas ya se describieron en gran número en la bibliografía (Synthetic applications of nitrileconverting enzymes [Aplicaciones sintéticas de enzimas convertidoras de nitrilos]; Martinkova, Ludmila; Mylerova, Veronika; Current Organic Chemistry (2003), 7(13), 1279-1295). Ya desde 1983 se emplean nitrilo hidratasas para la preparación de acrilamida a la escala de varios miles de toneladas por año. Este procedimiento biocatalítico se ha acreditado como competitivo en comparación con los procedimientos químicos (Enzymic synthesis of acrylamide: a success story not yet over [Síntesis enzimática de acrilamida: una historia exitosa que no ha acabado todavía]; Kobayashi, Michihiko; Nagasawa, Toru; Yamada, Trends in Biotechnology (1992), 10(11), 402-8).

Junto a las nitrilo hidratasas, que se pueden emplear para la conversión química de acrilonitrilo, se describieron p.ej. también aquellas que son especialmente adecuadas para la conversión química de metacrilonitrilo (A nitrile hydratase of Pseudonocardia thermophila and the genes encoding and manufacture of the enzyme for conversion of nitriles to amides [Una nitrilo hidratasa de Pseudonocardia thermophila y los genes que la codifican, y la manipulación de la enzima para la conversión de nitrilos en amidas] (documento de patente europea EP 790310), de 3-cianopiridina (Process for producing amides with Rhodococcus nitrile hydratase [Un procedimiento para producir amidas con la nitrilo hidratasa de Rhodococcus], (documento de solicitud de patente internacional WO 2002055670)

o de 2-hidroxinitrilos tales como el 2-hidroxi-4-metiltio-butironitrilo (A nitrile hydratase of Rhodococcus and its use in the manufacture of amides [Una nitrilo hidratasa de Rhodococcus y su uso en la preparación de amidas] (documento WO 2002070717) and Enzymic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding α-hydroxyamides, acids o acid salts [Y la conversión enzimática de α-hidroxinitrilos para dar las correspondientes α-hidroxiamidas, ácidos o sales de ácidos] (documento WO 9832872). En contraposición a esto, hasta ahora no se conoce en absoluto ninguna nitrilo hidratasa, con cuya ayuda se puedan convertir químicamente de una manera efectiva los 2-aminonitrilos. La nitrilo hidratasa procedente de Rhodococcus sp. Cr4 convierte químicamente p.ej. a los 2-hidroxinitrilos con una alta actividad, pero no en absoluto a un sencillo 2-aminonitrilo tal como el aminoacetonitrilo (documento WO 2002070717).

La conversión enzimática de aminonitrilos en las correspondientes amidas abre una atractiva ruta de síntesis para dar aminoácidos, puesto que las 2-aminoamidas pueden ser saponificadas de un modo sencillo (documento WO 2001060789). Este proceso transcurre en condiciones moderadas, con una selectividad muy alta y sin la formación de productos secundarios tales como unas sales, como las que resultan en el caso de la hidrólisis química.

Alternativamente, ciertas amidas se pueden hacer reaccionar también con hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos para dar las correspondientes sales de los ácidos. Se prefiere especialmente este modo de proceder en el caso del empleo del hidróxido de calcio para la conversión química de la 4-metiltio-α-hidroxibutiramida (amida de MHA); puesto que la sal de calcio del MHA se puede emplear directamente como una forma de producto alternativa a la metionina o al MHA como aditivo para piensos.

Para la preparación de un producto comercial, tal como p.ej. la DL-metionina, no es suficiente, sin embargo, poner a disposición un catalizador con una alta actividad. Para el aumento de la actividad se debe de establecer un sistema de expresión para los genes que deben de ser reforzados. Para esto se aconseja la expresión heteróloga p.ej. sobre todo en el seno de Escherichia coli, Bacillus, Pseudomonas, Pichia, Sacharomyces o Aspergillus, puesto que estos microorganismos poseen un rápido crecimiento, alcanzan unas muy altas densidades celulares y están disponibles unas herramientas de biología molecular que permiten un muy alto nivel de expresión (Lee SY (1996) High celldensity culture of Escherichia coli [Cultivo con alta densidad celular de Escherichia coli] TIBTECH 14:98-105; Riesenberg D, Guthke R (1999) High-cell-density cultivation of microorganisms [Cultivación con alta densidad celular de microorganismos]. Appl Microbiol Biotechnol 51:422-430).

Es conocido el hecho de que para la expresión heteróloga de unas nitrilo hidratasas deben de ser expresados concomitantemente por lo menos 3 genes. Junto a los dos genes estructurales, además de esto, debe de ser reforzada una correspondiente proteína auxiliadora tanto para las enzimas que dependen del hierro como también para las enzimas que dependen del cobalto (Nojiri M. y colaboradores, (1999) Functional expression of Nitrile hydratases in Escherichia coli: Requirement of a nitrile hydratase activator and a post-translational modification of a ligand cysteine [Expresión funcional de nitrilo hidratasas en Escherichia coli: Necesidad de un activador de la nitrilo hidratasa y modificación después de la traducción de un ligando de cisteína]. J. Biochem 125: 696-704, y Overproduction of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli: activity requires a novel downstream protein [Sobreproduccción de una nitrilo hidratasa estereoselectiva procedente de Pseudomonas putida 5B en E. coli: la actividad requiere una nueva proteína corriente abajo], Wu, S.; Fallon, R. D.; Payne, M. S. Applied Microbiology and Biotechnology (1997), 48(6), 704-708).

Adicionalmente a estos 3 genes, en Rhodococcus rhodochrous J1, en un racimo de genes, junto a los genes estructurales y al gen de la proteína auxiliadora, se encontró otro gen que codifica un transportador de cobalto (A novel transporter involved in cobalt uptake [Un nuevo transportador que participa en la absorción de cobalto], Komeda, Hidenobu y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América](1997), 94(1), 36-41). Tanto la sobreexpresión en Rhodococcus como también la expresión concomitante en E. coli dan lugar a una absorción aumentada de iones de Co2+ a partir del medio de cultivo. Además de esto, se pudo mostrar que en el caso de la expresión concomitante del transportador de cobalto en común con las otras 3 proteínas se puede conseguir la misma actividad de nitrilo hidratasa en el caso de una concentración más baja de Co en el medio, en comparación con la expresión a solas de los genes estructurales y de la proteína auxiliadora. No obstante, este efecto aparece en Rhodococcus, de acuerdo con Komeda y colaboradores, solamente en el caso de unas concentraciones situadas por debajo de 42 µM.

A partir del documento EP 0 362 829 se conoce la fermentación de Rhodococcus rhodochrous en presencia de sales de cobalto.

Es una misión del invento hacer accesibles unas nitrilo hidratasas con una alta actividad, que en particular conviertan químicamente a los α-aminonitrilos en amidas.

El invento comprende los siguientes objetos:

1.: Un racimo aislado de polinucleótidos procedentes de Rhodococcus opacus, que contiene cuatro secuencias de nucleótidos, que codifican cuatro polipéptidos con unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas en cada caso en por lo menos un 90 % con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, poseyendo los polipéptidos las actividades de una nitrilo hidratasa, que se compone de unas subunidades α y β, de la proteína auxiliadora P15K y de un transportador de cobalto.

2.: Unos polinucleótidos de acuerdo con 1., escogidos entre el conjunto que se compone de

a) un polinucleótido, que se compone de las posiciones 1 hasta 708 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de la secuencia de nucleótidos complementaria con ésta,

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la secuencia procedente de a) dentro del marco de la degeneración del código genético,

c) un polinucleótido, que se hibrida en condiciones rigurosas con las secuencias complementarias a) o b), abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0,1 x SSC a una temperatura de 50-68°C y

d) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos procedente de a), b) o c), que contiene unas mutaciones con sentido neutras en su función,

codificando los polinucleótidos la subunidad β de la nitrilo hidratasa.

3. Unos polinucleótidos de acuerdo con 1., escogidos entre el conjunto que se compone de:

a) un polinucleótido, que se compone de las posiciones 710 hasta 1.327 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de la secuencia de nucleótidos complementaria con ésta,

codificando los polinucleótidos la subunidad α de la nitrilo hidratasa.

4.: Un polipéptido de acuerdo con 1., que contiene las secuencias de aminoácidos, que son idénticas por lo menos en un 90 % a las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, teniendo el polipéptido la actividad de una nitrilo hidratasa.

5.: Una sonda o un cebador, que contiene por lo menos 20 nucleótidos consecutivos dentro de las posiciones 1 hasta

1.327 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de su forma complementaria.

6. Un polinucleótido aislado de acuerdo con 2), que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento que

5 tiene las posiciones 1 hasta 708 de la SEQ ID NO:1, abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0,1 x SSC a una temperatura de 50 a 68°C.

7. Un polinucleótido aislado de acuerdo con 4), que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento que

tiene las posiciones 710 hasta 1.327 de la SEQ ID NO:1, abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0,1 x 10 SSC a una temperatura de 50 a 68°C.

8. Unos vectores que contienen un(os) polinucleótido(s) escogidos entre 1) hasta 3) y 6) hasta 7).

9.: El vector pUD15, que se compone de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:24. 15

10. El vector pUD16, que se compone de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:25.

11.: Una célula anfitriona, transformada o transfectada mediante la introducción de un polinucleótido de acuerdo con 1). 20 12. Una célula anfitriona, transformada mediante la introducción de un vector de acuerdo con 8) hasta 10).

13. Una célula anfitriona transformada de acuerdo con 11) o 12), siendo la célula anfitriona una bacteria de la familia de las Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli.

25 14. Un procedimiento para la preparación de amidas a partir de nitrilos con unas nitrilo hidratasas procedentes de Rhodococcus o de unos microorganismos que contienen esta enzima, en el que

a) un microorganismo transformado, que contiene unos genes sobreexpresados con las secuencias de nucleótidos escogidas entre las de las reivindicaciones 1 hasta 3 y 6, 7, se fermenta en presencia de 0,15 a 30 4 mM de Co2+, en unas condiciones, que dan lugar a la formación de la nitrilo hidratasa,

b) esta enzima se deja enriquecerse en el microorganismo, y

c) esta enzima se aísla a partir de las células, o 35 d) se cosechan los microorganismos y se obtienen unas células en reposo, que contienen la enzima, y

e) la enzima o los microorganismos que la contienen se hacen reaccionar con los compuestos de las

R''-CN (II)

en las que significan: 45

X: OH, H, alquilo con 1 hasta 4 átomos de C, en particular NH2;

R: H, un radical alquilo saturado con 1 a 12 átomos de C, ramificado o sin ramificar, eventualmente sustituido con NH2, radicales alquenilo con 1 a 12 átomos de C, ramificados o sin ramificar,

o grupos cicloalquilo con 3 a 6 átomos de C,

50 radicales alquileno sustituidos con grupos alquiltio, correspondiendo el alquilo aquí a un radical de C1 a C3 y el alquileno a un radical divalente de C3 a C8, R': H, alquilo con 1 a 3 átomos de C, R'': un anillo insaturado de uno o dos núcleos, con 6 a 12 átomos de C, eventualmente sustituido con uno o dos grupos alquilo de C1 - C3, Cl, Br o F, un radical alquil-nitrilo monovalente con 1 a 6 átomos de C,

55 para dar las correspondientes amidas.

15.: Un procedimiento de acuerdo con 14), caracterizado porque se emplean unas células anfitrionas de acuerdo con las reivindicaciones 11 hasta 13.

16.: Una nitrilo hidratasa recombinante producida de acuerdo con 14) con el origen de Rhodococcus opacus, que convierte químicamente a α-aminonitrilos con una actividad específica de >50 U/mg de biomasa seca.

Un ADN de vector se puede introducir en células eucarióticas o procarióticas mediante unas conocidas técnicas de transformación o transfección.

Los conceptos de "transformación", "transfección", "conjugación" y "transducción" se refieren a unas medidas técnicas conocidas a partir del estado de la técnica, con el fin de introducir ADN ajenos.

Asimismo, son un objeto del invento unos polinucleótidos, que se componen esencialmente de una secuencia de polinucleótidos, y que son obtenibles por escrutinio mediante una hibridación de un correspondiente banco genómico de Rhodococcus opacus, que contiene el gen completo o partes de éste, con una sonda, que contiene las secuencias de los polinucleótidos conformes al invento procedentes de la SEQ ID NO:1 o unos fragmentos de ésta, y un aislamiento de la mencionada secuencia de polinucleótidos.

Los polinucleótidos, que contienen las secuencias de acuerdo con el invento, son adecuados como sondas de hibridación para un ARN, un ADNc (cromosomal) y un ADN, con el fin de aislar unos ácidos nucleicos o respectivamente polinucleótidos o unos genes en su plena longitud, que codifican las proteínas conformes al invento, o con el fin de aislar aquellos ácidos nucleicos o respectivamente polinucleótidos o genes, que tienen una alta similaridad de las secuencias con las de los genes conformes al invento. Ellos se pueden aplicar asimismo como una sonda sobre unos denominados conjuntos (en inglés "arrays"), micro conjuntos (en inglés "micro arrays") o chips de ADN (en inglés "DNA chips"), con el fin de detectar y determinar los correspondientes polinucleótidos o unas secuencias derivadas de éstos, tales como p.ej. un ARN o un ADNc.

Los polinucleótidos, que contienen las secuencias de acuerdo con el invento, son adecuados además como unos cebadores, con cuya ayuda, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, acrónimo de Polymerase Chain Reaction) se puede producir unos ADN de genes, que codifican las proteínas conformes al invento.

Aquellos oligonucleótidos, que sirven como sondas o cebadores, contienen por lo menos 25 ó 30, de manera preferida por lo menos 20, de manera muy especialmente preferida por lo menos 15 nucleótidos consecutivos. Asimismo, son adecuados unos oligonucleótidos con una longitud de por lo menos 40 ó 50 nucleótidos. Eventualmente también se adecuan unos oligonucleótidos con una longitud de por lo menos 100, 150, 200, 250 ó 300 nucleótidos.

El concepto de "aislado" significa separado a partir de su entorno natural.

El concepto de "polinucleótido" se refiere por lo general a unos polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, pudiendo tratarse de unos ARN o ADN no modificados o de unos ARN o ADN modificados.

Los polinucleótidos conformes al invento incluyen unos polinucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO:1 y también aquéllos, que son idénticos por lo menos en un 90 %, 93 %, 95 %, 97 % o 99 % con los polinucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO:1.

Por el concepto de "polipéptidos" se entienden unos péptidos o unas proteínas, que contienen dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos.

Los polipéptidos de acuerdo con el invento incluyen unos polipéptidos de acuerdo con las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, y también aquéllos, que son idénticos por lo menos en un 90 %, y de manera especialmente preferida por lo menos en un 91 %, 95 %, 97 % o 99 % con los polipéptidos de acuerdo con las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO: 6.

El polinucleótido de la SEQ ID NO:1 contiene varias secuencias individuales, que codifican diferentes proteínas. Las secuencias para la subunidad α y para la proteína auxiliadora P15K se solapan.

Los genes, que codifican las subunidades α y β de la nitrilo hidratasa, deben de ser expresados en común, con el fin de obtener una proteína activa.

La SEQ ID NO:2 reproduce la secuencia de aminoácidos de la subunidad β y la SEQ ID NO:3 reproduce la de la subunidad α de la proteína, que muestra una actividad de nitrilo hidratasa.

La SEQ ID NO:2 se deriva de las posiciones 1 hasta 708 y la SEQ ID NO:3 se deriva de las posiciones 710 hasta

1.327 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1.

La secuencia de aminoácidos de la denominada proteína auxiliadora P15K se encuentra en la SEQ ID NO:6, correspondientemente a las posiciones 1.324 hasta 1.737 en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1.

La proteína auxiliadora activa a la nitrilo hidratasa y debe de estar presente en común con esta enzima en el microorganismo que produce la nitrilo hidratasa.

La SEQ ID NO:4 representa la secuencia de aminoácidos del transportador de cobalto y se deriva de las posiciones

2.076 hasta 3.146 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1.

El codón iniciador ttg en la SEQ ID NO:4 es traducido por el programa PatentIN versión 3.1 como leucina, y el codón iniciador gtg en la SEQ ID NO:6 es traducido como valina. Correctamente debe quererse decir metionina.

Se encontró que mediante una expresión concomitante del transportador de cobalto, la actividad de la nitrilo hidratasa en E. coli es aumentada en un múltiplo. Esto es válido también cuando se utilizan unas altas concentraciones de cobalto en el medio, que están situadas en algunos órdenes de magnitud por encima de las concentraciones que se presentan en la naturaleza. Sorprendentemente, la expresión concomitante del transportador de cobalto no da lugar a una contaminación del organismo sino solamente a una sensibilidad ligeramente aumentada de las células frente a unas altas concentraciones de cobalto en el medio.

Para el aislamiento del racimo de genes conforme al invento se establece por lo general primeramente un banco genómico de este microorganismo en Escherichia coli (E. coli). El establecimiento de bancos genómicos se ha descrito en unos libros de texto y manuales generalmente conocidos. Como ejemplos de ellos se citarán el libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Genes y clones, una introducción a la tecnología genética) (editorial Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990), o el manual de Sambrook y colaboradores: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clonación molecular, un manual de laboratorio) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un banco genómico muy conocido es el de la cepa W3110 de E. coli K-12, que fue establecido por Kohara y colaboradores (Cell 50, 495-508 (1987) en vectores λ. Bathe y colaboradores (Molecular and General Genetics (Genética molecular y general), 252:255-265, 1996) describen un banco genómico de C. glutamicum ATCC13032, que se estableció con la ayuda del vector cosmídico SuperCos I (Wahl y colaboradores, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) en la cepa NM554de E.coli K-12 (Raleigh y colaboradores, 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575).

Para la producción de un banco genómico en E. coli se pueden utilizar también unos plásmidos tales como el pBR322 (Bolivar, Life Sciences [Ciencias de la vida], 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Vieira y colaboradores, 1982, Gene [Genes], 19:259-268). Como anfitriones se adecuan especialmente aquellas cepas de E. coli, que son defectuosas en la restricción y la recombinación. Un ejemplo de ellas es la cepa DH5αmcr, que fue descrita por Grant y colaboradores (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Los fragmentos de ADN largos clonados con ayuda de cósmidos se pueden subclonar a continuación, por su parte, en unos vectores habituales, que son adecuados para la secuenciación, y seguidamente se pueden secuenciar, tal como se describe p.ej. en la cita de Sanger y colaboradores (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977).

Las secuencias de ADN obtenidas se pueden investigar entonces con unos algoritmos conocidos o respectivamente con unos programas de análisis de secuencias tales como p.ej. el de Staden (Nucleic Acids Research [Investigación de ácidos nucleicos] 14, 217-232(1986), el de Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988) o el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis [Métodos de análisis bioquímicos] 39, 74-97 (1998)).

Las secuencias codificadoras de ADN, que se establecen a partir de las secuencias contenidas en la SEQ ID NO:1 por medio de la degeneración del código genético, son asimismo una parte componente del invento. De igual manera son una parte componente del invento unas secuencias de ADN, que se hibridan con estas secuencias o con partes de ellas. En el mundo especializado se conocen además unos intercambios conservativos de aminoácidos tales como p.ej. el intercambio de glicina por alanina o el de ácido aspártico por ácido glutámico en proteínas como "mutaciones con sentido" (en inglés "sense mutations"), que no conducen a ninguna modificación fundamental de la actividad de la proteína, es decir que son neutras en su función. Además de esto, es conocido el hecho de que unas modificaciones realizadas junto al extremo terminal de N y/o C de una proteína no perjudican esencialmente a la función de ésta, o incluso pueden estabilizarla. Unos datos acerca de esto los encuentra un experto en la especialidad, entre otros lugares, en las citas de Ben-Bassat y colaboradores (Journal of Bacteriology [Revista de bacteriología] 169:751-757 (1987)), de O'Regan y colaboradores (Gene 77:237-251 (1989)), de Sahin-Toth y colaboradores (Protein Sciences [Ciencias de las proteínas] 3:240-247 (1994)), de Hochuli y colaboradores (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en conocidos libros de texto de la genética y la biología molecular.

Finalmente, constituyen una parte componente del invento unas secuencias de ADN, que se producen por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de unos cebadores, que se establecen a partir de la SEQ ID NO: 1. Tales oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de por lo menos 15 nucleótidos.

Unas instrucciones para la identificación de secuencias de ADN mediante hibridación, las encuentra un experto en la especialidad, entre otros lugares, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization (Guía para los usuarios del sistema DIG para la hibridación en filtro)" de la entidad Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en la cita de Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology [Revista internacional de bacteriología sistemática] (1991) 41: 255-260). La hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas, es decir que se forman solamente unos híbridos, en los que la sonda y la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados con la sonda, son idénticas/os en por lo menos un 90 %. Es conocido que la rigurosidad de la hibridación, inclusive las etapas de lavado, es (son) influida(s) o respectivamente determinada(s) por variación de la composición de los tampones, de la temperatura y de la concentración de sales. La reacción de hibridación se lleva a cabo por lo general con una rigurosidad relativamente baja en comparación con la de las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide [Guía de hibridación Hybaid, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación se puede emplear, por ejemplo, un tampón 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C. En este caso, unas sondas se pueden hibridar también con unos polinucleótidos, que tienen una identidad de menos que un 70 % con la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y se eliminan mediante lavado en condiciones rigurosas. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante una disminución de la concentración de sales hasta 2x SSC y eventualmente a continuación hasta 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybrisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C. Es eventualmente posible disminuir la concentración de las sales hasta 0,1x SSC. Mediante un aumento escalonado de la temperatura de hibridación, en escalones de aproximadamente 1 - 2°C desde 50°C hasta 68°C, se pueden aislar unos fragmentos de polinucleótidos, que poseen por ejemplo una identidad de por lo menos un 90 % hasta un 95 % con respecto a la secuencia de la sonda empleada. Otras instrucciones adicionales para la hibridación son obtenibles en el comercio en forma de los denominados estuches (p.ej. el DIG Easy Hyb de la entidad Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, n° de catálogo 1603558).

Unas instrucciones para la amplificación de secuencias de ADN con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) las encuentra un experto en la especialidad, entre otros lugares, en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (Síntesis de oligonucleótidos: Un enfoque práctico) (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en la cita de Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

Por lo general, se procede de tal manera que se clona un gen bien expresable en un vector con un bajo número de copias, y los genes que tienen un rendimiento de expresión más débil se clonan en un vector con un número más alto de copias y/o con un promotor fuerte. Las células anfitrionas son transformadas con estos vectores de tal manera que, en comparación con el organismo de partida, ellas contengan por lo menos en cada caso una copia adicional de las secuencias de nucleótidos que codifican la formación de la nitrilo hidratasa o respectivamente las otras proteínas adicionales.

Se ha acreditado como ventajoso expresar el gen que codifica el transportador de cobalto en menor extensión, por ejemplo, con un vector que tiene un número más bajo de copias - por lo menos una copia menos - que las secuencias de polinucleótidos que codifican las subunidades α y β y la proteína auxiliadora P15K. La diversa expresión de los mencionados genes se puede conseguir también mediante la utilización de unos promotores diversamente fuertes.

Los nucleótidos que codifican las subunidades α y β y la proteína auxiliadora se presentan de manera preferida en común en un vector, con un promotor común o con dos promotores separados.

Los microorganismos transformados o recombinantes, producidos de esta manera, son asimismo una parte constituyente del invento.

Se encontró que el refuerzo de los genes, que codifican la nitrilo hidratasa, la proteína auxiliadora P15K y el transportador de cobalto en microorganismos, conducen a una producción aumentada de la nitrilo hidratasa o también a una actividad aumentada de la nitrilo hidratasa.

El concepto de "refuerzo" describe en este contexto el aumento de la actividad intracelular en un microorganismo de una o varias enzimas, que es (son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se aumenta el número de copias del gen o respectivamente de los genes, de que se utiliza un promotor fuerte o de que se utiliza un gen, que codifica una correspondiente enzima con una alta actividad, y eventualmente se combinan estas medidas técnicas.

Para la consecución de una sobreexpresión se puede mutar la región de promotor y de regulación o el sitio de fijación a ribosomas, que se encuentra situada/o secuencia arriba del gen estructural. De igual manera, actúan unas casetes de expresión, que son incorporadas secuencia arriba del gen estructural. Por medio de unos promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción de aminoácidos por fermentación. Mediante unas medidas técnicas destinadas a la prolongación de la duración de vida útil del ARN-m (mensajero) se mejora asimismo la expresión.

Además, mediante una evitación de la degradación de la proteína enzimática se refuerza asimismo la actividad enzimática. Los genes o las construcciones artificiales de genes o bien pueden presentarse en plásmidos con diferentes números de copias, o se pueden integrar y amplificar en el cromosoma. Alternativamente, se puede conseguir además una sobreexpresión de los correspondientes genes mediante una modificación de la composición de los medios y mediante una realización de la cultivación.

Mediante las medidas técnicas de refuerzo, en particular una sobreexpresión, se aumenta la actividad o la concentración de la correspondiente proteína por lo general por lo menos en un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta 1.000 % o 2.000 %, referido a la proteína de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o la concentración de la proteína en unos microorganismos no transformados con las secuencias de nucleótidos conformes al invento.

Otro objeto del invento es la puesta a disposición de unos vectores replicables por lo general autónomamente en las cepas anfitrionas escogidas, los cuales son compatibles entre sí y contienen por lo menos unas secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 2, 3 y 4, o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4.

Un vector de ADN se puede introducir en células eucarióticas o procarióticas mediante unas conocidas técnicas de transformación.

Como organismo anfitrión sirven de manera preferida unos microorganismos, para los que existen unos sistemas de expresión, tales como p.ej. Pseudomonas, Pichia, diferentes levaduras, Saccaromyches, Aspergillus o la familia de Streptomyces, en particular E coli. Los microorganismos del género Rhodococcus son asimismo adecuados.

Un objeto del invento es asimismo un procedimiento para la producción de la nitrilo hidratasa procedente de Rhodococcus, en particular de Rhodococcus opacus o de unos microorganismos que contienen esta enzima, en el que

a) se fermenta un microorganismo transformado, que contiene unos genes sobreexpresados con las secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 4, en presencia de 0,15 a 4 mM (mmol/l) de Co2+, en particular de 0,3 a 4 mM, en unas condiciones, que dan lugar a la formación de la nitrilo hidratasa,

b) se deja enriquecerse esta enzima en el microorganismo, y

c) se aísla esta enzima a partir de las células, o

d) se cosechan los microorganismos y se obtienen como unas células en reposo que contienen la enzima.

La nitrilo hidratasa producida por medios recombinantes convierte químicamente a α-aminonitrilos con una actividad de > 50 U/mg de la biomasa seca.

De manera preferida, se fermenta en presencia de 0,5 a 3,5 mM de Co2+, en particular de 0,7 a 3 mM, que se añade al caldo de fermentación de manera preferida como una sal soluble.

Los microorganismos utilizados conforme al invento se pueden cultivar de una manera continua o discontinua en el procedimiento batch (cultivación por tandas) o en el procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o en el procedimiento fed batch repeated (procedimiento de afluencia repetida). Una recopilación acerca de métodos conocidos de cultivación se encuentra en el libro de texto de Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de los bioprocesos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas] (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que se ha de utilizar debe de satisfacer de un modo adecuado los respectivos requisitos establecidos por las respectivas cepas. Unas descripciones de medios de cultivo de diversos microorganismos están contenidas en el manual de métodos de bacteriología general "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology [Sociedad americana de bacteriología (Washington D. C., EE.UU., 1981).

Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de carbono tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, una melaza, un almidón y una celulosa, aceites y grasas tales como p.ej. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como p.ej. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como p.ej. glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como p.ej. ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar unos compuestos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja y urea, y/u compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de

5 amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio, o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe de contener además unas sales de metales, tales como p.ej. sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento.

10 Finalmente, se pueden emplear unas sustancias esenciales para el crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas, adicionalmente a las sustancias arriba mencionadas. Las sustancias de partida mencionadas se pueden añadir al cultivo en forma de una tanda única o se pueden administrar como alimento de una manera adecuada durante la cultivación.

15 Para realizar el control del valor del pH del cultivo se emplean de un modo adecuado unos compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o respectivamente agua amoniacal, o unos compuestos de carácter ácido tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para realizar la represión del desarrollo de espuma se pueden emplear unos agentes antiespumantes tales como p.ej. ésteres de poliglicoles con ácidos grasos. Con el fin de mantener la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio

20 unas adecuadas sustancias que actúan selectivamente tales como p.ej. antibióticos. Con el fin de mantener unas condiciones aerobias, se introduce(n) en el cultivo oxígeno o unas mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como p.ej. aire. La temperatura del cultivo se sitúa normalmente en 10°C hasta 40°C y de manera preferida en 10°C hasta 30°C. Se prosigue el tratamiento del cultivo por lo menos durante tanto tiempo hasta que él haya sobrepasado la fase de crecimiento logarítmico. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10

25 horas hasta 70 horas.

Asimismo es objeto del invento un procedimiento para la producción enzimática de amidas a partir de nitrilos, que contiene las siguientes etapas:

30 a) la reacción de un compuesto que contiene grupos nitrilo con una enzima procedente de Rhodococcus, en particular de Rhodococcus opacus, que tiene la actividad de nitrilo hidratasa, y

b) eventualmente la separación de la amida.

35 En una variante del procedimiento, las células se cosechan, se lavan y se recogen en un tampón como una suspensión a un valor del pH de 5-9, en particular de 6,8 a 7,9. La concentración celular de las células en reposo es por regla general de 1 - 25 %, en particular de 1,5 a 15 % (peso en húmedo/v). Ellas se pueden permeabilizar con métodos físicos o químicos, p.ej. con tolueno tal como se describe en la cita de Wilms y colaboradores, J. Biotechnol., tomo 86 (2001), 19 - 30, de tal manera que los compuestos de nitrilo que deben de ser transformados

40 atraviesen la pared celular y pueda salir la amida resultante.

El biocatalizador (catalizador de células enteras) muestra una sobresaliente estabilidad, de tal manera que se pueden alcanzar unas concentraciones del producto situadas por encima de 100 g/l.

45 También es posible separar la nitrilo hidratasa conforme al invento a partir de las células según unos métodos conocidos, eventualmente purificarla y emplearla para la conversión química de los nitrilos.

Objeto del invento es también un procedimiento, que está caracterizado porque se hacen reaccionar unos

R''-CN (II) en las que significan: 55 X: OH, H, alquilo con 1 a 4 átomos de C, en particular NH2;

R: H, un radical alquilo saturado con 1 a 12 átomos de C, ramificado o sin ramificar, eventualmente sustituido con NH2, radicales alquenilo con 1 a 12 átomos de C, ramificados o sin ramificar, grupos cicloalquilo con 3 a 6 átomos de C, radicales alquileno sustituidos con grupos alquiltio, correspondiendo el alquilo aquí a un radical de C1 a C3 y el alquileno a un radical divalente de C3 a C8,

R': H, alquilo con 1 a 3 átomos de C, R'': un anillo aromático de uno o dos núcleos, con 6 a 12 átomos de C, eventualmente sustituido con uno o dos grupos alquilo de C1 - C3 ó Cl ó F, un radical alquil-nitrilo con 1 a 6 átomos de C.

para dar las correspondientes amidas.

Los siguientes nitrilos se hacen reaccionar de manera preferida:

mononitrilos saturados: acetonitrilo, propionitrilo, butironitrilo, isobutironitrilo, valeronitrilo, isovaleronitrilo, capronitrilo

dinitrilos saturados: malononitrilo, succinonitrilo, glutaronitrilo, adiponitrilo

mono- y dinitrilos aromáticos, sin sustituir y sustituidos: benzonitrilo, 2,6-difluoro-benzonitrilo, ftalonitrilo, isoftalonitrilo, tereftalonitrilo,

α-amino-nitrilos:

α-amino-propionitrilo, α-aminometiltio-butironitrilo, α-amino-butironitrilo, amino-acetonitrilo, todos

los nitrilos que se derivan de aminoácidos naturales, α-amino-3,3-dimetil-propionitrilo, α-amino-2,3

dimetil-propionitrilo

nitrilos con grupos carboxilo: ácido cianoacético

β-amino-nitrilos: 3-amino-propionitrilo

nitrilos insaturados: acrilonitrilo, metacrilonitrilo, cianuro de alilo, crotononitrilo

α-hidroxi-nitrilos:

α-hidroxi-n-propionitrilo, α-hidroxi-n-butironitrilo, α-hidroxi-isobutironitrilo, α-hidroxi-n-hexanonitrilo,

α-hidroxi-n-heptanonitrilo, α-hidroxi-n-octanonitrilo, α,γ-dihidroxi-β,β-dimetil-butironitrilo, la

cianhidrina de acroleína, la cianhidrina de metacrilaldehído, 3-cloro-lactonitrilo, 4-metiltio-α

hidroxibutironitrilo y α-hidroxifenil-propionitrilo.

La concentración de los nitrilos que deben ser convertidos químicamente en la solución de reacción no está restringida a determinados intervalos.

Con el fin de evitar una inhibición de la actividad enzimática por medio del substrato, la concentración del nitrilo se mantiene por lo general en 0,001 hasta 10 p/p% (= % en peso/peso), en particular en 0,1 hasta 2 p/p%, referida a la cantidad del biocatalizador como masa celular secada. El substrato se puede añadir al comienzo de la reacción en su totalidad o en el transcurso de la reacción de una manera continua o discontinua.

Cuando la solubilidad del compuesto de nitrilo en el sistema acuoso de reacción sea demasiado pequeña, se puede añadir un agente solubilizante.

Sin embargo, la reacción se puede llevar a cabo alternativamente también en un sistema bifásico de agua y un disolvente orgánico.

En el caso de la utilización de células del microorganismo como un material activo enzimáticamente, la cantidad de las células empleadas en relación con la cantidad del substrato es de manera preferida de 0,001 a 8 p/p% como masa celular secada.

El peso en seco de la masa celular se determina con un Moisture Analyser MA45 (de Sartorius).

También es posible inmovilizar a la enzima aislada según unas técnicas conocidas por lo general, y emplearla luego en esta forma.

La reacción se lleva a cabo por lo general a unas temperaturas de -5°C a 50°C, en particular de 0°C a 30°C, y durante un período de tiempo de 0,1 a 100 horas.

El valor del pH, que debe de ser respetado, de la mezcla de reacción no está restringido a determinados valores mientras tanto que la actividad enzimática no sea perjudicada. Después de la reacción, la amida formada se puede separar y purificar desde la solución de reacción, tal como es conocido.

Asimismo, es objeto del invento un procedimiento, en el que la amida o respectivamente la solución que contiene la amida, se separa, p.ej., con respecto de las células de la biomasa, y la amida o bien se saponifica para dar el correspondiente ácido, o se convierte químicamente mediando adición de hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos, en las correspondientes sales de los ácidos. De manera preferida, la amida de MHA se saponifica con hidróxido de calcio y se aísla la correspondiente sal de calcio.

Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación de la nitrilo hidratasa procedente de Rhodococcus opacus

Un ADN cromosomal de Rhodococcus opacus se digirió con las enzimas de restricción PinAI, PstI y XmaI (de Roche) y los fragmentos se separaron sobre un gel de agarosa al 0,8 %. Se llevó a cabo una transferencia de borrón de Southern según los métodos clásicos (p.ej. en Sambrook y colaboradores: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) sobre una membrana cargada positivamente de nilón (Hybond-N+, de Amersham). La hibridación se efectuó con una sonda marcada con DIG según las instrucciones del fabricante (Roche). La sonda se produjo mediante una PCR con los cebadores degenerados 1F y 1R con un ADN genómico como molde. Los cebadores se habían derivado de regiones homólogas de la subunidad β, que se determinaron mediante una alineación de secuencias de diversas NHasas. Sus secuencias se obtuvieron a partir de unos bancos de datos. Para el aislamiento de un fragmento de PinAI detectado con un tamaño de aproximadamente 2,2 kb (kilobases), unos fragmentos de ADN cortados con PinAI con un tamaño comprendido entre 2 y 2,5 kb se purificaron mediante una electroforesis en gel preparativa, se ligaron dentro del vector pUC18 (de Promega) cortado con XmaI y la tanda de ligación se transformó en el seno de E. coli JM 109 (de Promega). Unos transformantes positivos se identificaron mediante una hibridación de colonias con la misma sonda. Los clones obtenidos de esta manera contenían una inserción de 2.206 nt (nucleótidos) con el gen de la subunidad β y con la mayor parte del gen de la subunidad α de la nitrilo hidratasa.

Para la secuencia ausente, con el método arriba descrito, se preparó con los cebadores 2F y 2R una nueva sonda, que se hibrida junto al extremo 3' del fragmento clonado de PinAI. Como molde sirvió el fragmento de PinAI clonado en pUC18. Antes de la hibridación con esta sonda, desde la membrana más arriba descrita se eliminaron primeramente las señales cromáticas así como la primera sonda según las instrucciones del fabricante (Roche). Sobre esta membrana, con la segunda sonda se detectó una banda de PstI con un tamaño de 2 kb. Tal como se ha descrito más arriba, se clonó el correspondiente fragmento de ADN en el vector pUC18 abierto con PstI, el producto se transformó en el seno de E. coli JM109 y unos clones positivos se identificaron a través de una hibridación de colonias. El fragmento de PstI tiene un tamaño de 1.883 nt y contiene una parte (en 3') del gen de la subunidad α de la nitrilo hidratasa, el gen de la proteína auxiliadora P15K y una parte (en 5') del gen del transportador de cobalto.

Con el fin de clonar un fragmento de ADN con la secuencia ausente del gen del transportador de cobalto, con los cebadores 3F y 3R y con el fragmento de PstI clonado en pUC18 como molde se produjo una sonda, que se hibrida junto al extremo 3' del fragmento clonado de PstI. Con esta sonda, sobre la misma membrana, desde la que se habían eliminado por su parte unas señales cromáticas y la segunda sonda, se detectó una banda de XmaI con un tamaño de aproximadamente 1,7 kb. El correspondiente fragmento de ADN se clonó en el vector pUC18 abierto con XmaI, el producto se transformó en el seno de E. coli JM109 y los clones positivos se identificaron a través de una hibridación de colonias. Para esto, se empleó una sonda, que había sido amplificada con los cebadores 4F y 3R. El fragmento de XmaI tiene un tamaño de 1.747 nt y contiene una parte (en 3'-) del gen del transportador de cobalto.

La secuencia continua del racimo de genes, que contiene los polinucleótidos que codifican las subunidades α y β de la nitrilo hidratasa, de la proteína auxiliadora P15K y del transportador de cobalto, se reproduce en la SEQ ID NO:1.

Ejemplo 2

Construcción de los vectores de expresión

Los genes estructurales se clonaron en un conocido vector de expresión para E. coli, en el que los genes introducidos se encuentran bajo del control de un promotor de ramnosa. Adicionalmente, se introdujo un segundo promotor de ramnosa. El gen para la subunidad β-UE se amplificó para esto con los cebadores 5F y 5R, que introdujeron los sitios de corte para las enzimas de restricción Ndel, BamHI y HindIII. El segundo promotor de ramnosa se amplificó con los cebadores 6F y 6R, que introdujeron los sitios de corte para las enzimas de restricción BamHI, NcoI, y HindIII. El gen para la subunidad α-UE se amplificó con los cebadores 7F y 7R, que introdujeron los sitios de corte para las enzimas de restricción NcoI, KpnI y HindIII. El gen para la proteína P15K se amplificó con los cebadores 8F y 8R, que introdujeron los sitios de corte para las enzimas de restricción KpnI y HindIII, y que modificaron el codón iniciador de GTG a ATG. El vector de expresión, que resultó de esta manera, se llama pUD 15.

El mapa de restricción se encuentra en la Figura 1, y la secuencia bajo la SEQ ID NO:24.

5 El gen para el transportador de cobalto se clonó en otro vector de expresión para E. coli, en el que los genes introducidos están también bajo el control del promotor de ramnosa. Para esto, él se amplificó con los cebadores 9F y 9R, que introdujeron los sitios de corte para las enzimas de restricción NdeI y HindIII, y que modificaron el codón iniciador de TTG a ATG. El vector de expresión, que resultó de esta manera, se llama pUD 16.

10 El mapa de restricción se encuentra en la Figura 2, y la secuencia bajo la SEQ ID NO:25.

Los plásmidos de expresión se transformaron en el seno de la cepa E. coli DSM 14459, que se ha presentado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y 15 cultivos celulares) (DSMZ).

Cebador:

20 Los genes se encuentran en los segmentos:

pUD15: gen de la subunidad β: nt 25 -732 gen de la subunidad α: nt 949 - 1.566 gen de la P15K: nt 1.592 - 2.005

25 pUD16: gen del transportador de cobalto: nt 25 - 1.095

Ejemplo 3

30 Expresión heteróloga de la nitrilo hidratasa en E. coli DSM 14559 La cepa DSM 14559 se depositó en conexión con el documento de patente alemana DE 101 55 928. Las células transformadas con el pUD15 se cultivaron en un medio LB (LB Bouillon según Miller, VWR), que

35 contenía 1 mM de CoCl2 y 100 µg/ml de ampicilina, mediando sacudimiento a 37°C. La cultivación para las células transformadas con pUD15 y pUD16 se llevó a cabo análogamente, el medio contenía, no obstante, adicionalmente 50 µg/ml de cloramfenicol. Las células se sobreinocularon después de esto todavía 3 veces más en el mismo medio, después de que ellas hubieren alcanzado por lo menos una OD600 (densidad óptica a 600 nm) de 2. Después de 12 16 horas se sobreinoculó tanta cantidad del cultivo previo en un cultivo principal, tal que éste tuviese una OD600 de 0,1. El medio de cultivación del cultivo principal correspondía al del cultivo previo, pero contenía adicionalmente 2 g/l

5 de L-ramnosa. La cosecha de las células se efectuó después de una cultivación durante 22 horas.

Ejemplo 4

Determinación de las actividades enzimáticas

10 Las células se cultivaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 3, se separaron mediante una centrifugación con respecto del medio de cultivo y se resuspendieron en el tampón patrón (un tampón de fosfato de potasio 50 mM, de pH 7,5). 50 µl de esta suspensión de células se añadieron a 700 µl del tampón clásico y, para la iniciación de la reacción, se mezclaron con 250 µl de una solución 200 mM del nitrilo en el tampón patrón. La concentración de las

15 células en la suspensión celular se había de dimensionar en este caso de tal manera que, después de 10 min a 20°C, el nitrilo hubiese sido convertido químicamente en un 5 - 30 %. Después de 10 min a 20°C, se interrumpió la reacción mediante la adición de 20 µl de un ácido fosfórico semiconcentrado y las células se separaron mediante centrifugación.

Analítica por HPLC

Columna: Intersil ODS-3V

Fase móvil: una mezcla de un tampón de fosfato de potasio 10 mM, de pH 2,3, y de acetonitrilo en la relación de 85:15 para el nitrilo de metionina, el nitrilo de MHA y la cianhidrina de acetona, o respectivamente de 99:1 para todos los otros substratos

Caudal: 1 ml/min

Detección: por UV a 200 nm

20 La actividad de una unidad (U) se define como la cantidad de la enzima, que convierte químicamente en un minuto a 1 µmol del nitrilo de N-formil-valina en la amida. La actividad específica se indica en U por mg de biomasa seca (U/mg de BTM).

25 Ésta se mide con el Moisture Analyser modelo MA45 (de Sartorius).

Ejemplo 5

Expresión concomitante de los genes que codifican la subunidad α y la subunidad β de la nitrilo hidratasa y la 30 proteína p15K.

La expresión se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 con la cepa de E. coli DSM 14459 transformada, que contiene el plásmido pUD15. La actividad específica de las células fue de 23 U/mg de BTM.

Ejemplo 6

Expresión concomitante de los genes que codifican la subunidad α y la subunidad β de la nitrilo hidratasa, la proteína p15K y el transportador de cobalto.

40 La expresión se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 con la cepa de E. coli DSM 14459 transformada, que contiene los plásmidos pUD15 y pUD16. La actividad específica de las células fue de 81 U/mg de BTM.

45 Ejemplo 7

Especificidad para el substrato

Se convirtieron químicamente diversos nitrilos análogamente al Ejemplo 3 con células transformadas en reposo de la

50 cepa de E. coli DSM 14459, que contiene el plásmido pUD15. La actividad específica, que se obtuvo con el nitrilo de N-formil-valina, se estableció como igual a 100 %. Las otras actividades se indicaron con relación a ésta. Los resultados se reproducen en la Figura 3.

Ejemplo 8

55 Crecimiento de la cepa E. coli DSM 14459 transformada en presencia de sales de Co2+.

Las células transformadas de la cepa E. coli DSM 14459, que o bien contienen solamente el plásmido pUD15 o pUD15 y pUD16, se cultivaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. La concentración de cobalto en el medio se hizo variar en este caso de 0,5 a 2 mM. Después de 24 horas se midió la densidad óptica del cultivo a 600 nm.

E. coli con pUD15: E. coli con pUD15 y pUD16

CoCl2 0,5 mM: 2,808 2,524

CoCl2 1,0 mM: 2,6955 2,173

CoCl2 2,0 mM: 2,330 2,113

Se pone de manifiesto que también en el caso de unas altas concentraciones de cobalto solamente se puede comprobar una pequeña influencia sobre el crecimiento de las células.

Ejemplo 9

Reacción del nitrilo de metionina con células en reposo transformadas de E. coli DSM 14459, que contienen el plásmido pUD15.

Unas células de E. coli DSM 14459, que contienen el plásmido pUD15, se cultivaron y se separaron por centrifugación tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. 2,8 g de las células, referido al peso en húmedo, se resuspendieron en 47,2 ml de un tampón de fosfato de potasio 50 mM, de pH 7,5, y se añadió el nitrilo de metionina a 20°C mediando agitación enérgica, de una manera continua con una velocidad tal que la concentración durante la reacción no sobrepasase en ningún momento los 15 g/l. El valor del pH se mantuvo constante en 7,5. La vigilancia de la reacción se llevó a cabo mediante una HPLC (cromatografía en fase líquida de alto rendimiento) tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Después de 320 min habían reaccionado totalmente 9,1 g del nitrilo para dar 10,4 g de la amida. Esto corresponde a una concentración de 176 g/l.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1

Plásmido pUD15

rhaP promotor de ramnosa beta gen de la subunidad β de la nitrilo hidratasa alpha gen de la subunidad α de la nitrilo hidratasa P15K gen de la proteína auxiliadora P15K ori origen de la replicación bla gen para la resistencia a ampicilina (β-lactamasa)

Figura 2

Plásmido pUD16

rhaP promotor de ramnosa CoTrans gen del transportador de cobalto ori origen de la replicación Cmr gen para la resistencia a cloramfenicol

Figura 3

Actividad específica relativa en el caso de la conversión química de diversos nitrilos en comparación con la actividad en el caso de la conversión química del nitrilo de N-formil-valina.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Degussa AG

<120> Nitrilo hidratasa de Rhodococcus opacus

<130> 040069 BT

<160> 25

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 3.146

<212> ADN

<213> Rhodococcus opacus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(708)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (710)..(1.327)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (2.076)..(3.146)

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> Rhodococcus opacus

<400> 2

<210> 3

<211> 205

<212> PRT

<213> Rhodococcus opacus

<400> 3

<210> 4

<211> 356

<212> PRT

<213> Rhodococcus opacus

<400> 4

<210> 5

<211> 3.146 5 <212> ADN

<213> Rhodococcus opacus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1.324)..(1.737)

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 137

<212> PRT

<213> Rhodococcus opacus

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 7

<210> 8

<211> 17

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 8

<210> 9

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 9

<210> 10

<211> 16

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 10

<210> 11

<211> 16

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 11

<210> 12

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 12

<210> 13

<211> 15

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 13

<210> 14

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 14

<210> 15

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 15

<210> 16

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 16

<210> 17

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 17

<210> 18

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 18

<210> 19

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 19

<210> 20

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 20

<210> 21

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 21

<210> 22

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 22

<210> 23

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 23

<210> 24

<211> 6307

<212> ADN

<213> E. coli, Rhodococcus opacus

<400> 24

<210> 25

<211> 6191

<212> ADN

<400> 25

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Racimo aislado de polinucleótidos procedente de Rhodococcus opacus, que contiene cuatro secuencias de nucleótidos, que codifican cuatro polipéptidos con unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas en cada caso en por lo menos un 90 % con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, poseyendo los polipéptidos las actividades de una nitrilo hidratasa, que se compone de las subunidades α y β, de la proteína auxiliadora P15K y de un transportador de cobalto.
2.

Polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, escogidos entre el conjunto que se compone de:

a) un polinucleótido, que se compone de las posiciones 1 hasta 708 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de la secuencia de nucleótidos complementaria con ésta,

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la secuencia procedente de a) dentro del marco de la degeneración del código genético,

c) un polinucleótido, que se hibrida en condiciones rigurosas con las secuencias complementarias a) o b), abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0,1 x SSC a una temperatura de 50-68°C y

d) un polinucleótido, con una secuencia de nucleótidos procedente de a), b) o c), que contiene unas mutaciones con sentido neutras en su función,

codificando los polinucleótidos la subunidad β de la nitrilo hidratasa.
3. Polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, escogidos entre el conjunto que se compone de:

a) un polinucleótido, que se compone de las posiciones 710 hasta 1.327 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de la secuencia de nucleótidos complementaria con ésta,

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la secuencia procedente de a) dentro del marco de la degeneración del código genético,

c) un polinucleótido, que se hibrida en condiciones rigurosas con las secuencias complementarias procedentes de a) o b), abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0,1 x SSC a una temperatura de 50-68°C y

d) un polinucleótido, con una secuencia de nucleótidos procedente de a), b) o c), que contiene unas mutaciones con sentido neutras en su función,

codificando los polinucleótidos la subunidad α de la nitrilo hidratasa, y codificando los polinucleótidos la proteína auxiliadora P15K.
4.

Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene las secuencias de aminoácidos, que son idénticas por lo menos en un 90 % con las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, teniendo el polipéptido la actividad de una nitrilo hidratasa.
5.

Una sonda o un cebador, que contiene por lo menos 20 nucleótidos consecutivos dentro de las posiciones 1 hasta

1.327 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de su forma complementaria.
6.

Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 2, que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento con las posiciones 1 hasta 708 de la SEQ ID NO:1, abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0,1 x SSC a una temperatura de 50 a 68°C.
7.

Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 3, que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento con las posiciones 710 hasta 1.327 de la SEQ ID NO:1, abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0,1 x SSC a una temperatura de 50 a 68°C.
8.

Unos vectores que contienen un(os) polinucleótido(s) escogidos entre los de las reivindicaciones 1 hasta 3 y 6 hasta 7.
9.

El vector pUD15, que se compone de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:24.
10.

El vector pUD16, que se compone de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:25.
11.

Una célula anfitriona, transformada o transfectada mediante la introducción de un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.
12.

Una célula anfitriona, transformada mediante la introducción de un vector de acuerdo con las reivindicaciones 8 hasta 10.
13. Una célula anfitriona transformada de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, siendo la célula anfitriona una 5 bacteria de la familia de las Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli.
14. Procedimiento para la preparación de amidas a partir de nitrilos con unas nitrilo hidratasas procedentes de Rhodococcus o de unos microorganismos que contienen esta enzima, en el que

10 a) un microorganismo transformado, que contiene unos genes sobreexpresados con las secuencias de nucleótidos escogidas entre las de las reivindicaciones 1 hasta 3 y 6, 7, se fermenta en presencia de 0,15 a 4 mM de Co2+, en unas condiciones, que dan lugar a la formación de la nitrilo hidratasa, b) esta enzima se deja enriquecer en el microorganismo, y c) esta enzima se aísla a partir de las células, o

15 d) se cosechan los microorganismos y se obtienen las células en reposo, que contienen la enzima, y e) la enzima o los microorganismos que la contienen se hacen reaccionar con los compuestos de las

y 20 R''-CN (II)

en las que significan:

25 X: OH, H, alquilo con 1 a 4 átomos de C, en particular NH2;

R: H, un radical alquilo saturado con 1 a 12 átomos de C, ramificado o sin ramificar, eventualmente sustituido con NH2, radicales alquenilo con 1 a 12 átomos de C, ramificados o sin ramificar, o grupos cicloalquilo con 3 a 6 átomos de C,

30 radicales alquileno sustituidos con grupos alquiltio, correspondiendo el alquilo aquí a un radical de C1 a C3 y el alquileno a un radical divalente de C3 a C8, R': H, alquilo con 1 a 3 átomos de C, R'': un anillo insaturado de uno o dos núcleos, con 6 a 12 átomos de C, eventualmente sustituido con uno o dos grupos alquilo de C1 - C3, Cl, Br o F, un radical alquil-nitrilo monovalente con 1 a 6 átomos de C,

35 para dar las correspondientes amidas,
15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque se emplean unas células anfitrionas de acuerdo con las reivindicaciones 11 hasta 13.

40 16. Nitrilo hidratasa producida recombinantemente de acuerdo con la reivindicación 14 con el origen de Rhodococcus opacus, que convierte químicamente a los α-aminonitrilos con una actividad específica de >50 U/mg de biomasa seca.

Figura 1 Figura 2 Figura 3