Aufgabe war es nun, einen Mikroorganismus zu kreieren,
welcher zum einen weniger L-Rhamnose zur Induktion der
Genexpression benötigt, bei dem andererseits jedoch die aus
dem Stand der Technik bekannte genetische Instabilität
zumindest vermindert ist. Insbesondere sollte der
Mikroorganismus im technischen Maßstab zur Herstellung von
rec-Proteinen in ökonomisch günstiger Weise verwendet
werden können.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Anspruch 1 bis 4
beziehen sich auf den erfindungsgemäßen Mikroorganismus.
Ansprüche 5 und 6 schützen ein besonderes Herstellverfahren
für diesen, wohingegen Ansprüche 7 bis 9 auf dessen
spezielle Verwendungen gerichtet sind. Anspruch 10 umfaßt
einzelne Vektoren, die bei der Synthese des Mikroorgnismus
heranzuziehen sind.
Dadurch, daß man einen Mikroorganismus bereitstellt, der
eine Rekombinationsdefizienz (recA-) und eine durch eine
Deletion des rhaB-Gens erfolgte Defizienz im Abbau von
Rhamnose (rhaB-) aufweist, gelangt man zur Lösung der
gestellten Aufgabe in vorteilhafter aber dafür nicht in
ohne weiteres vorhersehbarer Art und Weise.
Der Mikroorganismus dient lediglich zur Vermehrung und
Gewinnung einer ausreichenden Menge des rekombinanten
Proteins. Die Verfahren zur Durchführung dieser Maßnahmen
sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook et al. 1989,
Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P & Bolivar F. 1990,
Design and construction of expression plasmid vectors in
E. coli, Methods Enzymology 185, 14-37).
Der erfindungsgemäße Organismus kann in ausgezeichneter
Weise zur Produktion von rekombinanten Proteinen
herangezogen werden (Fig. 4), wobei die für die zur
Induktion der Genexpression aufzuwendende Menge an L-
Rhamnose deutlich reduziert werden kann, da der
Mikroorganismus keine solche während des Wachstums
verbraucht. Der Vergleich der Stämme bzgl. Rhamnoseabbau in
Fig. 1 zeigt, dass sowohl E. coli BW3110 als auch der neu
erzeugte Stamm E. coli DSM 14459 den Induktor L-Rhamnose
kaum verstoffwechseln, wodurch eine, wie bereits für E. coli
BW3110 gezeigt, 90%-ige Reduktion des Rhamnoseverbrauches
möglich ist (Stumpp et al.).
Im Prinzip kann jeder zur Herstellung von rec-Proteinen
vorteilhaft zu benutzende Organismus erfindungsgemäß
modifiziert werden. Organismen wie z. B. Prokaryonten oder
Eukaryonten, wie Pseudomonas, Streptomyces, Arthrobacter,
Bacillus, Staphylococcus, Escherichia, Candida, Hansenula,
Pichia können für diesen Zweck herangezogen werden.
Vorzugsweise ist ein E. coli zu benutzen. Ganz besonders
bevorzugt sind: E. coli NM 522, BL21, XL1 Blue, JM101,
JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10- oder HB101. Äußerst
bevorzugt sind davon diejenigen, die schon eine recA-
Defizienz aufweisen.
Ganz besonders vorteilhaft ist der Mikroorganismus, welcher
unter der Nummer DSM 14459 bei der DSMZ GmbH, Mascher oder
Weg 1b, D-38124 Braunschweig am 24.08.01 nach dem
Budapester Vertrag hinterlegt wurde. Äußerst bevorzugt ist
darüberhinaus ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus
aufweisend die Vektoren pOM21 und pOM22 (PCT/US 00/08159).
Wie oben schon angedeutet eignet sich der erfindungsgemäße
Mikroorganismus vorzugsweise zur Produktion von rec-
Proteinen, wobei Genkonstrukte für die Expression
herangezogen werden, die einen rhamnoseinduzierbaren
Promotor besitzen. Ganz besonders bevorzugt ist deshalb ein
erfindungsgemäßer Mikroorganismus aufweisend mindestens ein
rhamnoseinduzierbares Expressionssystem. Unter dem Begriff
Expressionssystem wird in diesem Fall ein Vektor
verstanden, welcher in dem erfindungsgemäßen
Mikroorganismus stabil replizierbar und mit einem
rhasmnoseinduzierbaren Promotor ausgestattet ist. Derartige
Vektoren können vorzugsweise von pUC, pBR, pSC101 und pACYC
Derivaten abgeleitet und in entsprechend modifizierter Form
beispielsweise Studier et al., Methods Enzymol. 1990, 185,
61-69 oder den Broschüren der Firmen Roche Biochemicals,
Invitrogen, Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech
oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Vektoren
können gefunden werden in: DNA cloning: a practical
approach. Volume I-III, edited by D. M. Glover, IRL Press
Ltd., Oxford, Washington DC, 1985, 1987; Denhardt, D. T.
and Colasanti, J.: A surey of vectors for regulating
expression of cloned DNA in E. coli. In: Rodriguez, R. L.
and Denhardt, D. T (eds), Vectors, Butterworth, Stoneham,
MA, 1987, pp179-204;
Gene expression technology. In: Goeddel, D. V. (eds),
Methods in Enzymology, Volume 185, Academic Press, Inc.,
San Diego, 1990; Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis,
T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y.
Vektoren mit einem rhamnoseinduzierbaren Promotor, mit
denen das die zu expremierende Nukleinsäure aufweisende
Genkonstrukt in ganz bevorzugter Weise in den
Wirtsorganismus kloniert werden kann, sind: pKK-177-3H
(Roche Biochemicals), pBTac (Roche Biochemicals), pKK-233-3
(Amersham Pharmacia Biotech), pLex (Invitrogen) oder die
Vektoren der pET-Serie (Novagen).
Ganz besonders bevorzugt sind z. B. die Vektoren pOM21 und
pOM22 (PCT/US 00/08159).
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Mikroorganismen, bei dem man das Mutagenesekonstrukt zur
Inaktivierung des Rhamnulokinase-Gens konjugativ in den
rekombinationsaktiven Mikroorganismus transferiert und nach
erfolgreicher Integration die Rekombinationsaktivität
gezielt ausschaltet.
Zur Erzeugung des gewünschten Phänotyps könnte der Fachmann
u. a. das rhaB-Gen analog der Herstellung des Stammes E. coli
BW3110 (Development of an Escherichia coli whole cell
biocatalyst for the production of L-amino acids. Wilms, B.;
Wiese, A.; Syldatk, C.; Mattes, R.; Altenbuchner, J.
(2001), J. Biotechnol. 86, 19-30.) gezielt deletieren, wobei
im Gegensatz zur Erzeugung von E. coli BW3110 auf einen
Stamm mit recA-negativen Phänotyp zurückgegriffen wird. Aus
dem recA-negativen Phänotyp ergaben sich jedoch bei der
Erzeugung des gewünschten Stammes mehrere für den Fachmann
unerwartete Probleme:
Voraussetzung für die Mutagenese über homologe
Rekombination ist die Wiederherstellung des recA-positiven
Phänotyps in E. coli JM109. Dazu kann das recA-Gen aus dem
Stamm E, coli BL21 mittels PCR amplifiziert und
beispielsweise mit dem Vektor pBR322 bzw. pUniBlunt/V5-His-
TOPO (Fig. 2) ligiert werden. Diese Konstrukte vermitteln
dem Stamm E. coli JM109 einen recA-positiven Phänotyp, wie
die Induktion der SOS-Antwort nach UV-Bestrahlung belegt
(siehe Beispiel 1).
Ein Mutagensekonstrukt (z. B. pMut1, siehe Beispiel 1, Fig.
3) zur Inaktivierung des Rhamnulokinase-Gens (rhaB) kann
beispielsweise durch Ligation einer Teilsequenz des rhaB-
Gens, in die eine Leserasterverschiebung eingeführt wird,
in einen in E. coli JM109 nicht replizierbaren Vektor
(Suizidvektor) erstellt werden. Eine rhaB-negative Mutante
des Stamms E. coli JM109 + pBrecA+, welche durch das
Plasmid pBrecA+ einen recA-positiven Phänotyp besitzt,
konnte nach dieser Vorgehensweise durch Transformation des
Mutagenesekonstrukts jedoch nicht dargestellt werden.
Die Konstruktion einer rhaB-negativen Mutante von E. coli
JM109 durch ein Rekombinase-System (ein von recA
unabhäniges System; analog One-step inactivation of
chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR
products. Datsenko, Kirill A.; Wanner, Barry L. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. (2000), 97(12), 6640-6645.) führte
ebenfalls nicht zum Ziel.
Zum Ziel gelangt man jedoch, wenn man nach Insertion des
RP4-"origins of replication" (Conditionally replicative and
conjugative plasmids carrying lacZα for cloning,
mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Metcalf,
William W.; Jiang, Weihong; Daniels, Larry L.; Kim, Soo-Ki;
Haldimann, Andreas; Wanner, Barry L. Plasmid (1996), 35(1),
1-13.) in den Vektor pMut1 das resultierende
Mutagensekonstrukt pMut2 (Fig. 3) konjugativ (Sambrook et
a1. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P &
Bolivar F. 1990) nach E. coli JM109 + pBrecA+ transferiert
und in das Chromosom integriert. Mit pMut2 lässt sich wie
erwartet sowohl rhaB-negative als auch rhaB-positive
Transkonjuganten identifizieren, was sich am weißen bzw.
roten Phänotyp auf dem Indikatormedium (siehe Beispiel 1)
zeigt.
Ausgehend von einem rhaB-negativem Transkonjugant (bzw.
rhaB-positiven Transkonjuganten und anschließender
Excission des integrierten Vektors), lassen sich solche
Klone anreichern, die nach mehrfacher Inkubation ohne
Selektionsdruck für die durch den Vektor pBrecA+
vermittelte Antibiotikumsresistenz (Tetrazyklin)
Tetrazyklin-sensibel sind. Durch Induktion der SOS-Antwort
mittels UV-Bestrahlung kann deren recA-Phänotyp überprüft
und als recA-negativ bestätigt werden. So lassen sich Klone
identifizieren, deren Phänotyp als rhaβ-negativ und recA-
negativ zusammengefasst werden kann.
In einer nächsten Ausgestaltung beschäftigt sich die
Erfindung mit der Verwendung des erfindungsgemäßen
Mikroorganismus in einem Verfahren zur Herstellung von rec-
Proteinen. Prinzipiell ist der Fachmann frei in der Wahl
der herzustellenden rec-Proteine. Die Verfahren sind der
allgemeinen Fachliteratur zu entnehmen (s.: Sambrook et al.
1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P & Bolivar F.
1990; Design and construction of expression plasind vectors
in E. coli, Methods Enzymology 185, 14-37; Vectors: A Survey
of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R. L. Rodriguez
& D. T. Denhardt, Eds: 205-225). Bezüglich der allgemeinen
Vorgehensweise (PCR, Klonierung, Expression etc.) sei auch
auf obengenannte Literatur und das dort Zitierte verwiesen.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Mikroorganismus
zur Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminosäuren
analog einem Ganzzellkatalysator wie in PCT/EP 00/08473 und
PCT/US 00/08159 offenbart. Äußerst bevorzugt ist daher die
Ausführungsform, in der der erfindungsgemäße
Mikroorganismus ein rec-Protein mit der Eigenschaft einer
Hydantoinase, einer Carbamoylase und/oder einer Hydantoin-
oder Carbamoylracemase aufweist. Damit ist es möglich aus
leicht zu synthetisierenden Hydantoinen
enantiomerenangereicherte Aminosäuren zu generieren.
Vorteilhafterweise kann der so verwendete Mikroorganismus
die Vektoren pOM21 und pOM22, wie in E. coli DSM 14459
(pOM21/pOM22) verwirklicht, aufweisen (PCT/US 00/08159).
E.coli DSM 14459, E.coli JM109 und E.coli BW3110 wurden
jeweils mit pOM21 und pOM22 transformiert und bezüglich
Rhamnoseverbrauch und Aktivität verglichen (Fig. 1/4).
Fig. 4 zeigt, dass der rekombinante Stamm DSM 14459 nicht
nur gegenüber dem rekombinanten Ausgangstamm E. coli JM109
(pOM21, pOM22) sondern überraschenderweise auch gegenüber
E. coli BW3110 (pOM21, pOM22) eine deutlich höhere Aktivität
besitzt. Interessant in diesem Zusammenhang ist, dass für
E. coli BW3110 berichtet wurde, dass die spezifische
Aktivität eines gebildeten Enzyms im Rohextrakt um 15-25%
unter der eines isogenen Stammes, der Rhamnose verbraucht,
bleibt (Ein neues, L-Rhamnose-induzierbares
Expressionssystem für Escherichia coli. Stumpp, T.; Wilms,
B.; Altenbuchner, Biospektrum (2000), 1, 33-36.).
Einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet die Tatsache,
daß weitere Mutationen im Genom des erfindungsgemäßen
Mikroorganismus zu Mutanten oder Varianten führen können,
die weiter verbesserte Eigenschaften besitzen. Daher
beinhaltet die vorliegende Erfindung ebenfalls die
Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zur
Herstellung von Mutanten oder Varianten des
Mikroorganismus. Die Verfahren zur Einführung sind dem
Fachmann hinlänglich bekannt (s. in dieser Schrift zitierte
Lit.).
Der erfindungsgemäße Organismus kann mit allen dem Fachmann
für diesen Zweck in Frage kommenden Vektoren transformiert
werden. Die Konstruktion geeigneter Vektoren kann dem
allgemeinen Fachwissen entnommen werden. Spezielle
Strategien sind z. B in: One-step inactivation of
chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR
products. Datsenko, Kirill A.; Wanner, Barry L. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. (2000), 97(12), 6640-6645; A
genomebased approach for the identification of essential
bacterial genes. Arigoni, Fabrizio; Talabot, Francois;
Peitsch, Manuel; Edgerton, Michael D.; Meldrum, Eric;
Allet, Elisabeth; Fish, Richard; Jamotte, Therese; Curchod,
Marie-Laure; Loferer, Hannes. Nat. Biotechnol. (1998),
16(9), 851-856, beschrieben. Vorzugsweise werden die
folgenden Vektoren zur erfindungsgemäßen Modifizierung der
Mikroorganismen verwendet: pBrecA+, pMut1, pMut2. Ebenso
umfasst von der Erfindung ist die Erzeugung einer
Kombination eines recA-negativen und rhaB-negativen
Phänotyps durch gezieltes Knockout von rhaB mit dem
Fachmann bekannten Methoden unter Verwendung recA-positiver
Stämme und anschließender Inaktivierung von recA.
Für die erfindungsgemäßen Anwendungen, z. B. zur Herstellung
von Aminosäuren, können die betrachteten und
erfindungsgemäß hergestellten rec-Enzyme in freier Form als
homogen aufgereinigte Verbindungen verwendet werden.
Weiterhin kann das rec-Enzym auch als Bestandteil des
intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in
Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch
aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus. Möglich ist
ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form
(Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey and Ralph A.
Messing, "Immobilisierte Biomaterialien - Techniken und
Anwendungen", Angew. Chem. 1982, 94, 836-852).
Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch
Lyophilisation (Dordick et al., J. Am. Chem. Soc. 1994,
116, 5009-5010; Okahata et al., Tetrahedron Lett. 1997, 38,
1971-1974; Adlercreutz et al., Biocatalysis 1992, 6,
291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in
Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT
oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder
Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Goto et al.,
Biotechnol. Techniques 1997, 11, 375-378). Die Verwendung
als CLECs ist ebenfalls denkbar (St Clair et al., Angew
Chem Int Ed Engl 2000 Jan, 39(2), 380-383).
Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten,
enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der
Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch
mit der anderen in > 50 mol-% verstanden.
Eine natürliche Aminosäure ist eine solche, wie in Beyer-
Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag
Stuttgart, 22. Auflage, 1991, S. 822f. dargestellt.
Darüberhinaus sind jedoch auch entsprechende unnatürliche
α-Aminosäuren angesprochen, wie z. B. in DE 199 03 268.8
aufgeführt.
Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen gelten als
von der Offenbarung mitumfaßt.
SEQUENZPROTOKOLL
Beispiele
1. Verfahren zur Herstellung eines recA- und rhaB- E. colis
1.1 Präparation genomischer DNA aus E. coli JM109 und E. coli
BL21 (DE3)
5 ml LB-Flüssigmedium wurden mit einer Kolonie beimpft und
bei 37°C, 180 rpm, 16 Stunden inkubiert. Die Präparation
genomischer DNA erfolgte mittels eines Kits (Cat# 6560-200)
von Bio 101 (Vista, USA) gemäß des darin enthaltenen
Protokols.
1.2 Amplifikation von recA aus genomischer DNA von E. coli
BL21 (DE3) und rhaB aus genomischer DNA von E. coli JM109
mittels PCR
PCR-Ansatz
Ca. 100 ng genomische DNA aus 1.1; jeweils 20 pmol primer
recA+_01f (Seq ID 1) und primer recA+_01r (Seq. ID 2) für
Amplifikation des recA Gens bzw. 20 µmol primer rhab_01f
(Seq ID 3) und primer rhab_01r (Seq. ID 4) für
Amplifikation des rhaB Gens; 2,5 U Hot Star Taq Polymerase
(Qiagen, Germany); sonstige Bedingungen gem. Anleitung des
Hot Star Taq Polymerase Kits von Qiagen (Germany).
PCR-Zyklen
1 × (15 min 95°C)
30 × (30 s 95°C, 30 s 48°C, 60 s 72°C)
1 × (7 min 72°C)
Die Aufreinigung der PCR-Fragmente erfolgte mittels Min
Elute PCR Purification Kit (Qiagen, Germany) gem.
Anleitung.
1.3 Klonierung der rhaB und recA Fragmente in pUniBlunt/V5-
His-TOPO (Konstruktion von pUnirecA+ und pRhaB)
Die Klonierung der aus 1.2 resultierenden PCR-Fragmente und
Transformation der Ligationsprodukte in E. coli PIR1
erfolgte mittels des pUni/V5-His-TOPO Klonierungskits
(Cat.#: ET004-xx) von Invitrogen (Carlsbad, USA) gemäß
enthaltener Anleitung. Das aus rhaB und pUnißlunt/V5-His-
TOPO resultierende Plasmid wird als pRhaB bezeichnet (Fig.
5) Das aus recA und pUniBlunt/V5-His-TOPO resultierende
Plasmid wird als pUnirecA+ bezeichnet.
1.4 Kontruktion von pMut1 ausgehend von pRhaB
pRhaB wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI von Roche
(Deutschland) gem. beigefügter Anleitung geschnitten. Die
überstehenden Enden des resultierende Vektorfragment wurden
mit T4 DNA Polymerase von New England Biolabs (Frankfurt,
Germany) gem. beigefügter Anleitung aufgefüllt.
1.5 Konstruktion von pMut2 ausgehend von pMut1
pMut1 wurde mit KpnI und BglII verdaut und mit Hilfe der T4
DNA Polymerase die überhängenden Enden aufgefüllt. Das ca.
2,6 kb große Fragment wurde mittels eines Qiagen Gel
Extraction Kit aufgereinigt und mit einem RP4-Ori und R6K-
ori tragenden DNA Fragments (Seq. ID 5) mit einer T4 DNA
Ligase gem. Anleitung (s. o.) ligiert.
1.6 Herstellung eines recA-positiven E. coli JM109
E. coli 314109 wurde mit dem Plasmid pBrecA+ gem. eines
Standardprotokolls transformiert (z. B. beschrieben in:
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989.
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.).
Transformanten wurden auf einer LB-Agarplatte durch UV-
Bestrahlung (254 nm, 40 cm Entfernung, 5-20 Sekunden) auf
RecA-Aktivität getestet. Positive (recA-aktive) Klone
zeigten bei ansteigender Bestrahlungsdauer im Gegensatz zu
E. coli JM109 Wildtyp noch deutliches Wachstum. recA-
positive Klone werden als E. coli JM109 + pBrecA+
bezeichnet.
1.7 Konjugativer Transfer des Mutagenesekonstruktes pMut2
und Screening nach rhaB-negativem Phänotyp
2 ml stationärer Kulturen von E. coli S17-1 (λpir), welche
mit pMut2 gem. Standardprotokoll (s. o.) transformiert
wurden, und E. coli JM109 + pBrecA+ wurden durch
Zentrifugation geerntet und 3× mit LB-Medium gewaschen.
Nach Resuspendierung der jeweiligen Zellen wurden diese
gemischt und für 16 h auf LB-Platten bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen von der Platte abgeschwemmt
und auf LB-Kan, Tet-Platten ausplattiert. Nach 16-24 Stunden
waren Transkonjuganten sichtbar, bei welchen das
Mutagenesekonstrukt ins Chromosom integriert worden ist.
Ca. 25% der Transkonjuganten waren bei Plattierung auf
MacConkey-Rhamnose-Agar-Platten (Zusammensetzung in
g/Liter: Pepton 20.0; NaCl 5.0; Gallensalz 1.5; Rhamnose
10.0; Crystall Violet 0.001; Neutral Rot 0.03; Agar-Agar
15.0) weiß und zeigten damit einen rhaB-negativen Phänotyp.
1.8 Anreicherung eines Tetrazyklin-sensiblen, recA-
negativen Phänotyps
Die in 1.7 erzeugten rhaB-negativen Klone haben durch das
Plasmid pBrecA+ einen recA-positiven Phänotyp. Um nun recA-
negative Zellen zu erhalten wurden die in 1.7 erhaltene
rhaB-negative Klone ohne Selektionsdruck für die durch das
Plasmid pBrecA-vermittelte Tetrazyklinresistenz über
mehrere Generationen unter Zusatz von Tetrazyklin (12,5 µg/ml)
und Ampicillin (100 µg/ml) kultiviert. (Anmerkung:
Durch diese negative Selektion können nur Zellen überleben,
welche das Plasmid pBrecA+ verloren haben.) Nach Ernte der
Zellen und dreimaligem Waschen mit LB-Medium wurden die
Zellen auf LB-Agar aufgebracht und 16 Stunden bei 37°C
bebrütet. Der Verlust von pBrecA+ der gewachsenen Klone
konnte anschließend durch Tetrazyklin-Sensibilität und UV-
Bestrahlung zum Nachweis des recA-negativen Phänotyps
analog zum Vorgehen in 1.6 bestätigt werden. Somit konnten
E. coli Klone mit recA-negativen und rhaB-negativen
Phänotyp, wie beispielsweise E. coli DSM 14459, erzeugt
werden.
2. Bestimmung der Enzymaktivität von
Ganzzellbiokatalysatoren (siehe Fig. 4)
Zusammensetzung von Wachstumsmedium:
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
100 mg/l Ampicillin
50 mg/l Chloramphenicol
2 g/l Rhamnose
1 mM CoCl2
Zusammensetzung von Reaktionslösung:
100 mM DL-Methylthioethylhydantoin (MTEH)
0.1 mM CoCl2
pH 7.8
Übernachtkulturen von E. coli DSM 14459 (pOM21, pOM22),
E. coli JM109 (pOM21, pOM22) und E. coli BW3110 (pOM21,
pOM22) wurden 1 : 100 in 20 ml Wachstumsmedium verdünnt und
bei 30°C mit 250 rpm inkubiert. Das Wachstum wurde über 24 h
verfolgt. Nach ca. 24 h wurde eine optische Dichte gemessen
bei 600 nm (OD600) von 4 erreicht und die Zellen mittels
Zentrifugation (5 min, 15.000 g) pelletiert. Die jeweiligen
Zellpellets wurden anschliessend in der Reaktionslösung so
suspendiert, dass sich eine OD600 von 10 ergab und sofort
bei 37°C, 1000 rpm, für 10 Minuten inkubiert. Im Anschluss
daran wurde die Reaktion durch Zugabe von HPLC-Laufmittel
(s. u.) gestoppt und die Zellen mittels Zentrifugation
(5 min, 15.000 g) vom Reaktionsüberstand abgetrennt. Im
Reaktionsüberstand wurde mittels HPLC (s. u.) die gebildete
Konzentration an Methionin bestimmt und der prozentuale
Umsatz (mol/mol) berechnet.
HPLC-Methode:
Säule: RP-18 (Waters)
HPLC-Laufmittel: 985 ml H2O, 15 ml Acetonitril, 1 ml
Trifluoressigsäure
Fluss: 1 ml/min
Detektion: 220 nm
3. Bestimmung des Rhamnoseverbrauchs (siehe Fig. 1)
Übernachtkulturen von E. coli DSM 14459 (pOM21, pOM22),
E. coli JM109 (pOM21, pOM22) und E. coli BW3110 (pOM21,
pOM22) wurden 1 : 100 in 20 ml Wachstumsmedium verdünnt und
bei 30°C mit 250 rpm inkubiert. Das Wachstum wurde über 24 h
verfolgt. Nach ca. 24 h wurde eine optische Dichte gemessen
bei 600 nm (OD600) von 4 erreicht und die Zellen mittels
Zentrifugation (5 min, 15.000 g) pelletiert. Der Überstand
wurde mittels HPLC auf Rhamnosegehalt analysiert.
HPLC-Methode:
Säule: Aminex HPX-87 H (BioRad)
HPLC-Laufmittel: 5 mM H2SO4
Fluss: 0.6 ml/min
Detektion: Brechungsindex (RI-Detektor)