DE60215881T2

DE60215881T2 - Methode für die Erweiterung der chemischen Zusammensetzung von Proteinen produziert in vivo unter Verwendung von mutierten Aminoacyl-tRNA-Synthetasen ohne Korrekturfunktion

Info

Publication number: DE60215881T2
Application number: DE60215881T
Authority: DE
Inventors: Volker Doring; Leslie A. San Diego Nangle; Tamara L. Baltimore Hendrickson; Valerie La Jolla de Crecy-Lagard; Paul La Jolla Schimmel; Philippe Marlière
Original assignee: Evologic GmbH; Institut Pasteur de Lille; Scripps Research Institute
Current assignee: Evologic 78462 Konstanz De GmbH; Institut Pasteur de Lille; Scripps Research Institute
Priority date: 2001-04-19
Filing date: 2002-04-19
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2022-04-20
Also published as: US20030148422A1; ATE344836T1; US20050170460A1; DE60215881D1; US7524646B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verändern der chemischen Zusammensetzung von in vivo produzierten Proteinen, die den Schritt Deaktivierung, insbesondere durch Mutagenese, der Korrekturfunktion von einer der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die solche mutierten Aminoacyl-tRNA-Synthetasen codieren, deren Korrekturstelle mutiert ist, und die eine nicht-kanonische Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen. Ebenfalls ist hier ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von transformierten Zellen, die in vivo Proteine synthetisieren können, welche mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure enthalten, und ihre Verwendung zur Produktion solcher Proteine beschrieben.
Aminoacyl-tRNA-Synthetasen begründen die Regeln des genetischen Codes durch Katalyse der Aminoacylierung von transfer-RNAs. Die chemische Invarianz der 20 Aminosäure-Bausteine der Proteine ist gut begründet. Die einzigen bekannten Erweiterungen für diesen invarianten Satz sind Formyl-Methionin (1) und Selenocystein (2), die jeweils in Reaktion auf Punktuationssignale während der Translation in bestimmten Organismen eingebaut werden. Arten haben zwar im Verlauf geologischer Zeiten verschiedene terrestrische Lebensräume besiedelt, ihre Diversifizierung spiegelt sich jedoch somit nicht in der Evolution der Organismen wieder, dass sie spezialisierte Aminosäuresätze umfassen. Thermophile, mesophile und psychrophile Organismen bauen beispielsweise jeweils Proteinen auf, indem sie die gleichen Arten von 20 kanonischen Aminosäuren zu verschiedenen Proteinsequenzen vereinigen. Als "Missing Link" zwischen Alanin und Valin (3) kann Aminobutyrat (Abu, auch bekannt als Butyrin) durch Transaminierung aus dem physiologischen Metabolit 2-Oxobutyrat erzeugt werden, und es sollte somit als latenter Metabolit (4) angesehen werden. Sein Fehlen ist daher besonders auffällig in Proteinen von noch vorhandenen Organismen.
Die Auswahl von Aminosäuren für die Proteinsynthese erfolgt durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Gewöhnlich katalysiert jede der 20 Synthetasen die Bindung ihrer zugehörigen Aminosäure an ihre zugehörige tRNA, und die Aminosäuren werden auf diesem Weg spezifischen Triplets des genetischen Codes zugeordnet (5). Die aktiven Stellen einiger dieser Enzyme haben an sich nicht die Kapazität zur Unterscheidung zwischen sehr ähnlichen Aminosäuren in einem Ausmaß, das die hohe Genauigkeit des Codes erklären könnte. Aus diesem Grund kann ein gegebenes Enzym sehr ähnliche (hinsichtlich Größe und Form) Aminosäuren mit einer niedrigen Frequenz (0,1 bis 1 %) fehlaktivieren (6). Zur Korrektur dieser Fehler hat sich in vielen Fällen eine hydrolytische Korrekturfunktion an einer gesonderten aktiven Stelle entwickelt (7–10). Ein Beispiel für eine Synthetase mit Korrekturaktivität ist die Valyl-tRNA-Synthetase (ValRS), die die isosterische natürliche Aminosäure Thr (9) sowie das nicht-natürliche Abu (11) fehlaktviert. Die Fehlaktivierung dieser Aminosäuren führt zu einer transienten Falschbeladung von tRNA^Val, gefolgt von hydrolytischer Deacylierung (Korrektur) der fälschlicherweise übertragenen Aminosäure von der tRNA.
Die vorliegende Arbeit zielte auf die Erstellung von Bedingungen der künstlichen Selektion, die eine Verwendung nicht kanonischer Aminosäuren, wie Abu, fördern, die nicht durch natürliche Selektion erhalten wurden. Andere versuchten den Einbau einer nicht-kanonischen Aminosäure in ein Protein durch Einbringen eines fremden "orthogonalen" tRNA/Synthetase-Paars, das die Aminosäure an einem spezialisierten Stopp-Codon einfügen kann (12).
Solche Ansätze sind jedoch arbeitsaufwändig, da sie die Selektion, Identifikation, Klonierung und Untersuchung einzelner mutierter Stämme erfordern.
Zur Erleichterung der In-vivo-Produktion der Proteine, die nicht-kanonische Aminosäuren umfassen, möchte man über ein rasches und allgemeines Verfahren zur genetischen Modifikation und Selektion von Zellen verfügen, die die In-vivo-Produktion dieser Proteine erzielen können.
Ein solches wünschenswertes Verfahren ermöglicht die Vergrößerung der Translationschemie, indem man eine nicht-kanonische Aminosäure sämtliche Codons "infiltrieren" lässt, die normalerweise mit einer der natürlichen Aminosäuren einhergehen. Stattdessen können durch Zuordnen von zwei Aminosäuren (einer zugehörigen und einer nicht-zugehörigen) zu einem bestimmten Satz von Codons, damit ein selektiver Vorteil für die umprogrammierten Zellen geschaffen wird, globale Änderungen in den Aminosäure-Zusammensetzungen aller zellulären Proteine vorgenommen werden.
Dies ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde ein allgemeines Verfahren zur Veränderung der chemischen Zusammensetzung von Proteinen entwickelt, die in vivo von einer Zelle erzeugt werden, umfassend den Schritt, bei dem die Korrekturfunktion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase der Zelle deaktiviert wurde.
Dieses schnelle und allgemeine Verfahren kann zur Gewinnung von Zellen verwendet werden, die eine Mutation an der DNA-Sequenz, die für die Korrekturdomäne der beschädigten Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, aufweisen verglichen mit der DNA-Sequenz, die für die Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert.
Im allgemeinen umfasst das hier beschriebene Verfahren: a) das Auswählen eines Zellstamms, bei dem die Korrekturfunktion von einer seiner Aminoacyl-tRNA-Synthetasen deaktiviert wurde, so dass die deaktivierte Korrekturfunktion ermöglicht, dass die Aminoacyl-tRNA-Synthetase mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure durch die zugehörige tRNA fälschlicherweise überträgt; b) das Züchten des ausgewählten Stamms in einem Kulturmedium, das die nicht-kanonische Aminosäure oder eine ihrer Vorstufen umfasst, unter Bedingungen, die das Wachstum des Stamms begünstigen; und c) Gewinnen der Proteine, die die nicht-kanonische Aminosäure enthalten, aus dem Kulturmedium oder den in Schritt b) erhaltenen Zellen.
In verschiedenen Beispielen wurde die Korrekturfunktion der Aminoacyl-tRNA-Synthetase durch Mutagenese der DNA-Sequenz deaktiviert, die die Korrekturdomäne einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase in der Zielzelle codiert, wobei die Mutagenese in der Zelle vorzugsweise durch homologe Rekombination oder einen Allelersatzvektor erfolgt, was zu einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante mit einer Aminosäure-Mutation in ihrer Korrekturdomäne führt, wobei die Mutation die fälschliche Beladung der zugehörigen tRNA mit einer nicht-kanonischen Aminosäure durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante ermöglicht.
Hier ist auch ein Verfahren zur Selektion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante offenbart, die eine nicht zugehörige Aminosäure, vorzugsweise eine nicht-kanonische Aminosäure, durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen kann, einschließlich der Schritte: a) Erstellen eines DNA-Konstruktes, das eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante mit einer Aminosäure-Mutation in ihrer Korrekturdomäne codiert; b) Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Konstrukt; c) Untersuchen der Fähigkeit der rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, die durch die transformierte Wirtszelle produziert wird, auf ihre Fähigkeit, eine nicht-zugehörige Aminosäure, vorzugsweise eine nicht-kanonische Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise zu übertragen, und d) wenn geeignet Auswahl der untersuchten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, wenn die untersuchte Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante eine nicht-zugehörigen Aminosäure, vorzugsweise eine nicht-kanonische Aminosäure, durch ihre zugehörige tRNA (tRNA(s), die mit der untersuchten Aminoacyl-tRNA-Synthetase einhergehen) fälschlicherweise übertragen kann.
Die Erfindung betrifft isolierte Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Varianten, die eine nicht-zugehörige Aminosäure, vorzugsweise eine nicht-kanonische Aminosäure, durch die zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen können, wobei das Nukleinsäure-Fragment, das die Korrekturstelle codiert, zumindest eine Mutation umfasst, die zu einer Aminosäuremutation führt, vorzugsweise zu einer Aminosäure-Substitution in der Korrekturstelle der Isoleucyl-tRNA-Synthetase. Eine isolierte Nukleinsäure, die solche Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Varianten codiert, Vektoren, wie Plasmid, und Zellen, die eine solche Nukleinsäure umfassen, sind auch ein Teil der vorliegenden Erfindung.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die eine nicht-kanonische Aminosäure umfassen, einschließlich der allgemeinen Schritte: a) Kultivieren einer transformierten Wirtszelle, die eine Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Allel-Variante aufweist, welche durch ihre zugehörige tRNA eine nicht-kanonische Aminosäure fälschlicherweise übertragen kann, in einem Kulturmedium, das die nicht-kanonische Aminosäure oder eine ihrer Vorstufen, enthält; und b) Gewinnen und bei Bedarf Reinigen der Proteine mit der nicht-kanionischen Aminosäure aus dem Kulturmedium (Überstand) und/oder aus den Zellen (aus dem Zellpellet) von Schritt a).
Die Erfindung ermöglicht die Produktion der Proteine mit einer nicht-kanonischen Aminosäure durch das vorstehende Verfahren.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon und aus den Ansprüchen ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGNEN
1A bis 1C. Suppressions- und Toxizitäts-Phänotypen. Aminosäure-Gradientenplatten wurden mittels Minimalmedium (27) hergestellt (Siehe ebenfalls die 1A bis 1C in Döring et al., Science, 292 (5516), 453–454, 2001, die identisch sind).
1A: Strukturen von Cystein, S-Carbamoyl-Cystein, Valin, Threonin und α-Aminobuttersäure.
1B: Cystein (100 μl (0,4 M)) wurde in einer zentralen Vertiefung untergebracht, nach dem Verteilen und Trocknen wurden 0,5 ml einer 5/1000-Verdünnung einer Übernachtkultur (in MS-Glucose-Medium mit Thymidin (0,3 mM) von β5456 (thyA::erm+ ΔnrdD::kan+ valS:T222PpTS13 (bla+ thyA:146GUA)). Ile-Val (0,3 mM) wurde in einer Platte als Kontrolle zugegeben. Das Dipeptid Ile-Val wurde von Bachem AG (Bubendorf, Schweiz) erhalten. Die Platten wurde 2 Tage bei 30°C inkubiert.
1C: Minimalmedium-Platten, angereichert mit Thymidin (0,3 mM) wurden mit Aminosäure-Lösungen vorbehandelt durch Bestreichen entweder mit Thr (50 μl (0,2 M)) oder Abu (50 μl (0,1 M)) vertikal am Durchmesser der Platte entlang, so das ein Aminosäure-Gradient erhalten wurde. Die Mutante (β5456) und Wild-Typ (β5419 (thyA::erm+ ΔnrdD::kan+ pTS13 (bla+ thyA:146 GUA))-Stämme wurde dann horizontal über die Platten ausgestrichen und 2 Tage bei 37°C inkubiert.
2A bis 2C. Punktmutationen in der Korrekturstelle und ihre Folgen (Siehe ebenfalls die 2A bis 2C in Döring et al., Science, 292 (5516), 453–454, 2001, die identisch sind.
2A: Die Positionen der fünf Punktmutationen, die in der Korrekturstelle von ValRS isoliert sind, sind gezeigt. Die IleRS-Korrekturstelle (CP1) (28, 29), die die abwechselnden β-Stränge (Fünfecke) und α-Helices (Rechtecke) der katalytischen Domäne schneidet, ist gezeigt. Die Ausrichtung der Reste in den Korrekturstellen von HeRS und ValRS ist ebenfalls gezeigt, wobei die stark konservierten Reste sämtlicher veröffentlichter Sequenzen mit einem Doppelpunkt markiert sind. Die Abkürzungen sind Ec, Escherichia coli, Sc, Saccharomyces cerivisiae, Hs, Homo sapiens.
2B: Fehlaminoacylierung von tRNA^Val mit Thr durch das Enzym der T222P-Mutante bei pH-Wert 7,5 und 37°C. Die Wildtyp- (WT) und Mutanten-Allele wurde unter der Kontrolle eine P_BAD-Promotors (30) kloniert. Die Enzyme wurden aus einem Laborstamm, dem die chromosomale Kopie des valS-Gens fehlte (ΔvalS::kan+), partiell gereinigt. Die Reinigungs- und Aminoacylierungsverfahren wurden aus Hendrickson et al. (31) angepasst. (Hauptfeld) Fehlaminoacylierung von tRNA^Val mit Thr durch die beiden Enzyme. (Einfügung) Aminoacylierung von tRNA^Val mit Val durch die beiden Enzyme.
2C: In vivo-Einbau von Aminobutyrat. Das His-markierte Protein AlaXp wurde in zwei Δilv-Stämmen exprimiert, die das Wildtyp-valS- oder das mutierte valS:T222P-Allel enthielten, in MS-Medium, das Ile-Leu (0,3 mM), Ile-Val (0,02 mM) und Abu (0,2 mM) enthielt. AlaXp wurde mit Ni-NTA-Agarose (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gereinigt, aus einem präparativen SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten und für MALDI und μ-LC-MS/MS-Massenanalyse vorbereitet (32). Die MALDI-MS-Analysen wurden in einem Voyager-Elite-Time-of-Flight-Massenspektrometer mit verzögerter Extraktion (PerSeptive Biosystems Inc. Framingham, MA) durchgeführt. Das Spektrum für das Peptid Lys156-Arg172 mit der Masse 2097,04 ist auf dem unteren Feld gezeigt (Wildtyp-Zellen). Das obere Feld zeigt das in zwei Komponenten aufgelöste Peptid, wenn es aus den Zellen isoliert wurde, die das T222P-Allel des Gens für ValRS tragen. Die zweite Komponente hat eine Masse von 2083,04, die genau 14 Masseeinheiten kleiner als das "Wildtyp-Peptid". Mehrfache Peaks entsprechen der ¹³C-Isotopenform, die die Peptide voneinander trennen, die sich um 1, 2, 3 usw. Masseeinheiten unterscheiden.
3. Übernachtkulturen von Δilv-Auxotrophen, die das WT-valS (É) oder das mutierte valS:T222P-Allel (J) enthalten, und die in MS-Glucose-Medium mit limitierendem Valin (0,04 mM Ile-Val. 0,3 mM Ile-Leu) gezüchtet wurden, wurden 1/1 verdünnt, die Val-Konzentration wurde auf 0,02 mM eingestellt und die Biomasse wurde durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm nach 24 Std. Wachstum bei 30°C bestimmt.
4. Hydrolyse von Valyl-tRNAile durch Wildtyp- und mutiertes IleRS Diese Figur zeigt die größte Abnahme der Korrekturaktivität des mutierten IleRS mit 11 Alanin-Resten in Position aa 240–250 verglichen mit der Korrekturaktivität von Wildtyp-IleRS. ∎: IleS ala 11 (mutiertes IleRS mit 11 Alanin-Resten in der Position aa 240–250); ♦IleS wt (Wildtyp-IleRS).
5. Korrelation zwischen der Abu-Toxizität, gemessen als Mengen fehlaminoacylierter [³H]Thr-tRNA_Val und Toxizität von ABU, gemessen in den verschiedenen mutierten Stämmen. Die Korrelation der Abu-Toxizität-Phänotypen und die Wirksamkeit der Deacylierung durch mutierte Enzyme. A. Nicht zugehörige Aminosäure-Toxizitäts-Phänotypen. valS-Null-Stämme, die die mutierten ValRS-Enzyme jeweils in trans enthielten, wurden auf Minimalmedium plattiert. Abu (α-Aminobutyrat) wurde in eine zentrale Vertiefung geladen, und die Platten wurden für 24 Std. bei 42°C inkubiert. Der Grad der Toxizität in Reaktion auf Abu wurde durch den Durchmesser des Bereichs des gehemmten Zellwachstums bestimmt. Stämme, die die mutierten K227Q- und T222P-valS-Allele trugen, zeigten die schwerste Reaktion auf Abu. Das Wachstum von D230N-valS wurde durch hohe Konzentrationen Abu gehemmt, aber der Effekt wurde nicht bei niedrigeren Konzentrationen beobachtet. Die V276A-Mutation führt eine leichte Empfindlichkeit gegenüber Abu ein. Ähnliche Phänotypen wurden in Reaktion auf exogenes Threonin beobachtet (Daten nicht gezeigt). B. Histogramm-Darstellung der Hemmzonen-Durchmesser von DvalS::kanR-Stämmem, die jeweils die ValRS-Korrekturmutanten auf dem Plasmid enthielten, in Reaktion auf exogenes Abu. Die Effekte reichen von mild bis schwer. (Einfügung) Histogramm-Darstellung des Prozentsatzes von fälschlicherweise übertragener Thr-tRNAVal, der nach der Inkubation mit 2 nM Enzym für 15 min bei Raumtemperatur zurück blieb. Beide zeigen einen bestimmten Bereich in der Schwere der Korrekturdefekte, die durch diese Punktmutationen verursacht wurden. Zusammengenommen veranschaulicht dies eine Korrelation zwischen der Fähigkeit des mutierten Enzyms zur Deacylierung der von tRNAVal fälschlicherweise in vitro übertragener Aminosäuren und dem Ausmaß der In-vivo-Toxizität, die man in Reaktion auf exogene nicht zugehörige Aminosäuren beobachtet.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Veränderung der chemischen Zusammensetzung von Proteinen bereit, die in vivo durch eine Zelle produziert werden, umfassend den Schritt Deaktivieren der Korrekturfunktion von einer ihrer Aminoacyl-tRNA-Synthetasen.
Der Begriff "der Schritt Deaktivieren der Korrekturfunktion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase" soll einen Schritt bezeichnen, durch den ein mutierter Stamm erhalten wird, bei dem ein Allel, das eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, eine Mutation in ihrer Korrekturstelle oder -Domäne umfasst, was führt zu:

– Verlust der Rolle der Korrekturfunktion bei der Restriktion des genetischen Codes auf 20 Aminosäuren;
– Verlust der Rolle der Korrekturfunktion bei der Verhinderung des Eindringens der nicht-zugehörigen Aminosäure; und/oder
– Fehlaktivierung der nicht-zugehörigen Aminosäuren oder/und die Nicht-Hydrolysierung der erzeugten "nicht-zugehörigen Aminosäure-tRNA", die gewöhnlich durch die Korrekturfunktion der zugehörigen Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase hydrolysiert wird, wobei diese Veränderungen der Korrekturfunktion den potentiellen Fehleinbau einer nicht nicht-zugehörigen Aminosäure induzieren, vorzugsweise einer nicht-kanonischen Aminosäure, anstelle der zugehörigen Aminosäure, die von der durch das Wildtyp-Allel codierten Aminoacyl-tRNA-Synthetase übertragen wird.

Ein solcher Schritt der Deaktivierung der Korrekturfunktion von einer der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen kann beispielsweise die Schritte umfassen:

– Auswählen eines mutierten Stammes, der eine natürliche Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante mit einer Mutation in ihrer Korrekturdomäne enthält, die zu diesen vorstehend genannten Funktionsveränderungen führt; oder vorzugsweise
– Auswählen eines mutierten Stammes, der eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante mit einer Mutation in ihrer Korrekturdomäne enthält, die zu diesen vorstehend genannten Funktionsveränderungen führt, wobei diese Variante durch Mutagenese erhalten wird, wie durch homologe Rekombination oder Ersatzallelvektor- oder beliebige Mutagenese-Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, die eine solche Mutation, vorzugsweise in das Genom der Zelle integriert, einbringen können.

Der Begriff "zugehörige Aminosäure" in der vorliegenden Beschreibung soll die Aminosäure bezeichnen, die gewöhnlich von der tRNA übertragen wird, und zwar entsprechend (oder assoziiert mit) dem Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Wildtyp (die zugehörige Aminosäure für die Valyl-tRNA-Synthetase ist beispielsweise Valin).
Der Begriff "zugehörige tRNA" in der vorliegenden Bezeichnung soll die tRNA bezeichnen, die dem Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Wildtyp entspricht (oder mit diesem assoziiert ist) (die zugehörige tRNA für die Valy-tRNA-Synthetase ist beispielsweise tRNA^Val).
Zudem wird ein Verfahren zur Herstellung von In-vivo-Proteinen bereitgestellt, die mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure aufweisen, umfassend die Schritte:

a) Auswählen eines Zellstammes, wobei die Korrekturfunktion von einer seiner Aminoacyl-tRNA-Synthetasen durch Mutagenese deaktiviert wurde, wobei die deaktivierte Korrekturfunktion es ermöglicht, dass die Aminoacyl-tRNA-Synthetase mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure durch die zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen kann;
b) Züchten des ausgewählten Stammes in einem Kulturmedium, das die nicht-kanonische Aminosäure oder eine ihrer Vorstufen enthält, unter geeigneten Bedingungen für das Wachstum des Stammes; und
c) Gewinnen der Proteine, die die nicht-kanonische Aminosäure enthalten, aus dem Kulturmedium oder aus den in Schritt b) erhaltenen Zellen.

Der Begriff "günstige Wachstumsbedingungen" steht für eine Umgebung, die für das Zellwachstum und/oder die Lebensfähigkeit relativ günstig ist. Solche Bedingungen berücksichtigen die relative Verfügbarkeit der Nährstoffe und der optimalen Temperatur, Atmosphärendruck, Anwesenheit oder Abwesenheit von Gasen (wie Sauerstoff und Kohlendioxid), und Aussetzen gegenüber Licht, wie es der untersuchte Organismus erfordert.
Der Begriff "Vorstufe" steht für eine Verbindung, die sich in vivo effizient durch die Zelle in die nicht-kanonische Aminosäure umwandeln lässt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Zellstamm, bei dem die Korrekturfunktion seiner Isoleucyl-tRNA-Synthetasen deaktiviert wurde, eine Mutation in der DNA-Sequenz, die die Korrekturdomäne der deaktivierten Isoleucyl-tRNA-Synthetase codiert, verglichen mit der Wildtyp-Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Sequenz.
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform führt die DNA-Mutation zu einem Austausch der Reste 240 bis 250 der Korrekturdomäne des Proteins, das vom IleRS-Gen von E. coli codiert, durch 11 aufeinander folgende Alanin-Reste.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Verfahren bereitgestellt, wobei die beschädigte Isoleucyl-tRNA-Synthetase eine kanonische Aminosäure, die der Aminosäure sterisch ähnelt, die von der Wildtyp-Isoleucyl-tRNA-Synthetase durch ihre zugehörige tRNA übertragen wird, durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen kann.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Verfahren bereitgestellt, wobei die beschädigte Isoleucyl-tRNA-Synthetase eine nicht-kanonische Aminosäure, die sterisch der Aminosäure ähnelt, die von der Wildtyp-Isoleucyl-tRNA-Synthetase durch ihre zugehörige tRNA übertragen wird, durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen kann.
Bei einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung von Zellen bereitgestellt, die in vivo Proteine mit mindestens einer nicht-kanonischen Aminosäure produzieren können, umfassend den Schritt Mutagenisieren der DNA-Sequenz, die die Korrektur-Domäne einer Isoleucyl-tRNA-Synthetase in einer Zelle codiert, wobei die Mutagenese zu einer Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante mit einer Aminosäure-Mutation in ihrer Korrekturdomäne führt, durch die die Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante eine nicht-kanonische Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen kann.
Es wird ein Verfahren zur Gewinnung von Zellen offenbart, die in vivo Proteine produzieren können, die mindestens eine erfindungsgemäße nicht-kanonische Aminosäure aufweisen, umfassend die Schritte:

a) Untersuchen der Fähigkeit einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, deren Korrekturdomäne mutiert ist, zur fälschlichen Übertragung einer nicht-kanonischen Aminosäure durch ihre tRNA;
b) Mutagenese der DNA-Sequenz, die die Korrekturdomäne der Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, in einer Zelle, wobei die Mutagenese zum Austausch des Allels führt, das die Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, durch ein Allel, das die Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, die in Schritt a) untersucht wird und die eine nachweisbare nicht-kanonische Aminosäure-Fehlübertragung erzeugen kann.
c) gegebenenfalls Identifizieren, Auswählen und/oder Klonieren der Zellen, die eine solche Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante enthalten, mit der Fähigkeit zur fälschlichen Übertragung einer nicht-kanonischen Aminosäure.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle, bei der die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase, vorzugsweise durch Mutagenese, deaktiviert wurde, eine mikrobielle oder tierische Zelle, vorzugsweise ein Bakterium, eine Hefe oder ein Pilz, stärker bevorzugt ein Bakterium, wie Echerichia coli oder Acinetobacter.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, bei dem die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase der Zielzelle durch homologe Rekombination oder durch Rekombination in das Genom der Zielzelle mit einem Allelersatzvektor deaktiviert wurde.
Die Oligonukleotide, die das Nukleinsäurefragment umfassen, das die mutierte Korrekturstelle oder einen Abschnitt davon codiert, und die die Mutation enthalten, die in das Wildtyp-Allel der Zielzelle eingebracht werden muss, können chemisch synthetisiert oder durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) synthetisiert werden.
Von mikrobiellen oder tierischen Zellen sind Zellen bevorzugt, die homologe Rekombination durchlaufen. Solche Zellen können aus Bakterien, Mycobakterien, Hefe, Pilz, Algen, Pflanze oder Tier stammen.
"Homologe Rekombination" bedeutet ein Verfahren, durch das ein exogen eingebrachtes DNA-Molekül in ein Ziel-DNA-Molekül in einem Bereich integriert, in dem eine identische oder nahezu identische Nukleotidsequenz zwischen den beiden Molekülen integriert wird. Die Homologe Rekombination wird durch komplementäre Basenpaarung vermittelt, und kann entweder zu einer Einfügung der exogenen DNA in die Ziel-DNA (durch ein einfaches Cross-Over-Ereignis), oder zu einem Austausch der Ziel-DNA durch die exogene DNA (durch ein Doppel-Cross-Over-Ereignis) führen.
Der Begriff "Allelersatzvektor" steht für ein beliebiges DNA-Element, das zum Einbringen von Mutationen in das Genom einer Zielzelle durch einen spezifischen Austausch eines nativen Gens durch eine mutierte Kopie verwendet werden kann. Ein Gen-Austausch in Bakterien wird gemeinhin mit Plasmiden durchgeführt, die ein Zielgen mit einer Mutation und einen negativen selektiven Marker außerhalb des Homologiebereichs enthalten. Ein solches Plasmid integriert in das Zielchromosom durch homologe Rekombination (durch einfaches Crossover). Eine geeignete Selektion ergibt Zellen, die den negativen Selektionsmarker durch ein zweites homologes Rekombinationsereignis (Doppel-Crossover) verloren haben, und die nur eine mutierte Kopie des Zielgens enthalten.
Bei einer weiteren Ausfürungsform kann die Zelle, in der die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase deaktiviert oder mutagenisiert wurde, ein selektierbares Markergen zur Identifikation und Selektion der Zellen enthalten, die die mutagenisierte DNA enthalten. Die Identifikation und Selektion dieser Zellen, bei denen die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase deaktiviert oder mutagenisiert wurde, kann auf der Fähigkeit der Zellen auf Selektionsmedium zu wachsen beruhen, wobei eine Zelle, die den Selektionsmarker enthält, auf einem Selektionsmedium wachsen kann, und eine Zelle, die den Selektionsmarker nicht hat, nicht wachsen kann, oder auf einem Selektionsmedium langsamer wachsen kann.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Zelle, in der die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase deaktiviert oder mutagenisiert wurde, ein Reportergen zum Identifizieren und Selektieren der Zelle enthalten, die die mutagenisierte DNA enthält. Die Identifikation und Selektion dieser Zellen, bei denen die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase deaktiviert oder – mutiert wurde, kann auf einem Reportergen-Assay beruhen, bei dem die Deaktivierung oder die Mutagenese durch die Expression des Reportergens durch die Zelle bestätigt wird. Eine Zelle, der die Deaktivierung oder Mutagenese fehlt, exprimiert das Reportergen nicht.
Der Begriff "Selektionsmarker" steht für ein Gen, das die Fähigkeit einer Zelle, die dieses Gen hat, zum Wachstum oder Überleben in einer bestimmten Wachstumsumgebung gegenüber einer ähnlichen Zelle, der der Selektionsmarker fehlt, verändert. Ein solcher Marker kann ein positiver oder negativer Selektionsmarker sein. Ein positiver Selektionsmarker (beispielsweise eine Antibiotikaresistenz oder ein auxotrophes Wachstumsgen) codiert ein Produkt, das Wachstums- oder Überlebenseigenschaften in Selektionsmedium (beispielsweise mit einem Antibiotikum oder ohne einen essentiellen Nährstoff) verleihen kann. Ein negativer Selektionsmarker verhindert dagegen, dass Zellen, die dieses Gen tragen, in negativem Selektionsmedium wachsen, verglichen mit Zellen, die dieses Gen nicht tragen. Ein Selektionsmarker kann positive und negative Selektierbarkeit verleihen, je nachdem, welches Medium zur Anzucht der Zellen verwendet wird. Die Verwendung der Selektionsmarker in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ist dem Fachmann geläufig.
Der Begriff "Reportergen" bedeutet ein beliebiges Gen, das ein Produkt codiert, dessen Expression durch immunologische, chemische, biochemische, biologische oder mechanische Tests nachweisbar ist und/oder quantifizierbar ist. Ein Reportergenprodukt kann uneingeschränkt beispielsweise eine der folgenden Eigenschaften aufweisen: Fluoreszenz (beispielsweise ein grün fluoreszierendes Protein), enzymatische Aktivität (beispielsweise lacZ/beta-Galactosidase, Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase, alkalische Phosphatase), Toxizität (beispielsweise Ricin) oder eine Fähigkeit, spezifisch an ein zweites Molekül gebunden zu werden (beispielsweise Biotin oder einen nachweisbar markierten Antikörper). Es versteht sich, dass beliebige gentechnisch erzeugte Varianten der Reportergene, die dem Fachmann leicht verfügbar sind, ebenfalls ohne Einschränkung in der vorstehenden Definition eingeschlossen sind.
Der Begriff "Identifikation von Zellen, die mutagenisierte DNA enthält", steht für das Aussetzen der Population von Zellen, die mit der mutagenisierten DNA transformiert sind, gegenüber einem Selektionsdruck (wie das Wachstum in der Anwesenheit von einem Antibiotikum oder in der Abwesenheit eines Nährstoffs), was mit einem Selektionsmarker übereinstimmt, den die Zelle trägt, die die rekombinierte mutagenisierte DNA enthält (beispielsweise ein Antibiotikaresistenzgen oder ein auxotrophes Wachstumsgen, die im Stand der Technik bekannt sind). Die Identifikation von Zellen, die die rekombinante mutagenisierte DNA enthalten, kann ebenfalls erfolgen indem transformierte Zellen einem Reportergen-Assay unterworfen werden. Die Selektionen und Durchmusterungen können eingesetzt werden um Zellen zu identifizieren, die die rekombinierte mutagenisierte DNA enthalten, obgleich Selektionen bevorzugt sind.
Hier ist ein Verfahren zur Selektion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante beschrieben, die eine nicht-zugehörige und/oder eine nicht-kanonische Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen kann, das folgende Schritte umfasst:

a) Erstellen eines DNA-Konstruktes, das eine DNA-Sequenz umfasst, die eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, wobei die Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante verglichen mit der Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase mindestens eine Aminosäuremutation, vorzugsweise eine Substitution, stärker bevorzugt eine einzelne Substitution, in ihrer Korrekturdomäne hat;
b) Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Konstrukt aus Schritt a) und nach den Schritt Züchten der transformierten Wirtszelle, Gewinnen und gegebenenfalls Reinigen der rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, die von der Wirtszelle exprimiert wird;
c) Untersuchen der Fähigkeit der in Schritt b) gewonnenen rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, auf ihre Fähigkeit zur fälschlichen Übertragung einer nicht-zugehörigen und/oder einer nicht-kanonischen Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA; und
d) Auswählen der Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, wenn eine nachweisbare Fehlübertragung in Schritt c) erfolgte.

Solche Verfahren zur Untersuchung der Fähigkeit der in Schritt b) gewonnenen rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, auf ihre Fähigkeit zur fälschlichen Übertragung einer nicht zugehörigen und/oder nicht-kanonischen Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA, sind beispielsweise in den folgenden Beispielen offenbart (siehe 2B). Die dem Fachmann bekannten Verfahren zur Untersuchung einer solchen Fähigkeit lassen sich verwenden.
Der Begriff "Transformation" steht für ein Verfahren zum Einbringen fremder Moleküle, wie DNA, in eine Zelle. Die Lipofektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Calciumphosphatfällung, Retrovirusabgabe, Elektroporation, natürlich Transformation und biolistische Transformation sind nur einige dem Fachmann bekannte Verfahren, die sich einsetzen lassen.
Die isolierte Nukleinsäuresequenz, die die erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codieren, oder Vektoren, die eine Nukleinsäure umfassen, welche die Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine transformierte Zelle bereit, die eine Nukleinsäure umfasst, welche eine erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die transformierten Zellen dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die eine erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, in das Genom der Zelle integriert ist.
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform sind die transformierten Zellen dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurefragment, das die Substitution umfasst, die zu einer Veränderung der Korrekturfunktion der Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante führt, durch Verwendung von Mutagenese, wie homologe Rekombination, Austauschallel-Vektor oder durch beliebige dem Fachmann bekannte Mutageneseverfahren zum Einbringen der Nukleinsäuremoleküle, wie DNA, in eine Zelle, wie Lipofektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Calciumphosphatfällung, Retrovirusabgabe, Elektroporation, natürliche Transformation und biolistische Transformation in das Genom der transformierten Zellen integriert wurde.
Die Erfindung betrifft auch isolierte prokaryotische oder eukaryotische Zellen, die ein Protein erzeugen können, dessen Aminosäuresequenz mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure umfasst, und die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante umfassen, die durch eine ihrer zugehörigen tRNAs eine nicht-kanonische Aminosäure oder eine andere Aminosäure als die zugehörige Aminosäure übertragen kann, und dadurch dass die Nukleinsäuresequenz des Allels, das die Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, eine Substitution der Reste 240 bis 250 der Korrekturdomäne durch 11 aufeinander folgende Alaninreste aufweist, verglichen mit der Sequenz des entsprechenden Wildtypallels, wobei sich die in das Genom integrierte Mutation auf der Korrekturstelle der Isoleucyl-tRNA-Synthetase befindet und durch eine Mutagenesetechnik, wie genetische Rekombination, eingebracht wurde.
Bei einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen transformierten Zelle zur Produktion von Protein, insbesondere rekombinantem Protein, dessen Aminosäuresequenz mindestens eine unkonventionelle Aminosäure aufweist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die eine nicht-kanonische Aminosäure umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) das Züchten einer transformierten Zelle, die ein Allel umfasst, das eine erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, in einem Kulturmedium, das eine nicht-kanonische Aminosäure enthält, die von der zugehörigen tRNA der in der Zelle vorhandenen Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante fälschlicherweise übertragen werden kann, in einem Kulturmedium und unter Kulturbedingungen, die das Wachstum der Zelle ermöglichen.
b) Gewinnen und gegebenenfalls Reinigen der Proteine, die die nicht-kanonische Aminosäure umfassen, aus dem Kulturmedium (Überstand) oder aus den Zellen (Zellpellet) von Schritt a).

Proteine, die eine nicht-kanonische Aminosäure umfassen, können durch das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden.
Die Verfahren zur Reinigung von Protein, die natürlich oder rekombinant sein können, welche Herkömmlicherweise vom Fachmann verwendet werden, setzen gewöhnlich Methoden ein, die einzeln oder in Kombination verwendet werden wie Fraktionierung, chromatographische Verfahren, Immunoaffinitätstechniken mitspezifischen mono- oder polyklonalen Antikörpern, usw.
Die Anwesenheit einer nicht-kanonischen Aminosäure auf dem zu reinigenden Protein, wobei die nicht-kanonische Aminosäure eine spezielle funktionelle Gruppe haben kann, kann seine Reinigung durch selektives Umsetzen mit dem Reinigungsträger ohne Modifikation der Aktivität des Proteins erleichtern.
Von den Proteinen, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren produziert werden können, lassen sich uneingeschränkt Proteine erwähnen, die es durch den Einbau von mindestens einer nicht-kanonischen Aminosäure ermöglichen, dass man eine gewünschte Aktivität erhält, die man mit einem Protein, dessen Sequenz nur kanonische Aminosäure enthält, nicht erzielen kann. Der Begriff "Aktivität" soll im Allgemeinen eine beliebige Aktivität betreffen, wie eine physiologische Aktivität oder biologische Aktivität, selbst partiell, die unizelluläre oder multizelluläre Organismen betrifft, wie beispielsweise strukturelle oder biochemische Aktivität, beispielsweise eine enzymatische oder antigene Aktivität, eine Aktivität des Antikörpertyps, oder eine Aktivität, die die biologische Aktivität reguliert oder hemmt, oder so dass sie ihre Implementierung in einem Verfahren zur Biosynthese oder zum biologischen Abbau chemischer oder biochemischer Verbindungen ermöglicht.
Von diesen Proteinen, die sich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren herstellen lassen, können auch Proteine erwähnt werden, in die der Einbau von mindestens einer nicht-kanonischen Aminosäure derart erfolgt ist, das daraus keine wesentliche Modifikation der biologischen Aktivität des entsprechenden unmodifizierten Proteins resultiert. Neben der konservierten biologischen Aktivität des entsprechenden unmodifizierten Proteins haben diese erfindungsgemäßen Proteine eine nicht-kanonische Aminosäure mit spezifischen Eigenschaften, die vorteilhafterweise ausgenutzt werden.
Von diesen spezifischen Eigenschaften, die von der Anwesenheit einer nicht-kanonischen Aminosäure verliehen werden, können insbesondere Eigenschaften erwähnt werden, die mit der Anwesenheit einer funktionellen Gruppe der nicht-kanonischen Aminosäure einher gehen, die leicht und spezifisch mit einer chemischen oder biochemischen Verbindung unter Bedingungen reagieren kann, die es ermöglichen, dass die Aktivität des Proteins nicht modifiziert wird, oder die die Modifikation der konventionellen Aminosäuren umgehen.
Die Anwesenheit dieser spezifischen funktionellen Gruppe kann vorteilhafterweise verwendet werden, beispielsweise für:

(i) das Reinigen eines beliebigen Proteins, insbesondere eines rekombinanten Proteins, das die unkonventionelle Aminosäure enthält;
(ii) Kuppeln eines solchen Proteins an einen festen Träger;
(iii) Kuppeln nachweisbarer Moleküle, wie spektroskopischer Sonden verschiedener Natur, an ein solches Protein,;
(iv) Kuppeln lipophiler oder hydrophiler Polymere, die ihre Solubilisierung in Lösungsmitteln ermöglichen, oder die eine Maskierung gegenüber der Erkennung durch Antikörper ermöglichen, an ein solches Protein,;
(v) Kuppeln eines solchen Moleküls an ein Polynukleotid;
(vi) Kuppeln eines solchen Proteins an eine chemische oder biochemische Verbindung, deren Anwesenheit es ermöglicht, die biologische Aktivität des Proteins zu steigern, zu senken, zu modifizieren, zu regulieren, zu fokussieren, oder dessen biologische Verfügbarkeit als Verbindung zur therapeutischen Verwendung zu modifizieren; oder
(vii) permanentes Binden eines Coenzyms an ein solches Protein, das ansonsten in Lösung diffundieren würde.

Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung aufgenommen sind die erfindungsgemäßen Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die erfindungsgemäße transformierte Zelle ein interessierendes homologes oder heterologes Gen umfasst, deren codierende Sequenz mindestens ein Codon aufweist, das eine Aminosäure codiert, die durch die zugehörige tRNA der in der transformierten Zelle befindlichen Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante fälschlicherweise von übertragen werden kann.
Im Allgemeinen kann das interessierende homologe oder heterologe Gen, das durch eine beliebige herkömmliche Technik, wie Klonierung oder PCR (Polymerasekettenreaktion), isoliert werden kann oder chemisch synthetisiert werden kann, aus Genen ausgewählt werden, die ein beliebiges Protein codieren, das als therapeutische oder kosmetische Verbindung verwendet werden kann oder als diagnostisches Reagenz oder als Verbindung, die in einem Biosynthese- oder Bioabbauverfahren verwendet werden kann. Das interessierende Protein kann aus einem reifen Protein, einer Vorstufe, und insbesondere einer Vorstufe, die sezerniert werden soll und ein Signalpeptid umfasst, einem verkürzten Protein, einem chimären Protein, das aus der Fusion von Sequenzen verschiedenen Ursprungs herrührt, oder einem mutierten Proteine bestehen, das verbesserte und/oder modifizierte biologische Eigenschaften hat.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Produktion eines Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium von Schritt a) auch die Verbindungen umfasst, die zur Induktion der Synthese des Proteins erforderlich sind, die von dem interessierenden homologen oder heterologen Gen codiert werden. Diese Verbindungen sind dem Fachmann geläufig und hängen insbesondere von der Zelle und dem ausgewählten homologen oder hetereologen Gen ab.
Bei einem beliebigen Verfahren zur Veränderung der chemischen Zusammensetzung von in vivo produzierten Proteinen, umfassend den Schritt Deaktivieren der Korrekturfunktion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase, ist die Aminoacyl-tRNA-Synthetase vorzugsweise eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Aminoacyl-tRNA-Synthetase, deren Korrekturfunktion einer Korrekturstelle oder -Domäne entspricht, die von einem Abschnitt der DNA codiert wird, der die Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, vorzugsweise von einem DNA-Abschnitt codiert wird, der zumindest konservierte Reste aufweist, im Vergleich nach der Ausrichtung mit der Korrekturstelle der Valyl-tRNA-Synthetase und der Isoleucyl-tRNA-Synthetase wie in der 2A gezeigt, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Aminoacyl-tRNA-Synthetase, Valyl-tRNA-Synthetase, Isoleucyl-tRNA-Synthetase, Leucyl-tRNA-Synthetase, Alanyl-tRNA-Synthetase, Prolyl-tRNA-Synthetase, Threonyl-tRNA-Synthetase, Phenyl-tRNA-Synthetase und Lysyl-tRNA-Synthetase, die bekanntlich eine Korrekturstelle oder -Domäne aufweisen (siehe für Ile RS Baldwin, A. N. und Berg, P. (1966) J. Biol. Chem. 241, 839–845 und Eldred, E.W. und Schimmel, P. R. (1972) J. Biol. Chem. 247, 2961–2964; für Val RS, Fersht, A. R. und Kaethner, M. M. (1976) Biochemistry. 15 (15), 3342–3346; für Leu RS, English, S. et al., (1986) Nucleic Acids Research. 14 (19), 7529–7539; für Ala RS, Tsui, W.-C. und Fersht, A. R. (1981) Nucleic Acids Research. 9, 7529–7539; für Pro RS, Beuning, P. J. und Musier-Forsyth, K. (2000) PNAS. 97 (16), 8916–8920; für Thr RS, Sankaranarayanan, R. et al., (2000) Nat. Struct. Biol. 7, 461–465 und Musier-Foryth, K. und Beuning, P.J. (2000) Nat. Struct. Biol. 7, 435–436; für Phe RS, Yarus, M. (1972) PNAS. 69, 1915–1919 und für Lys RS, Jakubowski, H. (1997) Biochemistry. 36, 11077–11085.
BEISPIELE
Beispiel 1
Eine direkte Selektion zur Wiederherstellung einer Enzymaktivität durch Einbau von Abu konnte nicht leicht aufgebaut werden, da ihre aliphatische Seitenkette keine chemische Reaktivität aufweist, und daher nicht als katalytischer Rest wirken kann. Wir greifen somit auf ein indirektes Schema auf der Basis der strukturellen Ähnlichkeit von Abu mit Cys (1A), einem wesentlichen katalytischen Rest in zahlreichen Enzymen, zurück. Die Auswahl einer Synthetasemutante, die Cys durch ihre zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen hat, kann fälschlicherweise durch die mutierte Synthetase übertragenes Abu ergeben.
Wir profitieren von dem konditionalen thyA-Selektions-Screen in E. coli auf der Basis der absoluten Erfordernis für eine aktive Thymidatsynthase, wenn Thymidin nicht als Wachstumsfaktor bereitgestellt wird (13). Dieser gleiche Test wurde zuvor verwendet, um die Potenz von Suppressor-Cys-tRNAs bei falschem Codon-Lesen (14) zu bestimmen und die phänotypische Suppression von dem nicht-kanonischen Azaleucin zu verstärken (15). Ein vollständiger Satz von aus Plasmiden stammenden thyA-Allelen mit sämtlichen 64 Codons an der Position 146 wurde hergestellt, um die katalytische Stelle zu verändern, die von einem essentiellen Cys besetzt wird (16, 17). Jedes Allel wurde auf sein Fähigkeit untersucht, das Wachstum eines E. coli-Stammes (dem die chromosomale Kopie von thyA fehlt) auf Mineral-Glucosemedium in Abwesenheit von Thymidin wiederherzustellen (14, 15). Drei der 64 aus Plasmid stammenden thyA-Allele stellten das Wachstum wieder her. Diese hatten eines der drei Codons UGU, UGC oder UGA. Die Wachstumsreaktionen der UGU- und UGC-Allele wurde erwartet, da diese Cystein codieren. Die positive Reaktion von UGA (einem Terminationscodon in E. coli) stammt wahrscheinlich vom Durchlesen durch Cys-tRNA, und zeigt somit die Empfindlichkeit des Selektionsassays.
Stämme, die inaktive thyA-Allele tragen, wurden dann untersucht, um zu bestimmen, ob sie supprimiert werden konnten, indem sie mit überschüssigem L-Cystein in Minimalmedium ohne Thymidin versorgt wurden. Ein geringes Wachstum wurde reproduzierbar in L-Cystein-Gradientenplatten beobachtet (18), und zwar für die Missense-Allele die ein beliebiges der acht Codons AUN und GUN allein haben. Das Wachstum war stärker bei Allelen, die eines der vier Val-Codons (GUU, GUC, GUA und GUG) trugen, als bei denen mit den drei Ile-Codons (AUU, AUC, und AUA) oder für das Met-Codon AUG. Die Cystein-Suppression der drei Ile-Codon-tragenden Allele und des Met-Codon-tragenden Allels wurde durch Zugabe von exogenem L-Isoleucin und L-Methionin jeweils beseitigt. Die Suppression der vier Val-Codon-tragenden Allele wurde durch Zugabe von L-Valin plus L-Isoleucin, aber nicht durch L-Isoleucin allein beseitigt (18). Die vier Val146-Allele ergaben eine ähnliche Wachstumsreaktion in Cystein-Gradientenplatten, obwohl sie durch drei verschiedene tRNA^Val-Isoakzeptoren decodiert wurden, was somit nahe legt, dass Cys auf sämtlichen drei Val-Isoakzeptor-tRNAs durch ValRS fälschlicherweise übertragen wird. Diese Ergebnisse legen zusammen nahe, dass ValRS die Bildung von Cys-tRNA^Val in vivo mit einer Rate katalysierte, die zur aktiven Thymidylat-Synthaseproduktion hinreichte, und dass diese falsche Übertragungsreaktion durch Steigern der intrazellulären Konzentration von L-Valin verhindert wurde. Diese Interpretation stimmt mit früheren Bereichten der Cys-Fehlaktivierung durch ValRS in vitro überein (11).
Die Suppression von thyA:Val146-Allelen war schwach auf Platten und erforderte hohe L-Cystein-Konzentrationen (entwickelt von einem Gradient, ausgehend bei einer Konzentration von 100 mM). Man kann somit annehmen, dass eine spärliche L-Cystein-Versorgung auf eine verstärkte Effizienz der phänotypischen Suppression selektieren sollte. Zwei experimentelle Verfahren wurden zu diesem Zweck durchgeführt. In dem ersten Verfahren wurde der Stamm β5519 (thyA::erm+ ΔnrdD:: kan+ pTS13 (bla+ thyA:146GUA) über 100 Generationen in einer seriellen Flüssigkultur mit limitierendem Cystein (1,5 mM) unter anaeroben Bedingungen vermehrt, und schließlich der Stamm β5420 isoliert (19). Das zweite Verfahren beruhte auf einer Einschritt-Selektion unter aeroben Bedingungen auf Platten, die eine nicht-oxidierbare Vorstufe enthielten, die effizient durch E. coli in Cystein umgewandelt wird (S-Carbamoyl-Cystein (Scc, 1A) (19)). Ein Mutator-Marker (dnaQ oder mutS) wurde in den Teststamm β5519 eingebracht, um die Frequenz über 10^–10 von Scc-supprimierbaren Thymidin-Auxotrophen zu steigern (19). Dieser Ansatz führte zur Isolation von vier Stämmen: β5456, β5479, β5485 und β5486. Alle fünf isolierten Stämme wuchsen nicht bei 42°C, was mit der Wärmeempfindlichkeit übereinstimmt, die gewöhnlich durch Translationsfehler verursacht wird (20). Der Cystein-Suppression-Phänotyp ist für einen dieser Stämme (β5456) in 1B, zusammen mit seiner Aufhebung von L-Valin (das als Ile-Val-Peptid zugeführt wird) gezeigt
Aus diesen Phänotypen lässt sich schließen, dass Mutationen in dem ValS-Gen für die Valyl-tRNA-Synthetase für jeden isolierten Stamm verdächtigt wurden. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit profitierten wird vom nrdD::kan+-Marker (19), der sich 0,4 min von valS auf dem E. coli-Chromosom befindet. Für die fünf Mutanten stellte sich heraus, dass das Merkmal der Cystein- oder Scc-supprimierbaren Thymidin-Auxotrophie tatsächlich mit dem nrdD::kan+-Marker in einem Anteil von 45% cotransduzierte. Eine weitere Charakterisierung der valS-Mutationen wurde durch PCR-Amplifikation und anschließende Sequenzierung von fünf nrdD::kan+-Transduktanten durchgeführt, die eine aus den fünf isolierten Stämmen hergeleitete Scc-supprimierbare Thymidin-Auxotrophie aufwiesen (21). Der Tabelle 1 zufolge enthielt jede der fünf Mutanten eine einzelne Aminosäuresubstitution an Stellen in der konservierten Korrekturdomäne (bekannt als CP1) von ValRS (22). Die folgenden Mutationen wurden identifiziert T222P, R223H, D230N, V276A, und K277Q. Zwei dieser Positionen (T222 und D230) stimmen bemerkenswerterweise mit konservierten Positionen in IleRS überein, von denen vorher gezeigt wurde, dass sie an der hydrolytischen Korrektur von fehlacylierter Val-tRNA^Ile beteiligt sind (23) (2A).
Tabelle 1. Mutationen des valS-Gens, selektiert durch Suppression der Thymidin-Auxotrophie von Stamm β5419 (ΔthyA::erm⁺ ΔnrdD::kan⁺p TS 13 (bla⁺ ThyA:146 GUA).
ValRS fehlaktiviert bekanntlich Thr und erzeugt Thr-tRNA^Val, die gewöhnlich durch die ValRS-Korrektur-Aktivität (9) hydrolysiert wird. Wenn die ValRS-Mutanten in der Tabelle 1 hinsichtlich der Korrektur gestört sind, dann sollten Stämme, die diese Mutationen jeweils tragen, Thr falsch in ein Protein einbauen, und L-Threonin wird in diesen Stämmen dann toxisch. Das Wachstum der fünf verschiedenen valS-Stämme wurde daher auf die Anwesenheit von L-Threonin untersucht. Alle zeigten eine hohe Empfindlichkeit gegenüber exogenem L-Threonin (bei 2 mM), wohingegen der Parentalstamm β5419 gegenüber L-Threonin bei allen Konzentrationen unempfindlich war. Die Ergebnisse für den Stamm, der das valS:T222P-Allel trägt, sind in der 1C gezeigt.
Der Phänotyp des valS:T222P-Allels legt nahe, dass das T222P-Enzym die tRNA^Val fälschlicherweise mit Thr und Cys in vivo beladen hatte. Das mutierte T222P-Enzym wurde daher exprimiert und partiell gereinigt, so dass es direkt auf die Fähigkeit zur Fehlacylierung tRNA^Val untersucht werden konnte. Das gereinigte Enzym hatte die gleiche Aktivität wie das Wildtyp-Enzym für die Beladung mit Valin (2B, Einfügung). Das mutierte T222P-Enzym fehlacylierte die tRNA^Val fälschlicherweise mit Thr, so dass Thr-tRNA^Val erhalten wurde, wohingegen das Wildtyp-Enzym keine nachweisbare fälschlich beladene tRNA^Val aufwies (2B). Die Fehlacylierung der tRNA^Val mit Cystein wurde ebenfalls nur durch das mutierte Enzym katalysiert.
Wir nehmen an, dass die ValRS-Mutanten, die Cys fälschlicherweise einbauten, auch Abu fälschlicherweise einbauen. Tatsächlich war der Stamm, der das valS:T222P-Allel auf dem Chromosom trug (β5456), empfindlich gegenüber Abu (1C) (wohingegen sein Wildtyp-Gegenstück dies nicht war), was den Einbau von Abu in Reaktion auf Val-Codons nahe legt. Vor diesem Hintergrund zeigten wir, dass Abu zur Erleichterung der L-Valin-Auxotrophie des Δilv-Stammes CU505 beitrug, jedoch nur in der Anwesenheit des valS:T222P-Allels (19). Das Gesamt-Zellprotein wurde aus dem Stamm CU505 isoliert, der in der Anwesenheit von Abu (0,2 mM) gezüchtet wurde, und zwar in der Anwesenheit oder Abwesenheit des ValS:T222P-Allels in der Wirtszelle. Die Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung zeigt, dass 24% des Valins nur in dem Stamm, der das mutierte Allel trug, durch Abu ersetzt wurde (Tabelle 2). Schließlich wurde das valinreiche Hefeprotein AlaXp (Swissprot P53960) überexprimiert und aus den Stämmen gereinigt, die das valS:T222P-Allel enthielten, das in der Anwesenheit von Abu gezüchtet wurde. Die Proteinproben wurden durch Trypsin gespalten und durch Massenspektrometrie analysiert. Die MALDI-Analyse zeigte, dass sie bei Produktion von AlaXp in dem Stamm, der die T222P-Mutation enthielt, ein Gemisch aus Val und falsch eingebautem Abu enthielt (2C). Für ein gegebenes Peptid betrug der Grad des Fehleinbaus zwischen 9,5% und 18% pro Val-Codon. Die Sequenzierung mehrerer Abu-haltiger Peptide bestätigte, dass Abu spezifisch in Positionen fälschlich eingebaut wurde, die durch Val-Codons bezeichnet wurden.
Tabelle 2. Einbau von Abu in Zellen, die die Wildtyp- und mutierten T222P-Allele von valS trugen. Die Kulturen des Δilv-Stammes CU505 (19) und des isogenen Stammes β35498, der das valS:T222P-Allel trug, wurden über Nacht in Minimalmedium (27) mit Ile-Leu (0,3 mM) und limitierendem Valin (0,04 mM Ile-Val) gezüchtet, verdünnt (1/2) und mit Ile-Val (0,02 mM) mit oder ohne Abu (0,2 mM) eingestellt. Nach 24 Std. Wachstum wurde das Gesamtprotein folgendermaßen extrahiert. Die Zellen wurden zuerst durch Zentrifugation geerntet und in kalter 10%iger Trichloressigsäure (TCA, 1/2 des Kulturvolumens) gewaschen. Die Zellen wurden dann erneut bei 4000 x g für 10 min zentrifugiert, in kaltem 10% TCA resuspendiert (1/10 des Kulturvolumens) und wiederum zentrifugiert. Die gewaschenen Zellen wurden in 5% TCA resuspendiert, für 30 min bei 95°C erwärmt und zentrifugiert (4000 x g, 10 min): Der Niederschlag wurde dreimal mit kaltem Aceton gewaschen und in 50 mM NH₄HCO₃ gelöst. Die Proteine wurden in 6N HCl-0,2% Phenol bei 110°C für 20 Std. in verschlossenen Röhrchen hydrolysiert. Norleucin wurde als interner Standard zugegeben. Aliquote der Hydrolysate wurden auf einem Beckman 6300 Aminosäure-Analysegerät untersucht. Die Aminosäuren wurde durch geeignete Standards quantifiziert und die Werte werden im Vergleich zur Wildtyp-(WT)-Kontrolle angegeben, die kein Abu hatte.
Beispiel 2
Gerichtetes Evolutionsschema. Zur Vermeidung einer Abnahme der Cystein-Konzentration in dem Medium aufgrund von Oxidation, wurden die Selektionen unter streng anaeroben Bedingungen durchgeführt. Die Biomasse der Zellen in den Kulturen relativ zu der Cystein-Konzentration (gemessen als optische Dichte bei 600 nm nach 24 Std. Wachstum bei 30°C) stieg allmählich vierfach an, wenn der thyA-Stamm β5366 (ΔthyA::erm⁺ pTS13 (bla⁺ thyA:146GUA)) durch serielle Überführung in Mineral-Glucosemedium vermehrt wurde, das mit 1,5 mM Cystein angereichert war. Eine hohe Cystein-Konzentration war erforderlich, weil die Eingangs-Population kaum anderweitig vermehrt werden konnte. Nach 16 Inokulationen jeweils bei einer Verdünnung von 1/100 (insgesamt etwa 100 Generationen), wurden einzelne Kolonien auf Mineral-Glucose-Platten isoliert, die mit Thymidin angereichert waren (ein Beispiel dafür war der bezeichnete Stamm β5520).
Einschritt-Selektionsschema. Für Einschritt-Selektionen wurde die Cystein-Oxidation unter Aerobiose und die anschließende Cystein-Präparation aus dem Wachstumsmedium vermieden durch die Verwendung der nicht-oxidierbaren Vorstufe S-Carbamoyl-Cystein (Scc). Scc ist eine schlechte Vorstufe für Cystein und verzögert das Wachstum eines Cys-auxotrophen E. coli-Stammes weniger effizient als Cystein. Bei Konzentrationen über 1 mM führte Scc jedoch zur Suppression der Thymidin-Auxotrophie von Stamm β5520, wohingegen bei Fehlen von Thymidin kein Wachstum unter 1 mM Scc nachweisbar war. Wurden β5419-Zellen, die das thyA:Val146GUA-Allel auf einem High-Copy-Plasmid trugen, auf Mineral-Glucose-Platten plattiert, die mit Scc (3 mM) angereichert waren, wuchsen keine Kolonien nach einer verlängerten Inkubation bei 30°C. (Das Experiment war derart ausgelegt, dass es eine Mutante mit einer Häufigkeit von 10^–10 nachwies.) Zur Steigerung der Mutationsfrequenz wurde ein mutS:apc+ (33)-Mutator-Allel in den genetischen Hintergrund von Stamm β5419 durch P1-Transduktion eingebracht, so dass Stamm β5432 (die mutS:apc+-Disruption deaktiviert das Mismatch-Reparatur-System und führt zu statistischen Transitionen und Rasterverschiebungen (34)) erhalten wurde. Die Kolonien erschienen dann auf dem gleichen Medium mit einer Frequenz von etwa 10^–8. Es wurden keine Kolonien auf Platten gefunden, denen Scc fehlte. Eine vergleichbare Frequenz der Scc-supprimierbaren Klone wurde nach dem Einbringen eines dnaQ-Mutator-Allels (33) durch P1-Transduktion (33) (unter Bildung von Stamm β5435) erhalten.
Abu-Fehleinbau. Der Valin-Auxotroph CU505 (33) wurde in der Anwesenheit einer limitierenden Valin-Zufuhr und steigenden Abu-Konzentrationen gezüchtet (3). Die Biomasse von Zellen in Kulturen, relativ zur Valin-Konzentration in dem Medium veränderte sich nicht bis zu einer Abu-Konzentration von 1 mM. Wurde dagegen das valST222P-Allel in das Chromosom eingebracht (Stamm β5498), wurde die Zellausbeute in der Abwesenheit von Abu verringert, aber bis zu 30% erhöht, wenn Abu (0,2 mM) zugegeben wurde.
Somit wurden E. coli-Stämme, die nur aufgrund der Infiltration des Val-codierenden Wegs proliferieren, ausgewählt, und sie enthielten jeweils Mutationen, die zu einzelnen Aminosäure-Substitutionen in der Korrekturstelle von ValRS führten. Diese Beobachtung stimmt mit einer zentralen Rolle zur Korrektur bei der Restriktion des genetischen Codes auf 20 Aminosäuren überein, indem die Invasion anderer Aminosäuren, wie Abu, verhindert wird. Die Korrekturstellen in IleRS und ValRS werden sogar in den am tiefsten verzweigten Organismen im Lebensstammbaum tatsächlich rigoros konserviert. Die durch die Korrektur aufrechterhaltene Translationsgenauigkeit kann jedoch eine weitere chemische Veränderung von Proteinen verhindern. Somit bietet die Deaktivierung der Korrekturfunktion einer Synthetase, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, einen leistungsfähigen Ansatz zur Veränderung der chemischen Zusammensetzung von in vivo erzeugten Proteinen.
Für einige Synthetasen, hängt die Genauigkeit entscheidend von einer Korrekturfunktion an einer Stelle abseits der Aminoacylierungsstelle ab. Mutanten von Escherichia coli, die tRNA^Val fälschlicherweise mit Cystein beladen, wurden durch statistische Mutagenese des gesamten Chromosoms gesucht. Sämtliche erhaltenen Mutationen befanden sich in der Korrekturstelle der Valyl-tRNA-Synthetase. Mehr als 20% des Valins in Zellproteinen aus einem solchen Organismus mit mutierter Korrektur konnte durch nicht-kanonisches Aminobutyrat ersetzt werden, das dem Cystein sterisch ähnelt. Somit kann die Korrekturfunktion eine zentrale Rolle bei der Restriktion des genetischen Codes auf 20 Aminosäuren spielen. Die Deaktivierung dieser Korrekturfunktion bietet einen leistungsfähigen neuen Ansatz zur Veränderung der chemischen Zusammensetzung von Proteinen und zur Emulierung unklarer Evolutionsstufen der Translation.
Beispiel 3: Korrelation zwischen der Toxizität eines α-Aminobutyrates für E. coli-Stämme, die verschiedene valS-Allele tragen, die in der Korrektur-Domäne mutiert sind, und Ergebnisse der In-vitro-Korrektur-Assays, die mit den entsprechenden ValRS-Enzymvarianten durchgeführt wurden.
Zur eingehenderen Untersuchung der Korrekturphänotypen der fünf vorstehend genannten ValRS-Mutanten und der Beziehung zwischen der Zell-Überlebensfähigkeit und der Korrektur, wurden Plasmide, die die Gene für mutierte und Wildtyp-ValRSs enthielten, konstruiert und unter die Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Promotors gestellt. Diese Konstrukte wurden dann zur Untersuchung der In-vivo-Phänotypen der mutierten Enzyme verwendet. Gesondert wurden His-markierte Versionen der mutierten Enzyme parallel dazu konstruiert, zur Verwendung bei der Reinigung der Enzyme für Untersuchungen der Aminoacylierungs- und Korrektur-Aktivitäten in vitro.
Konstruktion von valS-Knockout-Stämmen: Ein 1,7 kb Abschnitt des valS-Gens aus pET16valS, der den Bereich enthielt, der die Korrektur-Domäne von ValRS codiert, wurde mittels SalI und XhoI ausgeschnitten. Dieser Bereich wurden dann durch einen Kanamycin-Marker (1,2 kb Größe) aus pUC4K durch flankierende SalI-Restriktionsstellen ersetzt. Überhängende Bereiche des ValS-Gens von 406 bzw. 708 Basenpaaren konnten die homologe Rekombination ermöglichen (so dass das Plasmid mit der Bezeichnung pLAN362 erhalten wurde). Der Kanamycin-Marker enthielt seinen eigenen Promotor und wurde in der Vorwärts-Richtung in Bezug auf das valS-Gen eingebracht. Zur Steigerung der Menge des liniearisierten Produktes, das zur homologen Rekombination verwendet wurde, wurde das valS::kan aus pLAN362, mit Hilfe der Primer, die an den T7-Promotor und Terminator hybridisieren, durch PCR amplifiziert. Die Produkte dieser Reaktion wurde sichtbar gemacht und in einem 1 % Agarose-TAE-Gel gereinigt. Zur Erzielung einer Rekombination in das E. coli-Chromosom wurde das linearisiertes valS::kan durch Elektroporation in einen hyperrekombinanten E. coli-Stamm (JC8679, Stewart et al.) transformiert, der aus Plasmid stammendes valS aus Haemophilus influenzae (pSU18valS) enthielt. Die Rekombinanten wurden auf Luria-Brühe-Agarplatten selektiert, die mit Chloramphenicol (Stamm JC8679 ist CmR) und wenig Kanamycin (25 μg/ml) angereichert war, weil die Effizienz der kanR-Marker gesenkt werden kann, wenn es in das Chromosom rekombiniert, eine Rekombinante wurde gewählt und als PS2838 bezeichnet. PS2838 wurde mit einem P1-Phagenausgangsmaterial infiziert, der Phage konnte sich 3 Std. vermehren, und wurde dann in CHC13 bei 4°C aufbewahrt. Die Übertragung von Genen und Resistenzmarkern erfolgte durch PI-Phagen-Transduktion mit Hilfe der Standard-Protokolle (Miller 1972) in MG1655-Wildtyp-E. coli, die jedes der valSpBAD-Konstrukte enthielten, die Wildtyp-ValRS, T222P, R223H, D230N, V276A bzw. K277Q exprimieren. Die Transduktanten wurden durch Plattieren auf Luria-Brühe-Agarplatten, die mit Kanamycin (25 μg/ml) und 0,2 % Arabinose angereichert waren, und Inkubieren bei 25°C für 48 Std. selektiert. Erwartungsgemäß führte die Transduktion des MG1655-Stammes allein nicht zum Kolonienwachstum. Sämtliche Transduktanten wurde erneut auf Medien ausgestrichen, die mit 50 μg/ml Kanamycin angereichert waren, so dass kann und die Insertion des Kanamycin-Markers in das E. coli-chromosomale valS-Gen durch Amplifikation mit einem Vorwärts-Primer, der an einen Bereich auf dem Chromosom direkt stromaufwärts des ValS-Gens (valS.103) hybridisierte, sowie mit einem Rückwärts-Primer, der an den Marker selbst hybridisierte (puc4k.o14), verifiziert wurde. Die Transduktion ergab die folgenden Stämme valS::kanR:wt ValRS-PS847, T222P-PS2849, R223H-PS2862, D230N-PS2865, V276A-PS2851, K277Q-PS2853.
Plasmid-Konstruktion. Ein vorsichtiger Ansatz wurde in dieser Konstruktion aufgrund des Fehlens von Erfolg beim vorherigen Einbringen von valS-Korrekturmutanten verwendet. Vor diesem Hintergrund wurden die anfänglichen Konstrukte in einer Variation von pBAD18 vorgenommen, einem Plasmid, das die genaue Regulation der Expression unter der Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Promotors ermöglicht. Das Parentalplasmid war eine Histidin-markierte valS-Konstruktion, die von Jack Horowitz zur Verfügung gestellt wurde, und die wir durch eine erforderliche Sequenzanalyse als pET16b (Novagen) verifizierten. Mit einer internen Restriktionsstelle und einer Restriktionsstelle, die sich stromabwärts des valS-Gens in der Mehrfachklonierungsstelle vonpET16b befand, wurde ein großes BamHI-Fragment in pUC19 (pSCO2) subkloniert. Parallel wurde das Parentalplasmid mit SalI und BglII gespalten, d.h. Restriktionsstellen, die den Bereich von valS flankieren, der das CPI codiert, und dieses kleine Segment wurde in pUC19 (pSCO5) ligiert. Das QuikChange-Mutagenese-Kit (Stratagene, La Jolla, CA) wurde auf pSCO5 verwendet, um einen A nach C-Basenaustausch an Nukleotid 663 einzubringen, damit man die Thr-zu-Pro-Substitution an Rest 222 von ValRS erhielt. Sowohl Wildtyp- als auch T222P-SalI-BglII-Fragmente wurden in pSCO2 subkloniert. Die resultierenden Vektoren wurden mit NcoI und SmaI gespalten, so dass Fragmente des gesamten stromabwärts befindlichen Bereichs von ValS erhalten wurden, die dann in pVDC441 kloniert wurden, einer Variation von pBAD18, worin der stromabwärts befindliche Abschnitt von valS aus dem pET16bvalS-Plasmid mittels EcoRI und KpnI kloniert wurde. Das His-markierte T222P-Konstrukt wurde durch Subklonieren des mutierten Bereichs von valS (DraIII/XhoI) aus pVDC447 und Ligieren in pET16bvalS konstruiert. Die Wildtyp-valS-Konstrukte, pBAD18valS und pET16bvalS wurden schließlich als Matrizen in dem QuickChange-Mutagenese-Protokoll zur Erzeugung von Mutanten verwendet, die den Mutanten R223H, D230N, V276A und K277Q entsprechen. Das gesamte valS-Gen für diese Vektoren wurde dann auf jede dieser Vektoren untersucht, um ihre Integrität zu verifizieren.
Mutanten-Toxizitäts-Reaktion auf hohe Mengen von α-Aminobutyrat: ΔvalS::kan+-Stämme, die Wildtyp-ValRS, T222P, R223H, D230N, V276A und K277Q exprimieren, wurden jeweils auf Standard-Mineralmedium (MS) (Richaud et al., 1993), angereichert mit 0,2% Glycerin, 0,02% Arabinose und Ampicillin (100 μg/ml) isoliert. Einzelne Kolonien aus jedem Stamm wurden in Flüssigkulturen der gleichen Medien-Zusammensetzung überimpft und bis zur Sättigung gezüchtet. Die Zellen wurden in Medien 1:100 verdünnt, und ein Zellrasen wurde auf MS-Mediumplatten ausgestrichen und trocknen gelassen. α-Aminobutyrat (50 μl von 0,1 M) wurde zu einer zentralen Vertiefung gegeben, die in jeder Platte erzeugt wurde, und die Platten wurden dann für 24 Std. bei 42°C inkubiert. Die relative Reaktion jedes Stammes auf hohe Spiegel nicht zugehöriges α-Aminobutyrat konnte dann auf der Basis des Durchmessers des Toxizitäts-Halos beobachtet werden.
Expression und Reinigung der ValRS-Proteine: pET16b-Plasmide, die dem Wildtyp-ValRS und jeder der ValRS-Mutanten entsprechen, wurden in kompetente BL21-Zellen (Novagen) überführt. Diese Zellen wurden in 250 ml Luria-Brühe gezüchtet, welche mit Ampicillin (100 μg/ml) angereichert war, wenn die Zellen eine optische Dichte bei 600 mit von 1,0 erreichten, wurde die ValRS-Expression mit 1 mM IPTG für 5 Std. induziert. Die Zellen wurden dann bei –80°C bis zur Reinigung aufbewahrt. Die Zellen wurden dann resuspendiert (50 mM Na₂PO₄, 300 mM NaCl, 50 mM B-ME, 30 mM Imidazol pH-Wert 7,4) und 2x in einer French-Press lysiert. Die Lysate wurden an eine Ni-NTA-Affinitäts-Säule gebunden und in Lyse-Puffer mit einem Gradient eluiert, der von 30 mM bis 250 mM Imidazol reichte. Die gesammelten Fraktionen wurden auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel sichtbar gemacht, das mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt wurde, so dass Reinheit gewährleistet war, die reinsten Fraktionen wurden gesammelt und in 25 mM Tris-HCl, 1 mM B-ME pH-Wert 7,5, dialysiert. Die Enzym-Konzentrationen wurden mit dem Bradford-Assay bestimmt.
Aminoacylierungs-Tests, Fehlacylierung und Deacylierung: Die Aminoacylierungsassays wurden bei 37°C in einem 100 μl Volumen durchgeführt, das Puffer (20 mM HEPES, 0,1 mM EDTA-Dinatrium-Salz, 0,15 M NH₄Cl, 10 μg/ml BSA pH-Wert 7,5), 2 μM MgCl₂, 0,7 μM [³H]Val, 20 μM kaltes Val, 2 μM tRNA_val (Sigma) und 20 nM ValRS-Enzym (angepasst von Hendrickson et al., 2000) enthielt. Aliquots (10 μl) des Reaktionsgemischs wurden mit Trichloressigsäure gefällt, und das Ausmaß der Aminoacylierung der tRNA wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Fehlacylierung von Thr auf tRNA_val wurde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, außer, dass Val durch 5,86 μM [³H]Thr in der Reaktion ersetzt wurde. Zur Untersuchung der Deacylierungsraten für diese Enzyme war es nötig, [³H]Thr-tRNA_val zu erzeugen. Dies erfolgte mittels ValRS mit der vorher gereinigten T222P-Substitution, (Döring et al., 2001), dieses Enzym bildet den [³H]Thr-tRNA_val-Komplex. Das Enzym wurde mit 2,5 μM tRNA_val und 45 μM [³H]Thr für 45 min bei 37°C inkubiert, zweimal in Phenol:Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurden in 100 μl sterilem H₂O gelöst, und das Szintillationszählen erfolgte zur Bestimmung des Reaktionserfolges. Die Deacylierungsreaktionen, die für jedes Enzym im Dreifachansatz erfolgten, erfolgten in 150 mN Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 μl/ml BSA, 10 mM MgCl₂. Bei Raumtemperatur wurden 2 nM Enzym mit [³H]Thr-tRNA_val bei 3, 6, 9, 16 und 30 min vereinigt. Aliquots (9 μl) des Reaktionsgemischs wurden mit Trichloressigsäure gefällt, und die Menge an fehlaminoacylierter [³H]Thr-tRNA_val, das in der Probe verblieb, wurde durch Szintillationszählung bestimmt, wobei A eine Kontrollreaktion ohne Enzym zur Bereitstellung eines Referenzpunktes aufgenommen wurde.
Wenn der Prozentsatz der Thr-tRNA^Val, die durch jedes Enzym in Deacylierungs-Assays in vitro hydrolysiert wurde, verglichen wurde mit den beobachteten Abu-induzierten Hemmzonen-Durchmessern in vivo, wurde ein Muster klar (5). Die T222P- und K277Q-ValRS-Proteinmutanten haben die schwersten Defekte, beispielsweise bei der Deacylierung der Thr-tRNA^Val in vitro. Stämme, die diese Mutationen tragen, zeigen eine toxische Reaktion auf nur leicht erhöhte Abu-Spiegel in vivo. Diese beiden Enzyme reicherten auch hohe Menge an fälschlicherweise übertragener Thr-tRNA^Val in vitro an. Die D230N-Mutation scheint weniger schädlich für die Deacylase-Aktivität zu sein, und weist eine langsamere Deacylierungsrate auf. Entsprechend wurde die Toxizität in vivo auf Zwischenmengen von Abu eingeschränkt. Die V276A-Mutation scheint die kleinste toxische Reaktion auf exogenes Abu zu verleihen. Dieser Phänotyp wird durch eine Deacylierungsrate reflektiert, die näher am Wildtyp-ValRS ist als die anderen Enzymmutanten. Sowohl D230N als auch V276A-ValRS zeigten auch niedrige Mengen von Falschübertragung in Bezug auf die anderen Enzymmutanten. Somit korrelierte die Fähigkeit der Enzymmutanten zur Hydrolyse der in vitro fehlaminoacylierten Aminosäuren aus tRNA^Val mit der Toxizität in vivo von exogenen nicht-zugehörigen Aminosäuren, die zu Zellen gegeben wurden, die die gleichen Mutationen in ihren ValRS tragen.
Beispiel 4: Konstruktion von E. coli, welcher eine Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Mutante exprimiert, deren Korrekturstelle mutiert ist.
Mehrere Untersuchungen identifizierten die Korrekturdomäne von IleRS (Schmidt und Schimmel, 1004, Science) und insbesondere die Aminosäuren der 240 bis 250-Region, die in der IleRS-Sequenz verschiedener Organismen sehr stark konserviert ist. Punktmutationen in diesem Bereich erzeugen Enzyme, die hinsichtlich ihrer Korrekturfunktion partiell oder vollständig defizient sind (Hendrickson, 2000). Ein künstliches Allel des Gens ileS, das die Isoleucyl-tRNA-Synthetase aus E. coli codiert, die eine Folge feiner Reste aufweist, die die Reste 240 bis 250 ersetzen, wurde folgendermaßen konstruiert: das pVDC433 (Hendrickson et al., 2001), hergeleitet von Plasmid pBAD (Guzman et al., 1995) durch Insertion des Wildtyp-IleS-Gens wird durch Restriktionsenzyme ClaI und SpeI gemäß den Herstellerangaben gespalten, so dass die Nukleotide 717 bis 750 des Gens eliminiert wurden. Die 5'-phosphorylierten Oligonukleotide (Invitrogen Life Technologies)
5'pCTAGTAATCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCGCGCAATAT und
5'pCGATATTGCGCGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGATTA
werden hybridisiert und mit dem Plasmid pVDC433 ligiert, das vorher durch SlaI und SpeI unter den folgenden Bedingungen gespalten wurde: 0,3 pmol Vektor und 3 pmol jedes Oligonukleotids werden für 10 min bei 70°C inkubiert, nach dem Fällen und Resuspendieren in 10 μl H₂O, nach der Rückstellen auf Raumtemperatur wurde die Ligation gemäß Standard-Protokollen durchgeführt. Das Ligationsgemisch wird zur Transformation kompetenter Zellen des Sure^TM-Stammes (Stratagen) durch Elektroporation nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Transformanten werden erhalten und Plasmid-DNA hergestellt (Qiaprep-Kit, Qiagen). Das derart erhaltene Plasmid pTLH 33 wird sequenziert und die Insertion von 11 Alanin-Codons verifiziert.
Das pTLH33-Plasmid wird in den Wildtyp E. coli-Stamm MG1655 eingebracht, so dass PS2419 erhalten wird. Das Allel, erhalten durch Deletion des ileS-Gens, deltaile S203::kan, aus Stamm IQ839 (Shiba und Schimmel, 1992) wird in den Stamm PS2419 durch P1-Transduktion gemäß dem Standard-Protokoll (Miller, 1972) eingebracht, und eine Transduktante, Stamm PS2449, wird in reichem Medium erhalten, das mit Kanamycin (25 mg/l) und Arabinose (0,02%) angereichert ist. Auf die gleiche Weise wird der Stamm PS2306 durch Insertion des Plasmids pVDC433 in Stamm MG1655 (resultierender Stamm: PS27752) und P1-Transduktion des Allels ileS203::kan in Stamm PS2752 konstruiert. Das Wachstum der beiden im ileS-Locus deletierten Stämme, PS2306 und PS2499, erfordert die Anwesenheit von Arabinose, was die kontrollierte Expression des Wildtyp-ileS-Gens (Plasmid PVDC433, Stamm PS2306) bzw. des mutierten Gens iles ala 11 (Plasmid pTLH33, Stamm PS2449) zeigt.
Beispiel 5: Empfindlichkeit der Isoleucyl-tRNA-Synthetase gegenüber nicht-kanonischen Aminosäuren.
Die Stämme PS2306 und PS2449 werden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber künstlichen Aminosäuren untersucht, die eine sterische Ähnlichkeit zu Isoleucin aufweisen. Die Zellen werden in MS-Minimalmedium, Succinat (0,2%), Arabinose (0,2%) für 24 Std. bei 37°C gezüchtet, und bei 1/250 in MS-Mineralmedium verdünnt. 0,5 ml dieser Zellsuspension werden auf einer Petrischale mit 25 ml MS-Medium, angereichert mit Succinat (0,2%) und Arabinose (0,2%), ausgestrichen. Eine Vertiefung wird dann in der Mitte der Schale hergestellt und mit 0,1 ml einer Aminosäure-Lösung gefüllt:

1) 25 mM S-Methylcystein
2) 25 mM Homocystein
3) 25 mM o-Methyl-L-serin
4) 25 mM Norleucin
5) 25 mM Norvalin

Die Petrischalen werden dann bei 37°C für 24 Std. inkubiert, und das Erscheinen einer Hemmzone um die Vertiefung wird aufgezeichnet. Die Durchmesser der Zonen des abgeschwächten Wachstums wurden folgendermaßen gemessen.
Tabelle 3
Alle 5 untersuchten nicht-kanonischen Aminosäuren hemmen das Wachstum der beiden Stämme, jedoch wird nicht vermerkt, dass in allen Fällen eine stärkere Hemmung des Stamms vorliegt, der das mutierte Allel des ileS-Gens in der Korrekturstelle exprimiert. Somit scheint die mutierte Isoleucyl-tRNA-Synthetase eine erhöhte Spezifität für die Substrat-Aminosäure zu haben, die die tRNAile mit nicht natürlichen Aminosäuren beladen.
Beispiel 6: Biochemische Charakterisierung der IleRS240-250-Ala-Mutante
Die Wildtyp- und mutierten IleRS-Enzyme wurden aus den Stämmen PS2306 und PS2449 durch Chromatographie gereinigt, wobei das von Hendrickson et al. (2002) beschriebene Verfahren verwendet wurde. Ile-tRNA, die mit der Aminosäure Val beladen war (Val-t-RNAIle) kann in großer Menge erzeugt werden, indem die Korrekturmutante IleRS T242P verwendet wurde (Hendrickson, 2000). Die Verwendung dieser Val-tRNA/Ile ermöglicht die Untersuchung der Deacylierungsaktivität verschiedener Enzyme mit dem von Hendrickson, 2000 beschriebenen Protokoll. Die in der 4 gezeigten erhaltenen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Deacylierungsfunktion der Val-tRNA-Ile bei der IleRS240-250-Mutante defizient ist.
Literatur und Bemerkungen

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17. Die 64 Allele von thyA mit verschiedenen Codons an der Position 146 der codierenden Sequenz wurde folgendermaßen konstruiert. Zuerst wurde eine einzelne NheI-Stelle durch eine G429->A Substitution in den thyA codierenden Bereich durch stellengerichtete Mutagenese (24) von Plasmid pTSO (14) eingebracht, so dass das Plasmid pTSO1 erhalten wurde. Die Oligonukleotide THY1 (5'-CTGGATAAAATGGCGCTAGCACCGTGCCATGCATTC-3') und THY2 (5'-TCTGCCACATAGAACTGGAAGAATGCATGGCACGGT-3') wurden für diese Mutation verwendet, die den Sinn des so mutierten Codons bewahrten. Plasmid pTSO1 wurde dann mit NheI und NsiI gespalten, um aus dem thyA codierenden Bereich ein 18 bp Fragment mit dem Codon 146 (UGC) zu entfernen. Alle 64 Oligonukleotide der thyA codierenden Sequenz von den Nukleotiden 427 bis 444 und die 64 Oligonukleotides der partiellen reversen Sequenz wurden konstruiert (GENAXIS Biotechnology, Montigny le Bretonneux, Frankriech). Die 64 Paare komplementärer Oligonukleotide wurden hybridisiert und mit dem gespaltenen Plasmid pTSO1 ligiert.
18. Cysteingradientenplatten wurden wie in der Legende von 1B beschrieben angefertigt. Die Wirkungen von L-Valin allein konnten nicht direkt untersucht werden, weil exogenes L-Valin bekanntlich das Wachstum von E. coli K12 in Minimalmedium hemmt (25). Diese Hemmung wird verringert, wenn auch L-Isoleucin zugeführt wird. Somit wurde das Ile-Val-Dipeptid als Valinquelle verwendet, weil dieses Dipeptid über die Zellmembran transportiert wird, und in Isoleucin und Valein abgebaut wird (26).
19. V. Döring, et al., Ergänzende Daten finden sich auf der Science Website.
20. M. J. Pine, Antimicrobio. Agents Chemother. 13, 676–85 (1978).
21. Chromosomale DNA aus E. coli wurde mit einem DNeasy Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) gemäß den Herstellerangaben extrahiert. PCR zur Amplifikation des valS-Gens wurde folgendermaßen durchgeführt: Denaturation bei 94°C für 3 min, gefolgt von 30 Zyklen 30 sec bei 94°C, Hybridisierung 57°C für 30 sec, und Primerextension bei 72°C für 200 sec. Der letzte Schritt war eine Primerextension bei 72°C für 600 sec. Die Reaktion erfolgte mit 2 Einheiten Vent DNA Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) und 100 ng chromosomaler DNA in einem 100 μl Reaktionsgemisch. Es wurden die folgenden Primer verwendet: VAL1 (5'-GGGGAATTCGGTGTGTGAAATTGCCGCAGAACG-3'), und VAL2 (5'-GGCAAGCTTTCAGGTATTTGCTGCCCAGATCGA-3'). Zwei unabhängige PCR-Amplifikationsprodukte jeder Mutante wurden sequenziert (GENAXIS Biotechnology, Montigny le Bretonneux, Frankreich).
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33. mutS:spc+ Allel (Gabe von F. Taddei, Hôpital Necker-Enfants, Paris); Δ nrdD::kan+ Allel, Laborsammlung; Δ dnaQ:tet Allele (Gabe von J. Shapiro, University of Chicago, IL); CU505 (Δ (ilvE-ilvC)2049 leu455 galT1 IN(rrnD-rrnE)1) Gabe von Dr. M. Berlyn vom E. coli Genetic Stock Center (New Haven, CT). Die Übertragung der Gene und Resistenzmarker durch P1-Transduktion erfolgten mit Standardprotokollen (35).
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Isoleucyl-tRNA-Synthetase Variante, dadurch gekennzeichnet, dass die Reste 240 bis 250 der Korrekturdomäne (editing domain) des durch das E. coli Gen ileRS kodierten Proteins durch 11 aufeinanderfolgende Alaninreste ersetzt sind.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für die Isoleucyl-tRNA-Synthetase Variante gemäß Anspruch 1 kodiert.
Vektor, der eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 umfasst.
Isolierte, transformierte Zelle, die eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 oder einen Vektor gemäß Anspruch 3 umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die eine nichtkanonische Aminosäure umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) das Kultivieren einer isolierten, transformierten Zelle gemäß Anspruch 4 in einem Kulturmedium, das die nicht-kanonische Aminosäure oder eine ihrer Vorstufen umfasst, welche durch die der in der genannten Zelle enthaltenen Isoleucyl-tRNA-Synthetase Variante zugehörigen tRNA fälschlicherweise übertragen werden kann; b) und das Gewinnen der Proteine, die die genannte nicht-kanonische Aminosäure umfassen, aus dem Kulturmedium oder aus den Zellen aus Schritt a).
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium in Schritt a) eine nicht-kanonische Aminosäure ausgewählt aus S-Methyl-L-cystein, Homocystein, O-Methyl-L-serin, Norleucin und Norvalin umfasst.