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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verändern der
chemischen Zusammensetzung von in vivo produzierten Proteinen, die
den Schritt Deaktivierung, insbesondere durch Mutagenese, der Korrekturfunktion
von einer der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen umfasst. Die vorliegende
Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen,
die solche mutierten Aminoacyl-tRNA-Synthetasen codieren, deren
Korrekturstelle mutiert ist, und die eine nicht-kanonische Aminosäure durch
ihre zugehörige
tRNA fälschlicherweise übertragen. Ebenfalls
ist hier ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von transformierten
Zellen, die in vivo Proteine synthetisieren können, welche mindestens eine
nicht-kanonische Aminosäure
enthalten, und ihre Verwendung zur Produktion solcher Proteine beschrieben.
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Aminoacyl-tRNA-Synthetasen
begründen
die Regeln des genetischen Codes durch Katalyse der Aminoacylierung
von transfer-RNAs. Die chemische Invarianz der 20 Aminosäure-Bausteine
der Proteine ist gut begründet.
Die einzigen bekannten Erweiterungen für diesen invarianten Satz sind
Formyl-Methionin
(1) und Selenocystein (2), die jeweils in Reaktion auf Punktuationssignale
während
der Translation in bestimmten Organismen eingebaut werden. Arten
haben zwar im Verlauf geologischer Zeiten verschiedene terrestrische
Lebensräume
besiedelt, ihre Diversifizierung spiegelt sich jedoch somit nicht
in der Evolution der Organismen wieder, dass sie spezialisierte
Aminosäuresätze umfassen.
Thermophile, mesophile und psychrophile Organismen bauen beispielsweise
jeweils Proteinen auf, indem sie die gleichen Arten von 20 kanonischen
Aminosäuren
zu verschiedenen Proteinsequenzen vereinigen. Als "Missing Link" zwischen Alanin
und Valin (3) kann Aminobutyrat (Abu, auch bekannt als Butyrin)
durch Transaminierung aus dem physiologischen Metabolit 2-Oxobutyrat
erzeugt werden, und es sollte somit als latenter Metabolit (4) angesehen
werden. Sein Fehlen ist daher besonders auffällig in Proteinen von noch
vorhandenen Organismen.
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Die
Auswahl von Aminosäuren
für die
Proteinsynthese erfolgt durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Gewöhnlich katalysiert
jede der 20 Synthetasen die Bindung ihrer zugehörigen Aminosäure an ihre
zugehörige tRNA,
und die Aminosäuren
werden auf diesem Weg spezifischen Triplets des genetischen Codes
zugeordnet (5). Die aktiven Stellen einiger dieser Enzyme haben
an sich nicht die Kapazität
zur Unterscheidung zwischen sehr ähnlichen Aminosäuren in
einem Ausmaß,
das die hohe Genauigkeit des Codes erklären könnte. Aus diesem Grund kann
ein gegebenes Enzym sehr ähnliche
(hinsichtlich Größe und Form)
Aminosäuren
mit einer niedrigen Frequenz (0,1 bis 1 %) fehlaktivieren (6). Zur
Korrektur dieser Fehler hat sich in vielen Fällen eine hydrolytische Korrekturfunktion
an einer gesonderten aktiven Stelle entwickelt (7–10). Ein
Beispiel für
eine Synthetase mit Korrekturaktivität ist die Valyl-tRNA-Synthetase
(ValRS), die die isosterische natürliche Aminosäure Thr
(9) sowie das nicht-natürliche Abu
(11) fehlaktviert. Die Fehlaktivierung dieser Aminosäuren führt zu einer
transienten Falschbeladung von tRNAVal,
gefolgt von hydrolytischer Deacylierung (Korrektur) der fälschlicherweise übertragenen
Aminosäure
von der tRNA.
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Die
vorliegende Arbeit zielte auf die Erstellung von Bedingungen der
künstlichen
Selektion, die eine Verwendung nicht kanonischer Aminosäuren, wie
Abu, fördern,
die nicht durch natürliche
Selektion erhalten wurden. Andere versuchten den Einbau einer nicht-kanonischen
Aminosäure
in ein Protein durch Einbringen eines fremden "orthogonalen" tRNA/Synthetase-Paars, das die Aminosäure an einem
spezialisierten Stopp-Codon einfügen
kann (12).
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Solche
Ansätze
sind jedoch arbeitsaufwändig,
da sie die Selektion, Identifikation, Klonierung und Untersuchung
einzelner mutierter Stämme
erfordern.
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Zur
Erleichterung der In-vivo-Produktion der Proteine, die nicht-kanonische Aminosäuren umfassen, möchte man über ein
rasches und allgemeines Verfahren zur genetischen Modifikation und
Selektion von Zellen verfügen,
die die In-vivo-Produktion dieser Proteine erzielen können.
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Ein
solches wünschenswertes
Verfahren ermöglicht
die Vergrößerung der
Translationschemie, indem man eine nicht-kanonische Aminosäure sämtliche
Codons "infiltrieren" lässt, die
normalerweise mit einer der natürlichen
Aminosäuren
einhergehen. Stattdessen können
durch Zuordnen von zwei Aminosäuren
(einer zugehörigen
und einer nicht-zugehörigen)
zu einem bestimmten Satz von Codons, damit ein selektiver Vorteil
für die
umprogrammierten Zellen geschaffen wird, globale Änderungen
in den Aminosäure-Zusammensetzungen aller
zellulären
Proteine vorgenommen werden.
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Dies
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
wurde ein allgemeines Verfahren zur Veränderung der chemischen Zusammensetzung
von Proteinen entwickelt, die in vivo von einer Zelle erzeugt werden,
umfassend den Schritt, bei dem die Korrekturfunktion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase der
Zelle deaktiviert wurde.
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Dieses
schnelle und allgemeine Verfahren kann zur Gewinnung von Zellen
verwendet werden, die eine Mutation an der DNA-Sequenz, die für die Korrekturdomäne der beschädigten Aminoacyl-tRNA-Synthetase
codiert, aufweisen verglichen mit der DNA-Sequenz, die für die Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert.
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Im
allgemeinen umfasst das hier beschriebene Verfahren: a) das Auswählen eines
Zellstamms, bei dem die Korrekturfunktion von einer seiner Aminoacyl-tRNA-Synthetasen
deaktiviert wurde, so dass die deaktivierte Korrekturfunktion ermöglicht,
dass die Aminoacyl-tRNA-Synthetase mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure durch
die zugehörige
tRNA fälschlicherweise überträgt; b) das
Züchten
des ausgewählten Stamms
in einem Kulturmedium, das die nicht-kanonische Aminosäure oder eine ihrer Vorstufen
umfasst, unter Bedingungen, die das Wachstum des Stamms begünstigen;
und c) Gewinnen der Proteine, die die nicht-kanonische Aminosäure enthalten,
aus dem Kulturmedium oder den in Schritt b) erhaltenen Zellen.
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In
verschiedenen Beispielen wurde die Korrekturfunktion der Aminoacyl-tRNA-Synthetase durch
Mutagenese der DNA-Sequenz deaktiviert, die die Korrekturdomäne einer
Aminoacyl-tRNA-Synthetase in der Zielzelle codiert, wobei die Mutagenese
in der Zelle vorzugsweise durch homologe Rekombination oder einen Allelersatzvektor
erfolgt, was zu einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante mit einer Aminosäure-Mutation
in ihrer Korrekturdomäne
führt,
wobei die Mutation die fälschliche
Beladung der zugehörigen
tRNA mit einer nicht-kanonischen
Aminosäure
durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante ermöglicht.
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Hier
ist auch ein Verfahren zur Selektion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante
offenbart, die eine nicht zugehörige
Aminosäure,
vorzugsweise eine nicht-kanonische Aminosäure, durch ihre zugehörige tRNA
fälschlicherweise übertragen
kann, einschließlich
der Schritte: a) Erstellen eines DNA-Konstruktes, das eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante
mit einer Aminosäure-Mutation
in ihrer Korrekturdomäne
codiert; b) Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Konstrukt;
c) Untersuchen der Fähigkeit
der rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, die durch
die transformierte Wirtszelle produziert wird, auf ihre Fähigkeit, eine
nicht-zugehörige
Aminosäure,
vorzugsweise eine nicht-kanonische Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA
fälschlicherweise
zu übertragen,
und d) wenn geeignet Auswahl der untersuchten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante,
wenn die untersuchte Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante eine nicht-zugehörigen Aminosäure, vorzugsweise
eine nicht-kanonische Aminosäure,
durch ihre zugehörige
tRNA (tRNA(s), die mit der untersuchten Aminoacyl-tRNA-Synthetase
einhergehen) fälschlicherweise übertragen
kann.
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Die
Erfindung betrifft isolierte Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Varianten,
die eine nicht-zugehörige
Aminosäure,
vorzugsweise eine nicht-kanonische Aminosäure, durch die zugehörige tRNA
fälschlicherweise übertragen
können,
wobei das Nukleinsäure-Fragment,
das die Korrekturstelle codiert, zumindest eine Mutation umfasst,
die zu einer Aminosäuremutation
führt,
vorzugsweise zu einer Aminosäure-Substitution
in der Korrekturstelle der Isoleucyl-tRNA-Synthetase. Eine isolierte
Nukleinsäure,
die solche Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Varianten codiert, Vektoren,
wie Plasmid, und Zellen, die eine solche Nukleinsäure umfassen,
sind auch ein Teil der vorliegenden Erfindung.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von Proteinen, die eine nicht-kanonische Aminosäure umfassen, einschließlich der
allgemeinen Schritte: a) Kultivieren einer transformierten Wirtszelle,
die eine Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Allel-Variante aufweist, welche
durch ihre zugehörige
tRNA eine nicht-kanonische Aminosäure fälschlicherweise übertragen kann,
in einem Kulturmedium, das die nicht-kanonische Aminosäure oder eine ihrer Vorstufen,
enthält;
und b) Gewinnen und bei Bedarf Reinigen der Proteine mit der nicht-kanionischen
Aminosäure
aus dem Kulturmedium (Überstand)
und/oder aus den Zellen (aus dem Zellpellet) von Schritt a).
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Die
Erfindung ermöglicht
die Produktion der Proteine mit einer nicht-kanonischen Aminosäure durch das vorstehende Verfahren.
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Andere
Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon und aus
den Ansprüchen
ersichtlich.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGNEN
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1A bis 1C.
Suppressions- und Toxizitäts-Phänotypen.
Aminosäure-Gradientenplatten
wurden mittels Minimalmedium (27) hergestellt (Siehe ebenfalls die 1A bis 1C in
Döring
et al., Science, 292 (5516), 453–454, 2001, die identisch sind).
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1A:
Strukturen von Cystein, S-Carbamoyl-Cystein, Valin, Threonin und α-Aminobuttersäure.
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1B:
Cystein (100 μl
(0,4 M)) wurde in einer zentralen Vertiefung untergebracht, nach
dem Verteilen und Trocknen wurden 0,5 ml einer 5/1000-Verdünnung einer Übernachtkultur
(in MS-Glucose-Medium mit Thymidin (0,3 mM) von β5456 (thyA::erm+ ΔnrdD::kan+
valS:T222PpTS13 (bla+ thyA:146GUA)). Ile-Val (0,3 mM) wurde in einer
Platte als Kontrolle zugegeben. Das Dipeptid Ile-Val wurde von Bachem
AG (Bubendorf, Schweiz) erhalten. Die Platten wurde 2 Tage bei 30°C inkubiert.
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1C:
Minimalmedium-Platten, angereichert mit Thymidin (0,3 mM) wurden
mit Aminosäure-Lösungen vorbehandelt
durch Bestreichen entweder mit Thr (50 μl (0,2 M)) oder Abu (50 μl (0,1 M))
vertikal am Durchmesser der Platte entlang, so das ein Aminosäure-Gradient
erhalten wurde. Die Mutante (β5456)
und Wild-Typ (β5419
(thyA::erm+ ΔnrdD::kan+
pTS13 (bla+ thyA:146 GUA))-Stämme wurde
dann horizontal über die
Platten ausgestrichen und 2 Tage bei 37°C inkubiert.
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2A bis 2C.
Punktmutationen in der Korrekturstelle und ihre Folgen (Siehe ebenfalls
die 2A bis 2C in
Döring
et al., Science, 292 (5516), 453–454, 2001, die identisch sind.
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2A:
Die Positionen der fünf
Punktmutationen, die in der Korrekturstelle von ValRS isoliert sind, sind
gezeigt. Die IleRS-Korrekturstelle (CP1) (28, 29), die die abwechselnden β-Stränge (Fünfecke)
und α-Helices
(Rechtecke) der katalytischen Domäne schneidet, ist gezeigt.
Die Ausrichtung der Reste in den Korrekturstellen von HeRS und ValRS
ist ebenfalls gezeigt, wobei die stark konservierten Reste sämtlicher
veröffentlichter
Sequenzen mit einem Doppelpunkt markiert sind. Die Abkürzungen
sind Ec, Escherichia coli, Sc, Saccharomyces cerivisiae, Hs, Homo
sapiens.
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2B:
Fehlaminoacylierung von tRNAVal mit Thr
durch das Enzym der T222P-Mutante bei pH-Wert 7,5 und 37°C. Die Wildtyp-
(WT) und Mutanten-Allele
wurde unter der Kontrolle eine PBAD-Promotors
(30) kloniert. Die Enzyme wurden aus einem Laborstamm, dem die chromosomale
Kopie des valS-Gens fehlte (ΔvalS::kan+),
partiell gereinigt. Die Reinigungs- und Aminoacylierungsverfahren
wurden aus Hendrickson et al. (31) angepasst. (Hauptfeld) Fehlaminoacylierung
von tRNAVal mit Thr durch die beiden Enzyme.
(Einfügung) Aminoacylierung
von tRNAVal mit Val durch die beiden Enzyme.
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2C:
In vivo-Einbau von Aminobutyrat. Das His-markierte Protein AlaXp
wurde in zwei Δilv-Stämmen exprimiert,
die das Wildtyp-valS- oder das mutierte valS:T222P-Allel enthielten,
in MS-Medium, das Ile-Leu (0,3 mM), Ile-Val (0,02 mM) und Abu (0,2 mM) enthielt.
AlaXp wurde mit Ni-NTA-Agarose (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland)
gereinigt, aus einem präparativen
SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten
und für
MALDI und μ-LC-MS/MS-Massenanalyse vorbereitet
(32). Die MALDI-MS-Analysen wurden in einem Voyager-Elite-Time-of-Flight-Massenspektrometer
mit verzögerter
Extraktion (PerSeptive Biosystems Inc. Framingham, MA) durchgeführt. Das
Spektrum für
das Peptid Lys156-Arg172 mit der Masse 2097,04 ist auf dem unteren Feld
gezeigt (Wildtyp-Zellen).
Das obere Feld zeigt das in zwei Komponenten aufgelöste Peptid,
wenn es aus den Zellen isoliert wurde, die das T222P-Allel des Gens
für ValRS
tragen. Die zweite Komponente hat eine Masse von 2083,04, die genau
14 Masseeinheiten kleiner als das "Wildtyp-Peptid". Mehrfache Peaks entsprechen der 13C-Isotopenform,
die die Peptide voneinander trennen, die sich um 1, 2, 3 usw. Masseeinheiten
unterscheiden.
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3. Übernachtkulturen
von Δilv-Auxotrophen,
die das WT-valS (É)
oder das mutierte valS:T222P-Allel (J) enthalten, und die in MS-Glucose-Medium
mit limitierendem Valin (0,04 mM Ile-Val. 0,3 mM Ile-Leu) gezüchtet wurden,
wurden 1/1 verdünnt,
die Val-Konzentration wurde auf 0,02 mM eingestellt und die Biomasse
wurde durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm nach 24 Std.
Wachstum bei 30°C
bestimmt.
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4.
Hydrolyse von Valyl-tRNAile durch Wildtyp- und mutiertes IleRS Diese
Figur zeigt die größte Abnahme
der Korrekturaktivität
des mutierten IleRS mit 11 Alanin-Resten in Position aa 240–250 verglichen mit
der Korrekturaktivität
von Wildtyp-IleRS. ∎: IleS ala 11 (mutiertes IleRS mit
11 Alanin-Resten in der Position aa 240–250); ♦IleS wt (Wildtyp-IleRS).
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5.
Korrelation zwischen der Abu-Toxizität, gemessen als Mengen fehlaminoacylierter
[3H]Thr-tRNAVal und
Toxizität
von ABU, gemessen in den verschiedenen mutierten Stämmen. Die
Korrelation der Abu-Toxizität-Phänotypen
und die Wirksamkeit der Deacylierung durch mutierte Enzyme. A. Nicht
zugehörige
Aminosäure-Toxizitäts-Phänotypen.
valS-Null-Stämme,
die die mutierten ValRS-Enzyme jeweils in trans enthielten, wurden
auf Minimalmedium plattiert. Abu (α-Aminobutyrat) wurde in eine
zentrale Vertiefung geladen, und die Platten wurden für 24 Std.
bei 42°C
inkubiert. Der Grad der Toxizität
in Reaktion auf Abu wurde durch den Durchmesser des Bereichs des
gehemmten Zellwachstums bestimmt. Stämme, die die mutierten K227Q-
und T222P-valS-Allele
trugen, zeigten die schwerste Reaktion auf Abu. Das Wachstum von
D230N-valS wurde durch hohe Konzentrationen Abu gehemmt, aber der
Effekt wurde nicht bei niedrigeren Konzentrationen beobachtet. Die
V276A-Mutation führt
eine leichte Empfindlichkeit gegenüber Abu ein. Ähnliche
Phänotypen
wurden in Reaktion auf exogenes Threonin beobachtet (Daten nicht
gezeigt). B. Histogramm-Darstellung der Hemmzonen-Durchmesser von
DvalS::kanR-Stämmem, die
jeweils die ValRS-Korrekturmutanten auf dem Plasmid enthielten,
in Reaktion auf exogenes Abu. Die Effekte reichen von mild bis schwer. (Einfügung) Histogramm-Darstellung
des Prozentsatzes von fälschlicherweise übertragener
Thr-tRNAVal, der nach der Inkubation mit 2 nM Enzym für 15 min
bei Raumtemperatur zurück
blieb. Beide zeigen einen bestimmten Bereich in der Schwere der
Korrekturdefekte, die durch diese Punktmutationen verursacht wurden.
Zusammengenommen veranschaulicht dies eine Korrelation zwischen
der Fähigkeit
des mutierten Enzyms zur Deacylierung der von tRNAVal fälschlicherweise
in vitro übertragener
Aminosäuren
und dem Ausmaß der
In-vivo-Toxizität, die man
in Reaktion auf exogene nicht zugehörige Aminosäuren beobachtet.
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EINGEHENDE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Veränderung
der chemischen Zusammensetzung von Proteinen bereit, die in vivo
durch eine Zelle produziert werden, umfassend den Schritt Deaktivieren
der Korrekturfunktion von einer ihrer Aminoacyl-tRNA-Synthetasen.
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Der
Begriff "der Schritt
Deaktivieren der Korrekturfunktion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase" soll einen Schritt
bezeichnen, durch den ein mutierter Stamm erhalten wird, bei dem
ein Allel, das eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, eine Mutation in
ihrer Korrekturstelle oder -Domäne
umfasst, was führt
zu:
- – Verlust
der Rolle der Korrekturfunktion bei der Restriktion des genetischen
Codes auf 20 Aminosäuren;
- – Verlust
der Rolle der Korrekturfunktion bei der Verhinderung des Eindringens
der nicht-zugehörigen
Aminosäure;
und/oder
- – Fehlaktivierung
der nicht-zugehörigen
Aminosäuren
oder/und die Nicht-Hydrolysierung der erzeugten "nicht-zugehörigen Aminosäure-tRNA", die gewöhnlich durch
die Korrekturfunktion der zugehörigen
Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase hydrolysiert wird, wobei diese
Veränderungen
der Korrekturfunktion den potentiellen Fehleinbau einer nicht nicht-zugehörigen Aminosäure induzieren,
vorzugsweise einer nicht-kanonischen Aminosäure, anstelle der zugehörigen Aminosäure, die
von der durch das Wildtyp-Allel codierten Aminoacyl-tRNA-Synthetase übertragen
wird.
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Ein
solcher Schritt der Deaktivierung der Korrekturfunktion von einer
der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen kann beispielsweise die Schritte
umfassen:
- – Auswählen eines
mutierten Stammes, der eine natürliche
Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante
mit einer Mutation in ihrer Korrekturdomäne enthält, die zu diesen vorstehend
genannten Funktionsveränderungen führt; oder
vorzugsweise
- – Auswählen eines
mutierten Stammes, der eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante mit einer Mutation in
ihrer Korrekturdomäne
enthält,
die zu diesen vorstehend genannten Funktionsveränderungen führt, wobei diese Variante durch
Mutagenese erhalten wird, wie durch homologe Rekombination oder
Ersatzallelvektor- oder beliebige Mutagenese-Verfahren, die dem
Fachmann bekannt sind, die eine solche Mutation, vorzugsweise in
das Genom der Zelle integriert, einbringen können.
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Der
Begriff "zugehörige Aminosäure" in der vorliegenden
Beschreibung soll die Aminosäure
bezeichnen, die gewöhnlich
von der tRNA übertragen
wird, und zwar entsprechend (oder assoziiert mit) dem Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Wildtyp (die zugehörige Aminosäure für die Valyl-tRNA-Synthetase
ist beispielsweise Valin).
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Der
Begriff "zugehörige tRNA" in der vorliegenden
Bezeichnung soll die tRNA bezeichnen, die dem Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Wildtyp
entspricht (oder mit diesem assoziiert ist) (die zugehörige tRNA
für die Valy-tRNA-Synthetase
ist beispielsweise tRNAVal).
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Zudem
wird ein Verfahren zur Herstellung von In-vivo-Proteinen bereitgestellt,
die mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure aufweisen, umfassend die
Schritte:
- a) Auswählen eines Zellstammes, wobei
die Korrekturfunktion von einer seiner Aminoacyl-tRNA-Synthetasen
durch Mutagenese deaktiviert wurde, wobei die deaktivierte Korrekturfunktion
es ermöglicht,
dass die Aminoacyl-tRNA-Synthetase
mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure durch die zugehörige tRNA fälschlicherweise übertragen
kann;
- b) Züchten
des ausgewählten
Stammes in einem Kulturmedium, das die nicht-kanonische Aminosäure oder eine
ihrer Vorstufen enthält,
unter geeigneten Bedingungen für
das Wachstum des Stammes; und
- c) Gewinnen der Proteine, die die nicht-kanonische Aminosäure enthalten,
aus dem Kulturmedium oder aus den in Schritt b) erhaltenen Zellen.
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Der
Begriff "günstige Wachstumsbedingungen" steht für eine Umgebung,
die für
das Zellwachstum und/oder die Lebensfähigkeit relativ günstig ist.
Solche Bedingungen berücksichtigen
die relative Verfügbarkeit der
Nährstoffe
und der optimalen Temperatur, Atmosphärendruck, Anwesenheit oder
Abwesenheit von Gasen (wie Sauerstoff und Kohlendioxid), und Aussetzen
gegenüber
Licht, wie es der untersuchte Organismus erfordert.
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Der
Begriff "Vorstufe" steht für eine Verbindung,
die sich in vivo effizient durch die Zelle in die nicht-kanonische
Aminosäure
umwandeln lässt.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Zellstamm, bei dem die Korrekturfunktion seiner Isoleucyl-tRNA-Synthetasen
deaktiviert wurde, eine Mutation in der DNA-Sequenz, die die Korrekturdomäne der deaktivierten
Isoleucyl-tRNA-Synthetase codiert, verglichen mit der Wildtyp-Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Sequenz.
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Bei
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
führt die
DNA-Mutation zu einem Austausch der Reste 240 bis 250 der Korrekturdomäne des Proteins,
das vom IleRS-Gen von E. coli codiert, durch 11 aufeinander folgende
Alanin-Reste.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird ein erfindungsgemäßes Verfahren
bereitgestellt, wobei die beschädigte
Isoleucyl-tRNA-Synthetase
eine kanonische Aminosäure,
die der Aminosäure sterisch ähnelt, die
von der Wildtyp-Isoleucyl-tRNA-Synthetase durch ihre zugehörige tRNA übertragen
wird, durch ihre zugehörige
tRNA fälschlicherweise übertragen
kann.
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Bei
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
wird ein erfindungsgemäßes Verfahren
bereitgestellt, wobei die beschädigte
Isoleucyl-tRNA-Synthetase
eine nicht-kanonische Aminosäure,
die sterisch der Aminosäure ähnelt, die
von der Wildtyp-Isoleucyl-tRNA-Synthetase durch ihre zugehörige tRNA übertragen wird,
durch ihre zugehörige
tRNA fälschlicherweise übertragen
kann.
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Bei
einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung
von Zellen bereitgestellt, die in vivo Proteine mit mindestens einer
nicht-kanonischen Aminosäure
produzieren können,
umfassend den Schritt Mutagenisieren der DNA-Sequenz, die die Korrektur-Domäne einer
Isoleucyl-tRNA-Synthetase
in einer Zelle codiert, wobei die Mutagenese zu einer Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante
mit einer Aminosäure-Mutation
in ihrer Korrekturdomäne
führt,
durch die die Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante eine nicht-kanonische Aminosäure durch
ihre zugehörige
tRNA fälschlicherweise übertragen
kann.
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Es
wird ein Verfahren zur Gewinnung von Zellen offenbart, die in vivo
Proteine produzieren können, die
mindestens eine erfindungsgemäße nicht-kanonische Aminosäure aufweisen,
umfassend die Schritte:
- a) Untersuchen der
Fähigkeit
einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, deren Korrekturdomäne mutiert ist,
zur fälschlichen Übertragung
einer nicht-kanonischen
Aminosäure
durch ihre tRNA;
- b) Mutagenese der DNA-Sequenz, die die Korrekturdomäne der Aminoacyl-tRNA-Synthetase
codiert, in einer Zelle, wobei die Mutagenese zum Austausch des
Allels führt,
das die Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, durch ein Allel,
das die Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, die in Schritt
a) untersucht wird und die eine nachweisbare nicht-kanonische Aminosäure-Fehlübertragung
erzeugen kann.
- c) gegebenenfalls Identifizieren, Auswählen und/oder Klonieren der
Zellen, die eine solche Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante enthalten,
mit der Fähigkeit
zur fälschlichen Übertragung
einer nicht-kanonischen Aminosäure.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Zelle, bei der die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase,
vorzugsweise durch Mutagenese, deaktiviert wurde, eine mikrobielle
oder tierische Zelle, vorzugsweise ein Bakterium, eine Hefe oder
ein Pilz, stärker
bevorzugt ein Bakterium, wie Echerichia coli oder Acinetobacter.
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Bei
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, bei
dem die Korrekturdomäne
der Isoleucyl-tRNA-Synthetase der Zielzelle durch homologe Rekombination
oder durch Rekombination in das Genom der Zielzelle mit einem Allelersatzvektor
deaktiviert wurde.
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Die
Oligonukleotide, die das Nukleinsäurefragment umfassen, das die
mutierte Korrekturstelle oder einen Abschnitt davon codiert, und
die die Mutation enthalten, die in das Wildtyp-Allel der Zielzelle
eingebracht werden muss, können
chemisch synthetisiert oder durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)
synthetisiert werden.
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Von
mikrobiellen oder tierischen Zellen sind Zellen bevorzugt, die homologe
Rekombination durchlaufen. Solche Zellen können aus Bakterien, Mycobakterien,
Hefe, Pilz, Algen, Pflanze oder Tier stammen.
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"Homologe Rekombination" bedeutet ein Verfahren,
durch das ein exogen eingebrachtes DNA-Molekül in ein Ziel-DNA-Molekül in einem
Bereich integriert, in dem eine identische oder nahezu identische
Nukleotidsequenz zwischen den beiden Molekülen integriert wird. Die Homologe
Rekombination wird durch komplementäre Basenpaarung vermittelt,
und kann entweder zu einer Einfügung
der exogenen DNA in die Ziel-DNA (durch ein einfaches Cross-Over-Ereignis), oder zu
einem Austausch der Ziel-DNA durch die exogene DNA (durch ein Doppel-Cross-Over-Ereignis)
führen.
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Der
Begriff "Allelersatzvektor" steht für ein beliebiges
DNA-Element, das zum Einbringen von Mutationen in das Genom einer
Zielzelle durch einen spezifischen Austausch eines nativen Gens
durch eine mutierte Kopie verwendet werden kann. Ein Gen-Austausch
in Bakterien wird gemeinhin mit Plasmiden durchgeführt, die
ein Zielgen mit einer Mutation und einen negativen selektiven Marker
außerhalb
des Homologiebereichs enthalten. Ein solches Plasmid integriert in
das Zielchromosom durch homologe Rekombination (durch einfaches
Crossover). Eine geeignete Selektion ergibt Zellen, die den negativen
Selektionsmarker durch ein zweites homologes Rekombinationsereignis
(Doppel-Crossover)
verloren haben, und die nur eine mutierte Kopie des Zielgens enthalten.
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Bei
einer weiteren Ausfürungsform
kann die Zelle, in der die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase
deaktiviert oder mutagenisiert wurde, ein selektierbares Markergen
zur Identifikation und Selektion der Zellen enthalten, die die mutagenisierte
DNA enthalten. Die Identifikation und Selektion dieser Zellen, bei
denen die Korrekturdomäne
der Isoleucyl-tRNA-Synthetase deaktiviert oder mutagenisiert wurde, kann
auf der Fähigkeit
der Zellen auf Selektionsmedium zu wachsen beruhen, wobei eine Zelle,
die den Selektionsmarker enthält,
auf einem Selektionsmedium wachsen kann, und eine Zelle, die den
Selektionsmarker nicht hat, nicht wachsen kann, oder auf einem Selektionsmedium
langsamer wachsen kann.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Zelle, in der die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase
deaktiviert oder mutagenisiert wurde, ein Reportergen zum Identifizieren
und Selektieren der Zelle enthalten, die die mutagenisierte DNA
enthält.
Die Identifikation und Selektion dieser Zellen, bei denen die Korrekturdomäne der Isoleucyl-tRNA-Synthetase
deaktiviert oder – mutiert
wurde, kann auf einem Reportergen-Assay beruhen, bei dem die Deaktivierung
oder die Mutagenese durch die Expression des Reportergens durch
die Zelle bestätigt
wird. Eine Zelle, der die Deaktivierung oder Mutagenese fehlt, exprimiert
das Reportergen nicht.
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Der
Begriff "Selektionsmarker" steht für ein Gen,
das die Fähigkeit
einer Zelle, die dieses Gen hat, zum Wachstum oder Überleben
in einer bestimmten Wachstumsumgebung gegenüber einer ähnlichen Zelle, der der Selektionsmarker
fehlt, verändert.
Ein solcher Marker kann ein positiver oder negativer Selektionsmarker sein.
Ein positiver Selektionsmarker (beispielsweise eine Antibiotikaresistenz
oder ein auxotrophes Wachstumsgen) codiert ein Produkt, das Wachstums-
oder Überlebenseigenschaften
in Selektionsmedium (beispielsweise mit einem Antibiotikum oder
ohne einen essentiellen Nährstoff)
verleihen kann. Ein negativer Selektionsmarker verhindert dagegen,
dass Zellen, die dieses Gen tragen, in negativem Selektionsmedium
wachsen, verglichen mit Zellen, die dieses Gen nicht tragen. Ein
Selektionsmarker kann positive und negative Selektierbarkeit verleihen,
je nachdem, welches Medium zur Anzucht der Zellen verwendet wird.
Die Verwendung der Selektionsmarker in prokaryotischen und eukaryotischen
Zellen ist dem Fachmann geläufig.
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Der
Begriff "Reportergen" bedeutet ein beliebiges
Gen, das ein Produkt codiert, dessen Expression durch immunologische,
chemische, biochemische, biologische oder mechanische Tests nachweisbar
ist und/oder quantifizierbar ist. Ein Reportergenprodukt kann uneingeschränkt beispielsweise
eine der folgenden Eigenschaften aufweisen: Fluoreszenz (beispielsweise
ein grün
fluoreszierendes Protein), enzymatische Aktivität (beispielsweise lacZ/beta-Galactosidase,
Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase, alkalische Phosphatase),
Toxizität
(beispielsweise Ricin) oder eine Fähigkeit, spezifisch an ein
zweites Molekül
gebunden zu werden (beispielsweise Biotin oder einen nachweisbar
markierten Antikörper).
Es versteht sich, dass beliebige gentechnisch erzeugte Varianten
der Reportergene, die dem Fachmann leicht verfügbar sind, ebenfalls ohne Einschränkung in
der vorstehenden Definition eingeschlossen sind.
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Der
Begriff "Identifikation
von Zellen, die mutagenisierte DNA enthält", steht für das Aussetzen der Population
von Zellen, die mit der mutagenisierten DNA transformiert sind,
gegenüber
einem Selektionsdruck (wie das Wachstum in der Anwesenheit von einem
Antibiotikum oder in der Abwesenheit eines Nährstoffs), was mit einem Selektionsmarker übereinstimmt,
den die Zelle trägt,
die die rekombinierte mutagenisierte DNA enthält (beispielsweise ein Antibiotikaresistenzgen
oder ein auxotrophes Wachstumsgen, die im Stand der Technik bekannt
sind). Die Identifikation von Zellen, die die rekombinante mutagenisierte
DNA enthalten, kann ebenfalls erfolgen indem transformierte Zellen
einem Reportergen-Assay unterworfen werden. Die Selektionen und
Durchmusterungen können
eingesetzt werden um Zellen zu identifizieren, die die rekombinierte
mutagenisierte DNA enthalten, obgleich Selektionen bevorzugt sind.
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Hier
ist ein Verfahren zur Selektion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante beschrieben,
die eine nicht-zugehörige
und/oder eine nicht-kanonische Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA
fälschlicherweise übertragen
kann, das folgende Schritte umfasst:
- a) Erstellen
eines DNA-Konstruktes, das eine DNA-Sequenz umfasst, die eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante
codiert, wobei die Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante verglichen mit der
Wildtyp-Aminoacyl-tRNA-Synthetase mindestens eine Aminosäuremutation,
vorzugsweise eine Substitution, stärker bevorzugt eine einzelne
Substitution, in ihrer Korrekturdomäne hat;
- b) Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Konstrukt aus
Schritt a) und nach den Schritt Züchten der transformierten Wirtszelle,
Gewinnen und gegebenenfalls Reinigen der rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, die von
der Wirtszelle exprimiert wird;
- c) Untersuchen der Fähigkeit
der in Schritt b) gewonnenen rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante,
auf ihre Fähigkeit
zur fälschlichen Übertragung
einer nicht-zugehörigen
und/oder einer nicht-kanonischen Aminosäure durch ihre zugehörige tRNA;
und
- d) Auswählen
der Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante, wenn eine nachweisbare Fehlübertragung
in Schritt c) erfolgte.
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Solche
Verfahren zur Untersuchung der Fähigkeit
der in Schritt b) gewonnenen rekombinanten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Variante,
auf ihre Fähigkeit
zur fälschlichen Übertragung
einer nicht zugehörigen und/oder
nicht-kanonischen
Aminosäure
durch ihre zugehörige
tRNA, sind beispielsweise in den folgenden Beispielen offenbart
(siehe 2B). Die dem Fachmann bekannten
Verfahren zur Untersuchung einer solchen Fähigkeit lassen sich verwenden.
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Der
Begriff "Transformation" steht für ein Verfahren
zum Einbringen fremder Moleküle,
wie DNA, in eine Zelle. Die Lipofektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion,
Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Calciumphosphatfällung, Retrovirusabgabe,
Elektroporation, natürlich
Transformation und biolistische Transformation sind nur einige dem
Fachmann bekannte Verfahren, die sich einsetzen lassen.
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Die
isolierte Nukleinsäuresequenz,
die die erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codieren,
oder Vektoren, die eine Nukleinsäure
umfassen, welche die Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert,
bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine transformierte Zelle
bereit, die eine Nukleinsäure umfasst,
welche eine erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante
codiert.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die transformierten Zellen dadurch gekennzeichnet, dass die
Nukleinsäure,
die eine erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante
codiert, in das Genom der Zelle integriert ist.
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Bei
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
sind die transformierten Zellen dadurch gekennzeichnet, dass das
Nukleinsäurefragment,
das die Substitution umfasst, die zu einer Veränderung der Korrekturfunktion
der Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante führt, durch Verwendung von Mutagenese,
wie homologe Rekombination, Austauschallel-Vektor oder durch beliebige
dem Fachmann bekannte Mutageneseverfahren zum Einbringen der Nukleinsäuremoleküle, wie
DNA, in eine Zelle, wie Lipofektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion,
Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Calciumphosphatfällung, Retrovirusabgabe,
Elektroporation, natürliche
Transformation und biolistische Transformation in das Genom der
transformierten Zellen integriert wurde.
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Die
Erfindung betrifft auch isolierte prokaryotische oder eukaryotische
Zellen, die ein Protein erzeugen können, dessen Aminosäuresequenz
mindestens eine nicht-kanonische Aminosäure umfasst, und die dadurch
gekennzeichnet sind, dass sie eine Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante
umfassen, die durch eine ihrer zugehörigen tRNAs eine nicht-kanonische
Aminosäure
oder eine andere Aminosäure
als die zugehörige
Aminosäure übertragen
kann, und dadurch dass die Nukleinsäuresequenz des Allels, das
die Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante codiert, eine Substitution
der Reste 240 bis 250 der Korrekturdomäne durch 11 aufeinander folgende
Alaninreste aufweist, verglichen mit der Sequenz des entsprechenden
Wildtypallels, wobei sich die in das Genom integrierte Mutation
auf der Korrekturstelle der Isoleucyl-tRNA-Synthetase befindet und
durch eine Mutagenesetechnik, wie genetische Rekombination, eingebracht
wurde.
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Bei
einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung auch die Verwendung
einer erfindungsgemäßen transformierten
Zelle zur Produktion von Protein, insbesondere rekombinantem Protein,
dessen Aminosäuresequenz
mindestens eine unkonventionelle Aminosäure aufweist.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen,
die eine nicht-kanonische Aminosäure
umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden
Schritte umfasst:
- a) das Züchten einer transformierten
Zelle, die ein Allel umfasst, das eine erfindungsgemäße Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante
codiert, in einem Kulturmedium, das eine nicht-kanonische Aminosäure enthält, die
von der zugehörigen
tRNA der in der Zelle vorhandenen Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante fälschlicherweise übertragen
werden kann, in einem Kulturmedium und unter Kulturbedingungen,
die das Wachstum der Zelle ermöglichen.
- b) Gewinnen und gegebenenfalls Reinigen der Proteine, die die
nicht-kanonische
Aminosäure
umfassen, aus dem Kulturmedium (Überstand)
oder aus den Zellen (Zellpellet) von Schritt a).
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Proteine,
die eine nicht-kanonische Aminosäure
umfassen, können
durch das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden.
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Die
Verfahren zur Reinigung von Protein, die natürlich oder rekombinant sein
können,
welche Herkömmlicherweise
vom Fachmann verwendet werden, setzen gewöhnlich Methoden ein, die einzeln
oder in Kombination verwendet werden wie Fraktionierung, chromatographische
Verfahren, Immunoaffinitätstechniken
mitspezifischen mono- oder polyklonalen Antikörpern, usw.
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Die
Anwesenheit einer nicht-kanonischen Aminosäure auf dem zu reinigenden
Protein, wobei die nicht-kanonische Aminosäure eine spezielle funktionelle
Gruppe haben kann, kann seine Reinigung durch selektives Umsetzen
mit dem Reinigungsträger
ohne Modifikation der Aktivität
des Proteins erleichtern.
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Von
den Proteinen, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren produziert werden
können,
lassen sich uneingeschränkt
Proteine erwähnen,
die es durch den Einbau von mindestens einer nicht-kanonischen Aminosäure ermöglichen,
dass man eine gewünschte
Aktivität
erhält,
die man mit einem Protein, dessen Sequenz nur kanonische Aminosäure enthält, nicht
erzielen kann. Der Begriff "Aktivität" soll im Allgemeinen
eine beliebige Aktivität
betreffen, wie eine physiologische Aktivität oder biologische Aktivität, selbst
partiell, die unizelluläre
oder multizelluläre
Organismen betrifft, wie beispielsweise strukturelle oder biochemische
Aktivität, beispielsweise
eine enzymatische oder antigene Aktivität, eine Aktivität des Antikörpertyps,
oder eine Aktivität, die
die biologische Aktivität
reguliert oder hemmt, oder so dass sie ihre Implementierung in einem
Verfahren zur Biosynthese oder zum biologischen Abbau chemischer
oder biochemischer Verbindungen ermöglicht.
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Von
diesen Proteinen, die sich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
herstellen lassen, können auch
Proteine erwähnt
werden, in die der Einbau von mindestens einer nicht-kanonischen
Aminosäure
derart erfolgt ist, das daraus keine wesentliche Modifikation der
biologischen Aktivität
des entsprechenden unmodifizierten Proteins resultiert. Neben der
konservierten biologischen Aktivität des entsprechenden unmodifizierten Proteins
haben diese erfindungsgemäßen Proteine
eine nicht-kanonische Aminosäure
mit spezifischen Eigenschaften, die vorteilhafterweise ausgenutzt
werden.
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Von
diesen spezifischen Eigenschaften, die von der Anwesenheit einer
nicht-kanonischen Aminosäure verliehen
werden, können
insbesondere Eigenschaften erwähnt
werden, die mit der Anwesenheit einer funktionellen Gruppe der nicht-kanonischen
Aminosäure
einher gehen, die leicht und spezifisch mit einer chemischen oder
biochemischen Verbindung unter Bedingungen reagieren kann, die es
ermöglichen,
dass die Aktivität
des Proteins nicht modifiziert wird, oder die die Modifikation der
konventionellen Aminosäuren
umgehen.
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Die
Anwesenheit dieser spezifischen funktionellen Gruppe kann vorteilhafterweise
verwendet werden, beispielsweise für:
- (i)
das Reinigen eines beliebigen Proteins, insbesondere eines rekombinanten
Proteins, das die unkonventionelle Aminosäure enthält;
- (ii) Kuppeln eines solchen Proteins an einen festen Träger;
- (iii) Kuppeln nachweisbarer Moleküle, wie spektroskopischer Sonden
verschiedener Natur, an ein solches Protein,;
- (iv) Kuppeln lipophiler oder hydrophiler Polymere, die ihre
Solubilisierung in Lösungsmitteln
ermöglichen, oder
die eine Maskierung gegenüber
der Erkennung durch Antikörper
ermöglichen,
an ein solches Protein,;
- (v) Kuppeln eines solchen Moleküls an ein Polynukleotid;
- (vi) Kuppeln eines solchen Proteins an eine chemische oder biochemische
Verbindung, deren Anwesenheit es ermöglicht, die biologische Aktivität des Proteins
zu steigern, zu senken, zu modifizieren, zu regulieren, zu fokussieren,
oder dessen biologische Verfügbarkeit
als Verbindung zur therapeutischen Verwendung zu modifizieren; oder
- (vii) permanentes Binden eines Coenzyms an ein solches Protein,
das ansonsten in Lösung
diffundieren würde.
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Ebenfalls
in der vorliegenden Erfindung aufgenommen sind die erfindungsgemäßen Verfahren,
dadurch gekennzeichnet, dass die erfindungsgemäße transformierte Zelle ein
interessierendes homologes oder heterologes Gen umfasst, deren codierende
Sequenz mindestens ein Codon aufweist, das eine Aminosäure codiert,
die durch die zugehörige
tRNA der in der transformierten Zelle befindlichen Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Variante
fälschlicherweise
von übertragen
werden kann.
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Im
Allgemeinen kann das interessierende homologe oder heterologe Gen,
das durch eine beliebige herkömmliche
Technik, wie Klonierung oder PCR (Polymerasekettenreaktion), isoliert
werden kann oder chemisch synthetisiert werden kann, aus Genen ausgewählt werden,
die ein beliebiges Protein codieren, das als therapeutische oder
kosmetische Verbindung verwendet werden kann oder als diagnostisches
Reagenz oder als Verbindung, die in einem Biosynthese- oder Bioabbauverfahren
verwendet werden kann. Das interessierende Protein kann aus einem
reifen Protein, einer Vorstufe, und insbesondere einer Vorstufe,
die sezerniert werden soll und ein Signalpeptid umfasst, einem verkürzten Protein,
einem chimären
Protein, das aus der Fusion von Sequenzen verschiedenen Ursprungs
herrührt,
oder einem mutierten Proteine bestehen, das verbesserte und/oder
modifizierte biologische Eigenschaften hat.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Produktion eines Proteins,
dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium von Schritt a) auch
die Verbindungen umfasst, die zur Induktion der Synthese des Proteins
erforderlich sind, die von dem interessierenden homologen oder heterologen
Gen codiert werden. Diese Verbindungen sind dem Fachmann geläufig und
hängen
insbesondere von der Zelle und dem ausgewählten homologen oder hetereologen
Gen ab.
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Bei
einem beliebigen Verfahren zur Veränderung der chemischen Zusammensetzung
von in vivo produzierten Proteinen, umfassend den Schritt Deaktivieren
der Korrekturfunktion einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase, ist die Aminoacyl-tRNA-Synthetase
vorzugsweise eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus der Aminoacyl-tRNA-Synthetase, deren Korrekturfunktion
einer Korrekturstelle oder -Domäne
entspricht, die von einem Abschnitt der DNA codiert wird, der die
Aminoacyl-tRNA-Synthetase codiert, vorzugsweise von einem DNA-Abschnitt
codiert wird, der zumindest konservierte Reste aufweist, im Vergleich
nach der Ausrichtung mit der Korrekturstelle der Valyl-tRNA-Synthetase
und der Isoleucyl-tRNA-Synthetase wie in der 2A gezeigt,
vorzugsweise ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus der Aminoacyl-tRNA-Synthetase, Valyl-tRNA-Synthetase,
Isoleucyl-tRNA-Synthetase, Leucyl-tRNA-Synthetase, Alanyl-tRNA-Synthetase,
Prolyl-tRNA-Synthetase, Threonyl-tRNA-Synthetase,
Phenyl-tRNA-Synthetase und Lysyl-tRNA-Synthetase, die bekanntlich
eine Korrekturstelle oder -Domäne
aufweisen (siehe für
Ile RS Baldwin, A. N. und Berg, P. (1966) J. Biol. Chem. 241, 839–845 und
Eldred, E.W. und Schimmel, P. R. (1972) J. Biol. Chem. 247, 2961–2964; für Val RS,
Fersht, A. R. und Kaethner, M. M. (1976) Biochemistry. 15 (15), 3342–3346; für Leu RS,
English, S. et al., (1986) Nucleic Acids Research. 14 (19), 7529–7539; für Ala RS,
Tsui, W.-C. und Fersht, A. R. (1981) Nucleic Acids Research. 9,
7529–7539;
für Pro
RS, Beuning, P. J. und Musier-Forsyth, K. (2000) PNAS. 97 (16),
8916–8920;
für Thr
RS, Sankaranarayanan, R. et al., (2000) Nat. Struct. Biol. 7, 461–465 und
Musier-Foryth, K. und Beuning, P.J. (2000) Nat. Struct. Biol. 7,
435–436;
für Phe
RS, Yarus, M. (1972) PNAS. 69, 1915–1919 und für Lys RS, Jakubowski, H. (1997)
Biochemistry. 36, 11077–11085.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Eine
direkte Selektion zur Wiederherstellung einer Enzymaktivität durch
Einbau von Abu konnte nicht leicht aufgebaut werden, da ihre aliphatische
Seitenkette keine chemische Reaktivität aufweist, und daher nicht
als katalytischer Rest wirken kann. Wir greifen somit auf ein indirektes
Schema auf der Basis der strukturellen Ähnlichkeit von Abu mit Cys
(1A), einem wesentlichen katalytischen Rest in
zahlreichen Enzymen, zurück.
Die Auswahl einer Synthetasemutante, die Cys durch ihre zugehörige tRNA
fälschlicherweise übertragen
hat, kann fälschlicherweise
durch die mutierte Synthetase übertragenes
Abu ergeben.
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Wir
profitieren von dem konditionalen thyA-Selektions-Screen in E. coli
auf der Basis der absoluten Erfordernis für eine aktive Thymidatsynthase,
wenn Thymidin nicht als Wachstumsfaktor bereitgestellt wird (13).
Dieser gleiche Test wurde zuvor verwendet, um die Potenz von Suppressor-Cys-tRNAs
bei falschem Codon-Lesen (14) zu bestimmen und die phänotypische
Suppression von dem nicht-kanonischen Azaleucin zu verstärken (15).
Ein vollständiger
Satz von aus Plasmiden stammenden thyA-Allelen mit sämtlichen
64 Codons an der Position 146 wurde hergestellt, um die katalytische
Stelle zu verändern,
die von einem essentiellen Cys besetzt wird (16, 17). Jedes Allel
wurde auf sein Fähigkeit
untersucht, das Wachstum eines E. coli-Stammes (dem die chromosomale
Kopie von thyA fehlt) auf Mineral-Glucosemedium in Abwesenheit von
Thymidin wiederherzustellen (14, 15). Drei der 64 aus Plasmid stammenden
thyA-Allele stellten das Wachstum wieder her. Diese hatten eines
der drei Codons UGU, UGC oder UGA. Die Wachstumsreaktionen der UGU-
und UGC-Allele wurde erwartet, da diese Cystein codieren. Die positive
Reaktion von UGA (einem Terminationscodon in E. coli) stammt wahrscheinlich
vom Durchlesen durch Cys-tRNA,
und zeigt somit die Empfindlichkeit des Selektionsassays.
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Stämme, die
inaktive thyA-Allele tragen, wurden dann untersucht, um zu bestimmen,
ob sie supprimiert werden konnten, indem sie mit überschüssigem L-Cystein in Minimalmedium
ohne Thymidin versorgt wurden. Ein geringes Wachstum wurde reproduzierbar
in L-Cystein-Gradientenplatten beobachtet (18), und zwar für die Missense-Allele
die ein beliebiges der acht Codons AUN und GUN allein haben. Das
Wachstum war stärker
bei Allelen, die eines der vier Val-Codons (GUU, GUC, GUA und GUG) trugen,
als bei denen mit den drei Ile-Codons
(AUU, AUC, und AUA) oder für
das Met-Codon AUG. Die Cystein-Suppression
der drei Ile-Codon-tragenden Allele und des Met-Codon-tragenden
Allels wurde durch Zugabe von exogenem L-Isoleucin und L-Methionin
jeweils beseitigt. Die Suppression der vier Val-Codon-tragenden
Allele wurde durch Zugabe von L-Valin plus L-Isoleucin, aber nicht
durch L-Isoleucin allein beseitigt (18). Die vier Val146-Allele
ergaben eine ähnliche
Wachstumsreaktion in Cystein-Gradientenplatten,
obwohl sie durch drei verschiedene tRNAVal-Isoakzeptoren
decodiert wurden, was somit nahe legt, dass Cys auf sämtlichen
drei Val-Isoakzeptor-tRNAs
durch ValRS fälschlicherweise übertragen
wird. Diese Ergebnisse legen zusammen nahe, dass ValRS die Bildung
von Cys-tRNAVal in vivo mit einer Rate katalysierte,
die zur aktiven Thymidylat-Synthaseproduktion hinreichte, und dass
diese falsche Übertragungsreaktion
durch Steigern der intrazellulären
Konzentration von L-Valin verhindert wurde. Diese Interpretation
stimmt mit früheren
Bereichten der Cys-Fehlaktivierung durch ValRS in vitro überein (11).
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Die
Suppression von thyA:Val146-Allelen war schwach auf Platten und
erforderte hohe L-Cystein-Konzentrationen (entwickelt von einem
Gradient, ausgehend bei einer Konzentration von 100 mM). Man kann
somit annehmen, dass eine spärliche
L-Cystein-Versorgung auf eine verstärkte Effizienz der phänotypischen Suppression
selektieren sollte. Zwei experimentelle Verfahren wurden zu diesem
Zweck durchgeführt.
In dem ersten Verfahren wurde der Stamm β5519 (thyA::erm+ ΔnrdD:: kan+
pTS13 (bla+ thyA:146GUA) über
100 Generationen in einer seriellen Flüssigkultur mit limitierendem
Cystein (1,5 mM) unter anaeroben Bedingungen vermehrt, und schließlich der
Stamm β5420
isoliert (19). Das zweite Verfahren beruhte auf einer Einschritt-Selektion
unter aeroben Bedingungen auf Platten, die eine nicht-oxidierbare
Vorstufe enthielten, die effizient durch E. coli in Cystein umgewandelt
wird (S-Carbamoyl-Cystein (Scc, 1A) (19)).
Ein Mutator-Marker (dnaQ oder mutS) wurde in den Teststamm β5519 eingebracht,
um die Frequenz über
10–10 von
Scc-supprimierbaren Thymidin-Auxotrophen zu steigern (19). Dieser
Ansatz führte
zur Isolation von vier Stämmen: β5456, β5479, β5485 und β5486. Alle
fünf isolierten
Stämme
wuchsen nicht bei 42°C,
was mit der Wärmeempfindlichkeit übereinstimmt,
die gewöhnlich
durch Translationsfehler verursacht wird (20). Der Cystein-Suppression-Phänotyp ist
für einen
dieser Stämme
(β5456)
in 1B, zusammen mit seiner Aufhebung von L-Valin (das
als Ile-Val-Peptid zugeführt
wird) gezeigt
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Aus
diesen Phänotypen
lässt sich
schließen,
dass Mutationen in dem ValS-Gen
für die
Valyl-tRNA-Synthetase für
jeden isolierten Stamm verdächtigt
wurden. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit profitierten wird
vom nrdD::kan+-Marker
(19), der sich 0,4 min von valS auf dem E. coli-Chromosom befindet.
Für die
fünf Mutanten
stellte sich heraus, dass das Merkmal der Cystein- oder Scc-supprimierbaren Thymidin-Auxotrophie
tatsächlich
mit dem nrdD::kan+-Marker in einem Anteil von 45% cotransduzierte.
Eine weitere Charakterisierung der valS-Mutationen wurde durch PCR-Amplifikation
und anschließende
Sequenzierung von fünf
nrdD::kan+-Transduktanten durchgeführt, die eine aus den fünf isolierten
Stämmen
hergeleitete Scc-supprimierbare Thymidin-Auxotrophie aufwiesen (21).
Der Tabelle 1 zufolge enthielt jede der fünf Mutanten eine einzelne Aminosäuresubstitution
an Stellen in der konservierten Korrekturdomäne (bekannt als CP1) von ValRS
(22). Die folgenden Mutationen wurden identifiziert T222P, R223H,
D230N, V276A, und K277Q. Zwei dieser Positionen (T222 und D230)
stimmen bemerkenswerterweise mit konservierten Positionen in IleRS überein,
von denen vorher gezeigt wurde, dass sie an der hydrolytischen Korrektur
von fehlacylierter Val-tRNAIle beteiligt
sind (23) (2A).
-
Tabelle
1. Mutationen des valS-Gens, selektiert durch Suppression der Thymidin-Auxotrophie von Stamm β5419 (ΔthyA::erm
+ ΔnrdD::kan
+p TS 13 (bla
+ ThyA:146
GUA).
-
ValRS
fehlaktiviert bekanntlich Thr und erzeugt Thr-tRNAVal,
die gewöhnlich
durch die ValRS-Korrektur-Aktivität (9) hydrolysiert wird. Wenn
die ValRS-Mutanten in der Tabelle 1 hinsichtlich der Korrektur gestört sind,
dann sollten Stämme,
die diese Mutationen jeweils tragen, Thr falsch in ein Protein einbauen,
und L-Threonin wird in diesen Stämmen
dann toxisch. Das Wachstum der fünf
verschiedenen valS-Stämme
wurde daher auf die Anwesenheit von L-Threonin untersucht. Alle zeigten eine
hohe Empfindlichkeit gegenüber
exogenem L-Threonin (bei 2 mM), wohingegen der Parentalstamm β5419 gegenüber L-Threonin bei allen
Konzentrationen unempfindlich war. Die Ergebnisse für den Stamm,
der das valS:T222P-Allel trägt,
sind in der 1C gezeigt.
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Der
Phänotyp
des valS:T222P-Allels legt nahe, dass das T222P-Enzym die tRNAVal fälschlicherweise mit
Thr und Cys in vivo beladen hatte. Das mutierte T222P-Enzym wurde
daher exprimiert und partiell gereinigt, so dass es direkt auf die
Fähigkeit
zur Fehlacylierung tRNAVal untersucht werden
konnte. Das gereinigte Enzym hatte die gleiche Aktivität wie das
Wildtyp-Enzym für
die Beladung mit Valin (2B, Einfügung). Das mutierte
T222P-Enzym fehlacylierte die tRNAVal fälschlicherweise
mit Thr, so dass Thr-tRNAVal erhalten wurde, wohingegen
das Wildtyp-Enzym keine nachweisbare fälschlich beladene tRNAVal aufwies (2B). Die
Fehlacylierung der tRNAVal mit Cystein wurde
ebenfalls nur durch das mutierte Enzym katalysiert.
-
Wir
nehmen an, dass die ValRS-Mutanten, die Cys fälschlicherweise einbauten,
auch Abu fälschlicherweise
einbauen. Tatsächlich
war der Stamm, der das valS:T222P-Allel auf dem Chromosom trug (β5456), empfindlich
gegenüber
Abu (1C) (wohingegen sein Wildtyp-Gegenstück dies
nicht war), was den Einbau von Abu in Reaktion auf Val-Codons nahe
legt. Vor diesem Hintergrund zeigten wir, dass Abu zur Erleichterung der
L-Valin-Auxotrophie des Δilv-Stammes CU505 beitrug,
jedoch nur in der Anwesenheit des valS:T222P-Allels (19). Das Gesamt-Zellprotein
wurde aus dem Stamm CU505 isoliert, der in der Anwesenheit von Abu
(0,2 mM) gezüchtet
wurde, und zwar in der Anwesenheit oder Abwesenheit des ValS:T222P-Allels
in der Wirtszelle. Die Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung zeigt,
dass 24% des Valins nur in dem Stamm, der das mutierte Allel trug,
durch Abu ersetzt wurde (Tabelle 2). Schließlich wurde das valinreiche
Hefeprotein AlaXp (Swissprot P53960) überexprimiert und aus den Stämmen gereinigt,
die das valS:T222P-Allel enthielten, das in der Anwesenheit von
Abu gezüchtet
wurde. Die Proteinproben wurden durch Trypsin gespalten und durch Massenspektrometrie
analysiert. Die MALDI-Analyse zeigte, dass sie bei Produktion von
AlaXp in dem Stamm, der die T222P-Mutation enthielt, ein Gemisch
aus Val und falsch eingebautem Abu enthielt (2C). Für ein gegebenes
Peptid betrug der Grad des Fehleinbaus zwischen 9,5% und 18% pro
Val-Codon. Die Sequenzierung mehrerer Abu-haltiger Peptide bestätigte, dass
Abu spezifisch in Positionen fälschlich
eingebaut wurde, die durch Val-Codons bezeichnet wurden.
-
Tabelle
2. Einbau von Abu in Zellen, die die Wildtyp- und mutierten T222P-Allele
von valS trugen. Die Kulturen des Δilv-Stammes CU505 (19) und des
isogenen Stammes β35498,
der das valS:T222P-Allel trug, wurden über Nacht in Minimalmedium
(27) mit Ile-Leu (0,3 mM) und limitierendem Valin (0,04 mM Ile-Val)
gezüchtet,
verdünnt
(1/2) und mit Ile-Val (0,02 mM) mit oder ohne Abu (0,2 mM) eingestellt.
Nach 24 Std. Wachstum wurde das Gesamtprotein folgendermaßen extrahiert.
Die Zellen wurden zuerst durch Zentrifugation geerntet und in kalter
10%iger Trichloressigsäure
(TCA, 1/2 des Kulturvolumens) gewaschen. Die Zellen wurden dann
erneut bei 4000 x g für
10 min zentrifugiert, in kaltem 10% TCA resuspendiert (1/10 des
Kulturvolumens) und wiederum zentrifugiert. Die gewaschenen Zellen
wurden in 5% TCA resuspendiert, für 30 min bei 95°C erwärmt und
zentrifugiert (4000 x g, 10 min): Der Niederschlag wurde dreimal
mit kaltem Aceton gewaschen und in 50 mM NH4HCO3 gelöst.
Die Proteine wurden in 6N HCl-0,2% Phenol bei 110°C für 20 Std.
in verschlossenen Röhrchen
hydrolysiert. Norleucin wurde als interner Standard zugegeben. Aliquote
der Hydrolysate wurden auf einem Beckman 6300 Aminosäure-Analysegerät untersucht.
Die Aminosäuren
wurde durch geeignete Standards quantifiziert und die Werte werden
im Vergleich zur Wildtyp-(WT)-Kontrolle angegeben, die kein Abu hatte.
-
-
Beispiel 2
-
Gerichtetes
Evolutionsschema. Zur Vermeidung einer Abnahme der Cystein-Konzentration
in dem Medium aufgrund von Oxidation, wurden die Selektionen unter
streng anaeroben Bedingungen durchgeführt. Die Biomasse der Zellen
in den Kulturen relativ zu der Cystein-Konzentration (gemessen als
optische Dichte bei 600 nm nach 24 Std. Wachstum bei 30°C) stieg
allmählich
vierfach an, wenn der thyA-Stamm β5366 (ΔthyA::erm+ pTS13 (bla+ thyA:146GUA))
durch serielle Überführung in
Mineral-Glucosemedium vermehrt wurde, das mit 1,5 mM Cystein angereichert
war. Eine hohe Cystein-Konzentration war erforderlich, weil die
Eingangs-Population kaum anderweitig vermehrt werden konnte. Nach
16 Inokulationen jeweils bei einer Verdünnung von 1/100 (insgesamt
etwa 100 Generationen), wurden einzelne Kolonien auf Mineral-Glucose-Platten isoliert,
die mit Thymidin angereichert waren (ein Beispiel dafür war der
bezeichnete Stamm β5520).
-
Einschritt-Selektionsschema.
Für Einschritt-Selektionen
wurde die Cystein-Oxidation unter Aerobiose und die anschließende Cystein-Präparation
aus dem Wachstumsmedium vermieden durch die Verwendung der nicht-oxidierbaren
Vorstufe S-Carbamoyl-Cystein (Scc). Scc ist eine schlechte Vorstufe
für Cystein
und verzögert
das Wachstum eines Cys-auxotrophen E. coli-Stammes weniger effizient
als Cystein. Bei Konzentrationen über 1 mM führte Scc jedoch zur Suppression
der Thymidin-Auxotrophie von Stamm β5520, wohingegen bei Fehlen
von Thymidin kein Wachstum unter 1 mM Scc nachweisbar war. Wurden β5419-Zellen,
die das thyA:Val146GUA-Allel auf einem High-Copy-Plasmid trugen,
auf Mineral-Glucose-Platten plattiert, die mit Scc (3 mM) angereichert
waren, wuchsen keine Kolonien nach einer verlängerten Inkubation bei 30°C. (Das Experiment
war derart ausgelegt, dass es eine Mutante mit einer Häufigkeit
von 10–10 nachwies.)
Zur Steigerung der Mutationsfrequenz wurde ein mutS:apc+ (33)-Mutator-Allel in
den genetischen Hintergrund von Stamm β5419 durch P1-Transduktion eingebracht,
so dass Stamm β5432
(die mutS:apc+-Disruption deaktiviert das Mismatch-Reparatur-System
und führt
zu statistischen Transitionen und Rasterverschiebungen (34)) erhalten
wurde. Die Kolonien erschienen dann auf dem gleichen Medium mit
einer Frequenz von etwa 10–8. Es wurden keine Kolonien
auf Platten gefunden, denen Scc fehlte. Eine vergleichbare Frequenz
der Scc-supprimierbaren Klone wurde nach dem Einbringen eines dnaQ-Mutator-Allels (33) durch
P1-Transduktion (33) (unter Bildung von Stamm β5435) erhalten.
-
Abu-Fehleinbau.
Der Valin-Auxotroph CU505 (33) wurde in der Anwesenheit einer limitierenden
Valin-Zufuhr und steigenden Abu-Konzentrationen
gezüchtet
(3). Die Biomasse von Zellen in Kulturen, relativ
zur Valin-Konzentration in dem Medium veränderte sich nicht bis zu einer
Abu-Konzentration
von 1 mM. Wurde dagegen das valST222P-Allel in das Chromosom eingebracht
(Stamm β5498),
wurde die Zellausbeute in der Abwesenheit von Abu verringert, aber
bis zu 30% erhöht,
wenn Abu (0,2 mM) zugegeben wurde.
-
Somit
wurden E. coli-Stämme,
die nur aufgrund der Infiltration des Val-codierenden Wegs proliferieren, ausgewählt, und
sie enthielten jeweils Mutationen, die zu einzelnen Aminosäure-Substitutionen
in der Korrekturstelle von ValRS führten. Diese Beobachtung stimmt
mit einer zentralen Rolle zur Korrektur bei der Restriktion des
genetischen Codes auf 20 Aminosäuren überein,
indem die Invasion anderer Aminosäuren, wie Abu, verhindert wird.
Die Korrekturstellen in IleRS und ValRS werden sogar in den am tiefsten
verzweigten Organismen im Lebensstammbaum tatsächlich rigoros konserviert.
Die durch die Korrektur aufrechterhaltene Translationsgenauigkeit
kann jedoch eine weitere chemische Veränderung von Proteinen verhindern.
Somit bietet die Deaktivierung der Korrekturfunktion einer Synthetase,
wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, einen leistungsfähigen Ansatz
zur Veränderung
der chemischen Zusammensetzung von in vivo erzeugten Proteinen.
-
Für einige
Synthetasen, hängt
die Genauigkeit entscheidend von einer Korrekturfunktion an einer
Stelle abseits der Aminoacylierungsstelle ab. Mutanten von Escherichia
coli, die tRNAVal fälschlicherweise mit Cystein
beladen, wurden durch statistische Mutagenese des gesamten Chromosoms
gesucht. Sämtliche
erhaltenen Mutationen befanden sich in der Korrekturstelle der Valyl-tRNA-Synthetase. Mehr
als 20% des Valins in Zellproteinen aus einem solchen Organismus
mit mutierter Korrektur konnte durch nicht-kanonisches Aminobutyrat
ersetzt werden, das dem Cystein sterisch ähnelt. Somit kann die Korrekturfunktion eine
zentrale Rolle bei der Restriktion des genetischen Codes auf 20
Aminosäuren
spielen. Die Deaktivierung dieser Korrekturfunktion bietet einen
leistungsfähigen
neuen Ansatz zur Veränderung
der chemischen Zusammensetzung von Proteinen und zur Emulierung
unklarer Evolutionsstufen der Translation.
-
Beispiel 3: Korrelation
zwischen der Toxizität
eines α-Aminobutyrates
für E.
coli-Stämme, die
verschiedene valS-Allele tragen, die in der Korrektur-Domäne mutiert
sind, und Ergebnisse der In-vitro-Korrektur-Assays, die mit den
entsprechenden ValRS-Enzymvarianten durchgeführt wurden.
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Zur
eingehenderen Untersuchung der Korrekturphänotypen der fünf vorstehend
genannten ValRS-Mutanten und der Beziehung zwischen der Zell-Überlebensfähigkeit und der Korrektur,
wurden Plasmide, die die Gene für
mutierte und Wildtyp-ValRSs enthielten, konstruiert und unter die
Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Promotors gestellt. Diese
Konstrukte wurden dann zur Untersuchung der In-vivo-Phänotypen der
mutierten Enzyme verwendet. Gesondert wurden His-markierte Versionen
der mutierten Enzyme parallel dazu konstruiert, zur Verwendung bei
der Reinigung der Enzyme für
Untersuchungen der Aminoacylierungs- und Korrektur-Aktivitäten in vitro.
-
Konstruktion
von valS-Knockout-Stämmen:
Ein 1,7 kb Abschnitt des valS-Gens aus pET16valS, der den Bereich
enthielt, der die Korrektur-Domäne
von ValRS codiert, wurde mittels SalI und XhoI ausgeschnitten. Dieser
Bereich wurden dann durch einen Kanamycin-Marker (1,2 kb Größe) aus
pUC4K durch flankierende SalI-Restriktionsstellen ersetzt. Überhängende Bereiche
des ValS-Gens von
406 bzw. 708 Basenpaaren konnten die homologe Rekombination ermöglichen
(so dass das Plasmid mit der Bezeichnung pLAN362 erhalten wurde).
Der Kanamycin-Marker enthielt seinen eigenen Promotor und wurde
in der Vorwärts-Richtung
in Bezug auf das valS-Gen eingebracht. Zur Steigerung der Menge
des liniearisierten Produktes, das zur homologen Rekombination verwendet
wurde, wurde das valS::kan aus pLAN362, mit Hilfe der Primer, die
an den T7-Promotor
und Terminator hybridisieren, durch PCR amplifiziert. Die Produkte
dieser Reaktion wurde sichtbar gemacht und in einem 1 % Agarose-TAE-Gel
gereinigt. Zur Erzielung einer Rekombination in das E. coli-Chromosom
wurde das linearisiertes valS::kan durch Elektroporation in einen
hyperrekombinanten E. coli-Stamm
(JC8679, Stewart et al.) transformiert, der aus Plasmid stammendes
valS aus Haemophilus influenzae (pSU18valS) enthielt. Die Rekombinanten
wurden auf Luria-Brühe-Agarplatten
selektiert, die mit Chloramphenicol (Stamm JC8679 ist CmR) und wenig
Kanamycin (25 μg/ml)
angereichert war, weil die Effizienz der kanR-Marker gesenkt werden
kann, wenn es in das Chromosom rekombiniert, eine Rekombinante wurde
gewählt
und als PS2838 bezeichnet. PS2838 wurde mit einem P1-Phagenausgangsmaterial
infiziert, der Phage konnte sich 3 Std. vermehren, und wurde dann
in CHC13 bei 4°C
aufbewahrt. Die Übertragung
von Genen und Resistenzmarkern erfolgte durch PI-Phagen-Transduktion
mit Hilfe der Standard-Protokolle (Miller 1972) in MG1655-Wildtyp-E.
coli, die jedes der valSpBAD-Konstrukte enthielten, die Wildtyp-ValRS,
T222P, R223H, D230N, V276A bzw. K277Q exprimieren. Die Transduktanten
wurden durch Plattieren auf Luria-Brühe-Agarplatten, die mit Kanamycin
(25 μg/ml)
und 0,2 % Arabinose angereichert waren, und Inkubieren bei 25°C für 48 Std.
selektiert. Erwartungsgemäß führte die
Transduktion des MG1655-Stammes allein nicht zum Kolonienwachstum.
Sämtliche
Transduktanten wurde erneut auf Medien ausgestrichen, die mit 50 μg/ml Kanamycin angereichert
waren, so dass kann und die Insertion des Kanamycin-Markers in das
E. coli-chromosomale valS-Gen durch Amplifikation mit einem Vorwärts-Primer,
der an einen Bereich auf dem Chromosom direkt stromaufwärts des
ValS-Gens (valS.103) hybridisierte, sowie mit einem Rückwärts-Primer,
der an den Marker selbst hybridisierte (puc4k.o14), verifiziert
wurde. Die Transduktion ergab die folgenden Stämme valS::kanR:wt ValRS-PS847,
T222P-PS2849, R223H-PS2862, D230N-PS2865, V276A-PS2851, K277Q-PS2853.
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Plasmid-Konstruktion.
Ein vorsichtiger Ansatz wurde in dieser Konstruktion aufgrund des
Fehlens von Erfolg beim vorherigen Einbringen von valS-Korrekturmutanten
verwendet. Vor diesem Hintergrund wurden die anfänglichen Konstrukte in einer
Variation von pBAD18 vorgenommen, einem Plasmid, das die genaue
Regulation der Expression unter der Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren
Promotors ermöglicht.
Das Parentalplasmid war eine Histidin-markierte valS-Konstruktion,
die von Jack Horowitz zur Verfügung
gestellt wurde, und die wir durch eine erforderliche Sequenzanalyse
als pET16b (Novagen) verifizierten. Mit einer internen Restriktionsstelle
und einer Restriktionsstelle, die sich stromabwärts des valS-Gens in der Mehrfachklonierungsstelle
vonpET16b befand, wurde ein großes
BamHI-Fragment in pUC19 (pSCO2) subkloniert. Parallel wurde das
Parentalplasmid mit SalI und BglII gespalten, d.h. Restriktionsstellen,
die den Bereich von valS flankieren, der das CPI codiert, und dieses
kleine Segment wurde in pUC19 (pSCO5) ligiert. Das QuikChange-Mutagenese-Kit
(Stratagene, La Jolla, CA) wurde auf pSCO5 verwendet, um einen A
nach C-Basenaustausch an Nukleotid 663 einzubringen, damit man die
Thr-zu-Pro-Substitution an Rest 222 von ValRS erhielt. Sowohl Wildtyp- als
auch T222P-SalI-BglII-Fragmente wurden in pSCO2 subkloniert. Die
resultierenden Vektoren wurden mit NcoI und SmaI gespalten, so dass
Fragmente des gesamten stromabwärts
befindlichen Bereichs von ValS erhalten wurden, die dann in pVDC441
kloniert wurden, einer Variation von pBAD18, worin der stromabwärts befindliche
Abschnitt von valS aus dem pET16bvalS-Plasmid mittels EcoRI und
KpnI kloniert wurde. Das His-markierte T222P-Konstrukt wurde durch
Subklonieren des mutierten Bereichs von valS (DraIII/XhoI) aus pVDC447
und Ligieren in pET16bvalS konstruiert. Die Wildtyp-valS-Konstrukte,
pBAD18valS und pET16bvalS wurden schließlich als Matrizen in dem QuickChange-Mutagenese-Protokoll
zur Erzeugung von Mutanten verwendet, die den Mutanten R223H, D230N,
V276A und K277Q entsprechen. Das gesamte valS-Gen für diese Vektoren
wurde dann auf jede dieser Vektoren untersucht, um ihre Integrität zu verifizieren.
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Mutanten-Toxizitäts-Reaktion
auf hohe Mengen von α-Aminobutyrat: ΔvalS::kan+-Stämme, die
Wildtyp-ValRS, T222P, R223H, D230N, V276A und K277Q exprimieren,
wurden jeweils auf Standard-Mineralmedium (MS) (Richaud et al.,
1993), angereichert mit 0,2% Glycerin, 0,02% Arabinose und Ampicillin
(100 μg/ml) isoliert.
Einzelne Kolonien aus jedem Stamm wurden in Flüssigkulturen der gleichen Medien-Zusammensetzung überimpft
und bis zur Sättigung
gezüchtet.
Die Zellen wurden in Medien 1:100 verdünnt, und ein Zellrasen wurde
auf MS-Mediumplatten ausgestrichen und trocknen gelassen. α-Aminobutyrat (50 μl von 0,1
M) wurde zu einer zentralen Vertiefung gegeben, die in jeder Platte
erzeugt wurde, und die Platten wurden dann für 24 Std. bei 42°C inkubiert.
Die relative Reaktion jedes Stammes auf hohe Spiegel nicht zugehöriges α-Aminobutyrat
konnte dann auf der Basis des Durchmessers des Toxizitäts-Halos
beobachtet werden.
-
Expression
und Reinigung der ValRS-Proteine: pET16b-Plasmide, die dem Wildtyp-ValRS
und jeder der ValRS-Mutanten entsprechen, wurden in kompetente BL21-Zellen
(Novagen) überführt. Diese
Zellen wurden in 250 ml Luria-Brühe
gezüchtet,
welche mit Ampicillin (100 μg/ml)
angereichert war, wenn die Zellen eine optische Dichte bei 600 mit
von 1,0 erreichten, wurde die ValRS-Expression mit 1 mM IPTG für 5 Std.
induziert. Die Zellen wurden dann bei –80°C bis zur Reinigung aufbewahrt.
Die Zellen wurden dann resuspendiert (50 mM Na2PO4, 300 mM NaCl, 50 mM B-ME, 30 mM Imidazol
pH-Wert 7,4) und 2x in einer French-Press lysiert. Die Lysate wurden
an eine Ni-NTA-Affinitäts-Säule gebunden
und in Lyse-Puffer mit einem Gradient eluiert, der von 30 mM bis
250 mM Imidazol reichte. Die gesammelten Fraktionen wurden auf einem
8% SDS-Polyacrylamidgel
sichtbar gemacht, das mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt wurde,
so dass Reinheit gewährleistet war,
die reinsten Fraktionen wurden gesammelt und in 25 mM Tris-HCl,
1 mM B-ME pH-Wert 7,5, dialysiert. Die Enzym-Konzentrationen wurden
mit dem Bradford-Assay bestimmt.
-
Aminoacylierungs-Tests,
Fehlacylierung und Deacylierung: Die Aminoacylierungsassays wurden
bei 37°C
in einem 100 μl
Volumen durchgeführt, das
Puffer (20 mM HEPES, 0,1 mM EDTA-Dinatrium-Salz, 0,15 M NH4Cl, 10 μg/ml
BSA pH-Wert 7,5), 2 μM
MgCl2, 0,7 μM [3H]Val,
20 μM kaltes
Val, 2 μM
tRNAval (Sigma) und 20 nM ValRS-Enzym (angepasst
von Hendrickson et al., 2000) enthielt. Aliquots (10 μl) des Reaktionsgemischs
wurden mit Trichloressigsäure
gefällt,
und das Ausmaß der
Aminoacylierung der tRNA wurde durch Szintillationszählung bestimmt.
Die Fehlacylierung von Thr auf tRNAval wurde
unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, außer, dass Val durch 5,86 μM [3H]Thr in der Reaktion ersetzt wurde. Zur
Untersuchung der Deacylierungsraten für diese Enzyme war es nötig, [3H]Thr-tRNAval zu
erzeugen. Dies erfolgte mittels ValRS mit der vorher gereinigten
T222P-Substitution, (Döring
et al., 2001), dieses Enzym bildet den [3H]Thr-tRNAval-Komplex. Das Enzym wurde mit 2,5 μM tRNAval und 45 μM [3H]Thr
für 45
min bei 37°C
inkubiert, zweimal in Phenol:Chloroform extrahiert und mit Ethanol
gefällt.
Das Pellet wurden in 100 μl
sterilem H2O gelöst, und das Szintillationszählen erfolgte
zur Bestimmung des Reaktionserfolges. Die Deacylierungsreaktionen,
die für
jedes Enzym im Dreifachansatz erfolgten, erfolgten in 150 mN Tris-HCl
(pH-Wert 7,5), 100 μl/ml
BSA, 10 mM MgCl2. Bei Raumtemperatur wurden
2 nM Enzym mit [3H]Thr-tRNAval bei
3, 6, 9, 16 und 30 min vereinigt. Aliquots (9 μl) des Reaktionsgemischs wurden
mit Trichloressigsäure
gefällt,
und die Menge an fehlaminoacylierter [3H]Thr-tRNAval, das in der Probe verblieb, wurde durch
Szintillationszählung
bestimmt, wobei A eine Kontrollreaktion ohne Enzym zur Bereitstellung
eines Referenzpunktes aufgenommen wurde.
-
Wenn
der Prozentsatz der Thr-tRNAVal, die durch
jedes Enzym in Deacylierungs-Assays in vitro hydrolysiert wurde,
verglichen wurde mit den beobachteten Abu-induzierten Hemmzonen-Durchmessern
in vivo, wurde ein Muster klar (5). Die
T222P- und K277Q-ValRS-Proteinmutanten haben die schwersten Defekte, beispielsweise
bei der Deacylierung der Thr-tRNAVal in
vitro. Stämme,
die diese Mutationen tragen, zeigen eine toxische Reaktion auf nur
leicht erhöhte
Abu-Spiegel in vivo. Diese beiden Enzyme reicherten auch hohe Menge
an fälschlicherweise übertragener
Thr-tRNAVal in vitro an. Die D230N-Mutation
scheint weniger schädlich für die Deacylase-Aktivität zu sein,
und weist eine langsamere Deacylierungsrate auf. Entsprechend wurde
die Toxizität
in vivo auf Zwischenmengen von Abu eingeschränkt. Die V276A-Mutation scheint
die kleinste toxische Reaktion auf exogenes Abu zu verleihen. Dieser
Phänotyp
wird durch eine Deacylierungsrate reflektiert, die näher am Wildtyp-ValRS
ist als die anderen Enzymmutanten. Sowohl D230N als auch V276A-ValRS
zeigten auch niedrige Mengen von Falschübertragung in Bezug auf die
anderen Enzymmutanten. Somit korrelierte die Fähigkeit der Enzymmutanten zur
Hydrolyse der in vitro fehlaminoacylierten Aminosäuren aus
tRNAVal mit der Toxizität in vivo von exogenen nicht-zugehörigen Aminosäuren, die
zu Zellen gegeben wurden, die die gleichen Mutationen in ihren ValRS
tragen.
-
Beispiel 4: Konstruktion
von E. coli, welcher eine Isoleucyl-tRNA-Synthetase-Mutante exprimiert,
deren Korrekturstelle mutiert ist.
-
Mehrere
Untersuchungen identifizierten die Korrekturdomäne von IleRS (Schmidt und Schimmel, 1004,
Science) und insbesondere die Aminosäuren der 240 bis 250-Region,
die in der IleRS-Sequenz verschiedener Organismen sehr stark konserviert
ist. Punktmutationen in diesem Bereich erzeugen Enzyme, die hinsichtlich
ihrer Korrekturfunktion partiell oder vollständig defizient sind (Hendrickson,
2000). Ein künstliches Allel
des Gens ileS, das die Isoleucyl-tRNA-Synthetase aus E. coli codiert, die
eine Folge feiner Reste aufweist, die die Reste 240 bis 250 ersetzen,
wurde folgendermaßen
konstruiert: das pVDC433 (Hendrickson et al., 2001), hergeleitet
von Plasmid pBAD (Guzman et al., 1995) durch Insertion des Wildtyp-IleS-Gens
wird durch Restriktionsenzyme ClaI und SpeI gemäß den Herstellerangaben gespalten,
so dass die Nukleotide 717 bis 750 des Gens eliminiert wurden. Die
5'-phosphorylierten
Oligonukleotide (Invitrogen Life Technologies)
5'pCTAGTAATCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCGCGCAATAT
und
5'pCGATATTGCGCGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGATTA
werden
hybridisiert und mit dem Plasmid pVDC433 ligiert, das vorher durch
SlaI und SpeI unter den folgenden Bedingungen gespalten wurde: 0,3
pmol Vektor und 3 pmol jedes Oligonukleotids werden für 10 min
bei 70°C inkubiert,
nach dem Fällen
und Resuspendieren in 10 μl
H2O, nach der Rückstellen auf Raumtemperatur
wurde die Ligation gemäß Standard-Protokollen
durchgeführt.
Das Ligationsgemisch wird zur Transformation kompetenter Zellen
des SureTM-Stammes (Stratagen) durch Elektroporation
nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Transformanten werden
erhalten und Plasmid-DNA hergestellt (Qiaprep-Kit, Qiagen). Das derart
erhaltene Plasmid pTLH 33 wird sequenziert und die Insertion von
11 Alanin-Codons verifiziert.
-
Das
pTLH33-Plasmid wird in den Wildtyp E. coli-Stamm MG1655 eingebracht,
so dass PS2419 erhalten wird. Das Allel, erhalten durch Deletion
des ileS-Gens, deltaile S203::kan, aus Stamm IQ839 (Shiba und Schimmel,
1992) wird in den Stamm PS2419 durch P1-Transduktion gemäß dem Standard-Protokoll
(Miller, 1972) eingebracht, und eine Transduktante, Stamm PS2449,
wird in reichem Medium erhalten, das mit Kanamycin (25 mg/l) und
Arabinose (0,02%) angereichert ist. Auf die gleiche Weise wird der
Stamm PS2306 durch Insertion des Plasmids pVDC433 in Stamm MG1655
(resultierender Stamm: PS27752) und P1-Transduktion des Allels ileS203::kan
in Stamm PS2752 konstruiert. Das Wachstum der beiden im ileS-Locus
deletierten Stämme,
PS2306 und PS2499, erfordert die Anwesenheit von Arabinose, was
die kontrollierte Expression des Wildtyp-ileS-Gens (Plasmid PVDC433,
Stamm PS2306) bzw. des mutierten Gens iles ala 11 (Plasmid pTLH33, Stamm
PS2449) zeigt.
-
Beispiel 5: Empfindlichkeit
der Isoleucyl-tRNA-Synthetase gegenüber nicht-kanonischen Aminosäuren.
-
Die
Stämme
PS2306 und PS2449 werden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber künstlichen
Aminosäuren
untersucht, die eine sterische Ähnlichkeit
zu Isoleucin aufweisen. Die Zellen werden in MS-Minimalmedium, Succinat
(0,2%), Arabinose (0,2%) für
24 Std. bei 37°C
gezüchtet,
und bei 1/250 in MS-Mineralmedium verdünnt. 0,5
ml dieser Zellsuspension werden auf einer Petrischale mit 25 ml
MS-Medium, angereichert mit Succinat (0,2%) und Arabinose (0,2%),
ausgestrichen. Eine Vertiefung wird dann in der Mitte der Schale
hergestellt und mit 0,1 ml einer Aminosäure-Lösung gefüllt:
- 1)
25 mM S-Methylcystein
- 2) 25 mM Homocystein
- 3) 25 mM o-Methyl-L-serin
- 4) 25 mM Norleucin
- 5) 25 mM Norvalin
-
Die
Petrischalen werden dann bei 37°C
für 24
Std. inkubiert, und das Erscheinen einer Hemmzone um die Vertiefung
wird aufgezeichnet. Die Durchmesser der Zonen des abgeschwächten Wachstums
wurden folgendermaßen
gemessen.
-
-
Alle
5 untersuchten nicht-kanonischen Aminosäuren hemmen das Wachstum der
beiden Stämme,
jedoch wird nicht vermerkt, dass in allen Fällen eine stärkere Hemmung
des Stamms vorliegt, der das mutierte Allel des ileS-Gens in der
Korrekturstelle exprimiert. Somit scheint die mutierte Isoleucyl-tRNA-Synthetase eine erhöhte Spezifität für die Substrat-Aminosäure zu haben,
die die tRNAile mit nicht natürlichen
Aminosäuren
beladen.
-
Beispiel 6: Biochemische
Charakterisierung der IleRS240-250-Ala-Mutante
-
Die
Wildtyp- und mutierten IleRS-Enzyme wurden aus den Stämmen PS2306
und PS2449 durch Chromatographie gereinigt, wobei das von Hendrickson
et al. (2002) beschriebene Verfahren verwendet wurde. Ile-tRNA,
die mit der Aminosäure
Val beladen war (Val-t-RNAIle) kann in großer Menge erzeugt werden, indem
die Korrekturmutante IleRS T242P verwendet wurde (Hendrickson, 2000).
Die Verwendung dieser Val-tRNA/Ile ermöglicht die Untersuchung der
Deacylierungsaktivität
verschiedener Enzyme mit dem von Hendrickson, 2000 beschriebenen
Protokoll. Die in der 4 gezeigten erhaltenen Ergebnisse
zeigen eindeutig, dass die Deacylierungsfunktion der Val-tRNA-Ile bei der
IleRS240-250-Mutante defizient ist.
-
Literatur und Bemerkungen
-
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Acad. Sci. U.S.A 85, 1472–6
(1988).
- 17. Die 64 Allele von thyA mit verschiedenen Codons an der Position
146 der codierenden Sequenz wurde folgendermaßen konstruiert. Zuerst wurde
eine einzelne NheI-Stelle durch eine G429->A Substitution in den thyA codierenden
Bereich durch stellengerichtete Mutagenese (24) von Plasmid pTSO
(14) eingebracht, so dass das Plasmid pTSO1 erhalten wurde. Die
Oligonukleotide THY1 (5'-CTGGATAAAATGGCGCTAGCACCGTGCCATGCATTC-3') und THY2 (5'-TCTGCCACATAGAACTGGAAGAATGCATGGCACGGT-3') wurden für diese
Mutation verwendet, die den Sinn des so mutierten Codons bewahrten.
Plasmid pTSO1 wurde dann mit NheI und NsiI gespalten, um aus dem
thyA codierenden Bereich ein 18 bp Fragment mit dem Codon 146 (UGC)
zu entfernen. Alle 64 Oligonukleotide der thyA codierenden Sequenz
von den Nukleotiden 427 bis 444 und die 64 Oligonukleotides der
partiellen reversen Sequenz wurden konstruiert (GENAXIS Biotechnology, Montigny
le Bretonneux, Frankriech). Die 64 Paare komplementärer Oligonukleotide
wurden hybridisiert und mit dem gespaltenen Plasmid pTSO1 ligiert.
- 18. Cysteingradientenplatten wurden wie in der Legende von 1B beschrieben
angefertigt. Die Wirkungen von L-Valin allein konnten nicht direkt
untersucht werden, weil exogenes L-Valin bekanntlich das Wachstum von
E. coli K12 in Minimalmedium hemmt (25). Diese Hemmung wird verringert,
wenn auch L-Isoleucin
zugeführt
wird. Somit wurde das Ile-Val-Dipeptid als Valinquelle verwendet,
weil dieses Dipeptid über
die Zellmembran transportiert wird, und in Isoleucin und Valein
abgebaut wird (26).
- 19. V. Döring,
et al., Ergänzende
Daten finden sich auf der Science Website.
- 20. M. J. Pine, Antimicrobio. Agents Chemother. 13, 676–85 (1978).
- 21. Chromosomale DNA aus E. coli wurde mit einem DNeasy Tissue
Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) gemäß den Herstellerangaben extrahiert.
PCR zur Amplifikation des valS-Gens wurde folgendermaßen durchgeführt: Denaturation
bei 94°C
für 3 min,
gefolgt von 30 Zyklen 30 sec bei 94°C, Hybridisierung 57°C für 30 sec,
und Primerextension bei 72°C
für 200
sec. Der letzte Schritt war eine Primerextension bei 72°C für 600 sec.
Die Reaktion erfolgte mit 2 Einheiten Vent DNA Polymerase (New England
Biolabs, Beverly, MA) und 100 ng chromosomaler DNA in einem 100 μl Reaktionsgemisch.
Es wurden die folgenden Primer verwendet: VAL1 (5'-GGGGAATTCGGTGTGTGAAATTGCCGCAGAACG-3'), und VAL2 (5'-GGCAAGCTTTCAGGTATTTGCTGCCCAGATCGA-3'). Zwei unabhängige PCR-Amplifikationsprodukte
jeder Mutante wurden sequenziert (GENAXIS Biotechnology, Montigny
le Bretonneux, Frankreich).
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Allele (Gabe von J. Shapiro, University of Chicago, IL); CU505 (Δ (ilvE-ilvC)2049
leu455 galT1 IN(rrnD-rrnE)1)
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