DE69333954T2

DE69333954T2 - An der streptogramin biosynthese beteiligte polypeptide, ihre kodierenden nukleotidsequenzen und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69333954T2
Application number: DE69333954T
Authority: DE
Inventors: Veronique Blanc; Francis Blanche; Joel Crouzet; Nathalie Jacques; Patricia Lacroix; Denis Thibaut; Monique Zagorec; Valerie De Crecy-Lagarde; Laurent Debussche
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1992-09-25
Filing date: 1993-09-25
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2013-09-26
Also published as: US6171846B1; FI951403A; CA2145523C; AU4823993A; JPH08501696A; WO1994008014A1; DK0662134T3; DE69333954D1; ES2253737T3; KR100359226B1; MX9305913A; FR2696189B1; NZ256053A; AU6189198A; EP0662134A1; CA2145523A1; AU692138B2; TW570978B; ATE314477T1; EP0662134B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide, die bei der Biosynthese der Streptogramine beteiligt sind und umfasst auch die Isolierung und Identifizierung von Genen der Biosynthese der Bestandteile A und B der Streptogramine, die Expression dieser Gene mit dem Ziel, die Produktionsraten zu erhöhen, und ihre Verwendung zur Konstruktion von blockierten Mutanten, die zur Synthese von neuen Antibiotika oder zu Formen, die von Streptograminen abgeleitet sind, führen können.
Die Streptogramine bilden eine homogene Gruppe von Antibiotika, die aus einer Kombination von zwei Molekültypen bestehen, die chemisch unterschiedlich sind; einerseits mehrfach ungesättigte Makrolactone (Komponenten bzw. Bestandteile der Gruppe A, für die zwei Strukturbeispiele in 1 gezeigt sind) und andererseits Depsipeptide (Komponenten der Gruppe B, für die drei Strukturbeispiele in 2 gezeigt sind). Diese Gruppe umfasst zahlreiche Antibiotika (siehe Tabelle 1 und 3), die in Abhängigkeit von ihrem Ursprung unter verschiedenen Namen bekannt sind, unter diesen Pristinamycine, Mikamycine, Virginiamycine (für eine Übersicht siehe Cocito, 1979, 1983).
Die Bestandteile A und B haben eine synergetische antibakterielle Aktivität, die das 100-Fache derjenigen der getrennten Komponenten erreichen kann und die im Gegensatz zu der jeder Komponente bakterizid ist (Cocito, 1979). Diese Aktivität ist ganz besonders gegen die Gram-positiven Bakterien wie die Staphylokokken und Streptokokken wirksam (Cocito, 1979, Videau, 1982). Die Komponenten A und B inhibieren die Proteinsynthese, indem sie sich an die Untereinheit 50 S des Ribosoms binden (Cocit, 1979; für eine Übersicht siehe Di Giambattista et al., 1989).
Die Streptogramine werden im Wesentlichen von den Actinomycetes, unter diesen zahlreiche Streptomycetes, präsentiert, die in Tabelle 1 angegeben sind. Außerdem werden die Streptogramine auch durch Eukaryoten wie Micromonospora produziert, die die Vernamycine synthetisieren. Die Actinomyceten bilden eine sehr interessante Gruppe von Mikroorganismen, und zwar aufgrund der wichtigen Menge an sekundären Metaboliten, die sie produzieren, unter ihnen zahlreiche Antibiotika (β-Lactame, Tetracycline, Macrolide, Aminoglycoside, Polyacetate usw.), Herbizide, Antikrebsmittel, Fungizide, Immunmodulatoren, Inhibitoren von Enzymen. Zahlreiche Biosynthesewege, die Antibiotika betreffen, die zu den verschiedenen Klassen gehören, wie auch andere sekundäre Metaboliten wie Pigmente (für eine Übersicht siehe Chater, 1990), wurden bis heute schon an den Aktinomyceten untersucht. Ein wichtiger Aspekt dieser Bakteriengruppe ist der, dass die in einem selben Biosyntheseweg implizierten Gene, Strukturgene, aber auch Gen(e) für Resistenz und Gen(e) für die Regulation physisch auf dem Chromosom gruppiert sind und Cluster bilden, die über 100 kb erreichen können (Hopwood et al., 1986a, Hopwood et al., 1986b, Hallam et al., 1988, Anzai et al., 1987, Ohnuki et al., 1985). Bis heute hat kein Beispiel dieser Feststellung widersprochen. Eine derartige strukturelle Organisation bietet ein wichtiges Interesse bei der Entwicklung von Klonierungsstrategien der Biosynthesegene. In der Tat ist es möglich, ausgehend von einem vorher durch verschiedene Techniken klonierten einzigen Gen, Biosynthesegen, Resistenzgen oder Regulierungsgen die Länge des Chromosoms abzugehen und so die Gesamtheit der Gene des Biosyntheseclusters zu isolieren.
Die Kenntnis der Biosynthesewege jeder der Komponenten der Streptogramine ist derzeit nur partiell, allerdings wurde der Ursprung verschiedener Teile jedes Moleküls durch radioaktive Markierung identifiziert (Kingston et al., 1983). So werden die Komponenten des Typs A von zwei Regionen gebildet, die aus der Kondensation von Acetaten und mehreren Aminosäuren wie z.B. Serin, Glycin stammen. Was die Komponenten des Typs B betrifft, so haben Untersuchungen gezeigt, dass alle Aminosäuren, die in der Peptidkette vorliegen, von natürlichen Aminosäuren stammen (Hook und Vining, 1973). Jedenfalls wurde kein Polypeptid, das bei diesen Wegen beteiligt ist, bis heute in ausreichender Menge gereinigt, um seine molekulare Charakterisierung zu ermöglichen, und kein Biosynthesegen wurde beschrieben. Im Verfahren der Biosynthese der Komponenten des Typs B können zwei Teile unterschieden werden:

1) Synthese von Vorstufen oder ihren Analoga des Makrozyklus: 3-Hydroxypicolinsäure, L-2-Aminobuttersäure, p-Dimethylamino-L-phenylalanin, 4-Oxo-L-pipecolinsäure, L-Phenylglycin.
2) Bildung des Makrozyklus ausgehend von den oben genannten Vorläufern, von L-Threonin und L-Prolin oder ihren Analoga, gegebenenfalls mit Modifikation dieser Vorläufer oder Peptid-N-Methylierung.

Bis heute wurde der metabolische wahrscheinliche Ursprung der Vorläufer des Makrozyklus der Komponenten des Typs B durch Untersuchungen bestimmt, die markierte Isotope verwenden (Reed et al., 1986, Molinero et al., 1989, Reed et al., 1989).
Die vorliegende Erfindung resultiert aus der Reinigung von Polypeptiden, die in die Biosynthese der Streptogramine eingreifen, sowie der Klonierung von Genen, deren Produkt in die Biosynthese der Streptogramine eingreift. Der Ausdruck Biosynthese der Streptogramine soll die regulatorischen Gene und die Gene, die Resistenz gegenüber den Produzenten-Mikroorganismen verleihen, umfassen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es demnach, die Produktionsraten dieser Metabolite dank DNA-Rekombinationstechniken zu erhöhen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht auf der Möglichkeit, durch Konstruktion von blockierten Mutanten in den verschiedenen Stufen dieser Biosynthese Synthesezwischenprodukte von jeder der zwei Komponenten zu produzieren. Diese Zwischenprodukte können als Substrate für neue Modifikationen auf chemischem, biochemischem, enzymatischem oder mikrobiologischem Weg dienen. Darüber hinaus erlaubt die Isolierung der Biosynthesegene durch Transfer von Genen zwischen Produzentenstämmen, Hybridantibiotika herzustellen, die pharmakologisch interessante Eigenschaften haben (Hopwood et al., 1985a, Hopwood et al., 1985b, Hutchinson et al., 1989). Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert auf der Tatsache, dass sie zu einem besseren Verständnis der Biosynthesewege der Metaboliten beiträgt, die als Streptogramine klassifiziert werden. In der Tat erlaubt die Erfindung es, Bakterien- oder Pilzstämme zu konstruieren, in denen man unter der Kontrolle geeigneter Expressionssignale ein Protein oder mehrere Proteine exprimiert, die bei der Biosynthese der Streptogramine eingreifen. Solche Stämme können auch zur Verwirklichung von Biokonversionen eingesetzt werden. Diese Biokonversionen können entweder mit Hilfe ganzer Zellen oder mit Hilfe von Zellextrakten der genannten Zellen erfolgen. Diese Biokonversionen können es erlauben, ein Streptogramin mit einem Enzym eines Biosynthesewegs in eine Derivatform überzuführen. Beispielsweise kann Pristinamycin IIB auf diese Weise in Pristinamycin IIA transformiert werden. Dieselbe Überlegung kann auf jedes Biosynthesezwischenprodukt angewendet werden.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft demnach eine Nucleotidsequenz, die für ein an der Biosynthese der Streptogramine beteiligtes Polypeptid codiert.
Genauer ausgedrückt, mehrere Gene, deren Produkt in die Biosynthese der Streptogramine eingreift, wurden ausgehend von Streptomyces pristinaespiralis isoliert. Die durch diesen Stamm produzierten Streptogramine werden allgemeiner mit dem Ausdruck "Pristinamycine" bezeichnet (siehe Tabelle 1), daher wird in einigen Fällen auf die Biosynthese der Pristinamycine Bezug genommen. Allerdings ist es klar, dass die erhaltenen Resultate sich auf die Gesamtheit der Streptogramine beziehen. Pristinamycin I und II entsprechen den Komponente bzw. Bestandteilen B und A der Streptogramine. Die Moleküle der Familie der Pristinamycine II und der Familie der Pristinamycine I bezeichnen demnach im Folgenden die Komponenten A und B der Streptogramine.
Die vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere die Isolierung und die Charakterisierung der Gene snaA, snaB, snaC, snaD, papA, papM, samS, snbA, snbC, snbD, snbE und snbR. Diese Gene wurden ausgehend von einer genomischen DNA-Bank von S. pristinaespiralis isoliert. Diese Bank wurde durch partiellen Verdau der genomischen DNA von S. pristinaespiralis durch das Restriktionsenzym Sau3A erhalten. Große DNA-Fragmente mit durchschnittlich 40 bis 50 kb wurden in das Cosmid pHC79 kloniert (B. Hohn und J. F. Collins, 1980). Nach einer in vitro-Einkapselung wurden die E. coli-Stämme HB101 (Boyer und Roulland-Dussoix, 1969) und DH1 (Low, 1968) transfiziert. Die DNA-Bank von S. pristinaespiralis befindet sich somit in den zwei verschiedenen E. coli-Stämmen.
Die Gene snaA, snaB und samS (ursprünglich snaC genannt) liegen auf dem Cosmid pIBV1 vor (4). Das Produkt der Gene snaA und snaB, das dem Polypeptid SnaA und SnaB entspricht, greift in der letzten Stufe der Biosynthese der Komponente II der Pristinamycine ein (Umwandlung von Pristinamycin IIB in Pristinamycin IIA), was der Oxidation der 2,3-Bindung des D-Prolins entspricht. Diese zwei Polypeptide bilden die zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthese, deren Reinigung in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird. Das Produkt des Gens samS greift in die Synthese des SAM (Donor für Methylgruppen), ausgehend von ATP und Methionin, ein. Die Komponente A der meisten Streptogramine ist in der Tat in C-4 methyliert (1), und es wurde beschrieben (Kingston et al., 1983), dass dieses Methyl vom Methyl des Methionins sehr wahrscheinlich über eine Methylierungsreaktion mit SAM stammt. Das Gen samS würde demnach für eine SAM-Synthase codieren (SamS; EC. 25.1.6), die für den Biosyntheseweg der Pristinamycine spezifisch ist.
Die Gene snbA, snbR, papA und papM sind auf dem Cosmid pIBV2 vorhanden (5). Das Gen snbA entspricht nach den in Beispiel 5 präsentierten biochemischen Untersuchungen der ersten Stufe der Synthese der Pristinamycine I. Dabei handelt es sich um die Aktivierung der primären Säure der Kette, 3-Hydroxypicolinsäure, durch Adenylierung. Das Gen snbR könnte in den Transport der Moleküle der Familie der Pristinamycine I (sogar der Pristinamycine II) außerhalb der Zelle nach Synthese eingreifen, wodurch dem Produzentenstamm Resistenz gegenüber dieser Komponente verliehen wird. Das Gen papA entspricht nach den Sequenzanalysen (Beispiel 8.8) und der Untersuchung einer Mutante, die in diesem Gen eine Disruption hat (Beispiel 9.3.), einem Biosynthesegen für para-Aminophenylalanin, ausgehend von Chorismat. Das para-Aminophenylalanin wird dann durch das Produkt des Gens papM, einer in der vorliegenden Erfindung beschriebene N-Methyltransferase, dimethyliert, um para-Dimethylaminophenylalanin zu bilden, das dann in das Pristinamycin eingebaut wird. Die Gene papA und papM sind demnach in der Synthese einer der Vorläufer des Pristinamycin IA beteiligt.
Die Gene snaA, snaD, snbC, snbD und snbE liegen auf dem Cosmid pIBV3 vor (6), das an das Cosmid pIBV1 angrenzt, auf dem das Gen snaA bereits vorhanden ist. Das Gen snaD codiert nach der Analyse seiner Sequenz (Beispiel 8.9.) und Untersuchung einer Mutanten, die in diesem Gen disruptiert ist, (Beispiel 9.5.), für eine Peptidsynthase, die an der Biosynthese des Pristinamycin II beteiligt ist. Das Gen snbC, dessen Produkt in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, interveniert beim Einbau der Reste Threonin und Amninobuttersäure in die Peptidkette des Pristinamycin IA. Das Gen snbD, dessen Produkt ebenfalls in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, ist beim Einbau der Reste Prolin und para-Dimethylaminophenylalanin in die Peptidkette des Pristinamycin IA impliziert. Es lenkt auch die N-Methylierung der Peptidbindung zwischen diesen zwei Resten. Schließlich greift das Gen SnbE, dessen Produkt auch in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, in den Einbau der zwei letzten Reste des Pristinamycin IA, das heißt Phenylglycin und 4-Oxopipecolinsäure, ein.
Das Gen snaC ist auf dem Cosmid pIBV4 vorhanden (7). Es codiert für eine FMN:NADH-Oxidoreduktase, auch FMN-Reduktase genannt, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird und die für die Pristinamycin IIA-Synthase das FMNH₂, ausgehend von FMN und NADH, liefert. Das Gen snaC greift in der letzten Stufe der Biosynthese des Pristinamycin IIA ein.
Diese verschiedenen Gene wurden ausgehend von ihrem Ursprungscosmid subkloniert und ihre Nucleinsäuresequenzen wurden bestimmt. Die Gene snaA, snaB und samS wurden auf ein BamHI-BamHI-Fragment mit 6 kb subkloniert, von dem ein Teil sequenziert wurde (SEQ ID NO: 1). Das Gen snbA wurde in ein EcoRI-BglII-Fragment mit 5,5 kb subkloniert, von dem ein Teil sequenziert wurde (SEQ ID NO: 5). Das Gen snbR wurde in ein BglII-BglII-Fragment mit 4,6 kb subkloniert, von dem ein Teil sequenziert wurde (SEQ ID NO: 6). Ein Teil des Gens papA wurde in ein XhoI-XhoI-Fragment mit 3,4 kb subkloniert, von dem ein Teil sequenziert wurde (SEQ ID NO: 9). Das Gen papM wurde in ein PstI-PstI-Fragment mit 4,1 kb subkloniert, von dem ein Teil sequenziert wurde (SEQ ID NO: 10). Ein Teil des Gens snaD wurde in ein BamHI-SstI-Fragment mit 1,5 kb subkloniert, von dem ein Teil sequenziert wurde (SEQ ID NO: 8). Ein Teil des Gens snbC wurde in ein SphI-SphI-Fragment mit 6,2 kb subkloniert, von dem zwei Regionen sequenziert wurden (SEQ ID NO: 11 und 12). Ein Teil des Gens snbD wurde in ein SphI-SphI-Fragment mit 8,4 kb subkloniert, von dem zwei Regionen sequenziert wurden (SEQ ID NO. 13 und 14). Ein Teil des Gens snbE wurde in ein SphI-SphI-Fragment mit 6,6 kb subkloniert, von dem zwei Regionen sequenziert wurden (SEQ ID NO: 15 und 16). Das Gen snaC wurde in ein BamHI-BamHI mit 4 kb subkloniert, von dem ein Teil sequenziert wurde (SEQ ID NO: 7).
Die Proximität der Gene snaA, snaB, snaD, samS, snbC, snbD und snbE einerseits sowie der Gene snbA, snbR, papA und papM bestätigt die Lokalisierung der Gene der Biosynthese der Komponenten A und B der Streptogramine in Clustern. Darüber hinaus sind die in der vorliegenden Erfindung beschriebene 4 Cosmide in einer Region des Chromosoms einer Größe von 200 kb durch Elektrophorese in gepulstem Feld regruppiert, und zwar als 3% des Gesamtgenoms (7500 kb) von Streptomyces pristinaespiralis (Beispiel 13). Es ist demnach offensichtlich, dass die Regionen, die die in der vorliegenden Erfindung identifizierten Gene (snaA, snaB, snaD, samS, snbC, snbD und snbE; snbA, snbR, papA und papM; snaC) umgeben, die anderen Gene des Clusters der Biosynthese der Pristinamycine enthalten und dass diese Gene verwendet werden können, um die anderen Gene der Biosynthese der Streptogramine zu lokalisieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, ausgewählt unter:

(a) den gesamten oder einem Teil der Gene snaA (SEQ ID NO: 2), snaB (SEQ ID NO: 3), snaC (SEQ ID NO: 7) snaD (SEQ ID NO: 8) papA (SEQ ID NO: 9), papM (SEQ ID NO: 10), samS (SEQ ID NO: 4), snbA (SEQ ID NO: 5), snbC (SEQ ID NO. 11 und 12), snbD (SEQ ID NO: 13 und 14), snbE (SEQ ID NO. 15 und 16) und snbR (SEQ ID NO: 6).
(b) den Sequenzen, die den Genen (a) benachbart sind, die die Cluster der Biosynthese bilden und die für die Polypeptide codieren, die in der Biosynthese der Streptogramine impliziert sind,
(c) den Sequenzen, die mit den ganzen oder einem Teil der Gene(n) (a) oder (b) hybridisieren und für ein Polypeptid codieren, das in der Biosynthese der Streptogramine impliziert ist, und
(d) den Sequenzen, die von den Sequenzen (a), (b) und (c) infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes abgeleitet sind.

Noch bevorzugter sind die Nucleotidsequenzen, die durch die Gene snaA (SEQ ID NO: 2), snaB (SEQ ID NO: 3), snaC (SEQ ID NO: 7) snaD (SEQ ID NO: 8) papA (SEQ ID NO: 9), papM (SEQ ID NO: 10), samS (SEQ ID NO: 4), snbA (SEQ ID NO: 5), snbC (SEQ ID NO. 11 und 12), snbD (SEQ ID NO: 13 und 14), snbE (SEQ ID NO. 15 und 16) und snbR (SEQ ID NO: 6) dargestellt werden, Gegenstand der Erfindung.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft jede rekombinante DNA, die ein Gen der Biosynthese der Streptogramine umfasst. Vorzugsweise handelt es sich um eine rekombinante DNA, die die Cosmide pIBV1, pIBV2, pIBV3 oder pIBV4, wie sie in den 4 bis 7 dargestellt sind, ganz oder teilweise oder Sequenzen, die mit den Cosmiden pIBV1 bis pIBV4 ganz oder teilweise oder mit Fragmenten dieser hybridisieren, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die oben definierten Nucleotidsequenzen Teil eines Expres sionsvektors, der zur autonomen oder integrierenden Replikation sein kann.
Wie weiter oben angegeben wurde, ist es klar, dass die erhaltenen Resultate sich auf die Gesamtheit der Streptogramine beziehen, obwohl die Erfindung insbesondere mit den Genen der Biosynthese des Pristinamycins veranschaulicht wird.
Die in der vorliegenden Erfindung entwickelten Techniken zur Reinigung der Proteine oder zum Klonieren der Gene der Biosynthese der Streptogramine, ausgehend von S. pristinaespiralis, können insbesondere auf andere Produzenten-Mikroorganismen für Steptogramine angewendet werden (siehe Tabelle 1).
So macht die Reinigung einer enzymatischen Aktivität S. pristinaespiralis die Reinigung derselben Aktivität aus einem anderen Produzentenstamm von Streptogramin möglich. Die vorliegende Erfindung kann somit auf die Klonierung von Genen der Biosynthese von Streptograminen, ausgehend von jedem Produzentenmikroorganismus, durch Reinigung eines Proteins, das in die Biosynthese eingreift, dann mit Hilfe der NH₂-terminalen Sequenz dieses Synthese einer Oligonucleotidsonde, die die Klonierung des entsprechenden Gens zulässt, angewendet werden. Danach erlaubt ein "Abgehen" des Chromosoms die Identifizierung des gesamten Biosyntheseclusters.
Ausgehend von den in der vorliegenden Anmeldung identifizierten Genen ist es darüber hinaus durch Hybridisierung möglich, direkt die Biosynthesegene der Streptogramine, ausgehend von der DNA eines anderen Produzentenmikroorganismus, zu klonieren. Tatsächlich hybridisieren die Gene der Biosynthese der Pristinamycine stark an die der anderen Streptogramine. Es ist so möglich, die Gene der Biosynthese der Streptogramine durch Hybridisierung zu klonieren, wobei die Gene sna, snb oder pap oder Fragment dieser oder die Fragmente, die diesen benachbart sind, und die, wie es in der vorliegenden Erfindung gezeigt wird, andere Gene sna und snb enthalten, als Sonde verwendet werden. Dies resultiert darin, dass 1) die Streptogramine, die durch die verschiedenen Mikroorganismen produziert werden, identische oder ähnliche Strukturen haben (siehe 1-3), 2) die Biosynthesegene der Streptogramine in Cluster organisiert sind und 3) die enzymatischen Systeme, die für diese Biosynthese verantwortlich sind, keine absolute Spezifität für ihre Substrate haben.
Im übrigen kann die Klonierung von Genen, die in der Biosynthese der Streptogramine impliziert sind, auch durchgeführt werden, indem degenerierte Oligonucleotide verwendet werden, die ausgehend von den Sequenzen der Gene sna oder snb, die weiter oben genannt wurden, oder Fragmenten dieser Gene oder Fragmenten, die an diese Gene angrenzend sind, hergestellt wurden, erfolgen. Es ist auch möglich, die Biosynthesegene der Komponenten A und B verschiedener Produzentenstämme von Streptograminen zu zerkleinern. Diese Stämme können zur Gattung Streptomyces, aber auch zu anderen Gattungen gehören (siehe Tabelle 1). Wenn außerdem die genomische DNA der verwendeten Ausgangsstämme eine Zusammensetzung an G + C hat, die sich von der unterscheidet, die bei den Streptomyces beobachtet wird, können die verwendeten Sonden über einen Umweg über ein spezifisches Codon der Gattung oder der Art, von dem ausgehend man die DNA isolieren möchte, synthetisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Peptide, die aus der Expression der oben definierten Nucleotidsequenzen resultieren. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Polypeptide, die die folgenden Peptide oder Derivate davon ganz oder teilweise umfassen: SnA (SEQ ID NO: 2), SnaB (SEQ ID NO: 3), SnaC (SEQ ID NO: 7), SnaD (SEQ ID NO: 8), PapA (SEQ ID NO: 9), PapM (SEQ ID NO: 10), SamS (SEQ ID NO: 4), SnbA (SEQ ID NO: 5), SnbC (SEQ ID NO: 11 und 12), SnbD (SEQ ID NO: 13 und 14), SnbE (SEQ ID NO: 15 und 16) und SnbR (SEQ ID NO: 6). Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck Derivat jedes Molekül, das durch Modifikation genetischer und/oder chemischer Natur an der Peptidsequenz erhalten wurde. Unter Modifikation genetischer und/oder chemischer Natur kann man jede Mutation, Substitution, Deletion, Addition und/oder Modifikation eines oder mehrerer Reste verstehen. Solche Derivate können mit unterschiedlichen Zielen erzeugt werden, z.B. mit dem, die Affinität des Peptids für sein Substrat (seine Substrate) zu erhöhen, dem Ziel, seine Produktionslevel zu verbessern, dem Ziel, seine Resistenz gegen Proteasen zu erhöhen, dem Ziel, seine Aktivität zu erhöhen und/oder zu modifizieren, oder dem Ziel, ihm neue biologische Eigenschaften zu verleihen. Unter den Derivaten, die aus einer Addition resultieren, kann man z.B. die chimären Polypeptide nennen, die einen zusätzlichen heterologen Teil an einem Ende gebunden tragen. Der Ausdruck "Derivat" umfasst auch Polypeptide, die mit den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptiden homolog sind, die aus anderen Zellquellen und insbesondere Produzentenstämmen der Streptogramine stammen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch jede rekombinante Zelle, die eine Nucleotidsequenz oder einen Vektor, wie sie/er vorstehend definiert wurde, enthält. Die rekombinanten Zellen gemäß der Erfindung können sowohl Eukaryoten wie auch Prokaryoten sein. Unter den Eukaryotenzellen, die zweckdienlich sind, kann man Tierzellen, Hefen oder Pilze nennen. Wenn es sich um Hefen handelt, kann man insbesondere die Hefen der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces oder Hansenula nennen. Wenn es sich um Tierzellen handelt, so kann man die COS-, CHO-, C127-Zellen, Regenbogenschlangeneier usw. nennen. Unter den Pilzen kann man insbesondere Mikromonospora, Aspergillus ssp. oder Trichoderma ssp. nennen. Als Prokaryotenzellen werden vorzugsweise die folgenden Bakterien verwendet: Actinomycetes und insbesondere Streptomyces, E. coli (Beispiel 11), Bacillus. Vorzugsweise werden die rekombinanten Zellen der Erfindung unter den Produzentenzellen der Streptogramine ausgewählt (siehe Tabelle 1). Die rekombinanten Zellen der Erfindung können durch jedes Verfahren erhalten werden, das eine Einführung einer fremden Nucleotidsequenz in eine Zelle erlaubt. Dabei kann es sich insbesondere um Transformation, Elektroporation, Konjugation, Protoplastenfusion oder jede andere Technik, die dem Fachmann bekannt ist, handeln.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das bei der Biosynthese der Streptogramine involviert ist, nach dem man eine rekombinante Zelle, wie sie vorstehend definiert wurde, kultiviert und das produzierte Polypeptid gewinnt.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer rekombinanten Zelle, wie sie vorstehend definiert wurde, die ein Polypeptid, das wenigstens in der Biosynthese der Streptogramine in einer Bioumwandlungsreaktion beteiligt ist, exprimiert. Diese Zellen ermöglichen es insbesondere, ein Streptogramin in eine Derivatform umzuwandeln. Beispielsweise kann das Pristinamycin IIB auf diese Weise in Pristinamycin IIA transformiert werden. Dieselbe Überlegung kann auf jedes Biosynthese-Zwischenprodukt angewendet werden. Diese Zellen können auch die Herstellung von Hybridantibiotika ermöglichen, die pharmakologisch interessante Eigenschaften haben (Hopwood et al., 1985a, Hopwood et al., 1985b, Hutchinson et al., 1989). Diese Biokonversionen können entweder mit Hilfe ganzer Zellen oder mit Hilfe azellulärer Extrakte der genannten Zellen durchgeführt werden.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Nucleotidsequenz, wie sie oben definiert wurde, zum Verstärken der Streptogramin-Produktion. Die Erfindung betrifft auch ein Herstellungsverfahren für Streptogramine, bei dem man in eine Produzentenzelle für Streptogramine oder eine potentielle Produzentenzelle für Streptogramine eine oder mehrere Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung einführt und/oder amplifiziert, man die genannte Zelle unter Produktionsbedingungen für Streptogramine kultiviert und man die produzierten Streptogramine gewinnt.
Die Überexpression von bestimmten Genen, die bei der Biosynthese beteiligt sind, kann eine Verstärkung der Produktion der Streptogramine A und/oder B der Produzentenstämme erlauben. Diese Überproduktion kann in mehreren Stämmen erfolgen: entweder in Stämmen, die nur Moleküle der Familie der Streptogramine A produzieren, oder in Stämmen, die nur Moleküle der Familie der Streptogramine B produzieren, oder in Stämmen, die die beiden Komponenten A und B produzieren. Diese Überexpressionen können aus der Erhöhung der Synthesequote, demnach der Produktivität der Komponenten A und/oder B, entweder in einem Erlenmeyer-Kolben oder in kleinen Fermentatoren oder in großen Industriefermentatoren resultieren. Im Übrigen ermöglicht die spezifische Überexpression eines Gens, das bei der Biosynthese einer Komponente A oder B beteiligt ist, auch die Variation des Prozentgehaltes an Komponenten A und B, die durch den Stamm produziert werden, und somit den Erhalt einer besseren Synergie zwischen diesen Molekülen. Im Übrigen können die Biosynthesegene, die ausgehend von einem Produzentenorganismus für Streptogramine isoliert werden, eingesetzt werden, um die Produktion in einem anderen Produzentenmikroorganismus zu verstärken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in einer Stufe des Biosynthesewegs der Streptogramine blockiert sind, nachdem man an einer Produzentenzelle für Streptogramine eine Mutagenese auf dem Level wenigstens eines Gens des Biosynthesewegs durchführt.
Vorzugsweise wird die Mutagenese in vitro oder in situ durch Suppression, Substitution, Deletion und/oder Addition einer oder mehrerer Basen in dem betrachteten Gen oder durch genetische Unterbrechung durchgeführt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert tatsächlich auf der Konstruktion von Mutanten, die in bestimmten Biosynthesestufen der Streptogramine blockiert sind. Das Interesse beruht einerseits in der Untersuchung der Funktionalität der mutierten Proteine und andererseits in der Verwirklichung von Stämmen, die Biosynthese zwischenprodukte produzieren. Diese Zwischenprodukte können modifiziert werden, gegebenenfalls nach Abtrennung, entweder durch Zusatz von besonderen Komponenten in die Produktionsmedien oder durch Einführung von anderen Genen, die geeignet sind, das Zwischenprodukt zu modifizieren, indem sie es als Substrat verwenden, in die so mutierten Stämme. Diese Zwischenprodukte können auch auf chemischem, biochemischem, enzymatischem und/oder mikrobiologischem Weg modifiziert werden. In diesem Rahmen wurde die Mutante SP92::pVRC505 des Stamms S. pristinaespiralis SP 92 konstruiert: S. pristinaespiralis SP92::pVRC505 wurde durch homologe Integration eines Suizidplasmids pVRC505, das ausgehend vom Vektor pDH5 und einem internen Fragment im Gen snaA konstruiert worden war, in das Gen snaA isoliert. Die folgenden Mutanten wurden ebenfalls konstruiert: SP92 samS::ΩamR; SP92::pVRC508; SP92::pVRC404 und SP92::pVRC1000 (Beispiel 9).
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Biosynthese-Zwischenproduktes der Streptogramine, umfassend:

– Man stellt eine Zelle her, die in einer Stufe des Biosynthesewegs der Streptogramine blockiert ist, wie es vorstehend beschrieben wurde,
– man kultiviert die genannte Zelle und
– man gewinnt das akkumulierte Zwischenprodukt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Moleküls, das ein Derivat der Streptogramine ist, umfassend:

– man stellt eine Zelle her, die in einer Stufe des Biosynthesewegs der Streptogramine blockiert ist, wie es vorher beschrieben wurde,
– man kultiviert die Zelle und
– man modifiziert das durch diese Zelle akkumulierte Zwischenprodukt gegebenenfalls nach Abtrennung aus dem Kulturmedium.

Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der Beispiele, die folgen, und die lediglich als erläuternd und nicht als beschränkend anzusehen sind, erläutert.
Liste der Figuren
1: Beispiel für die Struktur der Komponenten A der Streptogramine.
2: Beispiel für die Struktur der Komponenten B der Streptogramine.
3: Andere Beispiele für die Struktur von Streptograminen.
4: Darstellung des Cosmids pIBV1.
5: Darstellung des Cosmids pIVB2.
6: Darstellung des Cosmids pIBV3.
7: Darstellung des Cosmids pIBV4.
8: Reaktion, katalysiert durch die Pristinamycin IIA-Synthase.
9: Reaktion, katalysiert durch die 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase.
10: Reaktion, katalysiert durch SnbC.
11: Reaktion, katalysiert durch SnbD.
12: Reaktion, katalysiert durch SnbE.
13: Reaktion, katalysiert durch SnaC.
14: Reaktion, katalysiert durch PapM.
15: Darstellung der Plasmide pVRC402 (A) und VRC501 (B)
16: Darstellung des Plasmids pXL2045.
17: Darstellung des Plasmids pVRC1105.
18: Darstellung des Plasmids pVRC1106.
19: Darstellung des Plasmids pVRC1104.
20: Darstellung des Plasmids pVRC900.
21: Darstellung des Plasmids pVRC1000.
22: Darstellung des Plasmids pVRC509.
23. Darstellung des Plasmids pVRC903.
24: Darstellung des Plasmids pVRC409.
25: Darstellung des Plasmids pVRC505.
26: Darstellung des Plasmids pVRC701.
27: Darstellung des Plasmids pVRC702.
28: Darstellung des Plasmids pVRC508.
29: Darstellung des Plasmids pVRC404.
30: Darstellung des Plasmids pVRC507.
31: Darstellung des Plasmids pVRC706.
32: allgemeine Kartographie.
Materialien

Säule Bio-Sil SEC 125 und 250 (Bio-Rad)
Säule MonoQ HR 5/5, 10/10 und 16/10 (Pharmacia)
Säule PD-10 (Pharmacia)
Säule Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia)
Säule Superdex 200 Hi-Load 16/60 und 75 HR 10/30 (Pharmacia)
Säule Superose 12 prep grade (Pharmacia)
Säule Vydac C4 und C18 (The Separations Group)
Säule Nucleosil 5-C18 (Macherey-Nagel)
Säule Phenyl-Superose HR 10/10 (Pharmacia)
Säule TSK G2000 SW (Tosoh, Japan)
Phenyl-Sepharose (Pharmacia)
FMN-Agarose (Sigma)
Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)
Sephadex G25 Fine (Pharmacia)
Centricon 10 oder 30 (Amicon)
Centriprep 10 oder 30 (Amicon)
Centrilutor (Amicon)

BEISPIEL 1: Isolierung der Gesamt-DNA des Stamms Streptomyces pristinaespiralis SP92
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die DNA von S. pristinaespiralis SP92 gereinigt werden kann.
Der Stamm S. pristinaespiralis SP92 ist vom Stamm S. pristinaespiralis DS5647 (ATCC25486) abgeleitet.
50 ml YEME-Medium (34% Saccharose, 5 mM MgCl₂, 0,25% Glycin (D. Hopwood et al., 1985)) werden mit 10⁸ Sporen von S. pristinaespirals SP92 inokuliert und die Kultur wird 40 Stunden bei 30°C unter Bewegung bei 280 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
Das Mycelium wird geerntet und mit 15 ml 10,3% Saccharose gewaschen. Etwa 1 g des Myceliumrückstands wird durch 5 ml TE, ergänzt durch 34% Saccharose, aufgenommen, dazu werden 1 ml Lysozym mit 50 mg/ml in einer Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 1 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, gegeben. Nach Inkubation bei 30°C während 30 bis 60 Minuten wird das Gemisch durch Zusatz von 0,8 ml 10%igem Sarkosyl geklärt. Danach werden 2 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, 10 ml TE, 18 g CsCl und 1,2 ml BET mit 10 mg/ml zugesetzt. Die Präparation wird für 1 Nacht einer Ultrazentrifugation bei 55.000 U/min bei 20°C unterworfen.
Die in dem CsCl-Gradienten in Form einer Bande vorliegende Chromosomen-DNA wird mit Hilfe einer Pasteur-Pipette gewonnen. BET wird durch mehrere Waschgänge mit einer Isopropanol-Lösung, die mit TE-Puffer, 5 M NaCl gesättigt war, eliminiert. Die DNA wird dann durch Zusatz von 3 Volumina TE und 4 Volumina Isopropanol präzipitiert.
Nach Waschen in 70%igem Ethanol wird die DNA in einem geeigneten Volumen an TE wieder aufgenommen. Die Menge an Gesamt-DNA, die erhalten wird, schwankt zwischen 250 und 500 μg/g Mycelium.
BEISPIEL 2: Isolierung von Plasma-DNA von E. coli:
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie Plasmid-DNA von E. coli aus rekobinanten E. coli-Stämmen, hergestellt wird.
2.1. Herstellung von Plasmid-DNA von E. coli in großen Mengen
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie Maxipräparationen von Plasmid-DNA bei E. coli durchgeführt werden.
Diese Herstellung wird ausgehend von einer 500 ml-Kultur in LB-Medium, das 150 μg/ml Ampicillin enthält, durchgeführt. Das Extraktionsprotokoll ist von den Verfahren abgeleitet, die von Birnboim und Doly (1979) und Ish-Horowicz und Burke (1981) beschrieben wurden, und ist bei Maniatis et al. (1989) beschrieben.
Nach dieser Extraktion wird die Plasmid-DNA durch CsCl-Gradient gereinigt, wie es bei Maniatis et al. (1989) beschrieben ist. Die Plasmid-DNA wird dann durch Zusatz von 3 Volumina TE und 4 Volumina Isopropanol präzipitiert. Nach Zentrifugation wird der Rückstand in 0,5 bis 1 ml TE aufgenommen.
2.2 Herstellung von Plasmid-DNA von E. coli in kleinen Mengen
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Minipräparationen von Plasmid-DNA bei E. coli hergestellt werden.
Diese Herstellung wird ausgehend von 15 ml Kultur im LB-Medium, das 150 μg/ml Ampicillin enthält, durchgeführt. Das Verfahren ist wie das von Birnboim und Doly (1979) beschriebene.
BEISPIEL 3: Konstruktion der genomischen DNA-Bank von S. pristinaespiralis SP92 bei E. coli und Herstellung der Hybridisierungsmembranen
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie eine genomische DNA-Bank von S. pristinaespiralis SP92 bei E. coli verwirklicht wird.
3.1. Herstellung der genomischen DNA-Fragmente
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie Fragmente genomischer DNA mit hohen Molekulargewichten hergestellt werden können.
Die Gesamt-DNA des Stamms SP92, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wird teilweise durch Sau3A (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 USA) in dem durch den Hersteller empfohlenen Puffer: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 100 μg/ml BSA, verdaut. Die Enzymmenge, die eingesetzt wird, um DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht zu erhalten, wird empirisch bestimmt. Es werden etwa 0,025 Einheiten Enzym verwendet, um 1 μg Gesamt-DNA während 20 Minuten bei 37°C zu verdauen. Die Reaktion wird dann durch eine 15-minütige Inkubation bei 65°C gestoppt, und das Enzym wird durch Zusatz eines gleichen Volumens an Phenyl-Chloroform eliminiert. Nach Zentrifugation wird der Überstand, der die Gesamt-DNA teilweise verdaut enthält, durch Zusatz von 0,3 M Endkonzentration an Natriumacetat und 2,5 Volumina Ethanol präzipiert.
Auf diese Weise werden etwa 100 μg Gesamt-DNA verdaut, dann werden die DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 30 und 50 kb durch einen Saccharosegradienten von 10–40% isoliert. Ihre Größe wird durch Elektrophorese an 0,4% Agarosegel bestätigt.
3.2. Herstellung des Cosmids pHC79.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie das Cosmid pHC79 aus E. coli hergestellt wird.
Das Cosmid pHC79 (B. Hohn und Collins, 1980) umfasst einen Teil von pBR322 (F. Bolivar et al., 1977), die Region cro-cII von λ und die Region, die die Sequenz cos von Charon 4A enthält (F. R. Blattner et al., 1977).
Die Extraktion des Cosmids wurde durchgeführt, wie es in Beispiel 2.1. beschrieben ist, und zwar ausgehend von einem Stamm von E. coli TG1 (K12, Δ(lac-pro) supE thi hsd DS F^– traD36 proA⁺B⁺ lacI^q LacZ ΔM15, Gibson, 1984).
500 ng Cosmid pHC79 wurden durch BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510, USA) in 20 μl Puffer aus 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 100 μg/ml BSA verdaut.
3.3. Ligation von DNA-Fragmenten und Cosmid
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Fragmente des Genoms von S. pristinaespiralis SP92, die aus einem Sau3A-Verdau stammen, mit dem Vektor pHC79, der durch BamHI linearisiert worden war, ligiert werden können.
Etwa 150 ng Cosmid, das wie oben beschrieben linearisiert worden war, wurden in Ethanol mit 350 ng Gesamt-DNA-Fragmenten von S. pristinaespiralis SP92, die wie in Beispiel 3.2. beschrieben hergestellt worden waren, präzipitiert. Der Rückstand wurde in 10 μl Ligationspuffer aufgenommen: 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 50 μg/ml BSA und 0,5 μl T4-DNA-Ligase mit 400.000 Einheiten pro ml (New England Biolabs, Beverly, MA, 01915-5510, USA) wurden zugesetzt. Die Inkubation wurde während einer Nacht bei 15°C durchgeführt.
3.4. Durchführung der Einkapselung in vitro.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die in 3.3. aufgebauten Cosmide in vitro eingekapselt werden.
Die Einkapselung der Hybridcosmide nach Ligation wurde mit dem Gigapack II Gold-Kit, entwickelt von Stratagene (Stratagene Cloning Systems, la Jolla, CA 92037, USA), verwirklicht.
2 × 4 μl Ligationsgemisch oder 2 × 70 ng Hybridcosmide wurden in vitro nach dem vom Lieferanten beschriebenen Verfahren eingekapselt.
3.5. Transfektion der E. coli-Stämme DH1 und HB101.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Cosmide bei E. coli eingeführt werden.
Es werden zwei Transfektionen parallel bei den E. coli-Stämmen DH1 (F^– gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 supE44L^–, Low 1968) und HB101 (F^– supE44 hsdS20 (r_B ^–m_B ^–) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1, Boyer und Roulland-Dussoix 1969) durchgeführt.
Die Zellen werden nach dem folgenden Protokoll hergestellt: eine Vorkultur mit 100 ml wird in LB-Medium, das mit 0,2% Maltose und 10 mM MgSO₄ ergänzt worden war, für 4 bis 5 Stunden durchgeführt, bis der OD₆₀₀-Wert 0,8 erreicht. Die Kultur wird auch zentrifugiert und der Rückstand wird in 40 ml 10 mM MgSO₄ wieder aufgenommen und bis zu OD₆₀₀ = 0,5 mit derselben Lösung verdünnt. 200 μl der so hergestellten Zellsuspension werden zu 100 μl Einkapselungsgemisch gemischt. Nach 20 Minuten Kontakt bei 37°C wird 1 ml LB zugesetzt und das Ganze wird für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Dann werden die Transfektanten auf festem LB-Medium, das 150 μg/ml Ampicillin enthält, selektiert. Die Zahl der erhaltenen Transfektanten ist etwa 10⁴ pro μg rekombinantes Cosmid.
3.6. Lagerung der Banken genomischer DNA von S. pristinaespiralis SP92.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Banken genomischer DNA von S. pristinaespiralis SP92 konserviert. werden.
Nach Bestimmung der mittleren Größe der Fragmente, die in das Cosmid pHC79 insertiert waren, werden etwa 1500 Kolonien, die aus jeder der mit den Stämmen HB101 und DH1 realisierten Transfektionen stammen, in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen aufgetragen, die 200 μl Hogness-Medium enthalten (LB-Medium, das mit 8,8% Glycerin, 3 mM Natriumacetat, 55 mM K₂HPO₄, 26 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 150 μg/ml Ampicillin). Diese Platten werden eine Nacht bei 37°C inkubiert, dann bei –80°C gelagert.
3.7. Herstellung der Hybridisierungsmembranen, aus Genombanken von S. pristinaespiralis SP92.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die DNA der Kolonien, die die genomischen Banken von S. pristinaespiralis SP92 bilden, auf eine Hybridisierungsmembran übertragen wird.
Diese Hybridisierungsmembranen wurden für jede der zwei Banken doppelt hergestellt, und zwar nach dem folgenden Protokoll:
Die 15 Mikrotiterplatten von jeder Bank werden mit Hilfe einer Nagelbürste auf LB-Agar-Medium, das 150 μg/ml Ampicillin enthält, repliziert. Nach einer Nacht Wachstum bei 37°C erfolgt die Übertragung der Kolonien auf Biohylon Z⁺-Membran (Bioprope System), und zwar nach dem folgenden Protokoll: Die auf eine passende Größe zugeschnittene Membran wird für 1 Minute mit den Kolonien in Kontakt gelassen. Dann wird eine Denaturierung durch Eintauchen der Membran in eine Lösung von 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl während 5 Minuten, gefolgt von einer Neutralisation durch Eintauchen der Membran in eine 3 M Natriumacetatlösung für 5 Minuten, durchgeführt. Die DNA wird durch Belichtung unter einer UV-Lampe für 5 Minuten auf der Membran fixiert.
BEISPIEL 4
4.1. Herstellung der chromosomalen DNA des Stamms S. pristinaespiralis SP92 und der von SP92 abgeleiteten Stämme in Form von Inserts für die Elektrophorese mit gepulstem Feld
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die DNA des Stamms S. pristinaespiralis SP92 und der von SP92 abgeleiteten Stämme von Form von Inserts für die Elektrophorese in gepulstem Feld hergestellt wird.
Diese Herstellung erfolgt ausgehend von einer Myceliumkultur, die in folgender Weise erhalten wird: 30 ml YEME-Medium, das 0,25% Glycin enthält, werden mit 10⁸ Spuren des untersuchten Stamms inokuliert, die Kultur wird in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben für 48 Stunden bei 30°C inkubiert und bei 250 U/min bewegt. Das Mycelium wird dann durch Zentrifugation für 10 Minuten mit 3800 U/min geerntet und zweimal mit 10% Saccharose gewaschen. Der Rückstand des Myceliums wird dann in 5 ml Lösung I (250 mM EDTA, pH = 8,0, 20,6% Saccharose) suspendiert. Zu 200 μl Mycelium, das so erhalten wurde, fügt man 400 μl einer Lösung von Lysozym mit 50 mg/ml in Lösung I sowie 800 μl 1% LMP-Agarose in 25 mM EDTA, pH = 8, und 10,3% Saccharose; die Lösung bei 42°C gehalten wird. Das bei 42°C gehaltene Gemisch wird dann in die Vertiefungen von speziellen Kämmen gegossen, die man mit Klebeband verschließt und für 30 Minuten bei 4°C hält. Das Gemisch verfestigt sich und die 30 bis 40 so erhaltenen Inserts, die in den Vertiefungen enthalten sind, werden vorsichtig aus den Formen genommen.
Die Inserts werden zunächst während 30 Minuten bei 4°C in einer Lösung, die 25 mM EDTA und 10,3% Saccharose enthält, gespült. Dann lässt man sie in einer Lösung von 500 mM EDTA, 1% Laurylsarcosyl und 1 mg/ml Proteinase K für 2 × 24 Stunden bei 50°C einweichen, wobei man von Zeit zu Zeit bewegt. Dann werden die Inserts 3 × 1 Stunde in TE, der 1 mM PMSF enthält, gewaschen, indem die Lösung nach jedem Waschen gewechselt wird. Die so erhaltenen Inserts werden bei 4°C während maximal 4 Monaten in 0,5 M EDTA, pH = 8,0, gelagert.
4.2. Verdau von Inserts der DNA des Stamms S. pristinaespiralis SP92 und von Stämmen, die von SP92 abgeleitet sind, und Analyse durch Elektrophorese in gepulstem Feld
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie chromosomale DNA des Stamms S. pristinaespiralis SP92 und von Stämmen die von SP92 abgeleitet sind, die in Form von Inserts hergestellt wurde, wie es in Beispiel 4.1. beschrieben ist, durch verschiedene Restriktionsenzyme für die Elektrophorese in gepulstem Feld geschnitten wird.
4.2.1. Verdau der chromosomalen DNA in Inserts:
Die Inserts werden zunächst 6 mal in TE gewaschen, dann 2 mal für 1 Stunde im Puffer des gewählten Restriktionsenzyms inkubiert. Jedes Insert wird dann in den Deckel eines Eppendorf-Röhrchens gelegt, der 160 μl Puffer des Restriktionsenzyms und 40 Einheiten Enzym enthält. Das Ganze wird mit einem Parafilm bedeckt, und das Eppendorf-Röhrchen wird verschlossen, um den Parafilm zu halten, der es ermöglicht, jede Verdampfung des Puffers zu vermeiden. Die Röhrchen werden bei der in diesem Versuch gewünschten Temperatur inkubiert, und zwar während einer Nacht.
4.2.2. Analyse der verdauten DNA durch Elektrophorese in gepulstem Feld:
Die Technik der Elektrophorese in gepulstem Feld, die für diese Untersuchung gewählt wird, ist die des CHEF-Systems (Clamped Homogenous Electric Field), die von Chu et al. (1986) erfunden wurde, die es ermöglicht, zwei alternative homogene Felder zu erhalten, die im Winkel von 120° zueinander orientiert sind, und die es ermöglicht, gerade Bahnen für die DNA-Moleküle zu erhalten. Die verwendete Apparatur ist das "Pulsafor System", das von Pharmacia-LKB im Handel ist.
Man variiert die Parameter der elektrophoretischen Wanderung wie die Pulsdauer (d.h. die Dauer des Anlegens des elektrischen Feldes) und die Dauer der Wanderung der Art, dass eine optimale Trennung von DNA-Fragmenten erreicht wird, deren Größe sich zwischen 10 und 2500 kb verteilt. Die drei Wanderungsbedingungen, die verwendet werden, sind die folgenden: um große Fragmente mit einer Größe von 200 bis 1700 kb zu trennen, ist die gewählte Migration 40 Stunden bei einer Pulsdauer von 90 Sekunden; um Fragmente mit einer Größe von 50 bis 400 kb zu trennen, ist die gewählte Migration 20 Stunden bei einer Pulsdauer von 10 Sekunden, dann 20 Stunden bei einer Pulsdauer von 30 Sekunden; um die kleinsten Fragmente mit einer Größe von 10 kb bis 200 kb zu trennen, ist die gewählte Migration schließlich 24 Stunden bei einer Pulsdauer von 10 Sekunden. Für diese drei Migrationsbedingungen ist die Spannung auf konstante 150 Volt festgelegt, die Temperatur wird bei 13°C gehalten und die Elektrophoresegele enthalten 1,3% Agarose.
Die Inserts, die chromosomale DNA des Stamms S. pristinaespiralis SP92 und der von SP92 abgeleiteten Stämme enthalten, werden durch die Restriktionsenzyme verdaut, wie es oben beschrieben wurde, und sie werden mit Hilfe von zwei Skalpellklingen in den Vertiefungen des Elektrophoresegels abgelegt. Die Molekulargewichtsmarker, die verwendet werden, sind der "Yeast chromosome PFG marker" und der "Lambda ladder PFG marker", die von der Firma New England Biolabs im Handel sind. Die Wanderung erfolgt unter einer der Bedingungen, die vorstehend beschrieben wurden, und das Gel wird dann in einem BET-Bad (Ethidiumbromid) mit 4 μg/ml während 20 Minuten gefärbt, dann in Wasser während 20 Minuten entfärbt. Nach Fotografie des Gels werden die DNA-Fragmente auf eine Nylonmembran übertragen, dann mit den Sonden, die mit [α – ³²P]dCTP markiert sind, hybridisiert, wie es in Beispiel 9.1 beschrieben ist.
BEISPIEL 5: Isolierung der Cosmide, die die Gene tragen, welche für die gereinigten Proteine codieren, welche bei der Biosynthese der Streptogramine involviert sind.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von einem gereinigten Protein, das in die Biosynthese der Pristinamycine eingreift, dessen NH₂-terminale Sequenz oder eine innere Sequenz geklärt wurden, möglich ist, ausgehend von vorher angelegten genomischen Banken ein Cosmid zu isolieren, das das Strukturgen desselben Proteins trägt, oder auch unter den schon sequenzierten Proteinen, die durch die Cosmide getragen werden, das entsprechende Strukturgen zu identifizieren.
5.1. Isolierung der Cosmide pIBV1 und pIBV3, die das eine Strukturgen oder die zwei Strukturgene der zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase tragen.
5.1.1. Identifizierung und Reinigung eines der Proteine, die in der Endstufe der Synthese der Pristinamycine II beteiligt sind: die Pristinamycin IIA-Synthase.
Wie es bereits in der Einführung angegeben wurde, entspricht die letzte Stufe der Synthese des Pristinamycin IIA einer Oxidation der Bindung 2-3 des D-Prolins zu Dehydroprolin. Das für diese Aktivität verantwortliche Protein wurde bis zur Homogenität gereinigt, wie es dieses Beispiel veranschaulicht.
5.1.1.A. Bestimmung der Aktivität der Pristinamycin IIA-Synthase.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung einer Aktivität des Biosynthesewegs von Pristinamycin IIA, die noch niemals beschrieben wurde und die die beachtliche Eigenschaft besitzt, nur während des Produktionszeitraums der Pristinamycine exprimiert zu werden. Es handelt sich um die Pristinamycin IIA-Synthase, die die Umwandlung von Pristinamycin IIB in Pristinamycin IIA durch Oxidation des D-Prolin-Restes von Pristinamycin IIB in den Rest 2-3-Dehydroprolin (8) in Gegenwart von molekularem Sauerstoff und FMNH₂ katalysiert. Die zu bestimmenden enzymatischen Fraktionen (0,002 bis 0,005 Einheiten) werden 1 Stunde bei 27°C in einem Gesamtvolumen von 500 μl 50 mM Bis-tris-propan-Puffer, pH = 6,8, der NADH (500 μM), FMN (5 μM), Pristinamycin IIB (20 μM) und 0,02 Einheiten FMN-Reduktase (Boehringer Mannheim) enthält, inkubiert.
Das gebildete Pristinamycin IIA wird nach Anhalten der Inkubation durch Zusatz von 500 μl 0,1 N Chlorwasserstoffsäure und 500 μl Acetonitril und einer Zentrifugation der Probe für 5 Minuten mit 5000 g durch HPLC bestimmt. 150 μl des Zentrifugationsüberstands werden in eine Nucleosil 5-C8-Säule mit 15 cm injiziert, durch ein Gemisch aus 34% Acetonitril und 66% 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 2,9, eluiert. Die Pristinamycine IIA und IIB werden durch ihre UV-Absorption bei 206 nm detektiert.
Die Einheit der enzymatischen Aktivität ist als die Enzymmenge definiert, die notwendig ist, um 1 μmol Pristinamycin IIA pro Stunde unter den beschriebenen Bedingungen zu produzieren.
5.1.1.B. Reinigung der Pristinamycin IIA-Synthase von S. pristinaespiralis SP92.
Dieses Experiment veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das im Biosyntheseweg des Pristinamycin IIA eingreift, gereinigt werden kann.
Unter Verwendung der vorstehend in Beispiel 5.1.1.A beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung der Pristinamycin IIA-Synthase wie unten beschrieben durchgeführt, wobei Sorge getragen wird, dass die aktiven Fraktionen bei Bedarf zwischen jeder Stufe bei –30°C gefroren und konserviert werden.
150 g eines Zentrifugationsrückstands einer Kultur von S. pristinaespiralis SP92, die in der Anfangsphase der Produktion der Pristinamycine geerntet worden war und die mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 7,2, mit 10 Volumenprozent Glycerin gewaschen worden war, wird in 450 ml 50 mM Bis- tris-propan-Puffer, pH = 6,8, der 5 mM DTT und 0,2 mg/ml Lysozym enthielt, aufgenommen. Die so erhaltene Suspension wurde 45 Minuten bei 27°C inkubiert, dann mit 50.000 g für 1 Stunde zentrifugiert. Der so erhaltene Rohextrakt wird durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Proteinfraktion, die zwischen 40 und 55% Sättigung präzipitiert, wird über eine Sephadex-G25-Fine-Säule entsalzt, dann in 50 mM Bis-tris-propan-Puffer, pH = 6,8, 1 mM DTT auf eine MonoQ HR 10/10-Säule injiziert (100 mg pro Injektion). Die Proteine werden mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,5 M) eluiert. Die Fraktionen, die die enzymatische Aktivität enthalten (bewiesen durch den in Beispiel 5.1.1.A beschriebenen Test), werden vereinigt und auf 20 ml an Centriprep 10 konzentriert. Nach Verdünnung durch ein Volumen an 50 mM Bis-tris-protein-Puffer, pH = 6,8, 1 mM DTT, enthaltend 2 M Ammoniumsulfat, werden die Proteine (22,5 mg pro Injektion) an einer Phenyl Superose HR 10/10-Säule mit einem abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten (1,0 M bis 0 M) chromatographiert. Die besten Fraktionen, die die gesuchte Aktivität enthalten, werden kombiniert, an Centriprep 10 erneut konzentriert, und zwar auf 1 ml, dann auf eine Bio-Sil SEC 250-Säule aufgetragen (200 μl pro Injektion). Der Aktivitätspeak wird bei dieser Technik bei einem Molekulargewicht mit einer Mitte bei 77.000 detektiert. Die Fraktion, die die Aktivität enthält, wird in dem Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM DTT, pH = 6,8, auf eine MonoQ HR 5/5-Säule injiziert und mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,5 M) eluiert.
Nach dieser Stufe ist das Enzym rein und bei der SDS-PAGE-Elektrophorese werden zwei Untereinheiten mit einem geschätzten Molekulargewicht von 35.000 und 50.000 gezeigt. Sie werden an einer Vydac C4-Säule mit 25 cm getrennt, mit einem linearen Gradienten von 30 bis 50% Acetonitril in Wasser mit 0,07% Trifluoressigsäure eluiert.
Tabelle: Reinigung der Pristinamycin II-Synthase
Der Reinigungsfaktor wird nach Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung errechnet.
5.1.2. Darstellung von Oligonucleotiden ausgehend von Proteinsequenzen:
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von den NH₂-terminalen Sequenzen der zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase, die wie in Beispiel 5.1.1.B beschrieben gereinigt worden war, möglich ist, Oligonucleotide zu synthetisieren. Die zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase werden SnaA und SnaB genannt und entsprechen den Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von 50.000 bzw. 35.000, wie es in Beispiel 5.1.1.B beschrieben ist.
Die NH₂-terminalen Sequenzen der Proteine SnaA und SnaB, die den Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase entsprechen, wurden durch Mikrosequenzierung bewiesen. Dies wurde durch die Technik des Edman-Abbaus durchgeführt, wobei ein automatischer Sequenzer (Applied Biosystems, Modell 407A) verwendet wurde, der mit einem HPLC-Gerät gekoppelt war, um die Identifizierung der Phenylthiohydantoin-Derivate durchzuführen. Für jedes von ihnen wurden 30 Reste bestimmt.
Protein SnaA: (siehe Reste 2 bis 29 in SEQ ID NO: 2)
T A P(R)(R,W)R I T L A G I I D G P G G H V A A(W)R H P (A) T
Protein SnaB: (siehe Reste 2 bis 31 in SEQ ID NO: 3)
T A P I L V A T L D T R G P A A T L G T I T(R)A V(R)A A E A
Im Übrigen wurden die internen Sequenzen für diese zwei Polypeptide nach Trypsinverdau von SnaA und SnaB und Reinigung der erhaltenen Fragmente an einer Vydac C18-HPLC-Säule bestimmt. Es wurden die folgenden internen Sequenzen gefunden:
Protein SnaA: (siehe Reste 365 bis 384 in SEQ ID NO: 2)
G A D G F N I D F P Y L P G S A D D F V
Protein SnaB: (siehe Reste 122 bis 136 in SEQ ID NO: 3)
G L(-)D S F D D D A F Y H D R
Ausgehend von den unterstrichenen Regionen in jeder der Sequenzen der internen Fragmente für die Proteine SnaR und SnaB und in Funktion der Degeneriertheit des genetischen Codes, der für Streptogramine spezifisch ist (siehe Beispiel 8), wurden die folgenden Oligonucleotidgemische mit einem automatischen Synthesizer, Biosearch 8600, synthetisiert. Danach wurden sie durch die bereits beschriebene Technik gereinigt (M. Sawadogo und M. W. Von Dyke, 1991). Die Gene snaA und snaB bezeichnen die Strukturgene der Proteine SnaA bzw. SnaB.
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der internen Sequenz von SnaA entspricht:
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der internen Sequenz von SnaB entspricht:
5.1.3. Markierung der Gemische synthetischer Oligonucleotide und Hybridisierung mit den Banken der genomischen DNA des Stamms SP92.
Dieses Beispiel beschreibt, wie die spezifischen Oligonucleotide eines Gens der Biosynthese der Pristinamycine radioaktiv markiert werden können und dann mit den Membranen hybridisiert werden können, auf denen die DNA der genomischen Banken von S. pristinaespiralis SP92 transferiert war.
Die Markierung der Oligonucleotide wird durch Übertragung der Gruppierung [γ – ³²P]Phosphat des ATP durch T4-Polynucleotidkinase in die terminale 5'-Position durchgeführt. Diese Markierung erfolgt, wie es bei Maniatis et al. (1989) beschrieben ist. Nach der Markierung werden die Oligonucleotide ohne Reinigung eingesetzt.
Ungefähr 2 × 500 ng jedes Gemisches an Oligonucleotiden wurde auf diese Weise mit ³²P markiert und verwendet, um mit jeder der zwei Banken zu hybridisieren.
Die Hybridisierung der Membranen jeder Bank wird nach einem Protokoll durchgeführt, das von denen abgeleitet ist, die von J. Meinkoth, G. Wahl (1984) und B. D. Hames und S. J. Higgins (1985) entwickelt wurden: die 15 Membranen werden für 3 Stunden bei 50°C in 40 ml einer Lösung vorhybridisiert, die enthält: Denhardt (×5) [Denhardt (×100): 2% (G/V) Ficoll, 2% (G/V) Polyvinylpyrrolidon, 2% (G/V) BSA)], SSC (×5) [SSC (×20): 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat), 50 mM NaPO₄, pH = 6,5, 0,1% SDS, 250 μg/ml Lachssperma-DNA].
Die Hybridisierung wird dann während einer Nacht bei 50°C in 20 ml derselben Lösung, der 500 ng markierte Oligonucleotide zugesetzt worden waren, durchgeführt.
Die Filter werden danach in einer Lösung von SSC (×6) und 0,5% SDS 2 mal 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gewaschen, dann empirisch bei allmählich höheren Temperaturen (50 bis 65°C). Die Temperatur dieser letzten Waschgänge wird progressiv nach sukzessiven autoradiographischen Expositionen erhöht, um die Spezifität der hybridisierenden Klone mit den Oligonucleotidgemischen zu bestimmen.
5.1.4. Isolierung der Cosmide pIBV1 und pIBV3 und Bestimmung der Regionen, die die Gene snaA und snaB enthalten.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, Cosmide zu isolieren, die wie in Beispiel 3 beschrieben konstruiert wurden und die Biosynthesegene der Pristinamycine enthalten.
Die Cosmide pIBV1 und pIBV3 wurden von zwei Klonen isoliert, die aus der Bank, die im Stamm HB101 angelegt wurde, bzw. der Bank, die im Stamm DH1 angelegt wurde, stammten, die mit den zwei Oligonucleotidgemischen im Fall von pIBV1 gleichzeitig und mit dem Oligonucleotidgemisch aus der internen Sequenz für das Protein SnaA für pIBV3 hybridisierten.
Diese Cosmide wurden wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt. Die Cosmide pIBV1 und pIBV3 enthalten jeweils ein genomisches DNA-Insert von S. pristinaespiralis SP92, dessen Größe mit 30 kb bzw. 34 kb bestimmt wurde. Eine Kartographie (4 und 6) wurde ausgehend von Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen entsprechend den Protokollen des Lieferanten (New England Biolabs, Beverly, MA 01915-5510, USA) durchgeführt.
Die Southern-Hybridisierungen der DNA von pIBV1 und pIBV3, die mit verschiedenen Enzymen verdaut worden war, mit den Oligonucleotidgemischen erlaubte es, die Region des Cosmids zu identifizieren, die die Gene snaA und/oder snaB enthält.
Die Southern-Analysen wurden wie in Maniatis et al. (1989) beschrieben durchgeführt. Nach Trennung der Restriktionsfragmente durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel wird die DNA auf Biohylon Z⁺ (Bioprope System) transferiert. Die Hybridisierung der so transferierten DNA auf die Membranen mit den Oligonucleotidgemischen wird durchgeführt, wie es in Beispiel 5.1.3. beschrieben ist.
Diese Southern-Techniken erlaubten es, zu zeigen, dass das Cosmid pIBV1 ein BamHI-Fragment mit 6 kb, das die zu den in Beispiel 5.1.2 synthetisierten Sonden (aus den Proteinen SnaA und SnaB) enthält, sowie ein EcoRI-Fragment mit 2,5 kb, das zum BamHI-Fragment intern ist, das die Sequenzen enthält, die zu den Sonden homolog sind, welche ausschließlich von dem Protein SnaA stammen, besitzt. Darüber hinaus haben die Hybridisierungssignale, die mit dem Cosmid pIBV3 erhalten wurden, gezeigt, dass es nur das EcoRI-Fragment mit 2,5 kb besitzt, das die Sequenzen enthält, die zu den Sonden homolog sind, die ausschließlich vom Protein SnaA stammen.
5.2. Isolierung des Cosmids pIBV2, das das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase (snbA) enthält.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Cosmid wie das Konstrukt von Beispiel 3 zu erhalten, das wenigstens ein Gen der Biosynthese der Pristinamycine I enthält.
5.2.1. Identifizierung und Reinigung des Proteins, das bei der Aktivierung der 3-Hydroxypicolinsäure beteiligt ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie das Protein, das für die Aktivierung der 3-Hydroxypicolinsäure verantwortlich ist, aus S. pristinaespiralis SP92 bis zur Homogenität gereinigt werden kann.
5.2.1.A. Bestimmung der Aktivität der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung einer Aktivität des Biosynthesewegs des Pristinamycin IA, die noch nie beschrieben wurde und die die beachtenswerte Eigenschaft besitzt, nur während des Zeitraums der Produktion der Pristinamycine exprimiert zu werden. Es handelt sich um 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase, die die Bildung des Adenylats der 3-Hydroxypicolinsäure (9), ausgehend von dieser freien Säure und dem ATP in Gegenwart von MgCl₂ katalysiert.
Die zu bestimmenden enzymatischen Fraktionen (0,002 bis 0,020 Einheiten) werden während 15 Minuten bei 27°C in einem Gesamtvolumen von 250 μl Puffer, pH = 6,8, aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM DTT, 10% V/V Glycerin, in Gegenwart von 3-Hydroxypicolinsäure (1 mM), ATP (2 mM), MgCl₂ (5 mM) und Tetranatriumpyrophosphat, das mit dem radioaktiven Isotop 32 des Phosphoratoms markiert war (200 μM), inkubiert.
Die Reaktion wird durch Zusatz von 1 ml einer Suspension von Aktivkohle mit 10 g/l in einem Gemisch aus 75% 0,1 M Tetranatriumpyrophosphat und 25% 14% Perchlorsäure gestoppt. Nach Bewegung wird der Kohlenstoff gesammelt und 2 mal mit 1 ml des Pyrophosphat-Perchlorsäure-Gemisches gewaschen. Die radioaktiven organischen Moleküle werden dann 3 mal mit 1 ml eines Gemisches aus 50% Methanol und 50% N-Ammoniak in eine Zählphiole, die 12 ml Wasser enthält, eluiert. Die Radioaktivität wird durch den Cerenkov-Effekt mit einem Szintillationszählgerät (Minaxi TriCarb 4000 PACKARD) gemessen.
Die Einheit enzymatischer Aktivität ist als die Enzymmenge definiert, die notwendig ist, um 1 μmol Pyrophosphat in 1 Stunde unter den oben beschriebenen Bedingungen einzubauen.
5.2.1.B. Reinigung der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase von S. pristinaespiralis SP92.
Dieses Experiment veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das in den Biosyntheseweg des Pristinamycin IA eingreift, gereinigt werden kann.
Indem man die vorstehend in Beispiel 5.2.1.A. beschriebene Bestimmung verwendet, wird die Reinigung der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase wie unten beschrieben durchgeführt, wobei man Sorge trägt, dass die aktiven Fraktionen bei –70°C gefroren werden und sie zwischen jeder Stufe, wenn dies notwendig ist, bei –30°C konserviert werden.
234 g eines Zentrifugationsrückstands einer Kultur von S. pristinaespiralis SP92, die in der Anfangsphase der Produktion der Pristinamycine geerntet worden war, der mit einem Puffer aus 0,1 M Phosphat, pH 7,2, mit 10 Vol.-% Glycerin gewaschen worden war, werden in 234 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 8,0, der 4 mM DTE, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 15 Vol.-% Glycerin und 0,6 mg/ml Lysozym enthält, wieder aufgenommen. Die so erhaltene Suspension wird 30 Minuten bei 27°C inkubiert, dann während 1 Stunde bei 50.000 g zentrifugiert. Der so erhaltene Rohextrakt wird in pH 8,0-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, 4 mM DTE, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 15 Vol.-% Glycerin auf eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule (80 ml) injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,4 M) eluiert. Die Fraktionen, die die enzymatische Aktivität enthalten (bewiesen durch den in Beispiel 5.2.1.A. beschriebenen Test), werden kombiniert und durch ein Volumen des pH 8,0-Puffers aus 100 mM Tris-HCl, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 15 Vol.-% Glycerin, der 2 M Ammoniumsulfat enthält, verdünnt. Die Proteine werden dann an einer Phenyl-Sepharose-Säule (50 ml) mit einem abnehmenden Gradienten an Ammoniumsulfat (1,0 M bis 0 M) in pH 8,0-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 15 Vol.-% Glycerin chromatographiert. Nach Zusatz von 4 mM DTE werden die aktiven Fraktionen gesammelt, an Centriprep 10 wieder auf 5 ml konzentriert, dann auf eine Superose 12 prep grade-Säule (100 ml) aufgetragen. Die Fraktionen, die die gesuchte Aktivität enthalten, werden kombiniert und in dem pH 8,0-Puffer aus 10 mM Tris-HCl, 4 mM DTE, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 15 Vol.-% Glycerin (ungefähr 6 mg pro Injektion) auf eine MonoQ HR 5/5-Säule injiziert und mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,4 M) eluiert. Die aktiven Fraktionen werden kombiniert, auf Centricon 10 zu 1 ml konzentriert, durch 3 Volumina pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 4 mM DTE, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 15 Vol.-% Glycerin verdünnt, dann in diesem letzten Puffer auf eine MonoQ HR 5/5-Säule injiziert (2 mg pro Injektion) und mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,3 M) eluiert. Die besten Fraktionen, die die gesuchte Ligase enthalten, werden kombiniert, dann in einem pH 6,8-Puffer aus 20 mM Natriumphosphat, 50 mM Natriumsulfat auf eine Bio-Sil SEC 250-Säule aufgetragen. Der Aktivitätspeak wird in dieser Technik bei einem Molekulargewicht zentriert auf 60.000 detektiert.
Das Protein, das Aktivität zur Aktivierung der 3-Hydroxypicolinsäure besitzt, wird im Folgenden SnbA genannt.
Nach dieser Stufe ist das Enzym rein und nach SDS-PAGE-Elektrophorese wird sein Molekulargewicht mit etwa 67.000 bestimmt. Tabelle: Reinigung der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase

^a Die Aktivität im Rohextrakt kann nicht genau gemessen werden, da ein nicht spezifischer Austausch zwischen dem Pyrophosphat und ATP der 3-Hydroxypicolinsäure erfolgt.

Der Reinigungsfaktor wird nach Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung berechnet.
5.2.2. Erhalt von Oligonucleotiden ausgehend von der Proteinsequenz:
Dieses Beispiel beschreibt, wie es möglich ist, ausgehend von NH₂-terminalen und inneren Sequenzen des Proteins 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase, Oligonucleotide zu synthetisieren.
Die NH₂-terminale Sequenz des Proteins SnbA wurde durch Mikrosequenzierung, wie es in Beispiel 5.1.2. beschrieben ist, durchgeführt. Auf diese Weise wurden 20 Reste identifiziert.
Eine interne Sequenz des Proteins SnbA mit ungefähr 20 Aminosäuren wurde nach Trypsinhydrolyse und Reinigung der erhaltenen Fragmente an einer Vydac C18-HPLC-Säule ebenfalls identifiziert.
NH₂-terminale Sequenz des Proteins 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase:
(siehe Reste 1 bis 21 in SEQ ID NO: 5)
M L D G S V P W P E D V A A K Y R A A G Y
Interne Sequenz des Proteins 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase:
(siehe Reste 448 bis 467 in SEQ ID NO: 5)
V S A (-) E V E G H L G A H P D V O O A A
Ausgehend von den unterstrichenen Regionen in jeder der Sequenzen und als Funktion der Degeneriertheit des spezifischen genetischen Codes der Streptomyces (siehe Beispiel 8) wurden die folgenden Oligonucleotidgemische synthetisiert:
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der NH₂-terminalen Sequenz des Proteins 3-Hydroxypricolinsäure-AMP-Ligase entspricht:
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der inneren Sequenz des Proteins 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase entspricht:
5.2.3. Markierung der Gemische synthetischer Oligonucleotide und Hybridisierung der Banken genomischer DNA von S. pristinaespiralis SP92.
Dieses Beispiel beschreibt, wie spezifische Oligonucleotide eines Biosynthesegens der Pristinamycine radioaktiv markiert werden können, dann mit den Membranen, auf die die DNA der genomischen Banken von S. pristinaespiralis übertragen wurden, hybridisiert werden können.
Die Markierung der Oligonucleotide erfolgt durch Übertragung der Gruppierung [γ – ³²P]phosphat des ATP durch die T4-Polynucleotidkinase, wie es in Beispiel 5.1.3. beschrieben ist.
Etwa 2 × 500 ng jedes Gemischs an Oligonucleotiden wurde so mit ³²P markiert und verwendet, um jede der zwei Banken zu hybridisieren.
Die Hybridisierung der Membranen jeder Bank wurde durchgeführt, wie es in Beispiel 5.1.3. angegeben ist.
5.2.4. Isolierung des Cosmids pIBV2 und Bestimmung der Region, die das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase enthält.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Cosmid, wie es in Beispiel konstruiert wird, zu erhalten, das wenigstens das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase enthält.
Das Cosmid pIBV2 wurde aus einem Klon der Bank isoliert, die in dem E. coli-Stamm DH1 angelegt worden war, der mit den zwei Oligonucleotidgemischen gleichzeitig hybridisiert.
Das Cosmid wurde gereinigt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Es enthält ein Insert genomischer DNA von S. pristinaespiralis SP92, dessen Größe auf 47 kb geschätzt wird. Es wurde eine Kartographie (5) aus Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen, wie es in Beispiel 5.1.4. angegeben ist, angelegt.
Die Southern-Hybridisierungen der DNA von pIBV2, das mit verschiedenen Enzymen verdaut worden war, mit den Oligonucleotidgemischen ermöglichte es, die Region zu identifizieren, die das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase enthält. Die Southern-Techniken und die Hybridisierungen wurden wie in Beispiel 5.1.4. beschrieben durchgeführt.
Die Hybridisierungsresultate ermöglichten es, zu zeigen, dass das Cosmid pIBV2 ein EcoRI-BglII-Fragment mit 5,5 kb besitzt, das die Sequenz enthält, die zu den in Beispiel 5.2.2. synthetisierten Sonden homolog ist.
5.3. Beweis des Vorliegens eines Teils des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase II (SnbC) auf dem Cosmid pIBV3.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, das Vorliegen von Biosynthesegenen der Pristinamycine I auf einem bereits isolierten Cosmid zu identifizieren (Beispiel 5.1).
5.3.1. Identifizierung der Pristinamycin I-Synthase II, die beim Einbau der Threonin- und Aminobuttersäure-Reste in die Peptidkette des Pristinamycin IA involviert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie das Protein, das für den Einbau der Threonin- und Aminobuttersäure-Reste in die Peptidkette des Pristinamycin IA verantwortlich ist, aus S. pristinaespiralis SP92 bis zur Homogenität gereinigt werden kann.
5.3.1.A. Bestimmung der partiellen Aktivitäten der Pristinamycin I-Synthase II.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung von Aktivitäten des Biosynthesewegs von Pristinamycin IA, die noch niemals beschrieben wurden und die die bemerkenswerte Eigenschaft besitzen, nur während des Zeitraums der Produktion der Pristinamycine exprimiert zu werden. Es handelt sich um partielle Aktivitäten des Synthesepeptids, das für den Einbau der Threonin- und Aminobuttersäure-Reste in die Peptidkette des Pristinamycin 1A (10) in Gegenwart von ATP und MgCl₂ verantwortlich ist.
Die Aktivitäten von Threonin-AMP-Ligase und Aminobuttersäure-AMP-Ligase werden in einem Enzymtest auf ATP-Pyrophosphat-Austausch analog dem in 5.2.1.A für 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase beschriebenen gemessen.
Die Aminoacylierungsreaktionen des Enzyms mit Threonin und Alanin (ein Analogon der Aminobuttersäure, das man in Pristinamycin IC wieder findet) erlauben es, die Peptidsynthase von anderen Enzymen zu unterscheiden, die einen ATP-Pyrophosphat-Austausch durchführen können, und insbesondere von den Aminoacyl-tRNA-Synthasen. Es ist demnach insbesondere der Test der Aminoacylierung des Enzyms mit Threonin, das Tritium-markiert ist, wie es unten beschrieben wird, der in diesem Beispiel eingesetzt wird.
Die zu bestimmenden enzymatischen Fraktionen (0,2 bis 2 Einheiten) werden für 15 Minuten bei 27°C in einem Gesamtvolumen von 250 μl pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin, in Gegenwart von 1 μCi [3 – ³H] L-Threonin (15 Ci/mmol), ATP (2 mM) und MgCl₂ (5 mM) inkubiert.
Die Reaktion wird durch Zusatz von 150 μl einer 25%igen Trichloressigsäure-Lösung gestoppt. Die präzipitierten Proteine werden auf einem Mikrofilter gesammelt und 3 mal mit 400 μl 7%ige Trichloressigsäure gewaschen, bevor sie durch 2 mal 400 μl N-Soda in eine Zählphiole, die 1 ml HCl und 12 ml Szintillationsmittel-Cocktail (Readygel Beckmann) enthält, eluiert werden. Die Menge an Radioaktivität, die in dieser Phiole ist, wird mit einem Szintillationszählgerät (Minaxi TriCarb 4000 PACKARD) gemessen. Sie stellt die Menge an Threonin dar, die kovalent an die gesamte Peptidsynthase gebunden ist.
Die Einheit der enzymatischen Aktivität ist als die Enzymmenge definiert, die notwendig ist, um 1 Picomol Threonin in 15 min unter den oben beschriebenen Bedingungen kovalent zu binden.
5.3.1.B. Reinigung der Pristinamycin I-Synthase II.
Dieses Experiment veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das in den Biosyntheseweg des Pristinamycin IA eingreift, gereinigt werden kann.
Indem die vorstehend in Beispiel 5.3.1.A beschriebene Bestimmung verwendet wird, wird die Reinigung der Peptidsynthase, die für den Einbau der Threonin- und Aminobuttersäurereste in die Peptidkette des Pristinamycin IA verantwortlich ist, durchgeführt, wie es unten beschrieben wird, wobei Sorge getragen wird, dass bei 4°C gearbeitet wird und die aktiven Fraktionen bei –70°C konserviert werden.
150 g eines Zentrifugationsrückstands einer Kultur von S. pristinaespiralis SP92, die in der Anfangsphase der Produktion der Pristinamycine geerntet worden war, der in 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 7,2, mit 10 Vol.-% Glycerin gewaschen worden war, werden in 450 ml, pH 8,0-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, enthaltend 4 mM DTE, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 15 Vol.-% Glycerin, aufgenommen. Die so erhaltene Suspension wird mit Hilfe einer French Press, die auf einen Druck von 5000 psi eingestellt ist, verrieben, dann 1 Stunde lang bei 50.000 g zentrifugiert. Der so geerntete rohe Extrakt wird in pH 8-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, 4 mM DTE, 2 mM Benzamidin, 2 mg/l Leupeptin, 1 mg/l E-64, 15 Vol.-% Glycerin auf eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule (200 ml) injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,6 M) eluiert. Am Ausgang der Säule wird jede Fraktion mit 1/10 ihres Volumen mit einer Lösung von 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA versetzt. Die Fraktionen, die die enzymatische Aktivität enthalten (bewiesen durch den in Beispiel 5.3.1.A. beschriebenen Test), werden kombiniert und durch Ultrafiltration mit Centriprep 30 zu einem Endvolumen von 28 ml rekonzentriert. Dieses Konzentrat wird mit einem Aliquot von 4 ml auf eine Superdex 200 Hi-Load 16/60-Permeationssäule injiziert, die mit pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM Benzamidin, 4 mM DTE, 0,2 MM Pefabloc, 1 mM EDTA, 0,1 M KCl, 20 Vol.-% Glycerin äquilibriert worden war. Nach der Bestimmung werden die aktiven Fraktionen gesammelt und erneut an Centriprep 30 auf 15 ml konzentriert, dann an PD-10 in dem pH 8-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, 4 mM DTE, 2 mM Benzamidin, 2 mg/l Leupeptin, 1 mg/l E-64, 20 Vol.-% Glycerin entsalzt und auf 2 mal auf eine MonoQ HR 10/10-Säule aufgetragen, die äquilibriert worden war, und mit einem linearen Gradienten von 0,4 M KCl in dem selben Puffer eluiert. Die Fraktionen, die die gesuchte Aktivität haben, werden kombiniert, an Centriprep 30, dann Centricon 30 bis zu einem Endvolumen von 1 ml konzentriert und auf 5 mal auf eine Superose 6 HR 10/30-Säule im pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM Benzamidin, 4 mM DTE, 0,2 mM Pefabloc, 1 mM EDTA, 0,1 M KCl, 20 Vol.-% Glycerin injiziert. Der Aktivitätspeak wird in dieser Technik bei einem auf 450.000 zentriertes Molekulargewicht detektiert.
Nach dieser Stufe ist das Enzym rein und nach SDS-PAGE-Elektrophorese wird sein Molekulargewicht mit etwa 240.000 bestimmt. Diese Bande enthält auch die gesamte Radioaktivität des Proteins, das durch Aminoacylierung mit dem tritiierten Threonin markiert war.
In diesem Stadium erhöht sich die maximale Aktivität des Enzyms unter Verwendung einer Konzentration von 100 μCi/ml an Threonin (15 Ci/mmol) auf 3670 Einheiten/mg; das Enzym ist auch fähig, mit L-Aminobuttersäure oder L-Alanin Adenylate zu bilden; eine Aminoacylierungsreaktion des Enzyms mit tritiiertem Alanin wird detektiert, und die maximale Aktivität in Gegenwart von 200 μCi/ml an [2,3-³H]-L-Alanin (15 Ci/mmol) ist 2290 pmol/mg in 15 min. Tabelle: Reinigung der Pristinamycin I-Synthase II.

^a: Die Aktivität des Rohextrakts kann nicht genau gemessen werden.

Der Reinigungsfaktor wird nach Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung errechnet.
5.3.2. Herstellung von Oligonucleotiden ausgehend von der Proteinsequenz
Dieses Beispiel beschreibt, wie es möglich ist, ausgehend von internen Sequenzen der Pristinamycin I-Synthase II Oligonucleotide zu synthetisieren.
Die internen Sequenzen des Synthasepeptids, das für den Einbau der Threonin- und Aminobuttersäurereste in die Peptidkette des Pristinamycins 1A verantwortlich ist, wurden durch Mikrosequenzierung, wie es in Beispiel 5.1.2 beschrieben ist, nach Trypsinhydrolyse und Reinigung der erhaltenen Fragmente an einer Vydac C18-Säule realisiert.
Interne Sequenzen für das Protein Pristinamycin I-Synthase II
(siehe Reste 49 bis 61 in SEQ ID NO: 12)
Ausgehend von den in diesen Sequenzen unterstrichenen Regionen und als Funktion der Degeneriertheit des spezifischen genetischen Codes der Streptomyces (siehe Beispiel 8) wurden die folgenden Oligonucleotidgemische synthetisiert:
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der Sequenz 1 im Inneren des Proteins Pristinamycin I-Synthase II entspricht:
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der Sequenz 2 im Inneren des Proteins Pristinamycin I-Synthase II entspricht:
5.3.3. Markierung der Gemische synthetischer Oligonucleotide und Southern-Hybridisierung der DNA des Cosmids pIBV3.
Dieses Beispiel beschreibt, wie die spezifischen Oligonucleotide eines Gens der Biosynthese der Pristinamycine I radioaktiv markiert werden können, dann mit einer Membran hybridisiert werden können, auf die die DNA des Cosmids pIBV3 übertragen worden war.
Die Markierung der Oligonucleotide wird durch Übertragung der Gruppierung [γ – ³²P]Phosphat des ATP durch die T4-Polynucleotidkinase, wie es in 5.1.3. angegeben ist, in 5'-terminale Position durchgeführt.
Etwa 500 ng des Oligonucleotidgemisches wurde so mit ³²P markiert und verwendet, um eine Southern-Hybridisierung der DNA von pIBV3, die durch verschiedene Enzyme verdaut war, durchzuführen. Diese Hybridisierungen haben es ermöglicht, zu zeigen, dass ein Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase II durch das Cosmid pIBV3 getragen wird, und die Region zu identifizieren, die dieses Gen trägt. Die Southern-Techniken und die Hybridisierungen wurden wie in Beispiel 5.1.4. beschrieben durchgeführt.
Die Hybridisierungsresultate haben es erlaubt, zu zeigen, dass das Cosmid pIBV3 ein Fragment SphI mit 6,2 kb besitzt, das die Sequenz enthält, die den in Beispiel 5.3.2. synthetisierten Sonden homolog ist.
5.4. Beweis des Vorliegens eines Teils des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase III (SnbD) auf dem Cosmid pIBV3.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, das Vorliegen von Biosynthesegenen der Pristinamycine I auf einem bereits isolierten Cosmid (Beispiel 5.1.) zu identifizieren.
5.4.1. Identifizierung der Pristinamycin I-Synthase III, die im Einbau der Prolin- und p-Dimethylaminophenylalanin-Reste in die Peptidkette des Pristinamycin IA involviert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie das Protein, das für den Einbau der Prolin- und p-Dimethylaminophenylalanin-Reste in die Peptidkette des Pristinamycin IA verantwortlich ist, aus S. pristinaespiralis SP92 zur Homogenität gereinigt werden kann.
5.4.1A. Bestimmung der partiellen Aktivitäten der Pristinamycin I-Synthase III.
Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung von Aktivitäten des Biosynthesewegs des Pristinamycin IA, die noch nie beschrieben wurden und die die bemerkenswerten Eigenschaften besitzen, nur während des Zeitraums der Produktion der Pristinamycine exprimiert zu werden. Es handelt sich um partielle Aktivitäten der Peptidsynthase, die für den Einbau der Prolin- und para-Dimethylaminophenylalanin-Reste in die Peptidkette des Pristinamycins IA (11) in Gegenwart von SAM, ATP und MgCl₂ verantwortlich sind.
Die Prolin-AMP-Ligase- und p-Dimethylaminophenylalanin-AMP-Ligase-Aktivitäten werden in einem enzymatischen Test des Austauschs ATP-Pyrophosphats ähnlich dem in 5.2.1.A. für 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase beschriebenen gemessen.
Die Aminoacylierungsreaktionen des Enzyms mit Prolin und p-Dimethylaminophenylalanin erlauben es, die Peptidsynthase von anderen Enzymen, die einen Austausch ATP-Pyrophosphat durchführen können, und insbesondere von den Aminoacyl-tRNA-Synthasen zu unterscheiden. Das gleiche gilt für die N-Methylierung der α-aminierten Funktion des acylierten p-Dimethylaminophenylalanins auf dem Enzym. Dieser letzte Test, der für N-Methylierung charakteristisch ist, wird demnach in diesem Beispiel verwendet.
Die zu bestimmenden enzymatischen Fraktionen (0,2 bis 2 Einheiten) werden für 15 Minuten bei 27°C in einem Gesamtvolumen von 250 μl pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin in Gegenwart von 1 μCi [Methyl-³H] SAM (15 Ci/mmol), para-Dimethylamino-L-phenylalanin (1 mM), ATP (2 mM) und MgCl₂ (5 mM) inkubiert.
Die Reaktion wird durch Zusatz von 150 μl einer 25%igen Trichloressigsäurelösung gestoppt. Die präzipitierten Proteine werden auf einem Mikrofilter gesammelt und 3 mal mit 400 μl 7%iger Trifluoressigsäure gewaschen, bevor sie mit 2 mal 400 μl N-Natriumcarbonat in eine Zählphiole, die 1 ml N-HCl und 12 ml Szintillationsmittel-Cocktail (Readygel Beckmann) enthält, eluiert. Die Menge an Radioaktivität, die in dieser Phiole enthalten ist, wird mit einem Szintillationszählgerät (Minaxi TriCarb 4000 PACKARD) gemessen. Sie stellt die Menge an N-methyliertem para-Dimethylaminophenylalanin dar, die in kovalenter Art an die gesuchte Peptidsynthase gebunden ist.
Die Einheit der enzymatischen Aktivität ist als die Enzymmenge definiert, die notwendig ist, um in kovalenter Art 1 Picomol N-methyliertes p-Dimethylaminophenylalanin in 15 Minuten unter den oben beschriebenen Bedingungen zu fixieren.
5.4.1.B. Reinigung der Pristinamycin I-Synthase III.
Dieses Experiment veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das in den Biosyntheseweg des Pristinamycin IA eingreift, gereinigt werden kann.
Unter Verwendung der vorstehend in Beispiel 5.4.1.A beschriebenen Bestimmung wird die Reinigung der Peptidsynthase, die für den Einbau der Prolin- und para-Dimethylaminophenylalanin-Reste in die Peptidkette des Pristinamycin IA verantwortlich ist, durchgeführt, wie es unten beschrieben wird, wobei Sorge getragen wird, dass bei 4°C gearbeitet wird und die aktiven Fraktionen bei –70°C konserviert werden.
250 μg eines Zentrifugationsrückstands einer Kultur von S. pristinaespiralis SP92, die in der Anfangsphase der Herstellung der Pristinamycine geerntet worden war, der durch einen Puffer aus 0,1 M Phosphat, pH = 7,2, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0,5 M KCl, 10 Vol.-% Glycerin gewaschen worden war, werden in 750 ml pH 8,0-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, enthaltend 4 mM DTE, 5 mM Benzamidin, 0,2 mM Pefabloc, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/l Leupeptin, 2 mg/l STI, 2 mg/l Aprotinin, 1 mg/l E-64, 20 Vol.-% Glycerin, aufgenommen. Die so erhaltene Suspension wird mit Hilfe einer French Press, die auf einen Druck von 5000 psi eingestellt ist, zerrieben, dann während 1 Stunde mit 50.000 g zentrifugiert. Der so gesammelte Rohextrakt wird durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Proteinfraktion, die zwischen 0 und 35% Ammoniumsulfat-Sättigung fällt, wird erneut in dem Spaltungspuffer aufgelöst und auf eine Sephadex G 25 Fine-Säule, die in demselben Puffer äquilibriert worden war, entsalzt und eluiert. Die so hergestellten Proteine werden in dem pH 8,0-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, 4 mM DTE, 2 mM Benzamidin, 2 mg/l Leupeptin, 1 mg/l E-64, 20 Vol.-% Glycerin auf eine Q-Separose Fast Flow-Säule (200 ml) gespritzt, dann mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,6 M) eluiert. Am Ausgang der Säule wird jede Fraktion mit 1/10 ihres Volumens mit einer Lösung von 2 mM Pefabloc, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM Benzamidin versetzt. Die Fraktionen, die die enzymatische Aktivität enthalten (bewiesen durch den in Beispiel 5.4.1.A) beschriebenen Test), werden kombiniert und mit Ammoniumsulfat mit 80% Sättigung präzipitiert. Die ausgefallenen Proteine werden in einem pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM Benzamidin, 1 mM DTE, 0,2 mM Pefabloc, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/l Leupeptin, 0,15 M NaCl, 20 Vol.-% Glycerin wieder aufgelöst und in 5 mal einem 4 ml-Aliquot auf eine Superdex 200 Hi-Load 16/60-Permeationssäule, die äquilibriert worden war, injiziert und im selben Puffer eluiert. Nach der Bestimmung werden die aktiven Fraktionen kombiniert und mit Centriprep 30 wieder auf 3 ml konzentriert, dann mit pH 8,0-Puffer aus 100 mM Tris-HCl, 4 mM DTE, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 20 Vol.-% Glycerin wieder auf 20 ml verdünnt und auf 2 mal auf eine MonoQ HR 10/10-Säule aufgetragen, die äquilibriert worden war, und dann mit einem linearen Gradienten von 0,4 M KCl in dem selben Puffer eluiert. Die besten Fraktionen, die die gesuchte Aktivität enthalten, werden kombiniert und dienen als Material für die Charakterisierung der Aktivitäten des Enzyms und für seine Mikrosequenzierung.
Nach dieser Stufe ist das Enzym rein und nach SDS-PAGE-Elektrophorese wird sein Molekulargewicht auf etwa 250.000 geschätzt. Diese Bande enthält auch die gesamte Radioaktivität des Proteins, das durch Aminoacylierung mit tritiiertem SAM und para-Dimethylaminophenylalanin markiert worden war. Bei Permeation an Superose 6 HR 10/30 wird das native Molekulargewicht des Enzyms auf 700.000 geschätzt.
In dieser Stufe ist das Enzym auch fähig, mit Prolin Adenylate zu bilden; eine Aminoacylierungsreaktion des Enzyms mit dem tritiierten Prolin wird detektiert und die maximale Aktivität in Gegenwart von 200 μCi/ml [5-³H]-L-Prolin (34 Ci/mmol) ist 2490 pmol/mg in 15 Minuten. Tabelle: Reinigung der Pristinamycin I-Synthase III

^a: Aktivität im Rohextrakt und nach der Präzipitation mit Ammoniumsulfat kann nicht genau gemessen werden.

Der Reinigungsfaktor wird nach Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung errechnet.
5.4.2. Herstellung von Oligonucleotiden ausgehend von der Proteinsequenz
Dieses Beispiel beschreibt, wie es möglich ist, ausgehend von inneren Sequenzen der Pristinamycin I-Synthase II Oligonucleotide herzustellen.
Eine innere Sequenz der Peptidsynthase, die für den Einbau der Prolin- und para-Dimethylaminophenylalaninreste in die Peptidkette des Pristinamycin IA verantwortlich ist, wurde durch Mikrosequenzierung, wie es in Beispiel 5.1.2. beschrieben ist, nach Behandlung mit Bromcyan und Reinigung der erhaltenen Fragmente an einer Vydac C18-HLPC-Säule hergestellt.
Interne Sequenz des Proteins Pristinamycin I-Synthase III:
1 (siehe Reste 2 bis 20 in SEQ ID NO: 13)
Ausgehend von der unterstrichenen Region in dieser Sequenz und als Funktion der Degeneriertheit des spezifischen genetischen Codes der Streptomyces (siehe Beispiel 8) wurde das folgende Gemisch von Oligonucleotiden synthetisiert:
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der inneren Sequenz im Protein Pristinamycin I-Synthase III entspricht:
5.4.3. Markierung der Gemische synthetischer Oligonucleotide und Southern-Hybridisierung der DNA des Cosmids pIBV3:
Dieses Beispiel beschreibt, wie die spezifischen Oligonucleotide eines Gens der Biosynthese der Pristinamycine I radioaktiv markiert werden können, dann mit einer Membran hybridisiert werden können, auf die die DNA des Cosmids pIBV3 transferiert worden war.
Die Markierung der Oligonucleotide wird durch Übertragung der Gruppierung [γ – ³²P]Phosphat des ATP durch die T4-Polynucleotidkinase wie in 5.1.3. angegeben, in die terminale 5'-Position durchgeführt.
Ungefähr 500 ng des Oligonucleotidgemisches wurde so mit ³²P markiert und zur Southern-Hybridisierung der DNA von pIBV3, die durch verschiedene Enzyme verdaut worden war, verwendet. Diese Hybridisierungen haben es ermöglicht, zu zeigen, dass ein Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase III durch das Cosmid pIBV3 getragen wird, und die Region, die dieses Gen enthält, zu modifizieren. Die Southern-Techniken und die Hybridisierungen wurden wie in Beispiel 5.1.4. beschrieben durchgeführt.
Die Hybridisierungsresultate haben es ermöglicht, zu zeigen, dass das Cosmid pIBV3 ein Fragment SphI mit 8,4 kb besitzt, das die zu der in Beispiel 5.4.2. synthetisierten Sonde homologe Sequenz enthält.
5.5. Beweis des Vorliegens eines Teils des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase IV (SnbE) auf dem Cosmid pIBV3.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, das Vorliegen von Biosynthesegenen der Pristinamycine I auf einem bereits isolierten Cosmid (Beispiel 5.1) zu identifizieren.
5.5.1. Identifizierung der Peptidsynthase (Pristinamycin I-Synthase IV genannt), die für den Einbau des Phenylglycinrests in die Peptidkette des Pristinamycins IA verantwortlich ist.
5.5.1.A. Bestimmung von enzymatischen Aktivitäten, die durch die Peptidsynthase (Pristinamycin I-Synthase IV) getragen werden, die für den Einbau des Phenylglycinrestes in die Peptidkette des Pristinamycin IA verantwortlich ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung einer enzymatischen Aktivität des Biosyntheseweges des Pristinamycin IA, die bis heute noch nicht beschrieben wurde und die die bemerkenswerte Eigenschaft besitzt, nur während des Zeitraums der Produktion der Pristinamycine in dem Wildmikroorganismus exprimiert zu werden. Es handelt sich um die Aktivität der Peptidsynthase (Pristinamycin I-Synthase IV), die für den Einbau des L-Phenylglycinrests in die Peptidkette (12) in Gegenwart von ATP und MgCl₂ verantwortlich ist. Die Phenylglycin-AMP-Ligase-Aktivität der Pristinamycin I-Synthase IV wird in einem enzymatischen Test auf ATP-Pyrophosphat-Austausch ähnlich dem in 5.2.1.A. für die Aktivität von 3-Hydroxypicolinsäure-AMP- Ligase beschriebenen in Gegenwart von L-Phenylglycin (1 mM) und KCl (50 mM) in Inkubationspuffer gemessen.
5.5.1.B. Reinigung der Peptidsynthase, die für den Einbau des Phenylglycinrestes (Pristinamycin I-Synthase IV) in die Peptidkette des Pristinamycin IA verantwortlich ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das in den Biosyntheseweg des Pristinamycin IA eingreift, gereinigt werden kann. Indem die vorstehend in Beispiel 5.5.1.A beschriebene Bestimmung verwendet wird, wird die Reinigung der Pristinamycin I-Synthase IV wie unten beschriebene durchgeführt. Alle Arbeitsgänge werden bei 4°C durchgeführt. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten, werden unverzüglich gefroren und bei –70°C konserviert.
70 g feuchte Zellen, die wie in Beispiel 5.2.1.B gesammelt worden waren, werden in 250 ml Zelllysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH = 8,0, enthaltend 25% Glycerin, 4 mM DTE, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mg/l E64, 2 mg/l STI, 2 mg/l α2-Macroglobulin, 1 mg/l Leupeptid, 2 mg/l Aprotinin, 5 mM Benzamidin, 0,6 mg/ml Lysozym), resuspendiert. Die so erhaltene Lösung wird 1 Stunde bei 4°C unter Rühren gehalten, dann für 1 Stunde bei 50.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird dann in dem Zelllysepuffer auf eine Sephadex-G-25-Säule injiziert und die ausgelaufene Fraktion (ungefähr 250 mg Proteine, die während jeder Chromatographie injiziert wurden) wird auf einer Mono Q HR 16/10-Säule (Pharmacia), die mit dem Puffer aus 100 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 4 mM DTE, 1 mg/l E-64, 2 mg/l STI, 20% Glycerin äquilibriert worden war, injiziert. Die Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,6 M KCl eluiert und am Ausgang der Säule wird jede Fraktion mit 1/10 ihres Volumens einer Lösung von 2 mM Pefabloc, 5 mM EGTA, 5 mM EDTA versetzt. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten, werden kombiniert, dann mit einem Volumen 100 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 15% Glycerin, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 4 mM DTT, 3,4 M Ammoniumsulfat für 3 Volumina Fraktion gemischt. Die Lösung wird auf eine Phenyl-Superose HR 10/10-Säule injiziert (1/5 der Lösung wird bei jeder Chromatographie injiziert) und die Proteine werden mit einem linearen abnehmenden Gradienten von 0,9 bis 0 M Ammoniumsulfat eluiert. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten, werden kombiniert. Die Lösung wird in einem Centriprep 30 auf 3500 μl konzentriert und auf 2 mal auf eine Superdex 200 Hi-Load 16/60 injiziert; diese wurde mit dem Puffer 50 mM Bis-tris-propan, pH = 6,8, der 20% Glycerin, 0,15 M NaCl, 4 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 1 mM EDTa enthält, äquilibriert und eluiert. Die aktive Fraktion wird durch 9 Volumina Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, pH = 6,8, der 25% Glycerin, 4 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin enthält, verdünnt, dann in eine Mono Q HR 5/5-Säule, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, injiziert. Die gesuchte Aktivität wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M KCl eluiert und in einem Centricon-30 auf 630 μl konzentriert. Das gesuchte Protein wird dann durch Elektrophorese an 6% Polyacrylamidgel nach Denaturierung der Probe durch 10-minütigen Erwärmen auf 80°C mit einem Gemisch SDS-Mercaptoethanol gereinigt. Nach Elektrophorese und Färbung des Gels mit Coomassie-Blau wird die Gelbande, die das Protein enthält, herausgeschnitten, und das Protein wird in einem Centrilutor aus dem Gel elektroeluiert.
Bemerkung: Die Bande, die Pristinamycin I-Synthase IV entspricht, wird durch Vergleich mit einem tritiierten Standard Pristinamycin I-Synthase IV identifiziert (tritiiert durch kovalente Bindung an tritiiertes Phenylglycin; siehe Beschreibung in Beispiel 5.5.2.).
Nach dieser Stufe ist das Enzym nach Elektrophorese (PAGE-SDS) rein. Sein Molekulargewicht wird mit etwa 170.000 geschätzt.
5.5.2. Markierung der Pristinamycin I-Synthase IV durch Thioveresterung des radioaktiven Phenylglycins im Enzym.
Nach Aktivierung in Adenylatform durch Phenylglycin-AMP-Ligase-Aktivität wird das Phenylglycin auf eine Thio-Gruppierung der aktiven Stelle des Enzyms übertragen, bevor es im Verlauf einer Verlängerung (allgemeiner Prozess der Biosynthese der Peptidantibiotika, bekannt unter dem Namen "Thiomatrizen-Mechanismus") in die Peptidkette eingebaut wird. Im Allgemeinen kann die radioaktive Markierung des Proteins, das die Aktivierung einer Aminosäure bewirkt, durchgeführt werden, indem das Thioesterderivat mit einer radioaktiven Form der Aminosäure hergestellt wird.
Beispielsweise wird die radioaktive Markierung der Pristinamycin I-Synthase IV durchgeführt, indem 50 μg des Proteins (aktive Fraktion am Auslass der Chromatographiesäule Mono Q HR 5/5; siehe oben in Beispiel 5.5.1.B) mit 100 μCi (R,S)-2-Phenyl[2-³H]glycin (18 Ci/mmol; Amersham) in 70 μl Puffer aus 50 mM Bis-tris-protan, pH = 6,8, der 20% Glycerin, 25 mM MgCl₂, 5 mM ATP, 0,15 M NaCl, 4 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 1 mM EDTA enthält, inkubiert werden. Nach Denaturierung (nur SDS ohne Mercaptoethanol) werden die Proteine durch Elektrophorese (PAGE-SDS, Gel mit 6%) getrennt und mit Coomassie-Blau entwickelt. Die Analyse des Radioaktivitätsprofils durch Zählung der Proteinbanden sowie durch Autoradiographie (Hyperfilm MP; Fluorographie nach Imprägnierung des Gels mit Amplify Amersham) zeigt eine einzelne radioaktive Bande mit einem Molekulargewicht von 170.000. Tabelle: Reinigung der Pristinamycin I-Synthase IV.

^a Die spezifische Aktivität kann in dem Rohextrakt nicht genau gemessen werden, und zwar infolge des erhöhten Austauschniveaus ATP-Pyrophosphat, das nicht von Phenylglycin abhängt. Der Wert für die spezifische Aktivität wurde ausgehend von der Anzahl an Einheiten, die am Ausgang der ersten Chromatographiestufe gefunden werden, bezogen auf die Menge an Proteinen im Rohextrakt, errechnet.

5.5.3. Andere Aktivitäten, die von Pristinamycin I-Synthase IV getragen werden.
Die Reinigung der Peptidsynthase, die für den Einbau des Phenylglycins, der in Beispiel 5.5.2. beschrieben wurde, verantwortlich ist, hat zu einem reinen Protein mit einem Molekulargewicht von 170.000 geführt. Dieses Protein aktiviert die anderen getesteten Aminosäuren nicht, insbesondere nicht Pipecolinsäure oder 4-Oxopipecolinsäure. Eine zweite Herstellung dieses Proteins, die unter den in 5.5.1.B. beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurde, wobei jedoch die Stufe Phenyl-Superose unterdrückt wurde und von einer anderen Kultur von S. pristinaespiralis SP92 ausgegangen wurde, deren Rohextrakt mit einer French Press wie in 5.4.1.B beschrieben hergestellt wurde, hat zu einem Protein geführt, das am Ausgang der Stufe der Mono Q HR 5/5 rein war, und zwar ähnlich dem, das in derselben Stufe in dem in 5.5.1.B. beschriebenen Beispiel erhalten worden war, das aber gemäß SDS-PAGE ein Molekulargewicht von etwa 250.000 aufweist. Diese neue Präparation war für die Aktivierung und die Thioveresterung des Phenylglycins kompetent, besaß darüber hinaus ATP-Pyrophosphat-Austauschaktivität mit L-Pipecolinsäure (1 mM) in dem Austauschtest analog dem in 5.2.1.A. für 3-Hydroxypicolinsäure beschriebenen. Andererseits konnte gezeigt werden, dass das Protein mit 170.000 keine Austauschaktivität ATP-Pyrophosphat mit L-Pipecolinsäure zeigt, selbst nicht in den noch sehr unreinen Präparationen des Proteins. Es ist zu betonen, dass S. pristinaespiralis SP92 ein Analogon des Pristinamycin IA, das einen Pipecolinsäurerest anstelle der 4-Oxopipecolinsäure hat, natürlich in geringer Menge produziert. Dies beweist demnach, dass die Peptidsynthase, die für den Einbau des Phenylglycins (Pristinamycin I-Synthase IV) verantwortlich ist, auch den Einbau des vorangehenden Restes (wahrscheinlich Pipecolinsäure) katalysiert. Der Unterschied im Molekulargewicht, der für die Pristinamycin I-Synthase IV in den zwei Präparationen erhalten wird (170.000 und 250.000), wird einem Phänomen der partiellen proteolytischen Spaltung im ersten Fall zugeschrieben, das zum Verlust der Aktivierungsaktivität der L-Pipecolinsäure führt.
5.5.4. Oligonucleotidsynthese ausgehend von der Proteinsequenz.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von einer internen Sequenz der Pristinamycin I-Synthase IV möglich ist, das entsprechende Gen mit Hilfe zweckdienlicher Weise gewählter Oligonucleotide zu suchen.
Eine interne Sequenz der Pristinamycin I-Synthase IV mit 15 Aminosäuren wurde nach Bromcyan-Spaltung des gereinigten Proteins und Reinigung der Fragmente, die an einer Vydac-C18-HPLC-Säule erhalten wurden, identifiziert.
Interne Sequenz des Proteins Pristinamycin I-Synthase IV: (siehe Reste 82 bis 98 in SEQ ID NO: 16)
Ausgehend von der in dieser Sequenz unterstrichenen Region und als Funktion der Degeneriertheit des spezifischen genetischen Codes der Streptomyces (siehe Beispiel 8) wurde das folgende Oligonucleotidgemisch synthetisiert:
Gemisch, das dem unterstrichenen Teil der inneren Sequenz des Proteins Pristinamycin I-Synthase IV-entspricht:
5.5.5. Markierung der Gemische synthetischer Oligonucleotide und Southern-Hybridisierung der DNA des Cosmids pIBV3:
Dieses Beispiel beschreibt, wie die spezifischen Oligonucleotide eines Biosynthesegens der Pristinamycine I radioaktiv markiert werden können, dann mit einer Membran, auf die die DNA des Cosmids pIBV3 transferiert worden war, hybridisiert werden können.
Die Markierung der Oligonucleotide wird durch Übertragung der Gruppierung [γ – ³²P]Phosphat des ATP durch die T4-Polynucleotidkinase, wie es in 5.1.3. angegeben ist, in die 5'-terminale Position durchgeführt.
Etwa 500 ng des Gemisches von Oligonucleotiden wurden auf diese Weise mit ³²P markiert und wurde verwendet, um eine Southern-Hybridisierung der DNA von pIBV3, die durch verschiedene Enzyme verdaut worden war, durchzuführen. Diese Hybridisierungen haben es ermöglicht, zu zeigen, dass das Strukturgen der Pristinamycin I-Synthase IV durch das Cosmid pIBV3 getragen wird, und die Region, die dieses Gen enthält, zu identifizieren. Diese Southern-Techniken und die Hybridisierung wurden durchgeführt, wie es in Beispiel 5.1.4. beschrieben ist.
Die Hybridisierungsresultate haben es erlaubt, zu zeigen, dass das Cosmid pIBV3 ein Fragment SphI mit 6,6 kb besitzt, das die Sequenz enthält, die zu den in Beispiel 5.5.4. synthetisierten Sonden homolog ist.
5.6. Isolierung des Cosmids pIBV4, das das Strukturgen der FMN-Reduktase enthält (snaC).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Cosmid, wie es in Beispiel 3 konstruiert wurde, zu erhalten, das wenigstens ein Gen der Biosynthese der PII enthält.
5.6.1. Identifizierung der FMN-Reduktase, verbunden mit Pristinamycin IIA-Synthase.
Dieses Beispiel erläutert, wie das für die Reduktion von FMN durch NADH unter Bildung von FMNH₂, das für die Reaktion, die durch Pristinamycin IIA-Synthase katalysiert wird, notwendig ist, verantwortliches Protein, aus S. pristinaespiralis SP92 bis zur Homogenität gereinigt werden kann.
5.6.1.A. Bestimmung der Aktivität von FMN-Reduktase.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung einer Aktivität des Biosynthesewegs des Pristinamycin IIA, die noch niemals beschrieben wurde, und die die bemerkenswerte Eigenschaft besitzt, nur während des Zeitraums der Produktion der Pristinamycine exprimiert zu werden. Es handelt sich um die FMN-Reduktase, auch NADH:FMN-Oxidoreduktase genannt, die die Reduktion von FMN zu FMNH₂ (13) in Gegenwart von NADH katalysiert. FMN-Reduktasen, die dieselbe Reaktion katalysieren, die für NADH oder NADPH spezifisch sind oder nicht, die mit anderen Biosynthesewegen verbunden sind oder nicht, werden an anderer Stelle beschrieben (Duane et al., 1975, Jablonski et al., 1977, Watanabe et al., 1982).
Es werden zwei Bestimmungen eingesetzt, um diese Aktivität zu detektieren:
Die erste beruht auf einer Kupplung mit der in Beispiel 5.1.1. beschriebenen Pristinamycin IIA-Synthase und wird für die ersten Stufen der Reinigung verwendet. Die zu bestimmenden enzymatischen Fraktionen (0,002 bis 0,005 Einheiten) werden 1 Stunde bei 27°C in einem Gesamtvolumen von 500 μl 50 mM Bis-tris-propan-Puffer, pH = 6,8, der NADH (500 μM), FMN (2 μM), Pristinamycin IIB (20 μM) und 0,01 Einheiten der in Beispiel 5.1.1. beschriebenen Pristinamycin IIA-Synthase enthält, inkubiert. Das gebildete Pristinamycin IIA wird durch HPLC bestimmt, wie es in Beispiel 5.1.1.A, beschrieben ist.
Die Einheit der enzymatischen Aktivität ist als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 μmol Pristinamycin IIA pro Minute unter den oben beschriebenen Bedingungen zu synthetisieren.
Die zweite ist eine spektralfotometrische Bestimmung und kann nur mit wenigstens partiell gereinigten Fraktionen verwendet werden. Die zu bestimmenden enzymatischen Fraktionen (0,006 bis 0,030 Einheiten) werden 13 Minuten bei 27°C in einem Gesamtvolumen von 3 ml 50 mM Bis-tris-propan-Puffer, pH = 6,8, der NADH (500 μM) und FMN (2 μM) enthält, inkubiert. Nach 7 Minuten Inkubation werden 6 Ablesungen der optischen Dichte bei 340 nm im Abstand von 1 Minute gegen eine Referenzküvette ohne Enzym durchgeführt. Die Aktivität als μmol/min wird errechnet, indem der Anstieg der Verringerung der optischen Dichte pro Minute durch einen Faktor von 6,2 geteilt wird (optische Dichte von 1 mol NADH bei 340 nm).
Die Einheit der enzymatischen Aktivität ist als die Menge an Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 μmol NADH pro Minute unter den unten beschriebenen Bedingungen zu verbrauchen.
5.6.1.B. Reinigung der FMN-Reduktase von S. pristinaespiralis SP92
Dieses Experiment veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das in den Biosyntheseweg des Pristinamycin IIA eingreift, gereinigt werden kann.
Indem die vorstehend in Beispiel 5.6.1.A beschriebenen Bestimmungen verwendet werden, wird die Reinigung der FMN-Reduktase wie unten beschrieben durchgeführt, wobei Sorge getragen wird, dass die aktiven Fraktionen gefroren und bei –30°C zwischen jeder Stufe, wenn es erforderlich ist, konserviert werden.
500 g eines Zentrifugationsrückstands einer Kultur von S. pristinaespiralis SP92, die zu Beginn der Produktionsphase von Pristinamycinen geerntet worden war, der mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 7,2, mit 10 Vol.-% Glycerin gewaschen worden waren, werden mit 1500 ml 50 mM-Bis-tris-propan-Puffer, pH = 6,8, der 5 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin und 0,2 mg/ml Lysozym enthält, wieder aufgenommen. Die so erhaltene Suspension wird während 45 Minuten bei 27°C inkubiert, dann während 1 Stunde mit 50.000 g zentrifugiert. Der so geerntete Rohextrakt wird durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Proteinfraktion, die bei 40 und 75% Sättigung präzipitiert, wird an einer Sephadex G25 Fine-Säule entsalzt, dann in dem pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 5 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin auf eine Q-Separose Fast Flow-Säule (300 ml) injiziert. Die aktiven Proteine werden an der Säule nicht zurückgehalten und sie werden an einer Sephadex G25 Fine-Säule entsalzt, dann wieder in pH 8,2-Puffer aus 50 mM Tris-HCl, 5 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin auf eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule (35 ml) gespritzt und mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,5 M) eluiert. Die Fraktionen, die die enzymatische Aktivität enthalten (bewiesen in einem ersten Test, der in Beispiel 5.6.1.A. beschrieben wird), werden kombiniert, an einer Sephadex G25 Fine-Säule entsalzt, dann im pH 8,2-Puffer aus 50 mM Tris-HCl, 5 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin auf eine Mono Q HR 10/10-Säule injiziert. Die zurückgehaltenen Proteine werden direkt mit dem selben Puffer, dem 0,2 M KCl zugesetzt worden waren, eluiert. Sie werden in einem Volumen von 1 ml erneut unverzüglich auf eine Superdex 75HR 10/30-Säule injiziert, mit dem pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin eluiert. Die Fraktionen, die die gesuchte Aktivität enthalten (bewiesen ausgehend von dieser Stufe mit dem spektralfotometrischen Test, wie er in Beispiel 5.6.1.A. beschrieben ist), werden kombiniert und das Gesamtvolumen des Pools wird auf 7 ml gebracht; diese 7 ml werden auf eine Säule injiziert, die mit 8 ml FMN-Agarose gefüllt ist; die Säule wird mit pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, 1 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin gewaschen, dann mit dem selben Puffer, der 10 μM FMN enthält, eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, auf PD-10-Säulen entsalzt und in pH 8,2-Puffer aus 50 mM Tris-HCl, 5 mM DTT, 10 Vol.-% Glycerin auf eine Mono Q HR 5/5-Säule injiziert und mit einem linearen KCl-Gradienten (0 bis 0,25 M) eluiert.
Nach dieser Stufe ist das Enzym rein. Gemäß SDS-PAGE-Elektrophorese tritt nur eine ausreichend große Bande auf, diese hat ein Zentrum bei einem geschätzten Molekulargewicht von 28.000, obgleich dieses Protein bei Permeationschromatographie an Bio-Sil SEC 125-Gel einen symmetrischen Peak bildet, der bei einem Molekulargewicht von etwa 30.000 zentriert ist.
Zur Sequenzierung wird das Protein an einer Vydac C4-Säule mit 25 cm entsalzt, mit einem linearen Gradienten von 30 bis 70% Acetonitril in Wasser mit 0,07% Trifluoressigsäure eluiert. Tabelle: Reinigung der FMN-Reduktase

a: Bestimmung, verbunden mit Pristinamycin IIA-Synthase
b: spektralfotometrische Bestimmung.

Der Reinigungsfaktor wird nach Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung errechnet.
5.6.2. Herstellung von Oligonucleotiden ausgehend von der Proteinsequenz
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von NH₂-terminalen und internen Sequenzen des Proteins FMN-Reduktase möglich ist, Oligonucleotide zu synthetisieren.
Die NH₂-terminale Sequenz der FMN-Reduktase wurde durch Mikrosequenzierung, wie es in Beispiel 5.1.2. beschrieben ist, durchgeführt. 30 Reste wurden auf diese Weise identifiziert.
(NH₂-terminale Sequenzen, die am 4. und am 11. Rest beginnen, werden auch in der sequenzierten Probe gefunden).
Zwei Sequenzen im Inneren der FMN-Reduktase mit 13 und 21 Aminosäuren wurden nach Trypsinhydrolyse und Reinigung der erhaltenen Fragmente an einer Vydac C18-Säule ebenfalls identifiziert.
NH₂-terminale Sequenz des Proteins FMN-Reduktase:
(siehe Reste 2 bis 25 in SEQ ID NO: 7)
Interne Sequenzen des Proteins FMN-Reduktase:
(siehe Reste 102 bis 122 in SEQ ID NO: 7)
(siehe Reste 149 bis 161 in SEQ ID NO: 7)
Ausgehend von den in jeder der Sequenzen unterstrichenen Regionen und als Funktion der Degeneriertheit des spezifischen genetischen Codes der Streptomyces (siehe Beispiel 8) wurden die folgenden Gemische von Oligonucleotiden synthetisiert:
Gemisch, das der NH₂-terminalen Sequenz des Proteins FMN-Reduktase entspricht:
Gemische, die den inneren Sequenzen des Proteins FMN-Reduktase entsprechen:
5.6.3. Markierung der synthetischen Oligonucleotid-Gemische und Hybridisierung der Banken genomischer DNA von S. pristinaespirals SP92.
Dieses Beispiel beschreibt, wie spezifische Oligonucleotide eines Gens der Biosynthese der Pristinamycine radioaktiv markiert werden können, dann mit Membranen, auf die DNA der genomischen Banken von S. pristinaespirals transferiert wurde, hybridisiert werden können.
Die Markierung der Oligonucleotide wird durch Transfer der Gruppierung [γ – ³²P]Phosphat des markierten ATP durch die T4-Polynucleotidkinase, wie in 5.1.3. angegeben, in die 5'-terminale Position durchgeführt.
Ungefähr 2 × 500 ng jedes Oligonucleotidgemisches wurden so mit ³²P markiert und verwendet, um jede der zwei Banken zu hybridisieren.
Die Hybridisierung der Membrane jeder Bank wurde durchgeführt, wie es in Beispiel 5.1.3. angegeben ist.
5.6.4. Isolierung des Cosmids pIBV4 und Bestimmung der Region, die das Strukturgen der FMN-Reduktase enthält (snaC).
Das Cosmid pIBV4 wurde von einem Klon der Bank isoliert, die in dem Stamm E. coli HB101 angelegt worden war, der mit den drei Oligonucleotidgemischen gleichzeitig hybridisierte.
Das Cosmid wurde gereinigt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Es enthält ein Insert genomischer DNA von S. pristinaespiralis SP92, dessen Größe mit 48 kb bestimmt wurde. Eine Kartographie (7) wurde ausgehend von Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen, wie es in 5.1.4. angegeben ist, entwickelt.
Southern-Hyridisierungen der DNA von pIBV4, die durch verschiedene Enzyme verdaut worden war, mit den Oligonucleotidgemischen hat es ermöglicht, die Region zu identifizieren, die snaC, das Strukturgen der FMN-Reduktase, enthält. Die Southern-Techniken und die Hybridisierungen wurden durchgeführt, wie es in Beispiel 5.1.4. beschrieben ist.
Die Hybridisierungsresultate haben es erlaubt, zu zeigen, dass das Cosmid pIBV4 ein BamHI-BamHI-Fragment mit 4 kb besitzt, das die Sequenzen enthält, die den in Beispiel 5.6.3. hybridisierten Sonden homolog sind.
5.7. Beweis des Vorliegens des Strukturgens der p-Aminophenylalanin-(phenyl-N)-methyltransferase auf dem Cosmid pIBV2
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ausgehend von einem gereinigten Protein das entsprechende Strukturgen unter den bereits analysierten und sequenzierten Genen, wie es in Beispiel 6.7 und 7.8 beschrieben ist, und die auch in E. coli, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist, exprimiert werden, zu identifizieren
5.7.1. Identifizierung und Reinigung des Proteins, das bei der Methylierung des p-Aminophenylalanin zu p-Dimethylaminophenylalanin beteiligt ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie das Protein, das für die Methylierung des p-Aminophenylalanin zu p-Dimethylaminophenylalanin verantwortlich ist [die p-Aminophenylalanin-(phenyl-N)-methyltransferase], aus dem Stamm S. pristinaespiralis SP92 bis zur Homogenität gereinigt werden und wie man sie ausgehend von einem rekombinanten Stamm von E. coli rein erhalten kann (Beispiel 11).
5.7.1.A Bestimmung der Methylierungsaktivität von p-Aminophenylalanin in p-Methylaminophenylalanin und der Methylierungsaktivität von p-Methylaminophenylalanin in p-Dimethylaminophenylalanin.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung von zwei terminalen Aktivitäten der Biosynthese des p-Dimethylaminophenylalanins, das Bestandteil von Pristinamycin IA ist. Diese Aktivitäten wurden noch niemals beschrieben und besitzen die bemerkenswerte Eigenschaft, nur während des Zeitraums der Produktion der Pristinamycine exprimiert zu werden. Es handelt sich um die Methylierung des p-Aminophenylalanins in p-Methylaminophenylalanin (Methylierung 1) einerseits und die Methylierung des p-Methylaminophenylalanins in p-Dimethylaminophenylalanin (Methylierung 2); diese zwei Aktivitäten nutzen SAM als Donor für die Methylgruppierung (14).
Die zu bestimmenden enzymatischen Fraktionen (1 bis 20 Einheiten) werden während 30 Minuten bei 27°C in einem Gesamtvolumen von 200 μl pH 6,8-Puffer aus 50 mM Bis-tris-propan, enthaltend SAM (200 μm), dessen Methylgruppierung radioaktiv mit dem Isotop 14 des Kohlenstoffatoms (2 Ci/mol) markiert ist, in Gegenwart von p-Amino-L-phenylalanin (1 mM) zur Bestimmung der Methylierung 1 oder von p-Methylamino-L-phenylalanin (2,5 mM) zur Bestimmung der Methylierung 2 inkubiert.

Die Reaktion wird durch Zusatz von 16 μl 37%iger Salzsäure, danach 20 μl Natriumheptansulfonat mit 240 g/l angehalten. Nach Zentrifugation werden 150 μl Überstand in das HPLC-System mit folgendem Gradientenmodus injiziert:

– Mobile Phase A:

Elutionsmittel A = 1,2 g Natriumheptansulfonat + 2,5 ml Eisessig + Wasser (qsp 1000 ml) Elutionsmittel B = 1,2 g Natriumheptansulfonat + 2,5 ml Eisessig und 300 ml Acetonitril + Wasser (qsp 1000 ml)

– Stationäre Phase:

Nucleosil C18-Säule, 5 μm, 150 × 4,6 mm (Macherey-Nagel).

Am Ausgang der Säule werden die Substrate und Produkte der enzymatischen Reaktion durch Absorption bei 254 nm quantitativ bestimmt. Diese Detektion ist an eine radiochemische Detektion in Linie mit einem Detektor, Berthold LB506, der mit einer Zelle für Feststoff-Szintillation des Typs GT400-U4 ausgestattet ist, gekoppelt. Dies macht es möglich, den Einbau von radioaktiven Methylgruppierungen in die Produkte der Reaktion spezifisch zu verfolgen.
Die Einheit der enzymatischen Aktivität für die Methylierung 1 (für die Methylierung 2) ist als die Enzymmenge definiert, die notwendig ist, um 1 nmol Methylgruppierung in p-Aminophenylalanin (in p-Methylaminophenylalanin) einzubauen.
5.7.1.B. Reinigung der N-Methyltransferase aus S. pristinaespiralis SP92, die die SAM-abhängige Methylierung von p-Aminophenylalanin in p-Dimethylaminphenylalanin katalysiert [p-Aminophenylalanin-(phenyl-N)-Methyltransferase]
Dieses Experiment veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das in den Biosyntheseweg des Pristinamycin IA eingreift, gereinigt werden kann.
Indem die vorher in Beispiel 5.7.1.A. beschriebene Bestimmung verwendet wird, wird die Reinigung der SAM-abhängigen N-Methyltransferase durchgeführt, wie es unten beschrieben wird, wobei Sorge getragen wird, dass die aktiven Fraktionen gefroren und zwischen jeder Stufe; wenn erforderlich, bei –70°C konserviert werden.
240 g eines Zentrifugationsrückstands einer Kultur von S. pristinaespiralis SP92, die zu Beginn der Produktionsphase der Pristinamycine gesammelt worden war, die mit pH 7,2-Puffer aus 100 mM Phosphat, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0,5 M KCl, 10 Vol.-% Glycerin gewaschen worden waren, werden in 480 ml pH 8,0-Puffer aus 0,1 M Tris-HCl, enthaltend 4 mM DTE, 5 mM Benzamidin, 0,2 mM Pefabloc, 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/l STI, 2 mg/l Aprotinin, 20 Vol.-% Glycerin und 2 mg/ml Lysozym aufgenommen, wobei der Puffer bei +4°C gehalten wird. Die so erhaltene Suspension wird kräftig bei 4°C bewegt. Nach 30 Minuten Bewegung werden 0,2 mg/ml Desoxyribonuclease I und 5 mM MgCl₂ zugesetzt. Nach 90 Minuten Bewegung wird der Extrakt während einer Stunde mit 50.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird in 3 Fraktionen mit etwa 180 ml aufgeteilt. Jede wird durch Gelpermeation an einer Säule mit 500 ml Sephadex G25 Fine, die für einen natürlichen Durchfluss in einem pH 6,8-Puffer aus 20 mM Bis-tris, enthaltend, 4 mM DTE, 5 mM Benzamidin, 0,2 mM Pefabloc, 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/l STI, 2 mg/l Aprotinin, 20 Vol.-% Glycerin, äquilibriert worden war, entsalzt. Das Proteineluat wird dann (400 mg Protein pro Zyklus) an einer MonoQ HR 16/10- Säule mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min mit einem linearen steigenden Natriumchloridgradienten (0 bis 0,3 M) in einem Puffer mit pH = 6,8 aus 20 mM Bis-Tris, enthaltend 4 mM DTE, 2 mM Benzamidin, 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 20 Vol.-% Glycerin, chromatographiert. Am Ausgang der Säule werden die Fraktionen durch 10 Vol.-% pH 6,8-Puffer aus 20 mM Bis-Tris, enthaltend 4 mM DTE, 30 mM Benzamidin, 2 mM Pefabloc 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mg/l STI, 10 mg/l Aprotinin, 20 Vol.-% Glycerin, komplettiert. Unter diesen Bedingungen werden die zwei Methylierungsaktivitäten (1 und 2) in identischer Art in den Ausschlussfraktionen und den ersten Elutionsfraktionen detektiert. Diese Fraktionen werden kombiniert, durch Ultrafiltration an CentriPrep 10 konzentriert. Dieses Konzentrat wird in 0,85 M Ammoniumsulfat geleitet, dann an einer Phenyl-Superose HR 10/10-Säule bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min (20 bis 80 mg/Zyklus) mit einem abnehmenden linearen Gradienten an Ammoniumsulfat (0,85 bis 0 M) in einem 50 mM Bis-Tris-Puffer, pH = 6,8, enthaltend 4 mM DTE, 2 mM Benzamidin, 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 Vol.-% Glycerin, chromatographiert. Am Auslass der Säule werden die Fraktionen durch 10 Vol.-% 50 mM Bis-Tris-Puffer, pH = 6,8, enthaltend 4 mM DTE, 30 mM Benzamidin, 2 mM Pefabloc, 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mg/l STI, 10 mg/l Aprotinin, 10 Vol.-% Glycerin, ergänzt. Unter diesen Bedingungen werden die zwei Methylierungsaktivitäten (1 und 2) in den Elutionsfraktionen, die etwa 0,15 M Ammoniumsulfat entsprechen, in identischer Weise detektiert. Diese Fraktionen werden kombiniert, durch Ultrafiltration an Centricon 10 konzentriert, an PD-10-Säulen entsalzt, welche in einem 50 mM Tris-Puffer, pH = 8,2 (mit 5°C), enthaltend 4 mM DTE, 2 mM Benzamidin, 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 20 Vol.-% Glycerin, äquilibriert worden waren, dann an einer MonoQ HR 5/5-Säule, die in demselben Puffer äquilibriert worden war, mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min chromatographiert. Unter diesen Bedingungen werden die zwei Aktivitäten nicht auf der Säule zurückgehalten. Am Auslass der Säule werden die Ausschlussfraktionen, die demnach diese zwei Aktivitäten enthalten, durch 10 Vol.-% 50 mM Tris-Puffer, pH = 8,2 enthaltend 4 mM DTE, 30 mM Benzamidin, 2 mM Pefabloc, 100 μg/l E-64, 2 mg/l Leupeptin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 Vol.-% Glycerin, ergänzt. Diese Fraktionen werden dann durch Ultrafiltration an Centricon 10 konzentriert, dann an einer äquilibrierten Säule TSK G2000 SW 300 × 7,5 mm, 10 μm, mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml/min in 50 mM Hepes-Puffer, pH = 7,0, enthaltend 4 mM DTE, 0,2 mM Pefabloc, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 Vol.-% Glycerin, 0,15 M Natriumchlorid, chromatographiert. Die beiden Aktivitäten co-eluieren bei dieser Technik bei einer Retitionszeit, die einem Molekulargewicht in der Nähe von 30.000 entspricht. Nach dieser Stufe wird bei SDS-PAGE ein Hauptprotein sichtbar. Es liegt bei etwa 32.000. Tabelle: Reinigung des Enzyms der Methylierung von p-Aminophenylalanin zu p-Dimethylaminophenylalanin

^a: Es handelt sich um Einheiten der enzymatischen Aktivität für die Methylierung 1. In jeder Stufe ist der Wert der Einheiten der enzymatischen Aktivität für die Methylierung 2 120% desjenigen der Einheiten für die Methylierung 1. Der Reinigungsfaktor wird nach Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung errechnet.

5.7.1.C. Reinigung des rekombinanten Proteins von S. pristinaespiralis SP92, das SAM-abhängige N-Methyltransferase-Aktivität zeigt, das die Methylierung von p-Aminohenylalanin zu p-Dimethylaminophenylalanin katalysiert, ausgehend von E. coli::pVRC706.
Dieses Experiment veranschaulicht, wie ein Enzym von S. pristinaespiralis SP92, das in den Biosyntheseweg des Pristinamycin IA eingreift und bei E. coli durch Klonierung des Gens papM exprimiert wird, gereinigt werden kann.
Unter Verwendung der vorstehend in Beispiel 5.7.1.A. beschriebenen Bestimmung haben wir gezeigt, dass die Rohextrakte des rekombinanten Stamms E. coli::pVRC706 eine starke Aktivität für die Methylierung 1 und für die Methylierung 2 zeigen, während im E. coli-Vergleichsstamm (pMTL23) keine dieser zwei Aktivitäten detektiert wurde. Die Reinigung der p-Aminophenylalanin-(phenyl-N)-Methyltransferase, die SAM-abhängig ist und die Methylierung von p-Aminophenylalanin in p-Dimethylaminophenylalanin katalysiert, wurde dann durchgeführt.
Unter den selben Bedingungen wie die, die in Beispiel 5.7.1.B. beschrieben sind, außer einer Chromatographiestufe, die unterdrückt wurde (Reinigungsstufe an MonoQ HR 5/5), haben wir ein Protein bis zur Homogenität gereinigt, das bei Chromatographie an einer TSK G2000-Säule und bei SDS-PAGE ein Molekulargewicht zeigt, das identisch dem ist, das ein in Beispiel 5.7.1.B. gereinigtes Protein aufweist. Tabelle: Reinigung des Enzyms der Methylierung des p-Aminophenylalanins zu p-Dimethylaminophenylalanin, aus dem Stamm E. coli::pVRC706.

^a: Es handelt sich um Einheiten der enzymatischen Aktivität für die Methylierung 1. In jeder Stufe war der Wert für die Einheiten der enzymatischen Aktivität für die Methylierung 2 120% des Wertes der Einheiten für die Methylierung 1.

Der Reinigungsfaktor wird nach Erhöhung der spezifischen Aktivität der Fraktionen im Verlauf der Reinigung errechnet.
5.7.2. Identifizierung des Strukturgens der p-Aminophenylalanin-(phenyl-N)-Methyltransferase
Die NH₂-terminale Sequenz des Proteins mit 32.000, das in Beispiel 5.7.1.B. gereinigt wurde, wurde durch Mikrosequenzierung bestimmt, wie es in Beispiel 5.1.2. beschrieben ist. 10 Reste wurden auf diese Weise bestimmt:
TAAAPTLAQA
Die NH₂-terminale Sequenz des Proteins mit 32.000, das in Beispiel 5.7.1.C. gereinigt worden war, wurde durch Mikrosequenzierung bestimmt, wie es in Beispiel 5.1.2. beschrieben ist. Auf diese Weise wurden 10 Reste bestimmt:
TAAAPTLAQA
In den zwei Fällen handelt es sich um dieselben Reste und diese Sequenz entspricht genau dem Anfang der Proteinsequenz, die von der Sequenz des Gens papM abgeleitet ist (siehe Reste 2 bis 11 in SEQ ID NO: 10). Die gereinigte p-Aminophenylalanin(phenyl-N)-Methyltransferase ist demnach das Protein PapM.
BEISPIEL 6: Subklonierung der DNA-Fragmente, die in Cosmide kloniert wurden, wie sie in Beispiel 3 hergestellt wurden, und die die Gene von Interesse enthalten.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es ausgehend von Cosmiden, die wie in Beispiel 3 beschrieben konstruiert wurden und die Gene der Biosynthese der Pristinamycine II oder der Pristinamycine I enthalten, möglich ist, DNA-Fragmente, die diese Gene enthalten, zu subklonieren.
Diese Subklonierungen wurden durchgeführt, um letztlich die Nucleinsäuresequenz der identifizierten Gene wie die unterschiedlichen Konstruktionen, die in den folgenden Beispielen gezeigt werden, zu realisieren.
6.1. Isolierung des EcoRI-BglII-Fragments mit 5,5 kb, das das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase enthält
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV2, das das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase enthält, möglich ist, ein DNA-Fragment mit geringerer Größe, das dieses Gen enthält, zu subklonieren.
Ungefähr 10 μg des Cosmids pIBV2 wurden sukzessive durch die Restriktionsenzyme BglII und EcoRI (New England Biolabs) unter den vom Lieferanten empfohlenen Bedingungen geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel getrennt und das BglII-EcoRI-Fragment mit 5,5 kb wurde durch Elektroelution isoliert, wie es bei Maniatis et al. (1989) beschrieben ist.
Etwa 100 ng pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985), die durch BamHI und EcoRI geschnitten waren, wurden mit 200 ng des BglII-EcoRI-Fragments mit 5,5 kb unter den in Beispiel 3.3 beschriebenen Bedingungen ligiert.
Nach Transformation des Stamms TG1 und Selektion der Transformanten auf festem LB-Medium, das 150 μg/ml Ampicillin und 20 μg/ml X-gal enthielt, nach der von Maniatis et al. (1989) beschriebenen Technik wurde ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC402 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 15(A) dargestellt. Durch Hybridisierung, in Beispiel 5.2., wurde gezeigt, dass das EcoRI-BglII-Fragment mit 5,5 kb das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase von S. pristinaespiralis SP92 enthält. Das Plasmid pVRC402 enthält demnach das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase von S. pristinaespiralis SP92.
6.2. Isolierung eines BglII-BglII-Fragments mit 4,6 kb aus dem Cosmid pIBV2.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV2 möglich ist, ein DNA-Fragment mit geringerer Größe zu subklonieren, und zwar mit dem Ziel, die benachbarten Regionen des Strukturgens der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase, das Vorliegen anderer Gene, die bei einer Biosynthese der Pristinamycine I impliziert sind, zu identifizieren.
Die verschiedenen Stufen der Klonierung wurden durchgeführt, wie es weiter oben beschrieben wurde.
Ungefähr 10 μg des Cosmids pIBV2 wurden durch BglII geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel getrennt und das BglII-BglII-Fragment mit 4,6 kb wurde durch Elektroelution isoliert.
Ungefähr 100 ng pUC19, das durch BamHI geschnitten worden war, wurden mit 200 ng des BglII-BglII-Fragments ligiert.
Ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1, wie es in Beispiel 6.1. beschrieben ist, isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC501 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 15(B) gezeigt.
6.3. Isolierung des BamHI-BamHI-Fragments mit 6 kb, das die Strukturgene der zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase enthält.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV1 möglich ist, ein DNA-Fragment mit geringerer Größe, das die Strukturgene der zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase enthält, zu subklonieren.
Die verschiedenen Klonierungsstufen wurden wie weiter oben beschrieben durchgeführt.
Ungefähr 10 μg des Cosmids pIBV1 wurden durch BamHI geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel getrennt und das BamHI-Fragment mit 6 kb wurde durch Elektroelution isoliert.
Ungefähr 100 ng pBKS^– (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien), das durch BamHI geschnitten worden war, wurden mit 200 ng des BamHI-Fragments mit 6 kb ligiert.
Ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1 isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pXL2045 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 6 gezeigt. Durch Hybridisierung wurde, in Beispiel 5.1., gezeigt, dass das Fragment BamHI mit 6 kb die Gene snaA und snaB enthält, die für die zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase von S. pristinaespiralis SP92 codieren. Das Plasmid pXL2045 enthält demnach die Gene snaA und snaB, die für die zwei Untereinheiten der Pristinamycin IIA-Synthase von S. pristinaespiralis SP92 codieren.
6.4. Isolierung des SphI-Fragments mit 6,2 kb, das einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase II enthält.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV3 möglich ist, ein DNA-Fragment mit kleinerer Größe, das einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase II enthält, zu subklonieren.
Die verschiedenen Klonierungsstufen wurden wie weiter oben beschrieben durchgeführt.
Etwa 10 μg des Cosmids pIBV3 wurden durch SphI geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden an 0,8% Agarosegel getrennt und das Fragment SphI mit 6,2 kb wurde durch die Technik des Kits "Geneclean", der von der Firma Bio101-Ozyme im Handel ist, isoliert.
Etwa 100 ng pUC19, das durch SphI geschnitten worden war, wurden mit 200 ng des SphI-Fragments mit 6,2 kb ligiert.
Ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1 isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC1105 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 17 gezeigt.
6.5. Isolierung des SphI-Fragments mit 8,4 kb, das einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase III enthält.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV3 möglich ist, ein DNA-Fragment geringerer Größe, das einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase III enthält, zu subklonieren.
Die verschiedenen Klonierungsstufen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Etwa 10 μg des Cosmids pIBV3 wurden durch SphI geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden an 0,8% Agarosegel getrennt und das SphI-Fragment mit 8,4 kb wurde durch die Technik des Kits "Geneclean", der von der Firma Bio101-Ozyme im Handel ist, isoliert.
Etwa 100 ng pUC19, das durch SphI geschnitten worden war, wurden mit 200 ng des SphI-Fragments mit 8,4 kb ligiert.
Ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1 isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC1106 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 18 gezeigt.
6.6. Isolierung des SphI-Fragments mit 6,6 kb, das einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase IV enthält.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend vom Cosmid pIBV3 möglich ist, ein DNA-Fragment mit geringerer Größe, das einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase IV enthält, zu subklonieren.
Die verschiedenen Klonierungsstufen wurden wie weiter oben beschrieben durchgeführt.
Etwa 10 μg des Cosmids pIBV3 wurden durch SphI geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden an 0,8% Agarosegel getrennt und das SphI-Fragment mit 6,6 kb wurde durch die Technik des Kits "Geneclean", der durch die Firma Bio101-Ozyme im Handel ist, isoliert.
Etwa 100 ng pUC19, das durch SphI geschnitten worden war, wurden mit 200 ng des SphI-Fragments mit 6,6 kb ligiert.
Ein Klon, der das gesuchte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1 isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC1104 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 19 gezeigt.
6.7. Isolierung des HindIII-HindIII-Fragments mit 17 kb, das das Cosmid pHC79 enthält und die Gene trägt, die oberhalb der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase (Pristinamycin I-Synthease I) liegen.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV2, das das Strukturgen der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase enthält, möglich ist, einen großen Teil dieses Cosmids zu deletieren, um nur den Teil zu konservieren, der oberhalb der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase liegt.
Ungefähr 200 ng des Cosmids pIBV2 wurden durch das Restriktionsenzym HindIII geschnitten. Das Enzym wurde 30 Minuten bei 85°C denaturiert, wie es vom Lieferanten empfohlen wird. Das so verdaute Cosmid pIBV2 wurde in Ethanol präzipitiert, wie es bei Maniatis et al. (1989) beschrieben ist, und mit sich selbst in einem Volumen von 50 μl religiert.
Nach Transformation des Stamms TG1 und Selektion der Transformanten auf festem LB + 150 μg/ml Ampicillin nach der von Maniatis et al. (1989) beschriebenen Technik wurde ein Klon, der das Cosmid pHC79 und den Teil, der oberhalb der 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase liegt, enthält (das Ganze entspricht einer Größe von etwa 17 kb), isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC900 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 20 gezeigt.
6.8. Isolierung des BamHI-SstI-Fragments mit 1,5 kb, das aus dem Cosmid pIBV3 stammt.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV3, das das Gen snaA enthält, welches für die große Untereinheit der PIIA-Synthase codiert, möglich ist, ein DNA-Fragment, das stromaufwärts liegt, zu subklonieren, um es zu untersuchen und zu sequenzieren.
Etwa 10 μg des Cosmids pIBV3 wurden sukzessive durch die Restriktionsenzyme SstI und BamHI geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden an 0,8% Agarosegel getrennt und das BamHI-SstI-Fragment mit 1,5 kb wurde durch die Technik des Kits "Geneclean", der von der Firma Bio101-Ozyme im Handel ist, isoliert.
Etwa 100 ng des Plasmids pDH5 (Hilleman et al., 1991), das durch BamHI und SstI geschnitten war, wurden mit 200 ng des BamHI-SstI-Fragments unter den in Beispiel 3.3. beschriebenen Bedingungen ligiert.
Nach Transformation des Stamms TG1 und Selektion der Transformanten auf festem LB + 150 μg/ml Ampicillin + X-gal nach der von Maniatis et al. (1989) beschriebenen Technik wurde ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC1000 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 21 gezeigt.
6.9. Isolierung des BamHI-BamHI-Fragments mit 4 kb, das das Strukturgen der FMN-Reduktase enthält.
Dieses Beispiel beschreibt, wie es ausgehend von dem Cosmid pIBV4, das das Strukturgen der FMN-Reduktase enthält (snaC), möglich ist, ein DNA-Fragment mit geringerer Größe, das dieses Gen enthält, zu subklonieren.
Die verschiedenen Klonierungsstufen wurden wie weiter oben beschrieben durchgeführt.
Etwa 10 μg des Cosmids pIBV4 wurden durch das Restriktionsenzym BamHI geschnitten. Die so erhaltenen Restriktionsfragmente wurden an 0,8% Agarosegel getrennt und das BamHI-BamHI-Fragment mit 4 kb wurde durch Elektroelution isoliert.
Etwa 100 ng pUC19, das durch BamHI geschnitten worden war, wurde mit 200 ng des BamHI-BamHI-Fragments mit 4 kb ligiert.
Nach Transformation des E. coli-Stamms DH5α (supE44 DlacU169 (f80lacZDM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) (Hanahan, 1983) und Selektion der Transformanten auf festem LB + 150 μg/ml Ampicillin + X-gal nach der von Maniatis et al. (1989) beschriebenen Technik wurde ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC509 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 22 gezeigt.
BEISPIEL 7: Sequenz der isolierten DNA-Fragmente, die die Biosynthesegene der Pristinamycine von S. pristinaespirals SP92 enthalten.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Sequenzierung der DNA-Fragmente, die einerseits Gene tragen, die bei der Biosynthese der Pristinamycine der Familie der Pristinamycine I beteiligt sind, und andererseits Gene tragen, die bei der Biosynthese der Pristinamycine der Familie der Pristinamycine II des Stamms S. pristinaespiralis beteiligt sind.
7.1. Sequenzierung eines BamHI-XhoI-Fragments mit 5 kb.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz eines Fragments, das die Gene snaA und snaB von S. pristinaespiralis SP92 enthält, erhalten werden kann.
Das BamHI-XhoI-Fragment gehört zu dem BamHI-BamHI-Fragment mit 6 kb, das in das Plasmid pBKS-kloniert wurde, um das Plasmid pXL2045, das in Beispiel 6.3. beschrieben wurde, zu ergeben. Subfragmente dieses BamHI-XhoI-Inserts mit 5 kb wurden dann durch enzymatischen Verdau erhalten, danach in die Phagen M13mp18 oder M13mp19 (Messing et al., 1981) in den zwei Orientierungen subkloniert. Die verwendeten Subklonierungsstellen sind die folgenden: EcoRI, PstI, PstI, NruI, EcoRI, NruI, NotI, SalI, SstI, XhoI, SalI und XhoI und sind in 16 dargestellt.
Diese verschiedenen Inserts wurden durch die Methode der Kettenbeendigungsreaktion sequenziert, indem als Syntheseprimer der universelle Primer (Maniatis et al., 1989) oder synthetisierte Oligonucleotide (wie es in Beispiel 5 beschrieben ist) und Komplementäre einer Sequenz mit 20 Nucleotiden des zu sequenzierenden Inserts verwendet wurden.
Die Überlappung zwischen diesen verschiedenen Inserts hat es ermöglicht, die Gesamtnucleotidsequenz an den zwei Strängen des BamHI-XhoI-Fragments zu entwickeln, die 5392 bp umfasst (SEQ ID NO: 1).
7.2. Sequenzierung einer Region mit 1870 bp des Fragments EcoRI-BglII mit 5,5 kb.
Dieses Beispiel erläutert, wie die Nucleotidsequenz eines Fragments, das das Gen snbA von S. pristinaespiralis SP92 enthält, erhalten werden kann.
Die sequenzierte Region mit 1870 bp gehört zu dem Fragment EcoRI-BglII mit 5,5 kb, das in das Plasmid pUC19 kloniert wurde, um das in Beispiel 6 beschriebene Plasmid pVRC402 zu ergeben (15(A)). Unterfragmente des EcoRI-BglII-Inserts mit 5,5 kb wurden durch enzymatischen Verdau erhalten, dann in die Phagen M13mp18 oder M13mp19 in den zwei Orientierungen kloniert. Die Subklonierungsstellen sind HindIII, PstI und HindIII und sind in 15(A) dargestellt.
Die Überlappung zwischen diesen Fragmenten hat es ermöglicht, die Gesamtsequenz der Region Sau3A-Sau3A zu klären, die 1870 bp umfasst (SEQ ID NO: 5).
7.3. Sequenz einer Region mit 1830 bp in dem BglII-BglII-Fragment mit 4,6 kb.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz eines Fragments benachbart dem, das das Gen snbA von S. pristinaespiralis SP92 enthält, erhalten werden kann.
Diese Sequenz wurde durch Subklonierung der Fragmente BamHI-PstI mit 1 kb und PstI-EcoRI mit 2,1 kb (15(B)) ausgehend von pVRC501 (Beispiel 6) in die Vektoren M13mp18 und M13p19 subkloniert. Die PstI-Stelle wurde durch Subklonierung eines Sau3A-Sau3A-Fragments mit 423 bp, das diese Stelle überlappt, danach Sequenzierung, gekreuzt. Die so erhaltene Sequenz mit 1830 bp ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt.
7.4. Sequenzierung von zwei Regionen mit 227 bp und 247 bp des SphI-Fragments mit 6,2 kb
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz von Fragmenten, die ein Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase II (snbC) von S. pristinaespiralis enthält, erhalten werden kann.
Die sequenzierten Regionen mit 227 und 247 bp gehören zu dem SphI-Fragment mit 6,2 kb, das in das Plasmid pUC19 kloniert wurde, um das in Beispiel 6.4. (17) beschriebene Plasmid pVRC1105 zu erhalten. Subfragmente des SphI-Inserts mit 6,2 kb wurden durch enzymatisches Schneiden erhalten, dann in die Phagen M13mp18 oder M13mp19 in den zwei Orientierungen subkloniert. Die Subklonierungsstellen sind XhoI, PstI und BglII und sind in 17 dargestellt. Das PstI-BglII-Fragment mit 227 bp wurde vollständig sequenziert und 247 bp wurden ausgehend von dem XhoI-Fragment mit 900 bp sequenziert; diese Sequenzen sind in SEQ ID NO: 11 und 12 gezeigt.
7.5. Sequenzierung der zwei Regionen mit 192 bp und 474 bp des SphI-Fragments mit 8,4 kb.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz von Fragmenten, die Teile des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase III (snbD) von S. pristinaespiralis enthalten, erhalten werden können.
Die Regionen mit 192 und 474 bp, die sequenziert wurden, gehören zu dem SphI-Fragment mit 8,4 kb, das in das Plasmid pUC19 kloniert worden war, um das Plasmid pVRC1106, das in Beispiel 6.5. beschrieben ist (18), zu ergeben. Subfragmente des SphI-Inserts vom 8,4 kb wurden durch enzymatisches Schneiden erhalten, dann in den Phagen M13mp18 oder M13mp19 in den zwei Orientierungen subkloniert. Die Subklonierungsstellen sind XhoI, PstI, SphI und BglII und sind in 18 dargestellt.
Die Fragmente BglII-SphI mit 192 bp und PstI-XhoI mit 474 bp wurden vollständig sequenziert: diese Sequenzen sind in SEQ ID NO. 13 und 14 angegeben.
7.6. Sequenzierung der zwei Regionen mit 485 bp und 291 bp des SphI-Fragments mit 6,6 kb.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz von Fragmenten, die Teile des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase IV (snbE) von S. pristinaespiralis enthalten, erhalten werden können.
Die sequenzierten Regionen mit 291 und 485 bp gehören zu dem SphI-Fragment mit 6,6 kb, das in das pUC19-Plasmid kloniert worden war, um das Plasmid pVRC1104 zu ergeben, das in Beispiel 6.6 beschrieben ist (19). Unterfragmente des SphI-Inserts mit 6,6 kb wurden durch enzymatischen Verdau erhalten, dann in Phage M13mp18 oder M13mp19 in den zwei Orientierungen subkloniert. Die Subklonierungsstellen sind XhoI, PstI und SphI und sind in 19 dargestellt. Das XhoI-SphI-Fragment mit 485 pb wurde vollständig sequenziert und 291 bp wurden ausgehend von dem PstI-Fragment mit 1500 bp sequenziert: diese Sequenzen sind in SEQ ID NO: 15 und 16 gezeigt.
7.7. Sequenzierung einer Region mit 645 bp in einem XhoI-XhoI-Fragment mit 3,4 kb, das aus pVRC900 isoliert wurde.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz eines Fragments, das stromaufwärts desjenigen, das das Gen snbA von S. pristinaespiralis enthält, gelegen ist, erhalten werden kann.
Um diese Sequenz zu verwirklichen, wurde zunächst ein XhoI-XhoI-Fragment mit 3,4 kb in den Vektor pUC18 subkloniert, und zwar ausgehend vom Vektor pVRC900, der in 6.7. beschrieben ist. Die verschiedenen Klonierungsstufen wurden wie in 6.1. beschrieben durchgeführt: das Plasmid pVRC900 wurde durch das Restriktionsenzym XhoI verdaut und die so erhaltenen Fragmente wurden an 0,8% Agarosegel getrennt. Das XhoI-XhoI-Fragment mit 3,4 kb wurde durch Elektroelution gereinigt und mit pUC18, das durch das Restriktionsenzym SalI verdaut worden war, ligiert. Nach Transformation in TG1 wurde ein Klon, der das XhoI-XhoI-Fragment mit 3,4 kb trägt, isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC903 genannt. Seine Restriktionskarte ist in 23 gezeigt.
Dann wurde die Sequenz mit 645 bp durch Subklonierung der Fragmente PvuII-EcoRI mit 1,4 kb und PvuII-EcoRI mit 0,9 kb (23) aus pVRC903, das unten beschrieben wurde, in die Vektoren M13mp18 und M13mp19 verwirklicht. Um die Klonierungen zu realisieren, wurden die Vektoren M13mp18 und M13mp19 zunächst durch das Restriktionsenzym BamHI verdaut; die so freigesetzten kohäsiven Enden wurden durch das große Fragment der DNA-Polymerase I (Klenow: New England Biolabs) nach der von Maniatis et al. (1989) beschriebenen Technik aufgefüllt, und zwar so, dass vorstehende Enden gebildet wurden, die mit den durch den PvuII-Verdau freigesetzten Enden kompatibel sind; die Vektoren wurden dann durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Die PvuII-Stelle wurde durch Subklonierung eines PstI-PstI-Fragments mit 2,2 kb, das aus pVRC903 isoliert worden war, das mit dieser Stelle überlappt, durchquert. Die so erhaltene Sequenz mit 645 bp wird durch die SEQ ID NO: 9 dargestellt.
7.8 Sequenzierung einer Region mit 1050 bp in einem PstI-PstI-Fragment mit 4,1 kb, das aus pVRC900 isoliert wurde.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz eines Fragments, das stromabwärts desjenigen, das das Gen snbA von S. pristinaespiralis enthält, lokalisiert ist, erhalten werden kann.
Um diese Sequenz herzustellen, wurde vorab ein PstI-PstI-Fragment mit 4,1 kb in den Vektor pUC19, ausgehend vom Vektor pVRC900, der in 6.7. beschrieben ist, subkloniert. Die verschiedenen Klonierungsstufen wurden wie in 6.1 beschrieben durchgeführt. Das Plasmid pVRC900 wurde durch das Restriktionsenzym PstI verdaut und die so erhaltenen Fragmente wurden an 0,8% Agarosegel getrennt. Das PstI-PstI-Fragment mit 4,1 kb wurde durch Elektroelution gereinigt und mit pUC19, das durch das Restriktionsenzym PstI geschnitten worden war, ligiert. Nach Transformation in TG1 wurde ein Klon, der das PstI-PstI-Fragment mit 4,1 kb trägt, isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC409 genannt, seine Restriktionskarte ist in 24 gezeigt.
Diese Sequenz wurde dann durch Subklonierung der Fragmente XhoI-XhoI mit 0,7 kb und XhoI-StuI mit 1 kb (24) ausgehend von pVRC409, das oben beschrieben wurde, in die Vektoren M13mp18 und M13mp19 verwirklicht. Die XhoI-Stelle im Inneren der Sequenz wurde durch Sequenzierung am Doppelstrang ausgehend vom Plasmid pVRC409 traversiert. Die so erhaltene Sequenz mit 1050 bp ist in SEQ ID NO: 10 dargestellt.
7.9. Sequenzierung einer Region mit 640 bp in dem BamHI-SstI-Fragment mit 1,5 kb.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz eines Fragments benachbart zu dem, das die Gene snaA und snaB von S. pristinaespiralis enthält, die für die zwei Untereinheiten der PIIA-Synthase codieren, erhalten werden kann.
Diese Sequenz wird durch Subklonierung des BamHI-SstI-Fragments mit 1,5 kb (21) ausgehend von pVRC1000 (Beispiel 6.8.) in die Vektoren M13mp18 und M13mp19 (siehe Beispiel 7.1.) realisiert. Die erhaltene Sequenz mit 640 bp ist in SEQ ID NO: 8 dargestellt.
7.10. Sequenzierung der XhoI-KpnI-Region mit 694 bp, die in dem BamHI-BamHI-Fragment mit 4 kb vorliegt.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Nucleotidsequenz eines Fragments, das das Gen snaC von S. pristinaespiralis enthält, erhalten werden kann.
Die sequenzierte Region mit 694 bp gehört zu dem BamHI-BamHI-Fragment mit 4 kb, das in das Plasmid pUC19 kloniert wurde, um das Plasmid pVRC509 zu ergeben, das in Beispiel 6.9. beschrieben ist. Ein XhoI-KpnI-Fragment mit 694 bp, das durch doppelten Verdau des Plasmid pVRC509 mit den Restriktionsenzymen XhoI und KpnI und Hybridisieren mit den drei Oligonucleotidsonden, die in 5.6. beschrieben sind, erhalten wurde, wurde in die Phagen M13mp18 und M13mp19 kloniert. Die Stellen der Subklonierung XhoI und KpnI sind in 22 dargestellt.
Die Sequenz des so erhaltenen Fragments ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt.
BEISPIEL 8: Analyse der Nucleotidsequenzen durch Bestimmung der offenen Leseraster
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die in den in Beispiel 7 definierten Nucleotidsequenzen vorliegen, und Gene zu identifizieren, die in der Biosynthese der Pristinamycine I und der Pristinamycine II von S. pristinaespiralis SP92 impliziert sind, sowie die durch diese Gene codierten Polypeptide zu identifizieren.
8.1. BamHI-XhoI-Fragment mit 5 kb (pXL2045).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die im Inneren des BamHI-XhoI-Fragments mit 5 kb vorliegen, das vorher isoliert und sequenziert wurde, wie es in den Beispielen 6 und 7 beschrieben ist.
Wir haben das Vorliegen von offenen Leserastern im Inneren des BamI-XhoI-Fragments mit 5 kb untersucht, indem wir die Tatsache ausnutzten, dass die DNA der Streptomyces einen hohen prozentualen Anteil an Basen G und C aufweist, sowie eine starke Richtung in der Verwendung der Kodons, die die codierenden Phasen bilden, aufweist (Bibb et al., 1984). Die Methode von Staden und McLachlan (1982) erlaubt es, die Wahrscheinlichkeit der codierenden Phase als Funktion der Verwendung der Kodons von Genen von Streptomyces zu berechnen, welche bereits sequenziert wurden und in einer Kartei gesammelt wurden, die 19.673 Kodons enthält, die von dem Informationsdienst BISANCE (Dessen et al., 1990) erhalten wurde.
Diese Methode erlaubt es, vier offene Leseraster im Inneren des BamHI-XhoI-Fragments mit 5 kb mit starker Wahrscheinlichkeit zu charakterisieren, die in der folgenden Tabelle angegeben sind. Sie werden nach ihrer Position ausgehend von der BamHI-Stelle Raster 1 bis 4 bezeichnet. Für jedes ist seine Länge in Basen, seine Position im Inneren des Fragments (die BamHI-Stelle ist in Position 1 lokalisiert), sowie das Molekulargewicht als kDa des entsprechenden Proteins angegeben. Die Raster 1, 3 und 4 werden durch denselben Strang codiert und das Raster 3 wird durch den komplementären Strang codiert (16).

– Die Raster 1 und 3 entsprechen den Proteinen SnaA (SEQ ID NO: 2) und SnaB (SEQ ID NO: 3), die vorher isoliert wurden, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, und für die die Klonierung der Gene in Beispiel 6 detalliert beschrieben ist. Tatsächlich sind die NH₂-terminalen Sequenzen der Produkte der ORFs 1 und 3 identisch mit den NH₂-terminalen Sequenzen, die für die Proteine SnaA bzw. SnaB in Beispiel 5.1.2. gefunden wurden, mit Ausnahme des aminoterminalen Methionins, das ausgeschnitten worden war. Im Übrigen sind die nach den Sequenzen berechneten Molekülmassen mit den scheinbaren Molekülmassen der Proteine SnaA und SnaB, die jeweils durch SDS-PAGE, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, bestimmt wurden, vergleichbar.
– Der Vergleich des Produktes des offenen Leserasters Nr. 4 mit den Proteinsequenzen, die in der NBRF-Bank enthalten sind, lässt eine Homologie mit verschiedenen S-Adenosylmethionin-(oder SAM)-Synthasen, insbesondere von E. coli (Markham et al., 1984), von Ratten (Horikawa et al., 1989) und von S. cerevisiae (Thomas et al., 1988) zum Vorschein kommen. Die Prozentwerte für die Homologie, die bezogen auf die Gesamtheit der Sequenz mit Hilfe des Algorithmus von Kanehisa (1984) berechnet wurden, variieren von 51,8 bis 55,4%.

Diese Vergleiche von Sequenzen ermöglichen es, zu beweisen, dass das Produkt des offenen Leserasters Nr. 4 eine SAM-Synthase ist, die in der Biosynthese der Pristinamycine I oder II beteiligt ist. Dieses Gen wurde samS genannt (SEQ ID NO: 4).
Der Beweis der Beteiligung des Gens samS in der Biosynthese der Pristinamycine wird durch die Konstruktion der Mutanten von SP92, die in diesem Gen disruptiert ist, wie in Beispiel 9.2. beschrieben, bestätigt.

– Der Vergleich der Sequenz des Produktes des offenen Leserasters Nr. 2 mit den Proteinsequenzen, die in der Genpro-Bank enthalten sind, macht deutlich, dass ein innerer Teil dieses Proteins zu 36% mit einem inneren Teil des ersten offenen Leserasters der Insertionssequenz (IS891) von Anabaena (Bancroft und Wolk, 1989) homolog ist. Dieses Resultat legt nahe, dass das offene Leseraster Nr. 2, ORF 401 genannt, zu einer Insertionssequenz gehört, und dass demnach eine Insertionssequenz existiert, die zwischen den Genen snaA und snaB liegt.

8.2. Sau3A-Sau3A-Fragment mit 1870 bp (pVRC402)
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die im Inneren des Fragments Sau3A-Sau3A mit 1870 bp, das vorher isoliert und sequenziert wurde, wie es in den Beispielen 6 und 7 beschrieben ist, vorliegen.
Die Untersuchung der offenen Leseraster für das Sau3A-Sau3A-Fragment wurde wie vorstehend durchgeführt. Ein einziges vollständiges offenes Leseraster konnte so bewiesen werden. Seine Merkmale sind die folgenden: Dieses Raster erstreckt sich von Position 109 bis Position 1858 des Sau3A-Sau3A-Fragments, was einem Raster von 1749 Basen entspricht, die für ein Protein mit 582 Aminosäuren codieren, das eine Molekülmasse von 61.400 Da hat. Dieses Protein entspricht dem Protein SnbA, das vorher gereinigt wurde, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, und für das die Klonierung des Gens detailliert in Beispiel 6 beschrieben ist. Tatsächlich ist die NH₂-terminale Sequenz des Produktes des ORF, das im Sau3A-Sau3A-Fragment vorliegt, identisch mit der NH₂-terminalen Sequenz, die für das Protein SnbA in Beispiel 5.2. gefunden wird. Die Molekülmasse von 61.400 Da, die nach der Sequenz errechnet wurde, ist mit der scheinbaren Molekülmasse des Proteins SnbA vergleichbar, die nach SDS-PAGE mit 67.000 Da und durch Gelpermeationschromatographie mit 60.000 Da geschätzt wird, wie es in Beispiel 5.2.1.B. beschrieben ist.
Das Gen snbA codiert demnach für das Enzym, das die Bildung des Acyladenylat 3-Hydroxypicolinyl-AMP ausgehend von einem Molekül 3-Hydroxypicolinsäure und einem Molekül ATP katalysiert: 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Ligase (SEQG ID NO: 5).
8.3. Fragment mit 1830 bp (pVRC501).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die im Inneren des sequenzierten Fragments mit 1830 bp vorliegen, und zwar ausgehend von dem vorher isolierten BamHI-EcoRI-Fragment mit 3,1 kb.
Die Untersuchung der offenen Leseraster für das Fragment mit 1830 bp wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Ein einziges vollständiges offenes Leseraster konnte auf diese Weise bewiesen werden. Seine Merkmale sind die folgenden: Der wahrscheinliche Start dieses Rasters befindet sich in Position 103 und das Ende befindet sich in Position 1686 der Region mit 1830 bp, die ausgehend von dem BamHI-EcoRI-Fragment sequenziert wurde, was einem Protein mit 528 Aminosäuren entspricht, das ein ungefähres Molekulargewicht von 54.000 hat.
Der Vergleich der Sequenz dieses Proteins mit den Sequenzen, die in der Genepro-Bank enthalten sind, lässt erkennen, dass sie zu Proteinen homolog ist, die eine Transportfunktion für verschiedene Metaboliten, insbesondere für das Tetracyclin bei verschiedenen Mikroorganismen (Khan und Novick, 1983; Hoshino et al., 1985), Actinorhodin (Fernandez-Moreno et al., 1991) und Methylenomycin (Neal und Chater, 1987) bei S. coelicolor haben.
Diese Angaben zeigen, dass das Produkt des offenen Leserasters, das in dem BamHI-EcoRI-Fragment mit 3,1 kb enthalten ist, ein Transportprotein ist, das es möglich macht, die Pristinamycine I (und gegebenenfalls die Pristinamycine II) aus der Zelle zu exportieren. Dieses Protein wurde SnbR genannt und das entsprechende Gen wurde snbR genannt (SEQ ID NO: 6).
Die Analyse des Hydrophobizitätsprofils des Proteins SnbR durch das Verfahren nach Kyte und Doolittle (1982) unterstützt seine Membranlokalisierung und demnach seine Transportfunktion.
8.4. Fragment mit 1050 bp (pVRC409).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die im Inneren des Fragments mit 1050 bp vorliegen, das vorher ausgehend von pVRC409 sequenziert wurde, wie es in Beispiel 7.8. beschrieben ist.
Die Untersuchung der offenen Leseraster für das Fragment mit 1050 bp wurde wie vorstehend durchgeführt. Ein einziges vollständiges offenes Leseraster konnte auf diese Weise bewiesen werden. Seine Merkmale sind die folgenden: Dieses Raster erstreckt sich von der Position 84 bis zur Position 962 des sequenzierten Teils, was einem Raster von 878 Basen entspricht, die für ein Protein mit 292 Aminosäuren und einer Molekülmasse von 32.000 Da codieren. Dieses Protein wurde Protein PapM genannt. Es wurde im Übrigen aus dem Stamm S. pristinaespiralis SP92 gereinigt, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. Die Molekülmasse von 32.000 Da, die nach der Sequenz errechnet wurde, ist identisch mit der scheinbaren Molekülmasse von 32.000 Da, die mit SDS-PAGE bestimmt wurde, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. Im Übrigen entspricht die NH₂-terminale Sequenz dieses Proteins, dargestellt, wie in Beispiel 5 beschrieben ist, tatsächlich der NH₂-terminalen Sequenz des Proteins PapM, das durch Analyse der offenen Leseraster der Sequenz mit 1050 bp identifiziert wurde (SEQ ID NO: 10).
8.5. Fragment mit 227 bp und 247 bp (pVRC1105).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die in den Fragmenten mit 227 bp und 247 bp vorliegen, die aus pVRC1105 sequenziert wurden, wie es in den Beispielen 6 und 7 beschrieben ist.
Die Untersuchung des offenen Rasters für diese zwei Fragmente wurde wie vorstehend durchgeführt. Ein nicht vollständiges Leseraster konnte in den zwei Fällen über die gesamte Länge des Fragments bewiesen werden.
Die aus dem offenen Raster, das in dem Fragment mit 247 bp identifiziert wurde, welches aus dem Fragment XhoI mit 900 bp isoliert worden war, erhalten wurde, enthält eine der inneren Sequenzen des Proteins SnbC, das wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt worden war.
Der Vergleich des Produktes der offenen Raster, die bei den Fragmenten mit 227 bp und 247 bp, die aus pVRC1105 isoliert worden waren, identifiziert wurden, mit den Sequenzen der Genpro-Bank macht klar, dass sie zu den Peptidsynthasen homolog sind. Das vom Fragment mit 277 bp abgeleitete zeigt eine 24,5%ige Homologie mit der α-Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin-Synthase von Acremonium chrysogenum (Gutierrez et al., 1991). Das vom Fragment mit 247 bp abgeleitete zeigt eine 34,9%ige Homologie mit der Gramicidin-S-Synthase II von Bacillus brevis (Turgay et al., 1992) und eine 28%ige Homologie mit der α-Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin-Synthase von Acremonium chrysogenum (Gutierrez et al., 1991).
Dies bestätigt, dass das Cosmid pIBV3, das in Beispiel 5.1. isoliert wurde, einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase II, die in Beispiel 5.3. beschrieben wurde und SnbC genannt wird, enthält (SEQ ID NO: 11 und 12).
8.6. Fragment mit 192 bp und 474 bp (pVRC1106).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster, die in den Fragmenten mit 192 bp und 474 bp, die aus pVRC1106 sequenziert wurden, wie es in den Beispielen 6 und 7 beschrieben ist, vorliegen, zu bestimmen.
Die Untersuchung des offenen Leserasters für diese zwei Fragmente wurde wie vorstehend durchgeführt. Auf dem Fragment mit 192 bp, das aus pVRC1106 isoliert worden war, konnte ein nicht vollständiges Leseraster bewiesen werden. Seine Merkmale sind die folgenden: Dieses Raster beginnt in Position 3 des sequenzierten Teils in Richtung der BglII-Stelle. Es wurde kein Stoppcodon identifiziert, was anzeigt, dass dieses offene Leseraster nicht terminiert ist.
Die Sequenz, die ausgehend von dem offenen Leseraster erhalten wurde, das in dem BglII-SphI-Fragment mit 192 bp identifiziert wurde, enthält die innere Sequenz des Proteins SnbD, das wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt wurde, die sich tatsächlich als die NH₂-terminale Sequenz des Proteins erwies.
Über die gesamte Länge des XhoI-PstI-Fragments mit 474 bp konnte ein nicht vollständiges Leseraster bewiesen werden.
Der Vergleich des Produktes des offenen Leserasters, das in dem Fragment mit 474 bp identifiziert wurde, welches aus pVRC1106 identifiziert worden war, mit den Sequenzen der Genpro-Bank lässt erkennen, dass dieses Proteinfragment eine 30 bis 40%ige Homologie mit den Peptidsynthasen zeigt, z.B. 39,4% Homologie mit der Gramicidin-S-Synthase II von Bacillus brevis (Turgay et al., 1992) und eine 34%ige Homologie mit der α-Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin-Synthase von Acremonium chrysogenum (Gutierrez et al., 1991).
Dies bestätigt, dass das in Beispiel 5.1. isolierte Cosmid pIBV3 wirklich einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase III, die in Beispiel 5.4. beschrieben wurde und SnbD bezeichnet wird, enthält (SEQ ID NO: 13 und 14).
8.7. Fragment mit 291 bp und 485 bp (pVRC1104).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die im Inneren der Fragmente mit 291 bp und 485 bp vorliegen, die aus pVRC1104 sequenziert wurden, wie es in den Beispielen 6 und 7 beschrieben ist.
Die Untersuchung des offenen Rasters für diese zwei Fragmente wurde wie vorstehend durchgeführt. In den beiden Fällen konnte über die gesamte Länge des Fragments ein nicht vollständiges Leseraster bewiesen werden.
Die Sequenz, die aus dem offenen Leseraster erhalten wurde, das in dem Fragment mit 291 identifiziert wurde, welches aus dem PstI-Fragment mit 1450 bp isoliert worden war, enthält die innere Sequenz des Proteins SnbE, das wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt worden war.
Der Vergleich des Produktes des offenen Rasters, das im XhoI-SphI-Fragment mit 485 bp identifiziert worden war, welches aus pVRC1104 isoliert worden war, mit den Sequenzen der Genpro-Bank macht deutlich, dass es mit den Peptidsynthasen homolog ist, z.B. eine Homologie von 34,7% mit der Gramicidin S-Synthase II von Bacillus brevis (Turgay et al., 1992) und eine Homologie von 36,2% mit der α-Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin-Synthase von Acremonium chrysogenum (Gutierrez et al., 1991) hat.
Dies bestätigt, dass das in Beispiel 5.1, isolierte Cosmid pIBV3 tatsächlich einen Teil des Strukturgens der Pristinamycin I-Synthase IV, die in Beispiel 5.5. beschrieben wurde und SnbE bezeichnet wurde, enthält (SEQ ID NO: 15 und 16).
8.8. Fragment mit 645 bp (pVRC903)
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die im Fragment mit 645 bp vorliegen, welches vorher aus dem Plasmid pVRC903 sequenziert wurde, wie es in Beispiel 6.7. beschrieben ist.
Die Untersuchung offener Raster für das Fragment mit 645 bp wurde wie vorher durchgeführt. Es konnte auf diese Weise ein nicht vollständiges offenes Leseraster bewiesen werden. Seine Merkmale sind die folgenden: dieses Raster zeigt zwei Möglichkeiten des Translationsbeginns, ein GTG in Position 61, ein GTG in Position 70 des sequenzierten Teils (das ATG, das in Position 124 liegt, wurde wegen der später beschriebenen Sequenzhomologien nicht berücksichtigt). Die Analyse der Wahrscheinlichkeit des Vorliegens der Shine-Dalgarno-Regionen ermöglicht keine Unterscheidung, welches dieser Codons einem Start entspricht. Es wurde kein Stoppcodon identifiziert, was anzeigt, dass dieses offene Raster nicht terminiert ist. Das Gen, von dem ein Teil identifiziert wurde, wurde papA genannt und das entsprechende Protein wurde Protein PapA genannt (SEQ ID NO: 9).
Der Vergleich des Produktes des in dem XhoI-XhoI-Fragment mit 3,4 kb, das aus pVRC900 isoliert worden war, identifizierten Leserasters mit den Sequenzen, die in der Genpro-Bank enthalten sind, lässt erkennen, dass es mit den Komponenten II der Proteine des Typs p-Aminobenzoat-Synthase und Anthranilat-Synthese, die jeweils bei der Synthese der p-Aminobenzoesäure (Vorläufer der Folsäure) und bei der Synthese der Anthranilsäure (Vorläufer von Tryptophan) in verschiedenen Mikroorganismen beteiligt sind, homolog ist. Es zeigt eine Homologie von 48% mit dem Protein TrpG von Azospirillum (Zimmer et al., 1991) und eine Homologie von 47% mit dem Protein PabA von Klebsiella pneumoniae (Kaplan et al., 1985). Die Proteine TrpG und PabA tragen die Glutaminase-Aktivität, die bei der Transaminierung der Chorisminsäure impliziert ist. Die bewiesenen Homologien können zeigen, dass das Protein PapA auch bei der Transaminierungsaktivität der Chorisminsäure impliziert ist. Es wurde vorgeschlagen, dass Chorisminsäure ein Vorläufer des p-Dimethylaminophenylalanins, ein Bestandteil der Pristinamycine I, ist, und zwar in Analogie zu der Synthese des Chloramphenicols, ein Antibiotikum, das durch die Streptomycine produziert wird (Sharka et al., 1970).
Die Rolle des Proteins PapA wird schließlich (Beispiel 9.3.) durch Analyse von Mutanten des Stamms SP92 im Gen papA gezeigt.
8.9. BamHI-SstI-Fragment mit 1,5 kb (pVRC1000).
Dieses Beispiel zeigt, wie es möglich ist, die offenen Leseraster, die im Fragment BamHI-SstI mit 1,5 kb, das vorher isoliert und sequenziert wurde, wie es in den Beispielen 6.8. und 7.9. beschrieben ist, vorliegen, zu bestimmen.
Die Untersuchung von offenen Leserastern in der sequenzierten Region mit 640 bp, die in dem BamHI-SstI-Fragment mit 1,5 kb vorliegt, wurde wie in Beispiel 8.1. beschrieben durchgeführt. Ein einziges vollständiges Leseraster konnte so bewiesen werden. Es konnte kein Anfang und kein Ende für die Translation bewiesen werden, was anzeigt, dass die sequenzierte Region mit 640 bp wahrscheinlich in einem viel größeren Leseraster liegt, das snaD genannt wird (SEQ ID NO: 8).
Der Vergleich der Sequenz des Proteins, das durch die Region mit 640 bp codiert wird, mit den Proteinsequenzen, die in den Genpro- und NBRF-Banken enthalten sind, macht klar, dass dieses Protein eine Homologie von 20 bis 25% mit einem inneren Teil der Peptid-Synthasen hat, z.B. mit der Gramicidin-Synthase I von B. brevis (Hori et al., 1989), der Tyrocidin-Synthase I von B. brevis (Weckermann et al., 1988) und der ACV-Synthase von Acremonium chrysogenum (Gutierrez et al., 1991).
Diese Angaben zeigen, dass das Protein, das zum Teil durch die Region mit 640 bp codiert wird, wahrscheinlich eine Peptidsynthase ist, die in der Biosynthese des Peptidteils der Pristinamycine II impliziert ist: tatsächlich wurden alle Peptidsynthasen, die in der Biosynthese der Pristinamycine I involviert sind, bereits in anderen Regionen des Chromosoms von S. pristinaespiralis identifiziert, wie es in den Beispielen 5.2., 5.3., 5.4. und 5.5. beschrieben ist.
8.10. Fragment mit 694 bp (pVRC509).
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die offenen Leseraster zu bestimmen, die in dem Fragment mit 694 bp vorliegen, das vorher aus dem pVRC509 sequenziert wurde, wie es in den Beispielen 6 und 7 beschrieben ist.
Die Untersuchung der offenen Leseraster für das Fragment mit 694 bp wurde wie vorstehend durchgeführt. Auf diese Weise konnte ein nicht vollständiges offenes Leseraster bewiesen werden. Seine Merkmale sind die folgenden: dieses Raster beginnt in Position 210 des sequenzierten Teils. Es wurde kein Stoppcodon identifiziert, was anzeigt, dass dieses offene Raster nicht terminiert ist. Die Molekülmasse des entsprechenden Proteins konnte demnach nicht berechnet werden und mit der scheinbaren Molekülmasse von 28.000 Da der FMN-Reduktase, das durch SDS-PAGE bestimmt wurde, wie es in Beispiel 5.6. beschrieben ist, verglichen werden. Dagegen ist die NH₂-terminale Sequenz des Proteins, das so durch Analyse der offenen Raster der Sequenz mit 694 bp identifiziert wurde, identisch mit der NH₂-terminalen Sequenz des Proteins SnaC, das wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt worden war. In dem Protein, das von dem sequenzierten Teil abgeleitet ist, findet man auch die zwei inneren Proteinsequenzen der FMN-Reduktase, die in 5.6. beschrieben ist, wieder. Dies bestätigt, dass das aus dem Cosmid pIBV4 isolierte Gen wirklich dem Protein FMN-Reduktase entspricht, das in Beispiel 5.6. beschrieben wurde und das SnaC genannt wird (SEQ ID NO: 7).
Die Untersuchung der DNA-Fragmente des Stamms S. pristinaespiralis SP92, die von den Cosmiden pIBV1 bis pIBV4 getragen werden, hat das Vorliegen von mehreren Genen bewiesen, die in der Biosynthese der Pristinamycine II und der Pristinamycine I involviert sind. Die Gene snaA, snaB und samS codieren für Enzyme, die in die Biosynthese der Pristinamycine eingreifen, die Pristinamycin IIA-Synthase und eine vermeintliche SAM-Synthase, und sind physisch auf einem großen DNA-Fragment gruppiert, das in das Cosmid pIBV1 kloniert ist. Ebenso sind die Gene snaA, snaB und samS, die für Proteine codieren, die in die Biosynthese der Pristinamycine I eingreifen, die 3-Hydroxypicolinsäure-AMP-Lipase (SnbA), das Protein SnbR, das wahrscheinlich für den Transport der Pristinamycine I verantwortlich ist, das Protein PapA, das in die Biosynthese aus Chorisminsäure, p-Aminophenylalanin und p-Aminophenylalanin involviert sind, und die p-Aminophenylalanin-(phenyl-N)-Methyltransferase (PapM), auf einem großen DNA-Fragment gruppiert, das in das Cosmid pIBV2 kloniert ist. Außerdem sind die Gene snaA und snaD einerseits – die für Proteine codieren, die in die Biosynthese der Pristinamycine II eingreifen, das Protein SnaD, das wahrscheinlich eine Peptidsynthase ist – und die Gene snbC, snbD und snbE andererseits – die für die drei Peptidsynthase SnbC, SnbD und SnbE codieren, die in der Bildung der Peptidkette des Pristinamycins ausgehend von seinen 6 getrennten Aminosäuren involviert sind – auf einem großen DNA-Fragment gruppiert, das in das Cosmid pIBV3 kloniert ist. Diese Resultate bestätigen die Hypothese der Gruppierung der Gene der Biosynthese der Pristinamycine II und auch der Gene der Biosynthese der Pristinamycine I und bieten die Möglichkeit, die anderen Gene, die bei diesen Biosynthesen beteiligt sind, durch Abgehen des Chromosoms stromaufwärts und stromabwärts der untersuchten Regionen zu klonieren.
Darüber hinaus ist es durch Hybridisierung der Gesamt-DNA der verschiedenen Produzentenstämme für Streptogramine (siehe Tabelle 1) mit den Genen snaA, snaB, snaC, snaD, samS und snbA, snbR, snbC, snbD, snbE, papA und papM oder mit den Genen, die durch Durchmustern des Chromosoms identifiziert wurden, oder mit Fragmenten dieser möglich, Gene zu isolieren, die denselben Funktionen in den anderen Produzentenorganismen für Streptogramine entsprechen. Dies erlaubt durch dasselbe Vorgehen, wie das für die Pristinamycine ins Auge gefasste, die Gesamtheit der Gene zu isolieren, die in der Biosynthese der verschiedenen Streptogramine involviert sind.
BEISPIEL 9: Genetische Untersuchung der DNA-Fragmente durch Disruption der Gene
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die Involvierung von Genen in der Biosynthese der Streptogramine zu beweisen, indem Stämme konstruiert werden, die von einem Produzentenstamm abgeleitet sind, die auf der Ebene dieser Gene durch Disruption mutiert wurden, und indem der Phänotyp solcher Mutanten analysiert wird. Dieses Beispiel zeigt darüber hinaus, wie Stämme erhalten werden, die die eine oder die andere der Komponenten A und B der Streptogramine nicht mehr produzieren oder die Komponenten A oder B mit anderen Verhältnissen produzieren als die, die man mit dem Stamm SP92 beobachtet.
9.1. Konstruktion einer Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im Gen snaA disruptiert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, durch Disruption des Gens SnaA einen Stamm von S. pristinaespirals SP92 zu konstruieren, der kein Pristinamycin IIA mehr produziert und der dagegen Pristinamycin IIB produziert.
Diese Mutante wurde mit dem Ziel konstruiert, die Funktionalität des Proteins SnaA zu bestätigen und ein Zwischenprodukt für die Produktion des Pristinamycin II zu liefern, das in der Folge modifiziert werden kann.
Seine Konstruktion erfolgt mit Hilfe eines Suizidvektors, der fähig ist, sich in E. coli nur zu replizieren, der aber einen Resistenzmarker trägt, der sich bei Streptomyces exprimiert. Dieser Vektor, pDH5, wurde durch Hillemann et al. (1991) entwickelt.
9.1.1. Konstruktion des Plasmids pVRC505.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Plasmid zu konstruieren, das sich nicht bei S. pristinaespiralis SP92 repliziert und das verwendet werden kann, um durch einfache homologe Rekombination das Gen snaA zu disruptieren bzw. zu lösen ("disrupté").
Das Plasmid pVRC505 wurde konstruiert, um die chromosomale Mutante SP92, die im Gen snaA disruptiert ist, ausgehend vom Plasmid pXL2045, das in Beispiel 6.3, beschrieben ist, herzustellen.
Das BamHI-Fragment mit 6 kb, das in das pXL2045 kloniert ist (16), wurde durch die Restriktionsenzyme EcoRI und PstI geschnitten. Nach Trennung der so erzeugten Fragmente durch Elektrophorese an 1% Agarosegel wurde ein Fragment mit 0,7 kb, das das 5'-Ende des Gens snaA enthält, isoliert und durch Geneclean (Bio101, La Jolla, Kalifornien) gereinigt.
100 ng Vektor pHDH5, die durch zweifache Verdauung mit EcoRI, PstI linearisiert worden waren, wurden mit 100 ng des Fragments mit 0,7 kb, wie es in Beispiel 3.3. beschrieben ist, ligiert. Ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1 isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC505 genannt. Das Plasmid pVRC505 wurde wie in Beispiel 2.1. beschrieben hergestellt. Seine Restriktionskarte ist in 5 gezeigt.
9.1.2. Isolierung der SP92-Mutante, die in dem Gen snaA disruptiert ist, durch homologe Rekombination.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die bezüglich des Gens snaA disruptiert ist, konstruiert wurde.
Diese Mutante wurde durch Transformation des Stamms SP92 mit dem Suizidplasmid pVRC505 isoliert.
Die Herstellung der Protoplasten und ihre Transformation wurden durchgeführt, wie es bei D. Hopwood et al. (1985) beschrieben ist.
Der Stamm SP92 wurde in YEME-Medium, 34% Saccharose, 5 mM MgCl₂, 0,25% Glycin, während 40 Stunden bei 30°C kulti viert. Das Mycelium wurde protoplastiziert und 5 × 1 μg pVRC505 wurden für die Transformation der Protoplasten (nach dem Verfahren, das PEG verwendet) eingesetzt. Nach einer Nacht der Regeneration der Protoplasten auf R2YE-Medium (D. Hopwood et al., 1985) wurden die Rekombinanten durch Verteilung von 3 ml SNA-Medium (D. Hopwood et al., 1985), das 2,6 μg/ml Thiostrepton enthält, selektiert.
Unter den fünf durchgeführten Transformationen wurden drei Klone, die gegenüber Thiostrepton resistent sind, isoliert. Dies ergibt einen Gehalt an Rekombinanten von unter 1 pro μg DNA. Diese Rekombinanten resultieren aus der Integration durch einfache homologe Rekombination zwischen dem Gen snaA, das durch das Chromosom des Stamms SP92 getragen wird, und dem Fragment mit 0,7 kb des Suizidplasmids pVRC505. Die geringe Größe des in pVRC505 insertierten Fragments, 0,7 kb, erklärt den schwachen Grad der Rekombination.
Die Sporen der Rekombinanten wurden durch Ausbreitung und Wachstum auf R2YE-Medium, supplemiert durch 400 μg/ml Thiostrepton, isoliert und erneut auf demselben Medium verteilt, um isolierte Kolonien zu erhalten.
Um die Position der Integration des Plasmids pVRC505 zu bestätigten, wurden verschiedene Southern-Techniken der Gesamt-DNA von mehreren rekombinanten Klonen, verdaut durch geeignete Restriktionsenzyme, durchgeführt und mit dem Vektor pDH5 und dem Fragment mit 0,7 kb hybridisiert und schließlich sukzessive als Sonden nach Markierung durch statistisches Priming (Random Primed DNA labeling kit, Boehringer Mannheim, Frankreich) mit [α – ³²P]dCTP, wie bei Maniatis et al. (1989) beschrieben, verwendet. Die Hybridisierungsresultate zeigen im Genom der rekombinanten Klone das Auftreten einer zusätzlichen EcoRI-PstI-Bande, die die Größe des Vektors pDH5 hat und mit diesem hybridisiert, sowie eine zusätzliche EcoRI-EcoRI-Bande, die gleichzeitig mit den zwei Sonden hybridisiert. Eine dieser Mutanten wird SP92::LpVRC505 genannt. Diese Mutante entspricht tatsächlich der Integration des Plasmids pVRC505 in das Gen snaA durch einfache homologe Rekombination.
9.1.3. Produktion von Pristinamycinen durch die Mutante SP92::pVRC505.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie bestimmt wird, dass die Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die bezüglich des Gens snaA durch Integration des Plasmids pVRC505 disruptiert ist, kein Pristinamycin IIA mehr produziert, jedoch Pristinamycin IIB weiter produziert.
Die Mutante SP92::pVRC505 sowie der Stamm SP92 als Vergleichsstamm wurden in flüssigem Produktionsmedium kultiviert. Die Fermentation wurde wie folgt durchgeführt: 0,5 ml einer Suspension von Sporen der genannten Stämme wurden unter sterilen Bedingungen zu 40 ml Inoculummedium in einem 300 ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Das Inoculum-Medium besteht aus 10 g/l Corn Steep, 15 g/l Saccharose, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l K₂HPO₄, 3 g/l NaCl, 0,2 g/l MgSO₄·7H₂O und 1, 25 g/l CaCO₃. Der pH wird vor Einführung von Calciumcarbonat durch Natriumcarbonat auf 9,6 eingestellt. Die Erlenmeyerkolben werden während 44 Stunden bei 27°C an einem Rotator bei einer Geschwindigkeit von 325 U/min bewegt. 2,5 ml der vorherigen Kultur, die 44 Stunden gealtert war, werden steril zu 30 ml Produktionsmedium in einem 300 ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Das Produktionsmedium wird durch 25 g/l Sojamehl, 7,5 g/l Stärke, 22,5 g/l Glucose, 3,5 g/l Futterhefe, 0,5 g/l Zinksulfat und 6 g/l Calciumcarbonat gebildet. Der pH wird durch Salzsäure vor Einführung des Calciumcarbonats auf 6,0 eingestellt. Die Erlenmeyerkolben werden während 24, 28 und 32 Stunden bei 27°C bewegt. Zu jeder Zeit werden 10 g Würze bzw. Brühe in einen Erlenmeyerkolben gewogen, denen 20 ml mobile Phase zugesetzt werden, die aus 62,5% Acetonitril und 37,5% einer 0,1 M-Lösung von KH₂PO₄ (durch H₃PO₄ auf pH 3,0 eingestellt) besteht und die die Extraktion der Pristinamycine erlaubt. Nach Bewegung an einer Bewegungsvorrichtung (325 U/min) während 20 Minuten um Umgebungstemperatur wird das Ganze an einem Papierfilter filtriert und die Pristinamycine werden durch HPLC bestimmt, wie es in Beispiel 5.1.1.A. beschrieben ist.
Die Resultate zeigen, dass die Mutante SP92::pVRC505 unter den angewendeten Fermentationsbedingungen eine Menge an Pristinamycin I produziert hat, die äquivalent derjenigen des Vergleichs SP92 ist, und zwar für die drei getesteten Zeiten. Während der Vergleich bei 24, 28 und 32 Stunden Fermentation ungefähr 70% Pristinamycin IIA und 30% Pristinamycin IIB produziert hat, hat dagegen die Mutante SP92::pVRC505 für dieselben Zeiten 100% Pristinamycin IIB in Mengen produziert, die der Summe aus Pristinamycin IIA + Pristinamycin IIB, die durch den Stamm SP92 produziert wurden, äquivalent sind. Die Mutante ist demnach tatsächlich in einer Biosynthesestufe des Pristinamycins II blockiert, die der Oxidation der Bindung 2-3 des D-Prolins des Zwischenprodukts Pristinamycin IIB entspricht. Diese Mutante akkumuliert demnach Pristinamycin IIB. Dies zeigt tatsächlich die funktionelle Involvierung des Gens snaA bei der Umwandlung von Pristinamycin IIB in Pristinamycin IIA.
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, ausgehend von den klonierten Biosynthesegenen, Stämme zu konstruieren, die in den Biosynthesestufen der Pristinamycine mutiert sind. Dies wurde für die Pristinamycine II gezeigt, allerdings können dieselben Resultate für die Pristinamycine I und im weiteren Sinne für die verschiedenen Bestandteile der Streptogramine erhalten werden. Stämme, die verschiedene Zwischenprodukte produzieren, können auf diese Weise erhalten werden. Diese Stämme können eingesetzt werden, um neue Moleküle der genannten Zwischenprodukte durch chemische, biochemische, enzymatische Modifikation(en) usw. zu produzieren. Eine Blockade in einer frühen Stufe des Biosynthesewegs der einen oder der anderen der Komponenten der Streptogramine kann auch zu mutierten Stämmen führen, die die eine oder die andere der Komponenten nicht mehr produzieren.
9.2. Konstruktion einer Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im samS-Gen disruptiert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, durch Disruption des Gens samS einen Stamm von S. pristinaespiralis SP92 zu konstruieren, der 35% weniger PIA und ungefähr 10× mehr PIB (die chemischen Strukturen sind in 2 angegeben) im Vergleich zum Wildstamm SP92 produziert. Diese Mutante wurde mit dem Ziel konstruiert, die Funktion der SAM-Synthase, die für das durch das Gen samS codierte Protein angenommen wurde, zu bestätigen und einen Stamm zu erhalten, der mehr PIB synthetisiert als der Wildstamm SP92.
9.2.1. Konstruktion des Plasmids pVRC702.
Ausgehend von dem Plasmid pXL2045 (in Beispiel 6.3. beschrieben) isoliert man durch enzymatischen Verdau das BamHI-EcoRI-Fragment mit 3,2 kb, das man nach Elektrophorese an 1% Agarosegel durch die Methode des Geneclean-Kits (siehe Beispiel 6.8.) reinigt. Dieses Fragment trägt das Gen snaB sowie das Gen samS (16). Dieses Fragment wurde dann wie folgt in das Plasmid pUC18 kloniert: 50 ng pUC18 wurden durch zweifache Verdauung mit Hilfe der Enzyme EcoRI und BamHI linearisiert, dann in Gegenwart von T4-DNA-Ligase (Biolabs) mit 300 ng des BamHI-EcoRI-Fragments mit 3,2 kb ligiert. Nach Transformation der kompetenten Zellen des E. coli-Stamms TG1 mit diesem Ligationsgemisch konnte man einen rekombinanten Klon isolieren, der das Plasmid pUC18 mit dem Insert mit 3,2 kb besitzt, das man pVRC701 nennt (26).
Das Plasmid pVRC702 stammt vom Plasmid pVRC701 durch Einführung einer Kassette, die das Gen amR trägt, das für die Resistenz gegen Apramycin und Geniticin codiert, zwischen die zwei SstI-Stellen, die sich in der Mitte des Gens samS befinden (27). Dazu wurde zunächst ein BamHI-BamHI-Fragment mit 2,2 kb, das die Kassette ΩamR trägt, durch BamHI-Verdau des Plasmids pHP45ΩamR, (erhalten von J. L. Pernodet, Laboratoire de Génétique d'Orsay) verwendet, wobei dieselbe Technik wie vorher beschrieben verwendet wurde. 200 ng dieses Fragments wurden dann mit 50 ng des Plasmids pUC1318 (Kay und McPherson, 1987) ligiert, durch das Enzym BamHI linearisiert, und dieses Ligationsgemisch wurde in die kompetenten E. coli TG1-Zellen eingeführt. Ausgehend von dem rekombinanten Klon, der das Plasmid pUC1318 besitzt, das die Kassette ΩamR enthält, konnte man durch partielles Schneiden mit Hilfe des Enzyms Sst1 50 ng eines Sst1-Sst1-Fragments mit 2,2 kb, das die Kassette ΩamR enthält, isolieren, die man mit 30 ng des Plasmids pVRC701 ligiert hat, mit Sst1 geschnitten hat (26), um nach Transformation von kompetenten E. coli-TG1-Zellen das Plasmid PVRC702 zu erhalten, dessen Struktur detailliert in 27 gezeigt ist.
Das so erhaltene Plasmid pVRC702 wurde nach der vorstehend in Beispiel 2.1. beschriebenen Methode in großen Mengen hergestellt.
9.2.2. Konstruktion des Stamms, der das chromosomale Gen samS::ΩamR hat.
Dieser Stamm wurde durch Transformation von Protoplasten von S. pristinaespiralis mit 1 μg des Suizidplasmids pVRC702, das sich nicht in einer Zelle von Streptomyces replizieren kann, erhalten. Die Herstellungsprotokolle der Protoplasten und der Transformation sind dieselben wie die oben angegebenen (Beispiel 9.1.). Die einzigen Modifikationen, die im Vergleich zu Beispiel 9.1. eingebracht wurden, betreffen die Antibiotikum-Selektion. Im vorliegenden Fall werden die rekombinanten Protoplasten nach einer Regeneration von 18 Stunden bei 30°C auf R2YE-Medium in Gegenwart von 50 μg/ml Endkonzentration an Geneticin (Sigma Chemical Co.) selektiert. So gibt man in jede Flasche R2YE eine Deckschicht, die aus 3 ml SNA, enthaltend 383 μg/ml Geniticin, besteht.
So konnte man 500 rekombinante Klone isolieren, die gegen Geneticin resistent sind, die entweder aus einer Integration des Plasmids pVRC702 nach einer einfachen homologen Rekombination zwischen chromosomalen und Plasmid samS-Genen (im Fall des einfachen Crossing-over) oder einem Austausch zwischen dem chromosomalen samS-Gen und dem Plasmidgen samS::ΩamR nach doppeltem Ereignis homologer Rekombination (im Fall des Doppel-Crossing-over) in das Chromosom resultieren können. In diesen zwei Ausführungsfällen findet sich die Kassette ΩamR in das Chromosom des Stamms transferiert und verleiht ihm eine amR-Resistenz, die im Verlauf von Generationen stabil ist.
Die rekombinanten Klone wurden durch Ausbreitung und Wachstum auf R2YE-Medium, das eine Endkonzentration von 50 μg/ml Geneticin enthält, isoliert, und dann durch Hybridisierungstechniken an Kolonien analysiert. Die Hybridisierung der Klone mit einer ersten Sonde, die wie in Beispiel 9.1. beschrieben, ausgehend von dem Fragment BamHI-EcoRI von pVRC702 und entsprechend pUC18 erhalten worden war, sowie mit einer zweiten Sonde, die dem BamHI-Fragment mit 2,2 kb, das die Kassette ΩamR trägt, entspricht, hat es ermöglicht, die Fälle des einfachen Crossing-over (hybridisierend mit den zwei Sonden) von den Fällen des doppelten Crossing-over (hybridisierend nur mit der zweiten Sonde) zu unterscheiden. Die drei Klone, die aus einem doppelten Crossing-over resultieren, die auf diese Weise selektiert wurden, wurden durch Verteilung und Wachstum auf R2YE-Medium, das eine Endkonzentration von 50 μg/ml Geneticin hat, gereinigt, und es wurden Stammlösungen von Sporen erhalten.
Um die genomische Struktur der drei Doppelrekombinanten zu bestätigen, wurden verschiedene Southern der chromosomalen DNA dieser Klone, die durch die Enzyme EcoRI und BamHI verdaut worden waren, realisiert und mit den folgenden Sonden hybridisiert: die Sonde, die der Kassette ΩamR entspricht, die ausgehend von dem BamHI-Fragment mit 2,2 kb von pVRC702 erhalten wurde, die Sonde, die pUC18 entspricht, die ausgehend von dem BamHI-EcoRI-Fragment mit 2,7 kb von pVRC701 erhalten wurde, und schließlich eine Sonde, die ausgehend von dem EcoRI-SstI-Fragment mit 1,3 kb von pVRC701 erhalten wurde, die das Gen snaB und den Anfang von samS trägt. Diese Hybridisierungen wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass die drei getesteten Klone tatsächlich aus einem doppelten Ereignis der homologen Rekombination resultierten, das den Satz des intakten Chromosomengens samS durch das mutierte samS, das durch die Kassette ΩamR disruptiert ist, erlaubt hat.
Einer dieser drei mutanten Klone wird SP92 samS::ΩamR genannt.
9.2.3. Produktion von Pristinamycinen durch den Mutantenstamm samS::ΩamR.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie bestimmt wird, dass die Mutante Sp92samS::ΩamR, die das disruptierte samS-Gen hat, 35% weniger Pristinamycin IA und 10 mal mehr Pristinamycin IB produziert als der Wildstamm SP92.
Die Mutante SP92 samS::ΩamR sowie der Vergleichsstamm SP92 wurden in flüssigen Produktionsmedium kultiviert und ihre Produktionen an Pristinamycin II und Pristinamycin I wie in Beispiel 9.1. beschrieben bestimmt.
Die Resultate haben gezeigt, dass die Mutante SP92 samS::ΩamR unter den durchgeführten Fermentationsbedingungen eine Menge an Pristinamycinen II produziert, die für die drei getesteten Zeiten äquivalent derjenigen des Vergleichs SP92 ist. Dagegen produziert die Mutante SP92 samS::ΩamR zu den drei getesteten Zeiten etwa 35% weniger Pristinamycin IA und 10 mal mehr Pristinamycin IB als der Vergleichsstamm. Die Form IB der Pristinamycine stellt somit 20% der gesamten durch die Mutante SP92 samS::ΩamR produzierten Pristinamycine des Typs I dar, während der Vergleichsstamm PIB nur in der Größenordnung von 1% produziert. Die Form IB der Pristinamycine unterscheidet sich von der Form IA durch die Tatsache, dass der 5. Rest p-Methylaminophenylalanin anstelle des p-Dimethylaminophenylalanins für Pristinamycin IA ist. Die Tatsache, dass die Mutante SP92 samS::ΩamR mehr Pristinamycin IB und weniger Pristinamycin IA produziert, zeigt, dass die Disruption des Gens samS eine Verringerung des Methylierungsgrads des 5. Rests der Pristinamycine I provoziert und demnach das Gen samS wahrscheinlich in der Biosynthese des Donors für Methyl, SAM, beteiligt ist, d.h. des codiert für eine SAM-Synthase.
9.3. Konstruktion einer Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im Gen papA disruptiert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es durch Disruption des Gens papA möglich ist, einen Stamm von S. pristinaespiralis SP92 zu konstruieren, der kein PI mehr produziert. Diese Mutante wurde mit dem Ziel konstruiert, die Funktionalität des Proteins PapA zu bestätigen. Seine Konstruktion wurde mit Hilfe des Suizidvektors pDH5, der in Beispiel 9.1. beschrieben ist, durchgeführt.
9.3.1. Konstruktion des Plasmids pVRC508.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Plasmid zu konstruieren, das bei S. pristinaespiralis SP92 nicht repliziert, das verwendet werden kann, um durch einfache homologe Rekombination das Gen papA zu disruptieren.
Das Plasmid pVRC508 wurde konstruiert, um die chromosomale Mutante SP92, die in dem Gen papA disruptiert ist, ausgehend von dem Plasmid pVRC903, das in Beispiel 7.7 beschrieben ist, herzustellen.
Im Beispiel 7.7 wurde die Klonierung des PvuII-EcoRI-Fragments mit 1,4 kb in M13mp18, ausgehend vom Plasmid pVRC903, im Hinblick auf die Sequenzierung des Gens papA beschrieben (dieses Fragment entspricht dem PvuII-XhoI-Fragment mit 1,4 kb, das im Vektor pVRC903 vorliegt (23).
Diese Konstruktion in M13mp18 wurde durch die Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI verdaut. Nach Trennung des Vektors M13mp18 und des Fragments mit 1,4 kb, das einen Teil des Gens papA enthält, durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel, wurde dieses durch Geneclean (Bio101, La Jolla, Kalifornien) isoliert und gereinigt. Die Lokalisierung des Fragments in dem Gen papA ist in 23 dargestellt.
100 ng des Vektors pDH5, linearisiert durch einen doppelten Verdau mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI, wurden mit 200 ng des Fragments mit 1,4 kb, wie in Beispiel 3.3. beschrieben, ligiert. Ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1 isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC508 genannt. Das Plasmid pVRC508 wurde wie in Beispiel 2.1. beschrieben hergestellt. Seine Restriktionskarte ist in 28 gezeigt.
9.3.2. Isolierung der SP92-Mutante, die im Gen papA durch homologe Rekombination disruptiert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht wie die Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im Gen papA disruptiert ist, konstruiert wurde. Diese Mutante wurde durch Transformation des Stamms SP92 mit dem Suizidplasmid pVRC508 isoliert. Die Herstellung der Protoplasten und ihre Transformation wurden wie in Beispiel 9.1. beschrieben durchgeführt. Nach Transformation der Protoplasten des Stamms SP92 wurden die Rekombinanten durch Verteilung von 3 ml auf SNA-Medium, enthaltend 2,6 mg/ml Thiostrepton, selektiert. In den 5 Transformationen, die mit 5 × 1 μg Plasmid pVRC508 durchgeführt wurde, wurden 10 Klone isoliert, die gegen Thiostrepton resistent sind. Dies gibt einen Gehalt an Rekombinanten von ungefähr 2 pro μg DNA. Diese Rekombinationen resultieren aus der Integration durch einfache homologe Rekombination zwischen dem Gen papA, das auf dem Chromosom des Stamms SP92 getragen wird, und dem Fragment mit 1,4 kb des Suizidplasmids pVRC508.
Die Sporen der Rekombinanten wurden durch Verteilung und Wachstum auf R2YE-Medium, das 400 μg/ml Thiostrepton enthielt, isoliert, und sie wurden auf demselben Medium erneut verteilt, um isolierte Kolonien zu erhalten.
Um die Position der Integration des Plasmids pVRC508 zu bestätigen, wurden verschiedene Southerns der Gesamt-DNA von mehreren rekombinanten Klonen, die wie oben beschrieben gereinigt worden waren, durchgeführt und mit dem Vektor pDH5 und dem Fragment mit 1,4 kb hybridisiert, die in der Folge nach Markierung durch statistisches Priming mit [α – ³²P]dCTP, wie es in Beispiel 9.1. beschrieben ist, als Sonden verwendet wurden. Die Hybridisierungsresultate zeigen in dem Genom der rekombinanten Klone, die durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut worden waren (Stelle, die das Fragment mit 1 kb umfasst), das Verschwinden der EcoRI-Bande mit 6,8 kb und das Auftreten von zwei zusätzlichen Banden, im Vergleich zum Vergleichsstamm SP92, wobei die eine mit 2,4 kb mit dem Fragment mit 1,4 kb hybridisiert und die andere mit 10,5 kb gleichzeitig mit pDH5 und mit dem Fragment mit 1,4 kb hybridisiert. Der Verdau der rekombinanten Klone durch das Restriktionsenzym PstI zeigt das Auftreten von zwei zusätzlichen Banden im Vergleich zu dem Vergleichsstamm SP92, wobei die eine mit 1,0 kb mit dem Fragment mit 1,4 kb hybridisiert und die andere mit 5,1 kb gleichzeitig mit pDH5 und mit dem Fragment mit 1,4 kb hybridisiert. Eine dieser Mutanten wurde SP92::pVRC508 genannt.
9.3.3. Produktion von Pristinamycinen durch die Mutante SP92::pVRC508.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie bestimmt wird, dass die Mutante S. pristinaespiralis SP92, die im Gen papA durch Integration des Plasmids pVRC508 disruptiert ist, kein Pristinamycin I mehr produziert.
Die Mutante SP92::pVRC508 sowie der Stamm SP92 als Vergleichsstamm wurden in flüssigem Produktionsmedium kultiviert. Die Fermentation sowie die Bestimmung der Pristinamycine I und II wurden wie in Beispiel 9.1. beschrieben durchgeführt.
Die Resultate haben gezeigt, dass der Vergleichsstamm SP92 unter den angewendeten Fermentationsbedingungen eine Standardmenge an Pristinamycinen I produziert, wobei keine Spurenmenge an Pristinamycinen des Typs I in der Fermentationsbrühe der Mutante SP92::pVRC508 detektiert wurde. Im Übrigen ist die Produktion von Pristinamycinen II durch die Mutante SP92::pVRC508 äquivalent derjenigen des Vergleichs SP92. Die Mutante SP92::pVRC508 produziert demnach keine Pristinamycine II mehr. Diese Resultate zeigen tatsächlich, dass das Gen papA für ein Protein codiert, das in der Biosynthese der Pristinamycine I involviert ist.
Um sicher zu stellen, dass die durchgeführte Disruption das Zielgen papA nicht berührt, wurde die Mutante SP92::pVRC508 in Gegenwart von p-Dimethylaminophenylalanin fermentiert. Die Mutante SP92::pVRC508 wurde wie weiter oben beschrieben unter Zusatz von 100 mg/l p-Dimethylaminophenylalanin nach 17-stündiger Fermentation fermentiert. Unter diesen Komplementierungsbedingungen produziert die Mutante SP92::pVRC508 eine Menge an Pristinamycinen I, die äquivalent derjenigen ist, die durch den Stamm SP92 produziert wird. Die Produktion von Pristinamycinen II ist in den zwei Stämmen äquivalent. Dies erlaubt uns, den Schluss zu ziehen, dass die Mutante SP92::pVRC508 keine Pristinamycine I produziert, da sie in einem Gen disruptiert ist, das in die Biosynthese des p-Dimethylaminophenylalanins eingreift (das Gen papA). Die Komplementierung dieser Mutante durch p-Dimethylaminophenylalanin stellt ihre Fähigkeit, Pristinamycine I zu produzieren, wieder her, was beweist, dass die Mutation im Gen papA keinen bestimmenden Effekt auf die Synthese von anderen Vorstufen der Pristinamycine I oder auf die Bildung der Peptidkette aus diesen Vorstufen hat.
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, ausgehend von klonierten Biosynthesegenen Stämme zu konstruieren, die in den Biosynthesestufen der Pristinamycine und insbesondere Pristinamycine I mutiert sind. Dieses Beispiel zeigt auch, dass es durch diesen Ansatz möglich ist, Stämme von S. pristinaespiralis zu konstruieren, die spezifisch Pristinamycine II produzieren, und im weiteren Sinne Stämme, die spezifisch Pristinamycine I produzieren. Dieser selbe Ansatz könnte auch für die anderen Actinomycetenstämme verwendet werden, die Produzenten von Streptograminen sind.
9.4. Konstruktion einer Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im Gen snbA disruptiert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es durch Disruption des Gens snbA möglich ist, einen Stamm von S. pristinaespiralis SP92 zu konstruieren, der keine Pristinamycine I mehr produziert. Diese Mutante wurde mit dem Ziel konstruiert, die Funktionalität des Proteins SnbA zu bestätigen. Seine Konstruktion wurde mit Hilfe des Suizidvektors pDH5, der in Beispiel 9.1. beschrieben ist, verwirklicht.
9.4.1. Konstruktion des Plasmids pVRC404.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Plasmid zu konstruieren, das sich bei S. pristinaespiralis SP92 nicht repliziert, das verwendet werden kann, um durch einfache homologe Rekombination das Gen snbA zu disruptieren.
Das Plasmid pVRC404 wurde ausgehend von dem Plasmid pVRC402, das in Beispiel 6.1. beschrieben ist, konstruiert, um die chromosomale Mutante SP92 herzustellen, die im Gen snbA disruptiert ist. Das Plasmid pVRC402 wurde durch die Restriktionsenzyme XhoI und HindIII verdaut. Nach Trennung der so erzeugten Fragmente durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel, wurde ein Fragment mit 1170 bp, das einen inneren Teil des Gens snbA enthält, isoliert und durch Geneclean (Bio101, La Jolla, Kalifornien) gereinigt. Die Lokalisierung des Fragments in dem Gen snbA ist in 15A gezeigt.
100 ng Vektor pDH5, linearisiert durch einen SmaI-Verdau, wurden mit 200 ng des Fragments mit 1170 bp, wie es in Beispiel 3.3. beschrieben ist, ligiert. Ein Klon, der das gewünschte Fragment trägt, wurde nach Transformation des Stamms TG1 isoliert. Das rekombinante Plasmid wurde pVRC404 genannt. Das Plasmid pVRC404 wurde wie in Beispiel 2.1. beschrieben hergestellt. Seine Restriktionskarte ist in 29 gezeigt.
9.4.2. Isolierung der SP92-Mutante, die im Gen snbA durch homologe Rekombination disruptiert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die in dem Gen snbA disruptiert ist, konstruiert wurde.
Diese Mutante wurde durch Transformation des Stamms SP92 mit dem Suizidplasmid pVRC404 isoliert. Die Herstellung der Protoplasten und ihre Transformationen wurden wie in Beispiel 9.1. beschrieben durchgeführt. Nach Transformation der Protoplasten des Stamms SP92 wurden die Rekombinanten durch Ausbreiten von 3 ml SNA-Medium, das 2,6 mg/ml Thiostrepton enthielt, selektiert. Bei fünf Transformationen, die mit 5 × 1 μg Plasmid pVRC404 durchgeführt worden waren, wurden 30 Klone, die gegen Thiostrepton resistent sind, isoliert. Dies gibt einen Gehalt an Rekombinanten von ungefähr 5 pro μg DNA. Diese Rekombinanten resultieren aus der Integration durch einfache homologe Rekombination zwischen dem Gen snbA, das auf dem Chromosom des Stamms SP92 getragen wird, und dem Fragment mit 1170 bp des Suizidplasmids pVRC404. Die Sporen der Rekombinanten wurden durch Ausbreitung und Wachstum auf R2YE + 400 μg/ml Thiostrepton isoliert und auf dem selben Medium wieder ausgebreitet, um isolierte Kolonien zu erhalten. Um die Position der Integration des Plasmids pVRC404 zu bestätigen, wurden verschiedene Southerns der Gesamt-DNA von mehreren rekombinanten Klonen, die wie vorstehend beschrieben gereinigt worden waren, durchgeführt und mit dem Vektor pDH5 und dem Fragment mit 1170 kb hybridisiert, und sukzessive als Sonden nach Markierung durch statistisches Priming mit [α + ³²P]dCTP wie in Beispiel 9.1. beschrieben verwendet. Die Hybridisierungsresultate zeigen in dem Genom der rekombinanten Klone, die durch die Restriktionsenzyme XhoI und HindIII verdaut worden waren, eine zusätzliche XhoI-HindIII-Bande mit 4,7 kb (Vektor pDH5 + 1,17 kb), verglichen mit dem Vergleichsstamm SP92, die gleichzeitig mit pDH5 und mit dem Fragment mit 1170 bp hybridisierte. Der Verdau der rekombinanten Klone durch das Restriktionsenzym PflMI (Stellen, die das XhoI-HindIII-Fragment mit 1170 bp einrahmen) zeigt das Verschwinden der PflMI-PflMI-Bande mit 3,1 kb und das Auftreten einer Bande mit 8,8 kb, die mit den zwei Sonden hybridisiert. Diese Resultate zeigen, dass die genomische Struktur der analysierten Klone tatsächlich die ist, die man nach einem homologen Rekombinationsereignis zwischen pVRC404 und dem chromosomalen Gen snbA erwartet. Eine dieser Mutanten wird SP92::pVRC404 genannt.
9.4.3. Produktion von Pristinamycinen durch die Mutante SP92::pVRC404.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie bestimmt wird, dass die Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im Gen snbA durch die Integration des Plasmids pVRC404 disruptiert ist, kein Pristinamycin I mehr produziert.
Die Mutante SP92::pVRC404 sowie der Stamm SP92 als Vergleichsstamm wurden in flüssigem Produktionsmedium kultiviert. Die Fermentation sowie die Bestimmung der Pristinamycine I und II wurden wie in Beispiel 9.1. beschrieben durchgeführt. Die Resultate haben gezeigt, dass unter den durchgeführten Fermentationsbedingungen der Vergleichsstamm SP92 eine Standardmenge an Pristinamycinen I produziert, in der Fermentationsbrühe der Mutante SP92::pVRC404 jedoch keine Spur an Pristinamycinen detektiert werden konnte. Darüber hinaus entspricht die Produktion an Pristinamycinen II durch die Mutante SP92::pVRC404 derjenigen des Vergleichs SP92. Die Mutante SP92::pVRC404 produziert keine Pristinamycine II mehr. Dies zeigt tatsächlich, dass das Gen snbA für ein Protein SnbA codiert, das in der Biosynthese der Pristinamycine I involviert ist, wie es während der Reinigung bei Beispiel 5.2. gezeigt wurde.
Dieses Beispiel zeigt, wie im vorangehenden Beispiel, dass es möglich ist, ausgehend von klonierten Biosynthesegenen Stämme zu konstruieren, die in den Biosynthesestufen der Pristinamycine und insbesondere der Pristinamycine I mutiert sind. Dieses Beispiel zeigt auch, dass es durch diesen Ansatz möglich ist, Stämme von S. pristinaespiralis zu produzieren, die spezifisch Pristinamycine II produzieren und im weiteren Sinne Stämme produzieren, die spezifisch Pristinamycine I produzieren, wie es im folgenden Beispiel 9.5. beschrieben wird. Dieser gleiche Ansatz könnte auch für die anderen Actinomycetenstämme, die Produzenten von Streptograminen sind, verwendet werden.
9.5. Konstruktion einer Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im snaD-Gen disruptiert ist, welches wahrscheinlich für eine Peptidsynthase codiert, die in der Biosynthese der Pristinamycine II involviert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, durch Disruption des Gens snaD, das wahrscheinlich für eine Peptidsynthase codiert, die in der Biosynthese der Pristinamycine II involviert ist, einen Stamm von S. pristinaespiralis SP92 zu konstruieren, der keine Pristinamycine II mehr produziert.
Diese Mutante wurde mit dem Ziel konstruiert, die Funktionalität des Gens snaD zu bestätigen, und einen von SP92 abgeleiteten Stamm zu erhalten, der keine Pristinamycine I mehr produziert.
Seine Konstruktion wurde mit Hilfe des Plasmids pVRC1000, das in Beispiel 6.8. beschrieben ist und von dem Suizidvektor pDH5 abgeleitet ist, durchgeführt, der fähig ist, nur bei E. coli zu replizieren und der einen Resistenzmarker trägt, der bei Streptomyces exprimiert wird (siehe Beispiel 9.1.)
9.5.1. Konstruktion des Plasmids pVRC1000.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Plasmid zu konstruieren, das nicht in S. pristinaespiralis SP92 repliziert, das verwendet werden kann, um durch einfache homologe Rekombination das Gen snaD zu disruptieren. Die Konstruktion des Plasmids pVRC1000, das einen Teil des Gens snaD trägt, ist in Beispiel 6.8. beschrieben.
9.5.2. Isolierung der SP92-Mutante, die in dem Gen snaD durch homologe Rekombination disruptiert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im Gen snaD disruptiert ist, konstruiert wurde. Diese Mutante wurde durch Transformation des Stamms SP92 mit dem Suizidplasmid pVRC1000 isoliert. Die Herstellung der Protoplasten und ihre Transformation wurde wie in Beispiel 9.1. beschrieben durchgeführt. Bei den mit 1 μg pVRC1000 durchgeführten fünf Transformationen wurden etwa 1500 Klone isoliert, die gegen Thiostrepton resistent sind. Dies gibt einen Gehalt an Rekombinanten von etwa 375 pro μg DNA. Diese Rekombinanten resultieren aus der Integration durch einfache homologe Rekombination zwischen dem Gen snaD, das durch das Chromosom des Stamms SP92 getragen wird, und dem BamHI-SstI-Fragment mit 1,5 kb des Suizidplasmids pVRC1000. 20 Rekombinanten wurden wieder auf R2YE-Medium, das 400 μg/ml Thiostrepton enthielt, geimpft und die Sporen dieser Rekombinanten wurden durch erneutes Ausstreichen und Wachstum auf R2YE-Medium, das 400 μg/ml Thiostrepton enthielt, isoliert.
Um die Position der Integration des Plasmids pVRC1000 zu bestätigen, wurden verschiedene Southern-Blots der Gesamt-DNA von sieben rekombinanten Klonen, die wie vorher beschrieben gereinigt worden waren, durchgeführt und sie wurden mit dem Vektor pDH5 und dem BamHI-SstI-Fragment mit 1,5 kb, das in pVRC1000 enthalten ist, hybridisiert und sukzessive nach Markierung mit [α – ³²P]dCTP, wie in Beispiel 9.1. beschrieben ist, als Sonden verwendet. Die Hybridisierungsresultate zeigen in dem Genom der sieben rekombinanten Klone eine EcoRI-Bande mit 13,8 kb und eine BglII-Bande mit 17 kb, die mit den zwei Sonden hybridisieren, sowie eine EcoRI-Bande mit 3,7 kb, die mit der BamHI-SstI-Sonde mit 1,5 kb hybridisiert. Eine dieser Mutanten wurde SP92::pVRC1000 genannt und entspricht tatsächlich der Integration des Plasmids pVRC1000 durch einfache homologe Rekombination in das Gen snaD.
9.5.3. Produktion von Pristinamycinen durch die Mutante SP92::pVRC1000.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie bestimmt wird, dass die Mutante von S. pristinaespiralis SP92, die im Gen snaD durch Integration des Plasmids pVRC1000 disruptiert ist, keine Pristinamycine II mehr produziert, sondern nur noch Pristinamycine I. Die Mutante SP92::pVRC1000 sowie der Vergleichsstamm SP92 wurden in flüssigem Produktionsmedium kultiviert und ihre Produktionen an Pristinamycinen II und I wurden wie in Beispiel 9.1. beschrieben bestimmt.
Die Resultate haben gezeigt, dass die Mutante SP92::pVRC1000 unter den durchgeführten Fermentationsbedingungen und für die drei getesteten Zeiten 0 mg/l Pristinamycine und eine Menge an Pristinamycinen I, die äquivalent derjenigen des Vergleichs SP92 ist, produziert. Diese Mutante ist tatsächlich in einer Biosynthesestufe der Pristinamycine II blockiert, was zeigt, dass das Gen snaD für ein Enzym codiert, das in der Biosynthese der Pristinamycine II involviert ist, und sehr wahrscheinlich für eine Peptidsynthase codiert.
Dieses Beispiel zeigt, dass es wie im vorangehenden Beispiel möglich ist, ausgehend von klonierten Biosynthesegenen Stämme zu konstruieren, die in den Biosynthesestufen der Pristinamycine und insbesondere der Pristinamycine II mutiert sind. Dieses Beispiel zeigt auch, dass es durch diesen Ansatz möglich ist, Stämme von S. pristinaespiralis zu produzieren, die spezifisch Pristinamycine I produzieren, und im weiteren Sinne Stämme zu produzieren, die spezifisch Pristinamycine II produzieren. Dieser selbe Ansatz könnte auch für die anderen Actinomycetes-Stämme verwendet werden, die Produzenten der Streptogramine sind.
BEISPIEL 10: Komplementation einer Mutante des Stamms SP92, die nicht Produzent ist.
Dieses Beispiel zeigt, wie es möglich ist, Gene der Biosynthese der Pristinamycine zu exprimieren. Diese Expression wurde insbesondere für die Gene snaA und snaB, die durch das Cosmid pIBV1 getragen werden, in einem Mutantenstamm, der von SP92 abgeleitet ist, SP120 durchgeführt. Diese Mutante produziert kein Pristinamycin IIA. Sie akkumuliert das letzte Zwischenprodukt des Biosyntheseweges des Pristinamycins: Pristinamycin IIB.
10.1. Klonierung der Gene snaA und snaB in den Shuttle-Vektor pIJ903.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie ein Subfragment des Cosmids pIBV1, das die Gene snaA und snaB enthält, in einen Vektor kloniert wurde, der fähig ist, sich gleichzeitig in E. coli und in Streptomyces zu replizieren.
Der Vektor pIJ903 (D. J. Lydiate et al., 1985) ist ein Shuttle-Vektor mit geringer Kopienzahl (1 bis 3 pro Zelle), der fähig ist, sich gleichzeitig in E. coli dank seines Replikationsursprungs von pBR322 und bei Streptomyces dank seines Replikationsursprungs SCP2* zu replizieren. Das Gen für Ampicillinresistenz erlaubt diese Selektion in E. coli, und das Gen für Thiosteptonresistenz erlaubt die Selektion in Streptomyces.
Das Cosmid pIBV1 wurde durch das Restriktionsenzym SstI verdaut. Ein großes DNA-Fragment mit 7,6 kb, das die Gene snaA und snaB trägt, wurde durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel isoliert und elektroeluiert. 500 ng dieses Fragments wurden mit 100 ng des Vektors pUC1813 (Kay et McPerson, 1987), der durch SstI linearisiert worden war, ligiert. Nach Transformation des Stamms E. coli DH5α (supE44 ΔlacU169 (f80lacZΔMl5) hsdR17 recA1 endA1 gryA96 thi-1 relA1) und Selektion der Transformanten auf festem LB-Medium, das 150 μg/ml Ampicillin und 20 μg/ml X-gal enthielt, wurde 1 Klon, der das Fragment mit 7,6 kb enthält, isoliert. Das Plasmid wurde pVRC506 genannt. Eine Herstellung dieses rekombinanten Plasmids wurde durchgeführt, wie es in Beispiel 2.1 beschrieben ist.
Die Klonierung in den Vektor pIJ903 wurde an der HindIII-Stelle realisiert. Das Plasmid pVRC506 wurde durch HindIII geschnitten und das Fragment mit 7,6 kb, das die Gene snaA und snaB trägt, wurde durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel isoliert und elektroeluiert. 500 ng dieses Fragments wurden mit 500 ng des Vektors pIJ903, linearisiert durch HindIII, ligiert. Nach Transformation des Stamms E. coli DH5α und Selektion der Transformanten auf festem LB, das 150 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde ein Klon, der das Fragment mit 7,6 kb trägt, isoliert. Das Plasmid wurde pVRC507 genannt. Eine Herstellung dieses rekombinanten Plasmids wurde wie in Beispiel 2.1. beschrieben durchgeführt. Seine Kartographie ist in 30 gezeigt.
10.2. Expression der Gene snaA und snaB in der Mutante SP120.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die Proteine SnaA und SnaB bei S. pristinaespiralis SP92 durch Einführung eines Plasmids, das die entsprechenden Strukturgene trägt, in diesen Stamm herzustellen. Die Expression der Gene snaA und snaB wurde durch Transformation des Mutantenstamms SP120 mit 500 ng Plasmid pVRC507 durchgeführt. Die Transformation der Protoplasten von SP120 und die Selektion der Transformanten mit Thiostrepton wurde wie in Beispiel 9.1.2. beschrieben durchgeführt. Auf diese Weise wurden zahlreiche Transformaten erhalten und drei von ihnen wurden für Produktionstests in flüssigem Medium ausgewählt. Der Stamm SP120, der das Plasmid pIJ903 trägt, wurde als Vergleich ausgewählt. Die Fermentationen sowie die Extraktion der Biosyntheseprodukte wurden wie in Beispiel 9.1.3. beschrieben durchgeführt.
Die Resultate haben gezeigt, dass unter den durchgeführten Fermentationsbedingungen der Vergleich (SP120, das das Plasmid pIJ903 trägt) bei 24, 28 und 32 Stunden Fermentation 100% P IIB und 0% P IIA produziert hat, während die drei Klone des Stamms SP120, die durch das Plasmid pVRC507 transformiert wurden, für dieselben Zeiten etwa 85 bis 80% Pristinamycin IIB und 15 bis 20% Pristinamycin IIA produzieren, wobei die Summe dieser der Produktionsmenge von Pristinamycin II des Vergleichsstamms äquivalent ist (SP120, das das Plasmid pIJ903 trägt). Die Klone, die pVRC507 tragen, wurden tatsächlich teilweise bezüglich der Biosynthesestufe der Pristinamycine II, die der Oxidation der 2-3 Bindung des D-Prolins des Zwischenprodukts Pristinamycin IIB entspricht, komplementiert. Dies wurde durch enzymatische Bestimmung der Aktivität der Pristinamycin IIA-Synthase, wie es in Beispiel 5.1.1.A beschrieben ist, für die Stämme SP120, der pVRC507 trägt, und SP120, der pIJ903 trägt, bestätigt. Während der Vergleichsstamm SP120, der pIJ903 trägt, keine Pristinamycin IIA-Synthase-Aktivität zeigt, zeigt der Stamm SP120, der pVRC507 trägt, PIIA-Synthase-Aktivität.
Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, Gene der Biosynthese der Streptogramine zu exprimieren. Diese Expression wurde insbesondere für die Gene untersucht, die für die Pristinamycin IIA-Synthase codieren, aber auch die anderen Gene der Biosynthese der Pristinamycine II und der Pristinamycine I sowie die, die in der Biosynthese der Bestandteile verschiedener Streptogramine involviert sind, können auf diese Weise exprimiert werden. Diese Expression kann in Mutantenstämmen, wie dies in Beispiel 10 der Fall ist, aber auch in Produzentenstämmen durchgeführt werden, um die Produktionslevel der Streptogramine zu erhöhen. Die Expression kann durch Klonierung der Gene in einem Vektor mit unterschiedlicher Kopienzahl (schwach oder erhöht) oder in einem integrierenden Vektor durch Deregulierung dieser Gene, durch Klonierung dieser Gene unter einem homologen oder heterologen Promotor (starker Promotor oder spezifisch regulierter Promotor) modifiziert werden. Die Expression der verschiedenen Gene der Biosynthese der Streptogramine kann auch in den heterologen Stämmen ausgehend von Expressionsvektoren, die angepasst sind, um die Hybridantibiotika zu produzieren, durchgeführt werden.
BEISPIEL 11: Expression des Gens papM von S. pristinaespiralis in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, ein Gen von S. pristinaespiralis in E. coli so zu exprimieren, dass das durch dieses Gen codierte Protein identifiziert, gereinigt und untersucht werden kann.
11.1. Konstruktion des Plasmids pVRC706.
Die Expression des Gens papM in E. coli wird erreicht, indem dieses Gen stromabwärts des Promotors und der Fixierungsstelle der Ribosome des Gens lacZ von E. coli platziert wird. Das MluI-StuI-Fragment mit 1,7 kb wurde aus dem Plasmid pVRC409, das in Beispiel 7.8. beschrieben ist, isoliert, dann in das Plasmid pMTL23 (Chambers et al., 1988) kloniert, das an der BamHI-Stelle, die mit Hilfe des Klenow-Enzyms aufgefüllt worden war (Maniatis et al., 1989), und an der MluI-Stelle geschnitten war, um das Plasmid pVRC706 zu erhalten, das in 31 dargestellt ist. Die Klonierung an der MluI-Stelle ermöglicht es, eine Fusion im Raster zwischen den 32 ersten Aminosäuren der β-Galactase, die durch das Gen lacZ des Plasmids pMTL23 codiert werden, und den 12 letzten Aminosäuren des Gens, das genau stromaufwärts von papM liegt, zu erhalten, wodurch die Transduktionskopplung konserviert werden kann, die zwischen dem Gen papM und diesem stromabwärts gelegenen Gen, betrachtet von der Nucleotidsequenz, die in Beispiel 7.8. angegeben ist, zu existieren scheint. Demnach ist die Expression des Hybridgens zwischen lacZ und dem Gen stromaufwärts von papM und derjenigen des Gens papM unter der Kontrolle der Expressionssignale des Gens lacZ.
11.2. Expression des Produktes des Gens papM in dem Stamm E. coli-DH5α.
Die Plasmide pVRC706 und pMTL23 wurden durch Transformation in den E. coli-Stamm DH5α eingeführt, und die Expression ihrer Gene unter den Bedingungen, bei denen der Promotor des Gens lacZ induziert wird, wie es bereits beschrieben wurde (Maniatis et al., 1989), untersucht. Die Stämme von E. coli, die das Plasmid pVRC706 oder das Kontrollplasmid pMTL23 tragen, wurden in 500 ml reichhaltigem LB-Medium kultiviert, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, das die Induktion des Promotors des lacZ-Gens ermöglicht. Man entnimmt diese Kulturen, wenn sie bei 600 nm eine optische Dichte von 1 erreicht haben und stellt Proteinextrakte her, wie es unten beschrieben wird.
11.3. Bestimmung der Aktivität des Produktes des Gens papM, exprimiert in E. coli.
Die Aktivität, die dem Protein entspricht, das durch das Gen papM codiert wird, wird für die zwei Extrakte bestimmt, die von den Kulturen von E. coli hergestellt werden, die das Plasmid pVRC706 oder das Plasmid pMTL23 (Beispiel 5.7.) tragen. Es wurde gezeigt, dass der Extrakt, der aus dem Stamm E. coli::pVRC706 hergestellt wurde, die Methylierung des p-Aminophenylalanin zu p-Dimethylaminiphenylalanin mit einer Aktivität von 235 Einheiten pro mg katalysiert, während diese Aktivität bei den Extrakten des Kontrollstamms E. coli::pMTL23 fehlt (siehe Beispiel 5.7.1.C.). Diese Resultate zeigen, dass es möglich ist, das Gen papM von S. pristinaespiralis in E. coli zu exprimieren, und dass das entsprechende Protein tatsächlich das Enzym ist, das die Methylierung von p-Aminophenylalanin zu p-Dimethylaminophenylalanin katalysiert. Dieses Beispiel zeigt, dass es möglich ist, Gene der Biosynthese der Streptogramine in heterologen Stämmen (wie E. coli, aber auch in anderen Mikroorganismen), ausgehend von Expressionsvektoren, die angepasst sind, um Antibiotikavorläufer oder sogar natürliche Antibiotika oder Hybridantibiotika zu produzieren, zu exprimieren.
BEISPIEL 12: Beweis der Homologie von Genen, die in der Biosynthese der Streptogramine involviert sind, bei verschiedenen Streptomyces.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, durch Hybridisierung in der Gesamt-DNA zu beweisen, dass Homologie zwischen verschiedenen Genen, die in der Biosynthese der Streptogramine involviert sind, bei verschiedenen Stämmen von Streptomyces, die Produzenten für Streptogramine sind, existiert.
12.1. Extraktion der Gesamt-DNA von verschiedenen Streptomyces-Produzenten für Streptogramine.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie die DNA von verschiedenen Produzentenstämmen für Streptogramine gereinigt wurde. Diese Streptomyces-Stämme wurden unter den in Tabelle 1 beschriebenen ausgewählt:
Streptomyces loidensis
Streptomyces olivaceus
Streptomyces ostreogriseus
Streptomyces virginiae
Ein Stamm, der kein Produzent für Streptogramine ist, Streptomyces hygroscopicus, wurde als negativer Vergleich gewählt.
Die Extraktionen verschiedener Gesamt-DNA wurden ausgehend von Kulturen in YEME-Medium, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
12.2. Hybridisierung der Gesamt-DNA von Produzentenstämmen von Streptograminen durch DNA-Fragmente, die Gene enthalten, die bei der Biosynthese der Pristinamycine involviert sind und aus dem Stamm S. pristinaespiralis SP92 isoliert wurden.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es ausgehend von Genen, die in der Biosynthese der Pristinamycine beteiligt sind und aus dem Stamm SP92 isoliert wurden, wie es in den vorangehenden Beispielen beschrieben ist, möglich ist, homologe Gene durch Hybridisierung aller DNA von anderen Produzentenstämmen für Streptogramine zu beweisen.
Die als Sonde verwendeten DNA-Fragmente sind:
Das XhoI-XhoI-Fragment mit 3,6 kb, das aus pVRC1106 isoliert wurde, wie es in Beispiel 6.5 beschrieben ist, und dessen Restriktionskarte in 18 gezeigt ist. Dieses Fragment enthält einen Teil des Gens, das für die Pristinamycin I-Synthase II codiert.
Das BamHI-BamHI-Fragment mit 6 kb, das aus dem Plasmid pXL2045 isoliert wurde, wie es in Beispiel 6.3. beschrieben ist, und dessen Karte in 16 gezeigt ist. Dieses Fragment enthält die Strukturgene der zwei Untereinheiten der PIIA-Synthase.
Die Gesamt-DNA der vier Produzentenstämme von Streptograminen, des Stamms S. hygroscopicus sowie des Stamms SP92, wurde durch die Restriktionsenzyme BamHI und XhoI verdaut. Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden an 0,7% Agarosegel getrennt und die DNA wurde auf Nylonmembran transferiert, wie es bei Maniatis et al. (1989) beschrieben ist. Die Markierung der Fragmente XhoI-XhoI mit 3,6 kb und BamHI-BamHI mit 6 kb wurde durch Markierung durch statistisches Priming wie in Beispiel 9.1.2. beschrieben durchgeführt. Die Hybridisierungen der Membranen wurden in Gegenwart von 50% Formamid bei 42°C, wie bei Maniatis et al. (1989) beschrieben, durchgeführt. Das Waschen der Membranen nach Hybridisierung wurde bei 50 und 60°C in einer Lösung, die SSC (Maniatis et al., 1989) 10-fach verdünnt und 01,1% SDS enthielt, durchgeführt.
Diese Hybridisierungen erlauben den Beweis der folgenden Resultate:
Der Stamm S. hygroscopicus zeigt keine Hybridisierung mit den zwei verwendeten Sonden.
Die Gesamt-DNA (Verdau durch XhoI und BamHI) der Stämme S. ostreogriseus, S. olivaceus, S. loidensis und S. virginiae zeigen alle Hybridisierungssignale mit einer Intensität vergleichbar der Signale, die bei Gesamt-DNA des Stamms SP92 mit den zwei verwendeten Sonden beobachtet werden.
Dieses Beispiel zeigt, dass verschiedene Stämme von Streptomyces, die Streptogramine produzieren, Gene umfassen, die mit den Genen hybridisieren, die bei S. pristinaespiralis SP92 isoliert wurden und die bei der Biosynthese der Streptogramine involviert sind, wie es in den vorstehenden Beispielen beschrieben ist. Diese Hybridisierungen beweisen das Vorliegen einer Homologie zwischen den Genen, die bei der Biosynthese der Streptogramine des Stamms SP92 involviert sind, und denen, die in der Biosynthese der Streptogramine der anderen Produzentenstämme für Streptogramine involviert sind.
Dieses Beispiel zeigt demnach, dass es möglich ist, ausgehend von Genen, die von SP92 isoliert wurden und bei der Biosynthese der Streptogramine involviert sind, die homologen Gene, die bei den anderen Prozentenstämmen für Streptogramine vorliegen, durch Hybridisierung und Klonierung zu isolieren.
BEISPIEL 13: Untersuchung der physischen Bindung der verschiedenen Gene von S. pristinaespiralis SP92, die in der Biosynthese der Pristinamycine I und der Pristinamycine II involviert sind.
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie es möglich ist, die physische Bindung der Gene von S. pristinaespiralis SP92, die in der Biosynthese der Pristinamycine I und II involviert sind, zu untersuchen. Diese Untersuchung wurde mit dem Ziel geführt, zu zeigen, dass alle diese Gene auf einem Chromosom in einem Cluster gruppiert sind, und dass es demnach möglich ist, indem man auf dem Chromosom ausgehend von den bereits identifizierten Genen "marschiert", andere Gene zu isolieren, die in der Biosynthese der Pristinamycine I und II involviert sind. Ein derartiges "Marschieren" kann für die Gene in Betracht gezogen werden, die in der Biosynthese anderer Streptogramine involviert sind.
13.1. Restriktionsenzyme, die für die Elektrophorese mit gepulstem Feld verwendet werden.
Das Genom von S. pristinaespiralis SP92 besteht zu 70% bis 75% aus Nucleotiden, die die Basen G und C enthalten. Um sein Genom in eine geringe Anzahl großer Fragmente zu schneiden, haben wir Enzyme verwendet, die eine an AT reiche Sequenz erkennen, wie z.B. AseI (AT/TAAT), SspI (AAT/ATT), aber auch HindIII (A/AGCTT), EcoRI (G/AATTC), NdeI (CA/TATG) und ClaI (AT/CGAT).
13.2. Stämme von S. pristinaespiralis, die für die Elektrophorese bei gepulstem Feld verwendet werden.
Wir haben chromosomale DNA von mehreren Stämmen verwendet, um durch Elektrophorese bei gepulstem Feld die physische Bindung der Gene zu untersuchen, die in der Biosynthese der Pristinamycine I und der Pristinamycine II involviert sind. Wir haben Inserts der chromosomalen DNA des Stamms S. pristinaespiralis SP92 hergestellt, wie es in Beispiel 4.1. beschrieben ist, aber auch von der chromosomalen DNA von Stämmen, die sich von SP92 ableiten, deren Konstruktion in den Beispielen 9.1. und 9.4. beschrieben wird. Es handelt sich um den Stamm SP92::pVRC505, dessen Gen snaA durch Integration des Plasmids pVRC505 (Beispiel 9.1.) disruptiert wurde, und den Stamm SP92::pVRC404, dessen Gen snbA durch Integration des Plasmids pVRC404 disruptiert wurde (Beispiel 9.4.). Diese zwei letztgenannten Stämme wurden in unsere Untersuchung eingeschlossen, denn sie haben es erlaubt, die Gene snaA und snaB genau auf der Chromosomenkarte zu positionieren, indem das Vorliegen von Stellen, die selten Chromosomen-DNA schneiden AseI, SspI, HindIII, EcoRI, NdeI und ClaI in den Plasmiden pVRC505 und pVRC404 ausgenutzt wurde.
13.3. DNA-Sonden, die für die Hybridisierungen der durch Elektrophorese mit gepulstem Feld isolierten Fragmente eingesetzt wurden.
Wir haben verschiedene DNA-Fragmente verwendet, um radioaktiv markierte Sonden zu erhalten, wie es in Beispiel 9.1. beschrieben ist, die wir mit den Fragmenten, die durch Elektrophorese im gepulsten Feld nach enzymatischem Verdau der chromosomalen DNA-Inserts der drei oben präsentierten Stämme (Beispiel 4.2.) getrennt worden waren, hybridisierten. Die Sonden sind die folgenden: das Fragment EcoRI-BamHI mit 3,2 kb, isoliert aus dem Plasmid pVRC701, das die Gene snaB und samS trägt (siehe Beispiel 9.2.), das Fragment BamHI-SstI mit 1,5 kb, isoliert aus dem Plasmid pVRC1000, das einen Teil des snaD-Gens trägt (siehe Beispiel 6.8), das XhoI-HindIII-Fragment mit 1,1 kb, das aus dem Plasmid pVRC402 isoliert wurde, das das Gen snbA trägt (siehe Beispiel 6.1), das Pst1-Pst1-Fragment mit 2,4 kb, isoliert aus dem Plasmid pVRC900, das das Gen papA trägt (siehe Beispiele 6.7. und 8.8.) und das XhoI-PstI-Fragment mit 1,5 kb, isoliert aus dem Plasmid pVRC509, das das Gen snaC trägt (siehe Beispiel 6.9.).
13.4. Lokalisierung verschiedener Gene, die in der Biosynthese der Pristinamycine I und II impliziert sind, auf dem Chromosom und Untersuchung ihrer physischen Bindung.
Die Hybridisierungen der chromosomalen DNA der Stämme S. pristinaespiralis SP92, SP92::pVRC404 und SP92::pVRC505, geschnitten durch einfachen Verdau und doppelten Verdau mit Hilfe von sechs Enzymen, die oben genannt wurden, mit den verschiedenen vorstehend beschriebenen Sonden hat zu der allgemeinen Kartographie geführt, die in 32 gezeigt ist: die Position von wichtigen Stellen wurde angegeben, ebenso die Position und der Sinn der Transkription der Gene, die in der Biosynthese der Pristinamycine PI und PII involviert sind. Man konnte so den Abstand errechnen, der die drei chromosomalen Regionen trennt, die die identifizierten Gene enthalten: diese Gene snbA, snbR, papA und papM (Cosmid pIBV2, Beispiel 5.2.), die der Gene snaA, snaB, samS, snaD, snbC, snbD, snbE (Cosmide pIBV1 und 3, Beispiel 5.1.) und schließlich die des Gens snaC (Cosmid pIBV4, Beispiel 5.6.). Beispielsweise wurde die Entfernung zwischen den Genen snaA und snbA mit etwa 160 bis 170 kb bestimmt. Dies zeigt, dass die bereits identifizierten Gene alle in einer Region enthalten sind, die nur 200 kb des Chromosoms des Stamms S. pristinaespiralis abdeckt oder weniger als 3% der Gesamtlänge des Genoms, das wir durch die Elektrophoresetechnik mit gepulstem Feld auf 7500 kb schätzen konnten.
Diese Resultate zeigen, dass die Gene, die in der Biosynthese der Pristinamycine I und II involviert sind, auf dem Chromosom in einem Cluster gruppiert sind und dass es demnach möglich ist, in dem auf dem Chromosom ausgehend von den bereits identifizierten Genen "marschiert wird", andere Gene zu isolieren, wie in der Biosynthese der Pristinamycine I und der Pristinamycine II involviert sind. Allgemeiner ausgedrückt, ist es möglich, indem auf dem Chromosom "marschiert" wird, ausgehend von jedem Gen, das in der Biosynthese der Streptogramine involviert ist, die anderen Gene zu identifizieren, die in dieser Biosynthese involviert sind.
TABELLE I
Verwendete Abkürzungen:

DNA:

Desoxyribonucleinsäure

AMP:

Adenosin-5'-monophosphat

ATP:

Adenosin-5'-triphosphat

BET:

Ethidiumbromid

Bis-tris:

Bis[2-hydroxyethyl]iminotris[hydroxymethyl]methan

Bis-tris-propan:

(1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan)

BSA:

Rinderserumalbumin

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

OD:

optische Dichte

DTE:

Dithioerythrit

DTT:

Dithiothreitol

E64:

trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butan

EDTA:

Ethylendiamintetraessigsäure

EGTA:

Ethylenglykol-bis(β-aminoethyl)tetraessigsäure

FMN:

Flavinmononucleotid

FMNH2:

reduziertes Flavinmononucleotid

Hepes:

(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure])

IPTG:

Isopropyl-β-D-thioglactopyranosid

kDa:

Kilodalton

kb:

Kilobase

LB:

Luria-Brühe (reichhaltiges Wachstumsmedium für E. coli)

NAD:

Nicotinamiddinucleotid

NADH:

reduziertes Nicotinamiddinucleotid

PAGE:

Elektrophorese an Polyacrylamidgel

bp:

Basenpaar

PMSF:

Phenylmethylsulfonylfluorid

Ppi:

Pyrophosphat

U/min:

Umdrehungen/min

S. A.:

Ammoniumsulfat

SAM:

S-Adenosylmethionin

SDS:

Natriumdodecylsulfat

STI:

Trypsininhibitor von Soja

TE:

Puffer aus 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5

Tris:

Amino-2-hydroxymethyl-2-propandiol-1,3

U. V.:

Ultraviolette Strahlen

X-gal:

5-Brom-4-chlor-3-indoyl-b-D-galactosid

YEME:

Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium (reichhaltiges Wachstumsmedium für Streptomyces)

PEG:

Polyethylenglykol

LMP:

niedriger Schmelzpunkt

MG:

Molekulargewicht

LITERATURHINWEISE:

– Anzai H., Murakami T., Imai A., Satoh A., Nagaoka K. et Thompson C. J. (1987) J. Bacteriol., 169 : 3482–3488.
– Bancroft I. et WolK C. P. (1989) J. Bacteriol., 171: 5949–5954.
– Bibb M. J., Findlay P. R. et Johnson M. W. (1984) Gene, 30: 157–166.
– Birnboim H. C. et Doly J. (1979) Nucleic Acids Res., 7: 1513–1523.
– Blattner F. R., Williams B. G., Blechl A. E., Denniston-Thompson K., Faber H. E., Furlong L. A., Grunwald D. J., Kiefer D. O., Moore D. D., Schumm J. W., Sheldon E. L. et Smithies O. (1977) Science, 196: 161–169.
– Bolivar F., Rodriguez R. L., Greene P. J., Betlach M. C., Heynecker H. L., Boyer H. W., Crosa J. H. et Falkow S. (1977) Gene, 2: 95–113.
– Boyer H. W. et Roulland-Dussoix D. (1969) J. Mol. Biol., 41: 459.
– Chater K. F. (1990) Bio/Technology, 8: 115–121.
– Cocito C. G. (1974) Microbiol. Rev., 43: 145–198.
– Cocito C. G. (1983) In Antibiotics, 6: (Ed. F. E. Hahn), 296–332.
– Dessen P. C., Fondrat C., Valencien C. et Mugnier C. (1990) Comp. Appl. an Biosciences, 6: 355–356.
– Di Giambattista M., Chinali G. et Cocito C. G. (1989) J. Antim. Chemother., 24: 485–507.
– Fernandez-Moreno M. A., Caballero J. L., Hopwood D. A. et Malpartida F. (1991) Cell, 66: 769–780.
– Gibson T. J. (1984) Ph. D. thesis, Cambridge University, England.
– Hallam S. E., Malpartida F. et Hopwood D. A. (1988) Gene, 74: 305–320.
– Hames B. D. et Higgins S. J. (1985) IRL Press Ltd., Oxford, U. K.,
– Hanahan D. (1983) J. Mol. Biol., 166: 557
– Hillemann D., Pülher A. et Wohlleben W. (1991) Nucl. Acids Res., 19: 727–731.
– Hohn B. et Collins J. F. (1980) Gene, 11: 291–298.
– Hook J. D. et Vining L. C. (1973) J. C. S Chem. Comm., 185–186.
– Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F., Kieser T., Bruton C. J., Kieser H. M., Lydiate D. J., Smith C. P., Ward J. M. et Scrempf H. (1985) A laboratory manual., The John Innes Fondation, Norwich, England.
– Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F., Janssen G. R., Malpartida F. et Smith C. (1986b) In Regulation of gene expression – 25 years on (ed. I; A. Booth C; F. Higgins), 251–276.
– Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H., Duncan J., Fujii I., Rudd A. M., Floss H. G. et Omura S. (1985a) Nature, 314: 642–644.
– Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H. et Omura S. (1985b) In Microbiology (ed S. Silver). American Society for Microbiology, Washington D. C., 409–413.
– Hopwood D. A., Malpartida F. et Chater K. F. (1986a) In Regulation of secondary metabolite formation. (eds. H. Kleinkauf, H. von Hohren, H. Dornauer G. Nesemann), 22–33.
– Hoshino T., Ikeda T., Tomizuka N. et Furukawa K. (1985) Gene, 37: 131–138.
– Hutchinson C. R., Borell C. W., Otten S. L., Stutzman-Engwall K. J. et Wang Y. (1989) J. Med. Chem., 32: 929–937.
– Ish-Horowitz D. et Burk J. F. (1981) Nucleic Acids Res., 9: 2989–298.
– Kanehisa M. I. (1984) Nucleic Acids Res., 12: 203–215.
– Kay R. et McPherson J. (1987) Nucleic Acids Res., 15 (6): 2778.
– Khan S. A. et Novick R. (1983) Plasmid, 10: 251–259.
– Kingston D. G. I., Kolpak M. X., Lefevre W. et Borup-Grochtmann I. B. (1983) J. Am. Chem. Soc., 105: 5106–5110.
– Kyte J. et Doolittle R. (1982) J. Biol. Mol., 157: 105–135.
– Low B. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci., 60: 160.
– Lydiate D. J., Malpartida F. et Hopwood D. A. (1985) Gene, 35: 223–235.
– Maniatis T., Fritsh E. F. et Sambrook J. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y.
– Meinkoth J. et Wahl G. (1984) Anal. Biochem., 138: 267–284.
– Messing J., Crea R. et Seeburg P. H. (1981) Nucleic Acids Res., 9: 309.
– Neal R. J. et Chater K. F. (1987) Gene, 58: 229–241.
– Ohnuki T., Imanaka T. et Aiba S. (1985) J. Bacteriol., 164: 85–94.
– Sawadogo M. et Van Dyke M. W. (1991) Nucl. Acids Res., 19: 674.
– Staad J. F., Elkins M. F. et Earhart C. F. (1989) FEMS Microbiol. Lett., 59: 15.
– Staden R. et McLachlan A. D. (1982) Nucleic Acids Res., 10: 141–156.
– Videau D. (1982) Path. Biol., 30: 529–534.
– Chambers S. P., Prior S. E., Barstow D. A. et Minton N. P. (1988) Gene, 68: 139.
– Gutierrez S., Diez B., Montenegro E. et Martin J. F. (1991) Journal of bacteriology, 173: 2354–2365.
– Hori K., Yamamoto Y., Minetoki T., Kurotsu T., Kanda M., Miura S., Okamura K., Kuruyama J. et Saito Y. (1989) J. Biochem., 106: 639–645.
– Horikawa S., Ishikawa M., Ozaka H. et Tsukada K. (1989) Eur. J. Biochem., 184: 497–501.
– Kaplan J., Merkel W. et Nichols B. (1985) J. Mol. Biol., 183: 327–340.
– Markham G. D., DeParasis J. et Gatmaitan J. (1984) J. Biol. Chem., 259: 14505–14507.
– Sharka B., Westlake D. W. S. et Vining L. C. (1970) Chem. Zvesti, 24: 66–72.
– Thomas D., Rothstein R., Rosenberg N. et Surdin-Kerjan Y. (1988) Mol. Cell. Biol., 8: 5132–5139.
– Turgay K. et al. (1992) Molecular Microbiology, 6(4): 546.
– Weckermann R., FŸrbab R. et Marahiel M. A. (1988) Nucl. Acids Res., 16: 11841
– Yanisch-Perron C., Vieira J. et Messing J. (1985) Gene, 33: 103–119.
– Zimmer W., Aparicio C. et Elmerich C. (1991) Mol. Gen. Genet., 229: 41–51.
– Reed et al. J. Nat. Prod 49 (1986) 626
– Molinero et al., J. Nat. Prod 52 (1989) 99
– Reed et al. J. Org. Chem. 54 (1989) 1161
– Watanabe et al., Mol. Cell. Biochem. 44 (1982) 181
– Jablonski et al., Biochemistry 16 (1977) 2832
– Duane et al., Mol. Cell. Biochem. 6 (1975) 53.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleotidsequenz, die für ein an der Biosynthese der Streptogramine beteiligtes Polypeptid codiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt ist aus: (a) den Genen snaA (SEQ ID NO: 2), snaB (SEQ ID NO: 3), snaC (SEQ ID NO: 7), snaD (SEQ ID NO: 8), papA (SEQ ID NO: 9), papM (SEQ ID NO: 10), samS (SEQ ID NO: 4), snbA (SEQ ID: 5), snbC (SEQ ID NO: 11 und 12), snbD (SEQ ID NO: 13 und 14), snbE (SEQ ID NO: 15 und 16) und snbR (SEQ ID NO: 6), b) den Sequenzen, die mit den Genen (a) hybridisieren und für ein an der Biosynthese der Streptogramine beteiligtes Peptid codieren, und c) den Sequenzen, die von den Sequenzen (a) durch Degeneriertheit des genetischen Codes abgeleitet sind.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus den Genen snaA, snaB, snaC, snaD, papA, papM, samS, snbA, snbC, snbD, snbE und snbR ausgewählt ist.
Rekombinante DNA, die ein Gen der Biosynthese der Streptogramine nach Anspruch 2 umfasst.
Expressionsvektor zur autonomen und/oder integrativen Replikation, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eine rekombinante DNA nach Anspruch 3 umfasst.
Rekombinante Zelle, die einen Expressionsvektor nach Anspruch 4 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines an der Biosynthese der Streptogramine beteiligten Peptids, dadurch gekennzeichnet, dass man eine rekombinante Zelle nach Anspruch 5 kultiviert und das Polypeptidprodukt gewinnt.
Verwendung einer rekombinanten Zelle nach Anspruch 5, die ein Polypeptid, das wenigstens an der Biosynthese der Streptogramine beteiligt ist, exprimiert, in einer Biokonversionsreaktion.
Verwendung einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2 oder einer rekombinanten DNA gemäß Anspruch 3 oder eines Vektors gemäß Anspruch 4 zur Verstärkung der Produktion von Streptograminen.
Verfahren zur Herstellung von Streptograminen, dadurch gekennzeichnet, dass: – man in eine Streptogramine produzierende Zelle oder eine potentiell Streptogramine produzierende Zelle eine Sequenz oder mehrere Sequenzen und/oder Vektoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 einführt und/oder amplifiziert, – man die Zelle unter den Produktionsbedingungen für Streptogramine kultiviert und – man die produzierten Streptogramine isoliert.
Verfahren nach Anspruch 9 für die Produktion von Pristinamycinen, Mikamycinen oder Virginamycinen.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in einer Stufe des Biosynthesewegs der Streptogramine blockiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass man an einer Streptogramin produzierenden Zelle eine Mutagenese an wenigstens einem Gen des Biosynthesewegs durchführt, wobei das Gen unter den Genen snaA (SEQ ID NO: 2), snaD (SEQ ID NO: 8), papA (SEQ ID NO: 9), samS (SEQ ID NO: 4) und snbA (SEQ ID NO: 5) ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutagenese in vitro oder in situ durch Suppression, Substitution, Deletion und/oder Addition einer Base oder mehrerer Basen in dem betrachteten Gen oder durch Gendurchtrennung durchgeführt wird.
Mutante eines Streptogramine produzierenden Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Durchtrennung wenigstens in einem an der Biosynthese der Streptogramine beteiligten Gen besitzt, wobei das Gen unter den Genen snaA (SEQ ID NO: 2), snaD (SEQ ID NO: 8), papA (SEQ ID NO: 9), samS (SEQ ID NO: 4) und snbA (SEQ ID NO: 5) ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Zwischenproduktes der Biosynthese der Streptogramine, dadurch gekennzeichnet, dass: – man eine Zelle, die in einer Stufe des Biosynthesewegs der Streptogramine blockiert ist, gemäß Anspruch 11 herstellt, – man die Zelle kultiviert und – man das akkumulierte Zwischenprodukt isoliert.
Verfahren zur Herstellung eines von Streptograminen abgeleiteten Moleküls, dadurch gekennzeichnet, dass: – man eine Zelle, die in einer Stufe des Biosynthesewegs der Streptogramine blockiert ist, gemäß Anspruch 11 herstellt, – man die Zelle kultiviert und – man das durch diese Zelle akkumulierte Zwischenprodukt, gegebenenfalls nach Abtrennung des Kulturmediums, modifiziert.
Verfahren zur Herstellung von Streptograminen, umfassend die Kultur einer Zelle gemäß Anspruch 13, die außerdem eine Nukleotidsequenz und/oder eine rekombinante DNA und/oder einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Verwendung einer Sequenz und/oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Antibiotikahybriden.
Polypeptid, das aus der Expression einer Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2 resultiert.
Polypeptid, ausgewählt aus den Polypeptiden SnaA (SEQ ID NO: 2), SnaB (SEQ ID NO: 3), SnaC (SEQ ID NO: 7), SnaD (SEQ ID NO: 8), PapA (SEQ ID NO: 9), PapM (SEQ ID NO: 10), SamS (SEQ ID NO: 4), SnbA (SEQ ID: 5), SnbC (SEQ ID NO: 11 und 12), SnbD (SEQ ID NO: 13 und 14), SnbE (SEQ ID NO: 15 und 16) und SnbR (SEQ ID NO: 6).