KR100379100B1 - 스트렙토그라민및돌연변이합성에의한이의제조방법 - Google Patents

스트렙토그라민및돌연변이합성에의한이의제조방법 Download PDF

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조엘 크루제뜨
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Abstract

화학식 I의 신규한 그룹 B 스트렙토그라민-형 화합물, 및 적어도 하나의 그룹 B 스트렙토그라민의 전구체의 생합성에 영향을 끼치기 위해 돌연변이된 미생물을 사용하는 돌연변이합성에 의한 스트렙토그라민의 제조 방법을 공개한다. 상기 전구체의 생합성에 관여하는 신규한 뉴클레오티드 서열 및 이들의 용도를 또한 공개한다.
[화학식 I]

Description

스트렙토그라민 및 돌연변이합성에 의한 이의 제조 방법
스트렙토그라민은 두가지 유형의 화학적으로 상이한 분자 {한 유형은 폴리불포화 마크로락톤(그룹 A 요소), 다른 한 유형은 뎁시펩티드 (그룹 B요소)}의 회합으로 구성된 항생제의 균질 그룹으로 구성된다. 이 그룹은 기원에 따라 상이한 명칭으로 공지된 많은 항생제를 구성하고, 프리스티나마이신, 미카마이신 및 비르기니아마이신을 포함한다 (Cocito A79, 1983).
A 및 B 요소는 개별적인 요소의 활성의 100배에 상당할 수 있고, 각각의 요소의 활성과는 반대로 살균성인 상승적인 항박테리아 활성을 갖는다 (Cocito 1979). 이 활성은 스태필로코사이 (Staphylococci) 및 스트렙토코사이(Streptococci)와 같은 그람 양성 박테리아에 대해 더 특히 유효하다 (Cocito 1979, Videau 1982). 요소 A 및 B는 리보솜의 50S 서브유닛에 결합하여 단백질 합성을 저해한다 (Cocito 1979; Di Giambattista등, 1989).
각각의 요소가 생합성되는 경로에 대한 지식은 여전히 부분적으로 시작되어 있지만, 특허 출원 PCT/FR 93/0923호에 제시된 초기의 연구는 두가지 유형의 요소와 생합성에 관여하는 몇몇 단백질 및 상응하는 구조 유전자를 확인할 수 있었다.
그룹 B 스트렙토그라민을 생합성하기 위한 방법을 두 부분으로 구분할 수 있다.
1) 마크로사이클의 전구체, 또는 이의 동족체의 생합성:
3-히드로피콜린산, L-2-아미노부티르산, 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌, L-피페콜산 및 L-페닐글리신.
2) 펩티드 N-메틸화, 에피머화, 히드록실화 및 산화 유형의 가능한 후속의 변경(들)으로, 상기 나열된 전구체로부터, L-트레오닌으로부터 및 L-프롤린으로부터, 또는 이들의 동족체로부터 마크로사이클의 형성.
특허 출원 PCT/FR 93/0923호는 특히, 신장(elongation) 과정에서 그룹 B 스트렙토그라민의 펩티드 사슬내로 전구체의 삽입을 촉매하는 유전자 및 또한 이들의 구조 유전자에 관한 것이다. 이들 결과는 B 요소 유형의 비-리보솜 펩티드 합성특성을 설명한다.
본 발명은 주로 그룹 B 스트렙토그라민에 관한 신규한 화합물 및 돌연변이합성에 의한 스트렙토그라민의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그룹 B 스트렙토그라민의 전구체의 생합성에 관여하는 신규한 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
도면의 나열
도 1은 프리스티나마이신 IA의 구조도,
도 2는 프리스티나마이신 I의 마이너 요소의 구조도,
도 3은 스트렙토그라민의 B 요소의 구조의 다른 예시도,
도 4는 2.9kb의 PstI-XhoI 영역의 예시도,
도 5는 4.5kb의 XhoI-PstI 영역의 예시도,
도 6은 1.6kb의 HindIII-BgIII 영역의 예시도,
도 7은 약 10kb의 BgIII-XhoI 영역의 예시도,
도 8은 플라스미드 pVRC 415의 예시도,
도 9는 플라스미드 pVRC 420의 예시도,
도 10은 플라스미드 pVRC 411의 예시도,
도 11은 플라스미드 pVRC 421의 에시도,
도 12는 플라스미드 pVRC 414의 예시도,
도 13은 SP212 제작 방법.
더 특히, 본 발명은 그룹 B 스트렙토그라민에 관한 신규한 화합물에 관한 것이고, 더 정확하게는 프리스티나마이신 1족(도 1 및 도 2)(이하 PI로 지칭) 또는 비르기니아마이신 S족(도 3)의 신규한 화합물에 관한 것이다.
I 프리스티나마이신(PI)의 메이저 요소는 PIA(도 1)이고, 이는 PI의 약 94%를 구성하며, 나머지 약 6%는 도 2에 구조가 예시된 뎁시펩티드(PIB내지 PII)의 마이너 요소로 구성된다. 본질적으로 PI는 몇몇은 단백질 합성에 필수적이며(트레오닌 및 프롤린), 다른 몇몇은 신규하고, 자체가 2차 대사산물로 간주되는 (PIA에 있어서, L-2-아미노부티르산, 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌(DMPAPA), L-피페콜산 및 L-페닐글리신), 아미노산 및, 또한 방향족 전구체(3-히드록시피콜린산)의 축합에 의해 생성된다.
비르기니아마이신 S 유도체는 4-DMPAPA가 페닐알라닌으로 교체된 것을 제외하고는 PI의 경우와 동일한 산의 축합에 의해 생성된다(도 3).
따라서, 이러한 생합성에 의한 상이한 화합물의 생산은 생산자 균주에 의한 앞서 확인된 신규한 전구체의 예비합성을 필요로 한다.
특히, 본 발명은 스트렙토그라민을 생산하기 위한 균주로서 그룹 B 스트렙토그라민의 전구체의 생합성을 변경시키기 위해 돌연변이된 미생물 균주를 사용하는, 스트렙토그라민 제조의 신규한 방법에 관한 것이다. 본 방법에 따라, 상기 뮤턴트 균주를 생합성이 변경된 전구체와 상이한 신규한 전구체를 보충한 배지에서 배양한다. 기대치 않게, 이로 인해 그룹 B 스트렙토그라민에 관련되고, 약효 스피어의 가치를 갖는 신규한 화합물을 생산한다.
더 정확하게, 본 발명은 화학식 I로 나타낸 신규한 화합물에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure pct00001
여기에서,
R2및 R4는 각각 서로 독립적으로 수소 원자 또는 메틸 그룹을 나타내고,
R3은 수소 원자 또는 히드록실 그룹을 나타내고,
X는 CO, CHOH 또는 CH2그룹을 나타내며,
R1은
Figure pct00002
를 나타낸다.
여기에서,
메타 유도체의 경우:
A, C, D 및 E는 수소 원자를 나타내고,
B는 -할로겐, 바람직하게는 불소 원자,
- 알킬이 바람직하게 메틸 또는 에틸 그룹을 나타내는 모노알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹,
- 에테르 그룹; 더 특히, R이 바람직하게 메틸, 에틸, 트리플루오로메틸 및 알릴 그룹 중에서 선택된 OR 그룹
- 바람직하게는 알킬이 바람직하게 메틸 그룹을 나타내는 알킬티오 그룹에 의해 나타내는 티오에테르 그룹,
- C1-C3알킬 그룹 또는
- 트리할로게노메틸 그룹, 바람직하게는 트리플루오로메틸을 나타낼 수 있다.
파라 유도체의 경우:
A, B, D 및 E는 수소 원자를 나타내고,
C는 - 할로겐,
- [R1및 R2가 각각 독립적으로, -수소,
- 직쇄 또는 측쇄 C1내지 C4알킬 그룹(여기에서, 치환체 R1또는 R2중 하나가 메틸 그룹을 나타내고, 다른 하나가 반드시 에틸 그룹을 나타낸다),
- C3내지 C4시클로알킬을 갖는 알킬-시클로알킬메틸 그룹,
- 임의로 치환된 C3내지 C4시클로알킬 그룹,
- 직쇄 또는 측쇄 C1내지 C4(여기에서, 치환체 R1또는 R2중 하나는 알케닐 그룹을 나타내고, 다른 하나는 메틸 그룹 또는 C3내지 C6시클로알킬과 상이하다)에서 선택한 그룹을 나타내는] NR1R2그룹,
- 치환되거나 비치환된 N-피롤리디닐 그룹,
- 에테르 그룹; 바람직하게는, R이 바람직하게 염소 원자에 의해 적절히 치환된 메틸 및 에틸 그룹, 또는 트리플루오로메틸 및 알케닐 그룹 중에서 선택되는 OR그룹,
- 바람직하게는 알킬이 바람직하게 C1내지 C3알킬 그룹을 나타내는 알킬티오 그룹에 의해 나타나는 티오에테르 그룹,
- 아실 또는 알콕시카보닐 그룹 및 더 특히, R이 바람직하게 C1내지 C3알킬 그룹 또는 C1내지 C3알콕시 그룹을 나타내는 COR 그룹,
- 직쇄 또는 측쇄이고, 바람직하게는 메틸, 이소프로필 및 3급-부틸 그룹 중에서 선택된 C1내지 C6알킬 그룹,
- 알킬티오메틸 그룹 및 더 특히, R이 바람직하게 C1내지 C3알킬 그룹을 나타내는 CH2SR,
- 아릴 그룹, 바람직하게는 페닐 그룹, 또는
- 트리할로게노메틸 그룹, 바람직하게는 트리플루오로매틸을 나타낼 수 있다.
메타-파라 이치환된 유도체에 대해:
A, D 및 E는 수소 원자를 나타내고,
B는 - 할로겐, 바람직하게는 불소 원자,
- 알킬이 바람직하게 메틸 또는 에틸 그룹을 나타내는 모노알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹,
- 에테르 그룹, 바람직하게는, R이 바람직하게 메틸, 에틸 및 트리플루오로메틸 중에서 선택되는 OR 그룹,
- 티오에테르 그룹 및 바람직하게는 알킬이 바람직하게 에틸 그룹을 나타내는 알킬티오, 또는
- C1내지 C3알킬 그룹을 나타낼 수 있으며,
C는 -할로겐, 바람직하게는 불소 원자,
- 아미노, 알킬이 바람직하게 메틸 그룹을 나타내는 모노알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹, (단, B는 브롬 또는 염소 원자와 상이하다) 또는 치환되거나 비치환된 알릴 그룹,
- 에테르 그룹 및 바람직하게는 R이 바람직하게 메틸, 에틸 및 트리플루오로-그룹 중에서 선택되는 OR 그룹,
- 티오에테르 그룹 및 알킬이 바람직하게 메틸 그룹을 나타내는 알킬티오 그룹,
- C1내지 C6알킬 그룹, 또는
- 트리할로게노메틸 그룹, 바람직하게는 트리플루오로메틸을 나타낼 수 있다.
오르쏘-파라 이치환된 유도체의 경우:
B, E 및 D는 수소 원자를 나타내고, A 및 C는 메틸 그룹을 나타낸다.
바람직한 화합물로서 하기의 화합물이 특히 언급될 수 있다:
4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
5γ-히드록시-4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ξ-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-메톡시카보닐-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-클로로-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ξ-3급-부틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-3급-부틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ξ-이소프로필-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-이소프로필-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IE,
4ε-메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ε-플루오로-4ξ-메틸-데(ξ4-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티니-마이신 IA,
4ξ-디에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-디알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-알릴에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에틸프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에틸이소프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에틸메틸시클로프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-(1-피롤리디닐)-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-트리플루오로메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-알릴옥시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ζ-메틸티오메틸-데(4ζ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-(2-클로로에톡시)-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-아세틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
4ε-디메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
4ε-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA및
4ε-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA.
본 발명은 또한 화학식 I의 화합물을 제조하기 위해 특히 유용한 방법에 관한 것이다.
더 특히, 본 발명은 그룹 B 스트렙토그라민의 전구체의 생합성에 영향을 끼치는 적어도 하나의 유전적 변형을 소유한 스트렙토그라민-생성 미생물 균주를 사용하고, 상기 뮤턴트 균주를, 적절하며 생합성이 변경된 것과 상이한 적어도 하나의 신규한 전구체를 보충한 배양 배지에서 배양하고, 상기 스트렙토고라민을 수득함을 특징으로 하는 스트렙토그라민 제조 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 범위 내에서 사용하는 균주는 스트렙토그라민을 생산하며 돌연변이된 균주이다. 유전적 변형(들)은 전구체의 생합성에 관여하는 유전자 중 하나에 또는 코딩 유전자의 외부 (예를 들면, 상기 유전자의 발현 및/또는 전사 또는 전사후 조절에 책임지는 영역, 또는 상기 유전자를 포함하는 영역 또는 상기 유전자를 포함하는 트랜스크립트에 속하는 영역)에 위치할 수 있다.
본 발명의 한 특정 구체예에 따라, 뮤턴트 균주는 그룹 B 스트렙토그라민의 전구체에 생합성에 관여하는 유전자 중 적어도 하나에 하나 이상의 유전적 변형을 소유한다.
이러한 유전적 변형(들)은 상기 유전자의 발현을 변경시키고, 즉, 이 유전자 및 경우가 허용되면, 전구체의 생합성에 관여하는 다른 유전자를, 적어도 하나의 전구체의 생합성에 관여하는 천연 효소를 부분적으로 또는 전체적으로 암호화할 수 없게 만든다. 상기 유전자가 천연 단백질을 암호화할 수 없음은 구조 또는 형사의 변경으로 인해 불활성인 단백질의 생산 또는 생산의 부재, 또는 변경된 효소 활성을 갖는 단백질의 생산, 또는 감소된 레벨 또는 원하는 조절 유형의 천연 단백질의 생산에 의해 증명될 수 있다. 이들 가능한 증명 모두는 적어도 하나의 그룹 B 스트렙토그라민 전구체의 합성에서의 변경 또는 아마도 차단에 의해 나타난다.
본 발명의 범위 내에서 돌연변이될 수 있는 유전자는 바람직하게는, 다음의 전구체 [L-2-아미노부티르산, 4-디메틸아미노-L-페닌알라닌(DMAPA), L-피페콜산, L-페닐글리신 및/또는 3-히드록시피콜린산(3-HPA)의 생합성에 관여하는 유전자이다.
이들 유전자는 더 바람직하게는 하기에 설명될 papA, papM, papB(서열 3), papC(서열 2), hpaA(서열 8), snbF(서열 6) 및 pipA(서열 5) 유전자이다.
papA 및 papM 유전자는 특허 출원 PCT/FR 93/0923호에서 이미 설명하였다. 이들은 코스미드 pIBV2 상에 존재한다. papA 유전자는 코리스메이트로부티 4-아미노-L-패닐알라닌을 생합성하기 위한 유전자에 상응하는 것으로 나타난다. 이어서, 4-아미노-L-페닐알라닌을 papM 유전자의 생성물인 N-메틸트랜스퍼라제로 디메틸화하여 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌(DMPAPA)를 생성하여, 이를 프리스티나마이신 IA에 삽입시킨다. 따라서, 이들 두 유전자는 더 특히 DMPAPA로 지칭되는 전구체의 합성에 관여한다.
다른 유전자, papB, papC, pipA, snbF 및 hpaA를 본 발명의 범위 내에서 동정하고, 특성화한다. 이들을 약 10kb의 크로모좀 영역상의 snbA, papA 및 papM 유전자와 함께 그룹짓는다 (도 7).
PapB 및 PapC 단백질에 대해 설명된 서열 호몰러지는 이들 단백질이 또한 papA 및 papM 단백질과 결합하여 DMPAPA 전구체의 생합성에 관여하는 것을 보여준다. 두종의 상응하는 신규한 유전자, papB 및 papC를 특허 출원 PCT/FR 93/0923호에 설명된 코스미드 pIBV2, 및 HindIII 삭제에 의해 pIBV2로부터 유도되고 또한 특허 출원 PCT/FR 93/0923호에 설명된 플라스미드 pVRC900을 사용하여 실행되는 서브클로닝에 의해 분리하고 동정한다.
papC 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 Genpro 라이브러리(library)에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 이. 콜라이(E. coli) (Hudson 및 Davidson, 1984) 및 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola) (EMBL 데이터 라이브러리, 1991)의 이작용성 TyrA 단백질의 프레페네이트(prephenate) 데하이드로게나제 활성에 해당하는 영역과 27% 호몰러지를 보여준다. TyrA의 이 영역은 프레페네이트의 방향족화를 촉매하여 타이로신의 생합성에서 4-히드록시페닐피루베이트를 생성한다. 4-데옥시-4-아미노프레페네이트로부티 진행하여 4-아미노페닐피루베이트를 형성하는 유사한 방향족화가 DMPAPA의 합성에 관여할 것이다. 이는 PapC 단백질(서열 2)에 의해 촉매된다.
PapB는 이. 콜라이 (Hudson 및 Davidson, 1984)의 TyrA 및 PheA 이작용성 단백질 및 어위니아 허비콜라의 TyrA 단백질의 코리스메이트 뮤타제 활성에 해당하는 영역과 24 내지 30% 호몰러지를 소유한다. 이 영역은 코리스메이트의 이성화를 촉매하여 타이로신 및 페닐알라닌의 생합성에서 프레페네이트를 형성한다. PapB 단백질(서열 3)은 DMPAPA의 합성에서 4-데옥시-4-아미노코리스메이트로부터 4-데옥시-4-아미노프레페네이트를 형성하는 유사한 이성화에 관여할 것이다.
pipA, snbF 및 hpaA 유전자는 snbA 유전자 (3-히드록시피콜린산 AMP 리가제를 암호화하고, 특허 출원 PCT/FR 93/023호에 설명된다)와 papA또는 snbR 유전자사이에 포함된 영역에 위치된다. 이들은 특허 출원 PCT/FR 93/0923호에 설명된 플라스미드 pVRC900 및 코스미드 pIBV2를 사용하여 수행되는 서브클로닝에 의해 정확하게 배치된다.
hpaA 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 Genpro 라이브러리에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 많은 항생제 (DnrJ, EryCl, TylB, StrS 및 PrgL)의 생합성에서 중간체의 아민전달에 관여할 수 있는(Thorson 등, 1993) 단백질 그룹과 30 내지 40%의 호몰러지가 검출된다. 시클로탈아민화외의 경로에 의해 라이신으로부터 유도되는 것으로 보이는(실시예 1-2 및 실시예 2-1 참조) 3-HPA 전구체의 합성에서 유전자 hpaA(서열 8)의 생성물에 의해 촉매될 수 있는 아민전달 단계가 필요할 것이다. 더욱, 이 유전자의 돌연변이의 결과는 이 유전자가 3-HPA 전구체의 합성에 관여하는 것을 명백하게 설명한다.
pipA 유전자에 의해 암호화되는 생성물을 Genpro 라이브러리에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 에그로박테리움 투미파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의오르니틴 시클로데아민아제와 30% 호몰러지를 보인다 (Schindler 등, 1989). 이 효소는 옥토핀 분해의 최종 단계에 관여한다: 이는 시클로탈아민화에 의해 L-오르니틴을 L-프롤린으로 전환시킨다. 저자는 PIA및 비르기니아마이신 S1에서 모두 발견되는 4-옥소피페콜산 및 3-히드록시피콜린산이 라이신으로부터 유도되는 것을 라벨링된 라이신을 삽입함으로써 설명한다 (Molinero 등, 1989. Reed 등, 1989). 오르니틴을 설명한 바와 동일한 방식으로, 라이신을 시클로탈아민하여 피페콜산을 형성한다. 이 가정을 고려하여, 이 생성물을 PipA(서열 5)로 지칭한다. 아래 실시예에서 나타낸 pipA 유전자를 돌연변이시킨 결과는, 이 유전자가 피페콜산의 합성에 단독으로 참여함을 설명한다. 특히, 이 돌연변이는 또한 라이신으로부터 유도되고, 피페콜산이 전구체가 될 수 있는 3-히드록시피콜린산의 생합성에 영향을 끼치지 않음을 안다.
마지막으로, snbF 유전자의 생성물을 Genpro 라이브러리에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 2차 대사산물의 생합성에 관여하는 사이토크롬 P450형의 몇몇 히드록실라제와 30 내지 40% 호몰러지가 기록된다 (Omer 등, 1990. Trower 등, 1992). 몇몇 히드록실화는 프리스티나마이신 I의 전구체의 생합성, 특히, 3-HPA (피콜린산의 3위치에서 히드록실화) 및 4-옥소피페콜산 (피페콜산의 4위치에서 히드록실화)의 생합성에서 관찰할 수 있다. 상응하는 단백질은 SnbF(서열 6)으로 지칭한다.
snbF 유전자의 발현에 극성 효과를 갖는 pipA 유전자의 돌연변이의 결과는, snbF 유전자가 그룹 B 스트립토그라민의 피페콜산 잔기의 히드록실화에 관여하는것을 설명한다. 따라서, snbF 유전자의 발현은 pipA 유전자의 유전적 변형에 영향을 끼치는 방법에 의해 변경된다.
바람직하게, 유전적 변형(들)은 상기 유전자가 부분적으로 또는 전적으로 천연 단백질을 암호화할 수 없게 만든다.
유전적 변형은 더 특히, 임의의 억압, 치환, 삭제 또는 고려되는 유전자에 하나 이상의 염기의 첨가를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 이러한 변형은 실험실적으로 (분리된 DNA 상에) 또는 생체내에서 (예를 들면, 유전자 공학 기술에 의해, 또는 상기 미생물을 돌연변이제를 사용하는 처리에 노출시킴으로써) 수득될 수 있다. 언급될 수 있는 돌연변이제의 예는 고에너지광선 (X, γ, 자외선 등의 광선)과 같은 물리적 제제 또는 DNA 염기의 상이한 작용 그룹과 반응할 수 있는 화학적 제제 (예를 들면, 알킬화제 [에틸 메탄설포네이트(EMS), N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 및 N-니트로퀴놀린-1-옥사이드(NQO)], 이알킬화제, 인터킬레이트화제 등)이다. 삭제는 고려되는 유전자의 전체애 대해 일부의 임의의 억압을 의미한다. 특히, 이러한 삭제는 상기 단백질을 암호화하는 영역의 일부, 및/또는 전사 또는 번역을 위한 프로모터 영역의 전부 또는 일부, 또는 트랜스크립트의 삭제일 수 있다.
유전적 변형은 예를 들면, Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1983) 202]에 처음 설명된 프로토콜을 사용하는 유전자 붕괴에 의해, 또는 유리하게 이중 동종 재조합에 의해 획득될 수 있다. 이 경우, 바람직하게 전체 코딩 서열이 붕괴되어, 필요하다면, 동종 재조합에 의해 야생형 게놈 서열을 비작용성 또는 돌연변이 서열로교체할 것이다.
본 발명의 다른 선택에 따라, 유전적 변형은 상기 단백질을 암호화하는 유전자(들)를 조절된 프로모터의 제어하에 놓는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 돌연변이 미생물 균주는 스트렙토그라민을 생산하는 임의의 미생물로부터 획득할 수 있다(표 V참조). 본 발명의 한 특정 구체예에 따라, 뮤턴트 균주는 에스. 프리스티내스피랄리스 및 더 특히, 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92로부터 유도된 균주이다.
본 발명의 범위 내에서 바람직하고, 더 특히 언급될 수 있는 뮤턴트 균주는 생합성에서, 단순 교차에 의해 papA 유전자를 붕괴함으로써 돌연변이된 균주SP92::pVRC508, 또는 더 바람직하게는 이중 동종 재조합에 의해 papA 유전자를 붕괴함으로써 DMPAPA 전구체의 생합성에서 돌연변이된 균주 SP212이다. 이들 균주는 DMPAPA 전구체를 보충하지 않으면, PI를 생산하지 않는다. 기대치 않게, DMPAPA와 상이하고, 이 경우 대사 후에 PI 합성효소(synthetase) III을 (L-프롤린 및 DMPAPA 잔기를 삽입하기 위한 SnbD단백질) 삽입할 수 있는 신규한 전구체를 생산 배지에 첨가하면, 이들 두 균주는 신규한 I 프리스티나마이신 또는 비르기니아마이신을 생산할 수 있거나, 주로 PI의 마이너 요소, 특히, PIB인 요소를 생산할 수 있게 된다(도 2).
본 발명의 범위에서, 두종의 다른 뮤턴트 균주를 제조한다. 이들은 각각, 동종 재조합에 의해 pipA 유전자가 붕괴된 균주 SP92pipA::ΩamR, 및 hpaA 유전자가붕괴된 균주 SP92hpaA::ΩamR이다. 균주 SP92pipA::ΩamR는 표준 발효 조건하에서 PI를 생산하지 않지만, L-피페콜산의 존재하에, 처음에 그룹 B 스트렙토그라민 요소중의 마이너 요소였던 요소를 대랑 생산하며, 여기에서 4-옥소피페콜산을 L-피페콜산으로 교체한다. 균주 SP92hpaA::ΩamR는 표준 발효 조건하에서 PI를 생산하지 않지만, 신규한 전구체의 존재하에 신규한 그룹 B 스트렙토그라민을 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 뮤턴트 균주를 배양하기 위한 배지에 적어도 하나의 신규한 전구체를 보충함으로써, 신규한 스트렙토그라민 또는 스트렙토그라민의 마이너 폼을 생합성하는 것 또한 하나의 스트렙토그라민의 우수한 형성이 가능하다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 범위내에서 사용된 전구체는 아미노산(더 특히, 페닐알라닌) 뿐만 아니라, 유기산(더 특히, α-케토카복실산)의 유도체 또는 동족제, 더 특히 페닐피루브산의 유도체일 수 있다.
천연적으로, 신규한 전구체는 그룹 B 스트렙토그라민의 천연 전구체 중 하나의 생합성에서 본 발명에 따라 유도된 변경 또는 차단을 위해 제공하고, 스트렙토그라민의 합성을 이끈다. 본 발명의 한 특정 구체예에 따라, 이 신규한 전구체는 생합성이 변경된 전구체에 관련되도록 선택된다. 따라서, DMPAPA의 생합성에서 차단된 뮤턴트의 특정 경우에, 신규한 전구체는 바람직하게는 페닐알라닌의 유도체이다.
특히, 하기의 전구체가 본 발명에 적합할 수 있다:
페닐알라닌, 4-디메틸아미노페닐알라닌, 4-메틸아미노페닐알라닌, 4-아미노페닐알라닌, 4-디에틸아미노페닐알라닌, 4-에틸아미노페닐알라닌, 4-메틸티오페닐알라닌, 4-메틸페닐알라닌, 4-메톡시페닐알라닌, 4-트리플루오로메톡시페닐알라닌, 4-메톡시카보닐페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-브로모페닐알라닌, 4-요오도페닐알라닌, 4-트리플루오로메틸페닐알라닌, 4-3급-부틸페닐알라닌, 4-이소프로필페닐알라닌, 3-메틸아미노페닐알라닌, 3-메톡시페닐알라닌, 3-메틸티오페닐알라닌, 3-플루오로-4-메틸페닐알라닌, L-피페콜산, 4-3급-부틸페닐피루브산, 4-메틸아미노페닐피루브산, 2-나프틸페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 3-트리플루오로페닐알라닌, 3-에톡시페닐알라닌, 2,4-디메틸페닐알라닌, 3,4-디메틸페닐알라닌, 3-메틸페닐알라닌, 4-페닐페닐알라닌, 4-부틸페닐알라닌, 2-티에닐-3-알라닌, 3-트리플루오로메틸페닐알라닌, 3-히드록시페닐알라닌, 3-에틸아미노페닐알라닌, 4-알릴아미노페닐알라닌, 4-디알릴아미노페닐알라닌, 4-알릴에틸아미노페닐알라닌, 4-에틸프로필아미노페닐알라닌, 4-에틸이소프로필아미노페닐알라닌, 4-에틸메틸시클로프로필아미노페닐알라닌, 4-(1-피롤리디닐)페닐알라닌, 4-O-알릴타이로신, 4-O-에틸타이로신, 4-에틸티오패닐알라닌, 4-에틸티오메틸페닐알라닌, 4-O-(2-클로로에틸)타이로신, 4-아세틸페닐알라닌, 4-에틸페닐알라닌, 3-디메틸아미노페닐알라닌, 3-에톡시페닐알라닌, 3-플루오로-4-메틸페닐알라닌 및 4-아미노메틸페닐알라닌.
이들 전구체중에, 4-트리플루오로메톡시페닐알라닌, 3-메틸아미노페닐알라닌, 3-메틸티오페닐알라닌, 3-플루오로-4-메틸페닐알라닌, 4-메틸아미노페닐피루브산, 3-에톡시페닐알라닌, 4-알릴아미노페닐알라닌, 4-디알릴아미노페닐알라닌, 4-알릴에틸아미노페닐알라닌, 4-에틸프로필아미노페닐알라닌, 4-에틸이소프로필아미노페닐알라닌, 4-에틸메틸시클로프로필아미노페닐알라닌, 4-(1-피롤리디닐)페닐알라닌, 4-에틸티오메틸페닐알라닌, 4-O-(2-클로로에틸)타이로신, 3-디메틸아미노페닐알라닌 및 3-에틸아미노페닐알라닌이 신규하고 본 발명의 범위내에서 제조되고 특성화된다. 이들은 본 발명에 따른 스트렙토그라민을 제조하기에 특히 유용한 것으로 발견되었다.
청구된 방법은 신규한 그룹 B 스트렙토그라민을 제조하기에 또는 특정 스트렙토그라민의 우수한 형성을 위해 특히 유리함이 밝혀졌다. 이와 같이, 본 방법은 PIB를 제조하기에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 아래에서 선택된 뉴클레오티드에 관한 것이다:
(a) 유전자 papC(서열 2), papB(서열 3), pipA(서열 5), snbF(서열 6) 및 hpaA(서열 8)의 전부 또는 일부,
(b) (a) 유전자의 전부 또는 일부와 하이브리드화한 서열, 및
(c) 유전자 암호의 축퇴에 의해 (a) 및 (b) 서열로부터 유도된 서열.
특히 (b)에 따른 하이브리드 서열의 경우에, 이 서열은 바람직하게는 스트렙토그라민의 생합성에 관여하는 폴리펩티드를 암호화한다.
더욱 더 특히, 본 발명은 유전자 papC(서열 2), papB(서열 3), pipA(서열 5), snbF(서열 6) 및 hpaA(서열 8)에 의해 나타난 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 papC(서열 2), papB(서열 3), pipA(서열 5), snbF(서열 6) 및 hpaA(서열 8) 유전자를 포함하는 임의의 재조합 DNA에 관한 것이다.
천연적으로, 상기에 지정된 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터형의 벡터의 일부일수 있고, 이는 자발적으로 복제하는 벡터, 합성 벡터 또는 자살 벡터일 수 있다. 본 발명은 또한 이들 벡터 뿐만 아니라, 특히 관심있는 대사산물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 서열 또는 상응하는 벡터의 임의의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 청구된 서열의 발현에 의해 생성되는 임의의 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 papC(서열 2), papB(서열 3), pipA(서열 5), snbF(서열 6) 및 hpaA(서열 8) 유전자 내에 적어도 하나의 유전적 변형을 지니는 임의의 돌연변이된 에스. 프리스티내스피랄리스 균주, 및 더 바람직하게는, 이중 동종 재조합에 의한 papA 유전자의 붕괴로 이루어진 유전적 변형을 지니는 SP212와 같은 임의의 에스 프리스티내스피랄리스 균주 뿐만 아니라 균주 SP92pipA::ΩamR및 SP92hpaA::ΩamR에 관한 것이다.
그룹 A 스트렙토그라민의 요소 및 본 발명에 따른 화학식 I에 따른 화합물의 배합은 치료 스피어에 특히 유리한 조성물을 구성한다. 이들은 특히, 그람 양성박테리아 (스태필로코사이, 스트렙토코사이, 뉴모코사이(Pneumococci) 및 엔테로코사이(Enterococci) 종) 및 그람 음성 박테리아 (해모필루스(Haemophilus), 고노코사이(Gonococci), 메닝고코사이(Meningococci) 종)으로 인한 병을 치료하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 마우스스테필로코쿠스아우레우스(Staphylococcus aureus) IP8203에 대해 생체내 주로 30mg/kg 내지 100mg/kg의 경구 투여량으로 사용된 프리스티나마이신 IIB이 30/70 정도의 PI/PII 비율로 배합될 때 항박테리아 작용에 상승 효과를 갖는다.
본 발명은 그룹 A 스트렙토그라민과 배합되거나 배합되지 않은 적어도 하나의 화학식 I의 화합물을 포함하는 약학 조성물로 확장한다.
하기에 나타낸 실시예는 본 발명의 설명으로서 제공되며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 프리스티나마이신 I 및 이의 전구체이 생합성에 관여하는 유전자의 시퀀싱 및 동정
효소 PapA를 코딩하고 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명된 유전자의 다운스트림 및 업스트림에 놓인 유전자 뿐만 아니라, 효소 SnbA를 코딩하고 또한 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명된 유전자의 다운스트림에 놓인 유전자의 시퀀싱에 의한 동정.
본 실시예는 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명되며, 프리스티나마이신 I의 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌(DMPAPA) 전구체 합성에 관여하는 효소 PapA 및 PapM에 대한 구조 유전자 및 프리스티나마이신 I의 방향족 전구체인 3-히드록시피콜린산(3-HPA)을 활성화시키는 효소 SnbA에 대한 구조 유전자를 포함하는 코스미드 pIBV2를 사용하여, 이들 유전자 주위를 시퀀싱하고 상응하는 뮤턴트를 연구함으로써, DMPAPA 전구체의 생합성 또는 프리스티나마이신 I의 다른 전구체의 생합성에 관여하는 다른 유전자를 동정할 수 있음을 증명하는 방법을 설명한다.
이 목표를 염두에 두고, HindIII 삭제에 의해 pIBV2로부터 유도되고 또한 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명되어 있는 코스미드 pIBV2 및 플라스미드 pVRC900을 사용하여 서브클로닝을 수행한다.
본 실시예는 애스. 프리스티네스피랄리스의 papA 및 snbA 유전자의 다운스트림 및 업스트림에 놓인 단편의 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있는 방법을 설명한다.
M13mp18 및 19 벡터(Messing 등, 1981) 내에서 관심있는 DNA 단편을 클로닝하는 기술은 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli)에서 클로닝하는 표준 기술이며 Maniatis 등(1989)에 설명되어 있다.
1-1. papA 유전자의 다운스트림 영역의 시퀀싱 및 분석
papA 및 papM 유전자 사이에 포함된, 본 영역을 시퀀싱하기 위해, 1.5kb의 PstI-PstI 단편, 0.7kb의 PstI-XhoI 단편 및 0.7kb의 XhoI-XhoI 단편을 플라스미드 pVRC900로부터 진행하여 M13mp18 및 M13mp19 벡터내로 서브클로닝한다. 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명된 플라스미드 pVRC900 및 pVRC409를 사용하여, 두-가닥의 DNA상에 시퀀싱함으로써 클로닝 위치를 시퀀싱한다.
아래와 같이 클로닝을 수행한다. 약 2㎍의 플라스미드 pVRC900을 공급자에 의해 제안된 조건하에 제한 효소 PstI 및/또는 XhoI (New England Biolands)로 절단한다. 이렇게 수득된 제한 단편을 0.8% 아가로즈겔상에서 분리하고, 관심있는 1.5kb의 PstI-PstI, 0.7kb의 PstI-XhoI 및 0.7kb의 XhoI-XhoI 단편을 Geneclean(Bio101, La Jolla, California)을 사용하여 분리하고 정제한다. 각각의 클로닝에 대해, PstI 및/또는 XhoI로 절단된 M13mp19 및/또는 M13mp18 약 10ng을 Maniatis 등(1989)에 의해 설명된 조건하에 클로닝될 단편 100ng에 결찰한다. 균주 TG1(K12 △(lac-pro) supE thi hsd △S F' traD36 proA+B+ lacIq lacZ △M15; Gibson, 1984)를 형질전환시키고, Maniatis 등(1989)에 의해 설명된 기술에 따라LB+X-gal+IPTG 배지 상에서 용해 플라크를 선택한 후, 원하는 단편을 포함하는 파지를 분리한다. 합성 프라이머로서, 유니버설 프라이머 또는 시퀀싱될 인서트의 20 뉴클레오티드에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 체인 종결 반응에 의해 상이한 인서트를 시퀀싱한다. 형광 디데옥시뉴클레오티드(PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit-Applied Biosystem)를 사용하여 반응을 수행하고, 모델 373 A Applied Biosystems DNA 시퀀서 상에서 분석한다. 이들 상이한 인서트사이의 겹침은 papA 및 papM 유전자 사이의 전체 뉴클레오티드 서열(서열 1)을 확립할 수 있게 한다.
이 뉴클레오티드 서열의 도움으로, 개열 리딩 프레임을 결정하여, 에스. 프리스티내스피랄리스에서 PI 또는 이의 전구체의 생합성에 관여하는 유전자 뿐만 아니라 이러한 유전자에 의해 암호화되는 폴레펩티드를 동정할 수 있다.
스트렙토마이시즈(Streptomyces) DNA가 고농도의 G 및 C 염기를 나타내는 사실 뿐만 아니라 코딩 프레임을 이루는 코돈의 사용에서 강한 바이어스(Bibb 등, 1984)를 이용하여 papA 및 papM 유전자 사이의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2.9kb PstI-XhoI 단편 내에서 개열 리딩 프레임을 찾았다. Staden 및 McLachlan의 방법(1982)으로 이미 시퀀싱되고 19673 코돈을 포함하는 데이터 화일로서 조립되었으며, BISANCE (Dessen 등, 1990) 컴퓨터 서버(server)를 사용하여 수득된 스트렙토마이시즈 유전자의 코돈 용도에서 코딩 프레임의 가능성을 계산할 수 있다.
이 방법을 사용하여, 2.9kb PstI-XhoI 단편내에 4개의 높은 가능성의 개열 리딩 프레임을 특성화할 수 있고, 이 리딩 프레임을 하기 표에 예시하였다(표 I).이들을 PstI 위치로부터 시작하여 위치에 따라 프레임 1 내지 4로 지정하였다. 각각의 리딩 프레임이 길이(염기)는 단편내에 위치로서 지정된다(PstI 위치는 위치 1로 지정된다); 암호화된 폴리펩티드내의 아미노산의 수는 또한 개열 리딩 프레임 2 및 3에 대해 지정되었다. 프레임 1, 3 및 4는 동일한 스트랜드에 의해 암호화되지만, 프레임 2는 상보적인 스트랜드에 의해 암호화된다(도 4). 프레임 1 및 4는 각각 PapA 단백질의 C-말단 영역 및 PapM 단백질의 N-말단 영역에 상응하며, 이들 단백질을 이미 동정되어 특허 PCT/FR 93/0923호에 기술되어 있다.
[표 I]
Figure pct00003
프레임 2(표 I)의 생성물을 Genpro 라이브러리에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 이. 콜라이(Hudson 및 Davidson, 1984) 및 어위니아 허비콜라(EMBL 데이터 라이브러리, 1991)의 이작용성 TyrA 단백질의 프레페네이트 데하이드로게나제 활성에 관계되는 영역과 27%의 호몰러지를 나타낸다. TyrA의 이 영역은 프레페네이트의 방향화를 촉매하여 타이로신의 생합성에서 4-히드록시페닐파이루베이트를 형성한다. 4-데옥시-4-아미노프레페네이트로부터 4-아미노페닐파이루베이트를 생성하는 유사한 방향화가 DMPAPA의 합성에 관여한다. 이 반응은 프레임 2의 생성물, PapC(서열 2)에 의해 촉매될 것이다.
프레임 3(표 I)의 생성물을 Genpro 라이브러리애 포함된 단백질 서열과 비교하면, 이. 콜라이(Hudson 및 Davidson, 1984)의 이작용성 TyrA 및 PheA 단백질 및 어위니아 허비콜라(EMBL 데이터 라이브러리, 1991)의 TyrA 단백질의 코리스메이트뮤타제 활성에 관계되는 영역과 30%의 호몰러지를 나타낸다. 이 영역은 코리스메이트이 이성화를 촉매하여 타이로신 및 페닐알라닌의 생합성에서 프레페네이트를 형성한다. 4-데옥시-4-아미노코리스메이트로부터 4-데옥시-4-아미노프레페네이트를 생성하는 유사한 이성화가 DMPAPA의 합성에 관여할 것이다. 이 반응은 프레임 3의 생성물, PapB(서열 3)에 의해 촉매될 것이다.
TyrA 및 PheA의 경우에, 코리스메이트 뮤타제 및 프레페네이트 데하이드레이타제, 또는 프레페네이트 데하이드로게나제 활성은 동일한 단백질에 의해 촉매된다. 에스. 프리스티내스피랄리스에서, 코리스메이트 뮤타제 및 프레페네이트 데하이드로게나제 효소 활성은 두종의 개별적인 단백질, 즉, 각각 PapB 및 PapC에 의해 촉매된다.
PapB 및 PapC 단백질에 대해 설명된 서열 호몰러지는 이들 두 단백질이 PapA 및 PapM 단백질과 결합하여 방향족 유도체 DMPAPA의 생합성에 관여함을 설명한다. papA와 동일한 방식으로, papB 및 papC 유전자는 PI 생산할 수 없지만, 신규한 전구체에 존재하에 DMPAPA 잔기의 레벨에서 변형된 신규한 PI를 생산할 수 있는 에스. 프리스티내스피랄리스 균주의 제작을 이끌 것이다.
1-2. papA 유전자의 업스트림 영역의 시퀀싱 및 분석
이 영역은 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명된 3-히드록시피콜린산 AMP 리가제를 암호화하는 snbA, 및 papA유전자 사이에 포함된다.
클로닝은 실시예 1-1에 설명된 바와 같이 수행하고, 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명되어 있는 플라스미드 pVRC900 및 코스미트 pIBV2으로부터 진행한다. 1.3kb의 XhoI-XhoI, 0.2kb의 XhoI-XhoI, 3.3kb의 XhoI-XhoI, 1.1kb의 HindIII-PstI 및 2.2kb의 PstI-PstI 단편을 M13mp18 및 M13mp19 벡터 내로 서브클로닝한다. 이들 상이한 클로닝은 모든 클로닝 자리를 거쳐 통과할 수 있다. 상이한 인서트를 합성 프라이머로서, 유니버설 프라이머 또는 시퀀싱될 인서트의 20 뉴클레오티드에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 1-1에 설명된 바와 같이 시퀀싱한다.
이들 상이한 인서트 사이의 겹침은 snbA 및 papA 유전자 사이에 존재하는 전체 뉴클레오티드 서열(서열 4)을 확립할 수 있게 한다.
이 뉴클레오티드 서열을 기초로하여, 개열 리딩 프레임을 결정하고, 에스. 프리스티내스피랄리스에서 PI의 전구체의 생합성에 관여하는 유전자 뿐만 아니라 이러한 유전자에 의해 암호화되는 폴레펩티드를 동정할 수 있다.
실시예 1.1에 설명된 바와 같이, snbA 및 papA 유전자 사이의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 4.5kb XhoI-PstI 단편내에서 개열 리딩 프레임의 존재를 찾았다. 이 방법을 사용하여, 4.5kb XhoI-PstI 단편내에 4개의 높은 가능성의 개별 리딩 프레임을 특성화할 수 있고, 이 리딩 프레임을 하기 표에 예시하였다 (표 II). 이들을 XhoI 위치로부터 시작하여 위치에 따라 프레임 1 내지 4로 지정하였다. 이들의 길이(염기) 및 단편내 이들의 위치 (XhoI 위치는 위치 I로 지정된다)를 각각의 프레임에 대해 지정한다. 암호화된 폴리펩티드내의 아미노산의 수는 또한 개열 리딩 프레임 2 및 3에 대해 지정되었다. 프레임 2, 3 및 4는 동일한 스트랜드에 의해 암호화되지만, 프레임 1은 상보적인 스트랜드에 의해 암호화된다(도 5). 프레임 1 및 4는 각각 SnbA 및 PapA 단백질의 N-말단 영역에 상응하며, 이들 단백질을 이미 동정되어 특허 PCT/FR 93/0923호에 기술되어 있다.
[표 II]
Figure pct00004
프레임 2 (표 II)의 생성물을 Genpro 라이브러리에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 에그로박테리움 투미파시엔스 (Schindler 등, 1989)의 오르니틴 시클로데아미네이즈와 30%의 호몰러지를 나타낸다. 이 효소는 옥토핀의 분해의 최종 단계에 관여한다; 이는 시클로탈아민화에 의해 L-오르니틴을 L-프롤린으로 전환시킨다. 저자는 PIA 및 비르기니아마이신 S1에서 모두 발견되는 4-옥소피페콜산 및 3-히드록시피콜린산이 라이신으로부티 유도되는 것을 라벨링된 라이신을 삽입시킴으로써 절명한다 (Molinero 등, 1989; Reed 등, 1989). 오르니틴을 설명한 바와 동일한 방식으로, 라이신을 시클로탈아민화시키는 반응은 피페콜산을 형성시킨다. 이 가정을 고려하여, 프레임 2의 생성물을 PipA(서열 5)로 지칭한다. 2-1에 나타낸 pipA 유전자를 돌연변이시킴으로써, 이 돌연변이가 또한 라이신으로부터 유도되며, 이의 피페콜산이 전구체가 될 수 있는 3-히드록시피콜린산의 생합성에 영향을 끼치지 않기 때문에, papA 유전자가 피페콜산의 합성에 단독으로 참여함을 설명한다.
프레임 3 (표 II)의 생성물을 Genpro 라이브러리에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 히드록실라제가 2차 대사산물의 생합성에 관여하는(Omer 등, 1990. Trower 등, 1992) 사이토크롬 P450형의 몇몇 히드록실라제와 30 내지 40% 호몰러지를 나타낸다. 몇몇 히드록실화는 프리스티나마이신 I의 전구체의 생합성, 특히, 3-HPA(피콜린산의 3위치에서 히드록실화) 및 4-옥소피페콜산 (피페콜산의 4위치에서 히드록실화)의 생합성에서 관찰할 수 있다. 2-1-3에 주어진, papA 유전자의 돌연변이의 결과는 프레임 3의 생성물이 PIE의 피페콜산 잔기의 히드록실화에 관여함을 설명한다. 따라서 상응하는 유전자는 snbF로 지칭되고, 상응하는 단백질은 SnbF(서열 6)으로 지정한다.
1-3. snbA 유전자의 다운스트림 영역의 시퀀싱
이 영역은 3-히드록시피콜린산 아데닐레이트 리가제를 암호화하는 snbA, 및 PI를 전달하거나 차단하는 막단백질을 암호화하는 snbR 유전자 사이에 포함되며, 두 유전자는 특허 PCT/FR 93/0923호에 설명되어 있다. 이 영역의 시퀀싱은 실시예 1-1에서 설명한 바와 같이, 코스미드 pIBV2로부터 분리된 단편을 사용하여 수행한다.
코스미드 pIBV2로부티 진행하여 1.6kb의 HindIII-BglI 단편을 M13mp18 및M13mp19 벡터내로 서브클로닝한다. 인서트를 합성 프라이머로서, 유니버설 프라이머 또는 시퀀싱될 인서트의 20 뉴클레오티드애 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 1-1에 설명된 바와 같이 시퀀싱한다. 이렇게 수득된 뉴클레오티드 서열(서열 7)을 기초로, 개열 리딩 프레임을 결정하고, 에스. 프리스티내스피랄리스에서 PI의 전구체의 생합성에 관여하는 유전자 뿐만 아니라 이러한 유전자에 의해 암호화되는 폴레펩티드를 동정할 수 있다. 실시예 1.1에 설명된 바와 같이, snbA 유전자 및 이의 다운스트림 영역의 말단에 상응하는 1.6kb HindII-BglII 단편내에서 개열 리딩 프레임의 존재를 찾았다. snbA 유전자와 동일한 스트랜드에 의해 암호화되는 완전한 개열 리딩 프레임(도 6)이 검출되었다. HindIII 위치에 상응하는 위치 1에 비해, 이 프레임은 뉴클레오티드 249, 즉 snbA 유전자의 말단의 30 뉴클래오티드 후에서 시작하고, 뉴클레오티드 1481에서 종결된다. 이는 1234 뉴클레오티드 크기이고, 411 아미노산의 단백질에 상응한다.
이 개열 프레임을 Genpro 라이브러리에 포함된 단백질 서열과 비교하면, 많은 항생제 (DnrJ, EryCl, TylB, StrS 및 PrgL)의 생합성에서 중간체의 아민전달에 관여할 수 있는 단백질 그룹(Thorson 등, 1993)과 30 내지 40%의 호몰러지가 나타난다. 시클로탈아민화 외의 경로에 의해 라이신으로부터 유도되는 것으로 보이는 (실시예 1-2 및 실시예 2-1 참조) 3-HPA 전구체의 합성에서 프레임 3의 생성물, HpaA(서열 8)에 의해 촉매될 수 있는 아민전달 단계가 필요할 것이다. 2-2에 제시된 이 유전자의 돌연변이의 결과는 이 유전자가 3-HPA 전구체의 합성에 관여함을 명백하게 설명하며, 우리의 가정을 확정한다.
본 발명에서 설명되는 유전자, papB, papC, pipA, snbF 및 hpaA는 약 10kb의 크로모좀 영역상에서 snbA, papA 및 papM 유전자와 함께 그룹지워진다(도 7). 이는 PI 및 이의 전구체의 생합성에 관여하는 유전자의 클러스터(cluster)의 존재를 확정한다. 이 클러스터의 업스트림 및 다운스트림 영역을 연구함으로써, PI 전구체, 특히 L-페닐글리신 및 L-2-아미노부티르산의 생합성에 관여하는 다른 유전자를 동정할 수 있다.
실시예 2. 동정된 유전자를 붕괴함에 의한 재조합 균주의 제작
본 실시예는 프리스티나마이신 전구체의 생합성에서 실시예 1에 기술된 유전자의 참여를 설명할 수 있고, 또한 신규한 프리스티나마이신을 생산할 수 있는 에스. 프리스티내스피랄리스 균주를 제작할 수 있는 방법을 설명한다. 이들 균주는 교체를 원하는 잔기의 생합성에 관여하는 유전자를 붕괴함으로써 수득되고, 신규한 프리스티나마이신은 이들 뮤턴트에 신규한 전구체를 보충함으로써 생산된다.
전구체 DMPAPA를 다른 분자로 교체함으로써 PI의 신규한 유도체를 생산하기 위해 본 발명에서 사용되는 균주 SP92::pVRC508은 특허 PCT/FR 93/0923호에 기술되어 있다. 이는 DMPAPA의 전구체의 생합성에 관여하고, 코리스메이트의 아민전달에 관련된 초기 단계에 참여하는 것으로 생각되는 papA 유전자를 단순 교차에 의해 붕괴함으로써 수득된다. 붕괴는 이 뮤턴트에서 papA 유전자의 1.5kb 다운스트림에 위치하고, 4-아미노-L-페닐알라닌을 이중 메틸화하여 DMPAPA를 형성하는데 관여하는 papM 유전자의 발현(PCT/FR 93/0923호)이 감소되므로 극성을 갖는다. 따라서, 4-아미노-L-페닐알라닌(PAPA)을 DMPAPA로 전환시키기 위한 SAM-의존 메틸화 효소의 활성을 분석하면 뮤턴트 SP92::pVRC508이 야생형 균주의 활성보다 5% 이하의 활성을 가짐을 보여준다.
본 발명에서, 이 균주 SP92::pVRC508은 적절한 발효 조건 및 보충 조건하에서 실시예 3에서 설명될 바와 같이 DMPAPA 잔기의 레벨에서 변형된 신규한 프리스티나마이신을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 동일한 표현형(phenotype)을 갖는 뮤턴트를 본 발명에서 설명된 papB 또는 papC 유전자를 붕괴함으로써 수득할 수 있다.
papA 유전자가 붕괴되고 균주 SP92::pVRC508과 동일한 표현형을 포함하는 다른 유형의 에스. 프리스티내스피랄리스 균주는 이중 교차에 의해 papA 유전자를 붕괴함으로써 유사한 방법으로 수득할 수 있다. 이 제작은 4.6kb SphI-HindIII 단편으로 시작하여 수행될 수 있고, 이 단편은 코스미드 pIBV2로부터 분리되며 pipA 유전자의 3' 영역, 전체 snbF 및 papA 유전자 및 papC 유전자의 3'부를 갖는다. 이 단편을 자살 벡터 pDH5내로 클로닝하며, 이 벡터는 유일하게 이. 콜라이 내에서 복제할 수 있지만 스트렙토마이시즈에서 발현되는 내성 마커를 갖지 않는다 (티오스트렙톤 또는 노히헵티드, tsr에 내성인 유전자). 이 벡터, pDH5는 Wohlebben 등(1991 Nucleic Acid Res. 19, 727-731)에 의해 개발되었다. 이어서, papA 유전자내에 1.1kb의 BclI-BclI 삭제를 제조하고, amR유전자(게네티신 및 아프라마이신에 내성인)를 갖는 2.2kb 의 HindIII-HindIII 단편을 부착 말단을 채운 후에 도입한다. 재조합 벡터를 pVRC414로 지칭하고, 도 12에 예시한다. 프리스티나마이신-생성균주를 플라스미드 pVRC414로 형질전환시킨 후에, 게네티신에 내성이고 티오스트렙톤에 감수성인 트랜스포먼트를 분리하여 분석한다. 도 13에 예시한 바와 같이 이들 클론은 플라스미드 pVRC414의 에스. 프리스티내스피랄리스 DNA 영역 및 에스. 프리스티내스피랄리스의 상응하는 크로모좀 영역 사이의 이중 동종 재조합의 결과물이다. 이들 클론 중 하나를 SP212로 지칭한다. 이의 표현형은 PI의 임의의 생성이 없고, 신규한 전구체의 존재하에 신규한 항생제를 생산할 수 있는 균주의 능력을 갖는 것으로 간주되는 균주 SP92::pVRC508과 동일하다. 유리하게, 이중 교차에 의해 수득되는 유형의 균주는 단순 교차에 의해 수득되는 균주보다 더 안정하다.
2-1. papA 유전자가 붕괴된 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92의 뮤턴트의 제작
본 실시예는 pipA 유전자의 붕괴함에 의해, 표준 발효 조건하에서 PI를 생산하지 않고, 발효에 신규한 전구체를 첨가하면 PIA의 4-옥소피페콜산 잔기 레벨에서 변형된 신규한 프리스티나마이신을 생산할 수 있는 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92를 제작할 수 있는 방법을 설명한다.
이. 콜라이에서 유일하게 복제하는 자살 벡터(벡터 pUC1318)을 사용하여 이를 제작한다. 이 벡터는 스트렙토마이시즈에 발현된 임의의 내성 마커를 갖지 않는다. 스트렙토마이시즈의 게놈내의 벡터의 존재는 콜로니 하이브리드화에 의해서만 검출될 수 있다.
2-1-1. 플라스미드 pVRC420의 제작:
본 실시예는 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92에서 복제하지 않으며 이중 동종 재조합에 의해 pipA 유전자를 붕괴하기 위해 사용될 수 있는 플라스미드를 제작할 수 있는 방법을 설명한다.
pipA 유전자가 붕괴된 SP92의 크로모좀 뮤턴트를 생산하기 위해, 특허 PCT/FR 93/0923호에 기술된 코스미드 pIBV2로부터 진행하여 플라스미드 pVRC420을 제작한다. 코스미드 pIBV2를 제한 효소 PstI로 절단하고, 이렇게 생성된 단편을 0.8% 아가로즈겔상의 전기영동에 의해 분리한 후에, snbA 및 snbF 유전자의 시작부 및 pipA 유전자의 전체를 포함하는 2.8kb의 PstI-PstI 단편을 Geneclean (Bio101, La Jolla, California)을 사용하여 분리하고 정제한다. PstI의 소화에 의해 선형화된 벡터 pUC1318 50ng을 실시예 1에 기술된 2.8kb 단편 200ng에 결찰한다. 원하는 단편을 포함하는 클론을 분리하고, 균주 TG1을 형질전환시키고, LB+150㎍/㎖ 암피실린+X-gal+IPTG 배지상에서 선택한다. 재조합 플라스미드를 pVRC415로 지칭한다(도 8). 이어서, 아프라마이신 또는 게네티신에 내성을 암호화하는(Kuhstoss 등, 1991) amR유전자를 포함하는 카셋트를 플라스미드 pVRC415의 유닉 HindIII 자리에 도입하며, 이 자리는 pipA 유전자의 시작부의 530bp 다운스트림에 위치한다. 이 제작은 아래와 같이 실행한다. amR유전자를 포함하는 2.5kb DNA 단편, PermE 프로모터(Bibb 등, 1985) 및 에리스로마이신에 내성인 유전자, ermE의 제 1의 158 아미노산을 플라스미드 pIJ4026 (PermE 프로모터의 제어하에 ermE 유전자를 포함하는 플라스미드) 및 pHF45ΩamR으로부터 유도된 플라스미드의 SalI-BglII 이중 소화에 의해 분리한다. Maniatis 등, 1989에 의해 기술된 프로토콜에 따라 클렙나우효소를사용하여 SalI-BglII 돌출 5' 부착 말단을 채운 후, amR유전자를 포함하는 단편을 돌출 5' 부착 말단이 또한 이미 설명된 바와 같이 클렙나우 효소로 채워진 플라스미드 pVRC415의 HindIII 위치내로 클로닝한다. 이렇게 수득된 재조합 플라스미드를 pVRC420으로 지칭한다. 제한효소 지도를 도 9에 예시한다.
2-1-2. pipA 유전자가 동종 재조합에 의해 붕괴된 뮤턴트 SP92pipA::ΩamR의 분리:
본 실시예는 pipA 유전자가 붕괴된 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92를 제작하는 방법을 설명한다.
본 뮤턴트를 자살 플라스미드 pVRC420으로 균주 SP92를 형질전환시킴으로써 분리한다.
프로토플라스트의 제조, 이들의 형질변환 및 재조합 균주로부터 총 DNA의 추출은 모두 Hopwood 등(1985)에 의해 설명된 바와 같이 행한다.
균주 SF92를 30℃에서 40시간 동안, YEME 배지(Hopwood등, 1985), 34% 수크로즈, 5mM MgCl2및 0.25% 글리신 내에서 배양한다. 균사를 라이소자임의 존재하에 프로토플라스트화하고, 5×1㎍의 pVRC420을 (PEG를 사용하는 방법에 의해) 프로토플라스트의 형질전환을 위해 사용한다. 하룻밤 동안, 프로토플라스트를 R2YE 배지(D. Hopwood 등, 1985) 상에서 재배양시킨 후에, 1,500㎍/㎖의 게네티신을 함유하는 3㎖의 SNA 배지(D. Hopwood 등, 1985)상에 스프레딩하여 재조합균주를 선택한다.
게네티신에 내성인 100클론을 실행된 5 형질변환으로부터 분리한다. 이들 재조합균주는 pipA 유전자(균주 SP92의 크로모좀에 포함된) 및 pipA 유전자의 일부(자살 플라스미드 pVRC420에 포함된 5.3kb 단편에 포함된) 사이의 단일 또는 이중 동종 재조합에 의해 통합으로부터 생성한다. 이중 교차에 의해 수득된 재조합균주(즉, 게놈에 플라스미드 pVRC420의 pUC318 부분을 포함하지 않는)를 선택하기 위해, 콜로니 하이브리드화를 Maniatis 등(1989)에 의해 설명된 바와 같이 프루브로서 [α-32P]dCTP로 라벨링된 pUC19를 사용하여 90 클론에서 실행한다. 게네티신에 내성이지만, 벡터 pUC19를 하이브리드화하지 않는 10클론을 선택한다. 재조합균주의 포자를 스트리킹하여 분리하여, 10㎍/㎖ 게네티신을 포함하는 HT7배지상에서 배양한 후, 동일한 배지상에 재스트리킹하여 분리된 콜로니를 수득한다. 플라스미드 pVRC420의 통합 위치를 확인하기 위해, Hopwood 등, 1985에 의해 설명된 바와 같이 정제된 몇몇 재조합 클론으로부터 총 DNA의 다양한 Southern을 [α-32P]dCTP로 라벨링된 후 프루브로서 사용되는 2.8kb PstI-PstI 단편에 하이브리드화시켜 실행한다. 결과는 이들 재조합균주가 pipA 유전자를 포함하는 2.8kb PstI-PstI 단편이 amR유전자의 도입에 의해 붕괴된 pipA 유전자를 포함하는 5.3kb의 PstI-PstI 단편으로 교체되는 벡터 pVRC420 및 균주 SP92의 크로모좀간의 이중 교차에 의해 수득됨을 확정한다. 이들 뮤턴트 중 하나를 SP92pipA::ΩamR으로 지정한다.
2-1-3. 뮤턴트 SP92pipA::ΩamR을 사용하는 프리스티나마이신의 생산:
본 실시예는 pipA 유전자가 플라스미드 pVRC420의 통합에 의해 붕괴된 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92의 뮤턴트가, 한편으로 표준 발효 조건하에서 PI를 생산하지않는 반면, 4-옥소피레콜린산이 피페콜산에 의해 교체된 스트렙토그라민의 B요소의 마이너 폼의 생산의 높은 레벨을 나타냄을 입증하는 방법을 설명한다.
뮤턴트 SP92pipA::ΩamR뿐만 아니라, 대조 균주 역할을 하는 균주 SP92을 액체 생성 배지에서 배양한다. 발효를 아래와 같이 수행한다 : 전술된 균주로부터의 포자 현탁액 0.5㎖를 멸균 조건하에서, 300㎖ 배플장치된 엘렌마이어 플라스크내 접종 배지 40㎖에 첨가한다. 접종 배지는 10g/ℓ 의 콘 스팁, 15g/ℓ 의 수크로즈, 10g/ℓ 의 (NH4)2SO4, 1g/ℓ 의 K2HPO4, 3g/ℓ 의 NaCl, 0.2g/ℓ 의 MgSO4-7H2O 및 1.25g/ℓ 의 CaCO3로 구성된다. 탄산칼슘을 도입하기 전에 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 6.9로 조정한다. 엘렌마이어 플라스크를 27℃에서 44h동안 325rpm의 속도로 회전 교반기 상에서 교반한다. 44 유지된 앞서의 배양액 2.5㎖를 멸균 조건하에서 300㎖의 엘렌마이어 플라스크내 생성 배지 30㎖에 첨가한다. 생성 배지는 25g/ℓ의 대두분, 7.5g/ℓ 의 전분, 22.5g/ℓ 의 글루코즈, 3.5g/ℓ 의 사료 효모, 0.5g/ℓ의 황산아연 및 6g/ℓ 의 탄산칼슘으로 구성된다. 탄산칼슘을 도입하기 전에 염산으로 pH를 6.0으로 조정한다. 엘렌마이어 플라스크를 27℃에서 24, 28 및 32시간 동안 교반한다. 각각의 시점에서, 10g의 머스트를 평 엘렌마이어 플라스크로 칭량하고, 34% 아세토니트릴 및 66%의 0.1M KH2PO4용액(농축 H3PO4로 pH 2.9로 조정된)을 포함하는 20㎖의 이동상을 첨가하여 프리스티나마이신을 추출한다. 교반한 후에, 선체를 원심분리하여, 상등액에 포함된 프리스티나마이신을 150㎕의 원심분리 상등액을 Nucleosil 5-C8 4.6×150mm 컬럼상에 주입하여, 40% 아세토니트릴 및 60% 0.1M 인산염 완충액, pH 2.9의 혼합물로 용출함에 의한 HPLC로 분석한다. I 프리스티나마이신이 206nm에서의 UV 흡수에 의하여 검출된다.
결과는 사용된 발효 조건하에서, 뮤턴트 SP92pipA::ΩamR이 24, 28 또는 32 시간의 발효에서 PI를 생성하지 않지만 대조 균주 SP92는 시험된 3 시간에 대해 표준양의 PI을 생산함을 설명한다. 두 개의 균주에 의해 생성된 PII의 양은 동일하였다. 뮤턴트 SP92pipA::ΩamR는 확실히 PI의 생합성내 단계에서 차단되었다. PI의 상이한 전구체를 16시간 후에 생성 배지내 배양액에 개별적으로 또는 함께 첨가함으로써 발효 보충 시험을 수행한다. 이러한 보충의 결과는 100mg/ℓ 피페콜산 및 100mg/ℓ DMPAPA를 발효 배지에 동시에 첨가할때, 뮤턴트가 정상적으로 PI의 마이너 유도체, 즉, PIE(SP92에 의해 5%이하의 양으로 생산되는)를 대조 균주에 의한 PIA의 생산과 동등한 레벨로 생산함을 설명한다. 이러한 생산은 피페콜산 및 DMPAPA가 개별적으로 첨가된다면 발생하지 않는다. PIE는 피페콜산상의 4위치에 케토 작용의 부재의 면에서 PIA(PI의 메이저 요소)와 상이하다. 뮤턴트 SP92pipA::ΩamR가 피페콜산 및 DMPAPA를 동시에 첨가함으로써만 보충될 수 있다는 사질은 papA, 및 아마도 papB 및 papM 유전자가 제작물의 극성 효과에 의해 붕괴되었음을 나타낸다. 따라서, 이들 유전자 모두는 pipA 유전자의 다운스트림에 위치하고, 아마도 pipA와 함께 동시전사될 것이다. 따라서, 후자의 붕괴는 papA 유전자의 붕괴를 이끌어, 결과적으로 DMPAPA 합성의 부재를 이끈다. 뮤턴트 SP92pipA::ΩamR에 피페콜산으로 보충하면 PIE를 생산하며 PIA를 생산하지 않는다는 사실은 두가지 결론을 이끈다: 첫번째 결론은 PI 사이클의 제작은 4-옥소피페콜산이 아니라 피페콜산을 혼입시킴으로써 획득되고, 따라서 4위치에 케토 작용기를 생성시키는 히드록실화가 동시에 발생하는 것이다. 두번째 결론은 이 수산시첨가가 아마도 구조 유전자가 pipA 유전자의 직접적인 다운스트림에 위치한 효소 SnbF에 의해 수행된다는 것이다. 따라서, pap 유전자 상의 pipA 유전자의 붕괴의 분명한 극성은 아마도 snbF 유전자(pipA 및 pap 유전자 사이에 위치된) 상에 극성 효과를 나타내고, 이는 4-히드록시피페콜산(PIF및 PIG(도 2)에서 발견되고, 이어서 PIA에서 4-옥소피페콜산으로 산화되는)을 형성하는 PIE의 피패콜산 잔기의 히드록실화 작용의 저해를 증명한다.
이러한 특성의 뮤턴트를 제조하여, PI 전구체 DMPAPA 및 피페콜산이 존재하지 않으면 PI를 생산할 수 없고, 전구체를 사용하여 일반적으로 프리스티나마이신 혼합물내에서 PI 마이너 유조체를 출발 균주와 동량으로 생산할 수 있는 에스. 프리스티내스피랄리스의 균주를 제작할 수 있다. 유사하게, 신규한 전구체 또는 신규한 전구체의 혼합물 및 일반적으로 PI내에 존재하는 전구체의 존재하에, 본 균주는 DMPAPA 또는 4-옥소피페콜산 또는 둘 모두의 잔기에서 변형된 신규한 프리스티나마이신을 생산할 수 있을것이다.
2-2. hpaA 유전자가 붕괴된 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92의 뮤턴트의 제작:
본 실시예는 hpaA 유전자를 붕괴하여, 표준 발효 조건하에서 PI를 생산하지 않으며, 신규한 전구체를 발효중에 첨가할때 3-HPA 전구체 레벨에서 변형된 신규한 프리스티나마이신을 생산할 수 있는 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92의 균주를 제작할 수 있는 방법을 설명한다.
에스. 프리스티내스피랄리스 SP92내에서 복제하지않고 이중 동종 재조합에 의해 hpaA 유전자를 붕괴하기 위해 사용될 수 있는 플라스미드를 사용하여 본 뮤턴트를 제작할 수 있다.
2-2-1. 자살 플라스미트 pVRC421의 제작:
이. 콜라이에서만 복제할 수 있지만, 스트렙토마이시즈내에서 발현되는 내성 마커, 즉 티오스트렙톤 또는 노시헵티드에 내성인 유전자, tsr를 갖는 자살 벡터를 사용하여 플라스미드 pVRC421을 제작한다. 이 벡터, pDH5는 Hillemann 등(1991)에 의해 발견되었다.
특허 PCT/FR 93/0923호에 기술된 코스미드 pIBV2를 사용하여 hpaA 유전자가 붕괴된 SP92의 크로모좀 뮤턴트를 생산하기 위해 플라스미드 pVRC421을 제작한다. pIBV2를 제한 효소 SphI로 소화시키고, 0.6% 아가로즈겔상의 전기영동에 의해 단편을 분리하여, hpaA 유전자의 전체 및 snbA 유전자의 전체를 포함하는 SphI-SphI 단편을 생성한 후에, 전술된 Geneclean을 사용하여 분리하고 정제한다. SphI에 의해 소화되어 선형화된 50ng의 벡터 pDH5를 200ng의 아래에 설명된 바와 같이 4.8kb 단편에 결찰한다. 균주 TG1를 형질전환시키고, LB+150㎍/㎖ 암피실린+IPTG+X-gal 배지상에 선택하여 원하는 단편에 위치한 클론을 분리한다. 재조합 플라스미드를 pVRC411으로 지정한다 (도 10). 이어서, 아프라마이신 또는 게네티신에 내성을 암호화하는 유전자 amR를 포함하는 카셋트를 플라스미드 pVRC411의 유닉 PflmI 자리에 도입하며, 이 자리는 hpaA 유전자의 시작부의 610bp 다운스트림에 위치한다. 이 제작을 아래와 같이 실행한다. amR유전자를 포함하는 2.2kb DNA 단편을 amR유전자를 포함하는 pHP45ΩamR의 HindIII로 추가 소화하여 분리한다. Maniatis 등, 1989에 의해 기술된 프로토콜에 따라 클렙나우 효소를 사용하여 HindIII 돌출 5' 부착 말단을 채운 후, amR유전자를 포함하는 단편을 돌출 3' 부착 말단이 Maniatis 등, 1989에 의해 설명된 바와 같이 효소 T4 폴리머라제를 사용하여 블런트된 플라스미드 pVRC411의 PflmI 위치내로 클로닝한다. 이렇게 수득된 재조합 플라스미드를 pVRC421으로 지칭한다. 제한효소 지도를 도 11에 예시한다.
2-2-2. hpaA 유전자가 동종 재조합에 의해 붕괴된 뮤턴트 SP92hpaA::Ωam R 의 분리:
본 실시예는 hpaA 유전자가 붕괴된 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92의 뮤턴트를 제작하는 방법을 설명한다.
자살 플라스미드 pVRC421로 균주 SP92를 형질전환시킴으로써 본 뮤턴트를 분리한다.
프로토플라스트를 전술된 바와 같이 제조하여 형질전환시킨다.
균주 SP92를 30℃에서 40시간 동안, YEME 배지, 34% 수크로즈, 5mM MgCl2및 0.25% 글리신 내에서 배양한다. 균사를 라이소자임의 존재하에 프로토플라스트화 하고, 5×1㎍의 pVRC421을 (PEG를 사용하는 방법에 의해) 프로토플라스트의 형질전환을 위해 사용한다. 하룻밤 동안 R2YE 배지상에서 프로토플라스트를 재배양시킨 후, 1,500㎍/㎖의 게네티신을 함유하는 3㎖의 SNA 배지상에 스프레딩하여 재조합균주를 선택한다.
게네티신에 내성인 600클론을 실행된 5 형질전환물로부터 분리한다. 이들 재조합균주는 hpaA 유전자(균주 SP92의 크로모좀에 포함된) 및 자살 플라스미드 pVRC421의 6kb 단편 사이의 단일 또는 이중 동종 재조합에 의한 통합으로부터 생성한다. 이중 교차에 의해 수득된 재조합균주(즉, 게놈에 플라스미드 pVRC421의 pDH5 부분을 포함하지 않는)를 선택하기 위해, 클론을 400㎍/㎖ 티오스트펩톤을 함유하는 HT7 배지상에서 2차 배양한다. 게네티신애 내성이지만, 티오스트렙톤에 감수성인 6 클론을 선택한다. 재조합균주의 포자를 스트리킹함으로써 선택하여, 10㎍/㎖ 게네티신을 포함하는 HT7 배지상에서 배양한 후, 동일한 배지상에 재스트리킹하여 분리된 콜로니를 수득한다. 플라스미드 pVRC421의 통합 위치를 확인하기 위해, Hopwood 등, 1985에 의해 설명된 바와 같이 정제된 6 재조합균주 클론으로부터 총 DNA의 다양한 Southern을 [α-32P]dCTP로 라벨링된 후 프루브로서 사용되는 4.8kb SphI-SphI 단편에 하이브리드화시켜 실행한다. 결과는 이들 재조합균주가 hpaA 유전자를 포함하는 4.8kb SPhI-SPhI 단편이 amR유전자에 의해 붕괴된 pipA 유전자를 포함하는 6kb의 SphI-SphI 단편으로 교체시키는 벡터 pVRC421 및 SP92 균주의 크로모좀간의 이중 교차에 의해 수득됨을 확정한다. 이들 뮤턴트 중 하나를 SP92hpaA::ΩamR으로 지정한다.
2-2-3. 뮤턴트 SP92hpaA::ΩamR에 의한 프리스티나마이신의 생산:
본 실시예는 hpaA 유전자가 플라스미드 pVRC421의 통합에 의해 붕괴된 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92의 뮤턴트가 표준 발효 조건하에서 PI를 생산하지않음을 입증하는 방법을 설멍한다.
뮤턴트 SP92hpaA::ΩamR및 또한, 대조 균주 역할을 하는 균주 SP92을 액체 생성 배지에서 배양한다. 발효를 실시예 2-1-3에 기술된 바와 같이 수행한 다음, 프리스티나마이신을 전술된 바와 같이 추출하고 분식한다. 결과는 적용된 발효조건하에서, 뮤턴트 SP92hpaA::ΩamR가 발효의 24, 28 또는 32시간에 PI를 생산하지 않는 반면, 대조 균주는 시험된 3시점에서 표준량의 PI를 생산한다. 두 균주에 대해 생성된 PII의 양은 동일하다. 뮤턴트 SP92hpaA::ΩamR는 분명히 PI의 생합성 중의 단계에서 차단되었다. PI의 상이한 전구체를 각각 또는 함께 16시간 후에 생성배지내 배양액에 가함으로써 보충 발효 시험을 수행한다. 100mg/ℓ의 3-히드록시피콜린산을 발효 배지에 첨가하면, 뮤턴트는 대조 균주에 의한 PI의 생산과 동등한 레벨의 PIA를 생산한다. 뮤턴트 SP92hpaA::ΩamR가 3-히드록시피콜린산의 첨가에 의해서만 보충되는 사실은 hpaA 유전자가 이 전구체의 합성에 관여함을 설명한다.
본 뮤턴트의 제작으로 PI의 생산면에서 돌연변이되었지만, 전구체 3-HPA의 존재하에, 출발 균주에 의해 생산된 것과 동량으로 PI를 생산할 수 있는 에스. 프리스티내스피랄리스의 균주를 생산할 수 있다. 앞서 실시예와 동일한 방식으로, 이러한 특성의 뮤턴트를 사용하여, 신규한 전구체의 존재하에 3-히드록시피콜린산 잔기의 레벨에서 변형된 신규한 프리스티나마이신을 생성할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 뮤턴트 SP92::pVRC508에 의한 화학식 I의 화합물의 생성
본 실시예는 플라스미드 pVRC508의 통합에 의해 papA 유전자가 붕괴된 에스. 프리스티내스피랄리스 SP92의 뮤턴트가 생성 배지에 첨가된 전구체의 존재하에 신규한 스트렙토그라민을 합성할 수 있는 방법을 설명한다. 이들 전구체는 아미노산, 더 특히, 페닐알라닌 뿐만 아니라 α-케토카복실산, 더 특히 페닐피루브산의 유도체일 수 있다.
뮤턴트 SP92::pVRC508을 액체 생성 배지애서 배향한다. 발효를 다음과 같이 수행한다 : 전술된 균주로부터의 포자 현탁액 0.5㎖를 멸균 조건하에서, 300㎖ 배플장치된 엘렌마이어 플라스크내 접종 배지 40㎖에 첨가한다. 접종 배지는 10g/ℓ의 콘 스팁, 15g/ℓ의 수크로즈, 10g/ℓ의 (NH4)2SO4, 1g/ℓ의 K2HPO4, 3g/ℓ의 NaCl, 0.2g/ℓ의 MgSO4-7H2O 및 1.25g/ℓ의 CaCO3로 구성된다. 탄산칼슘을 도입하기 전에 수산화나트륨 용액으로 pH를 6.9로 조정한다. 엘렌마이어 플라스크를 27℃에서 44h동안 325rpm의 속도로 회전 교반기 상에서 교반한다. 44h 배양한 앞서의 배양액 2.5㎖를 멸균 조건하에서 300㎖의 엘렌마이어 플라스크내 생성 배지 30㎖에 첨가한다. 생성 배지는 25g/ℓ의 대두분, 7.5g/ℓ의 전분, 22.5g/ℓ의 글루코즈, 3.5g/ℓ의 사료 효모, 0.5g/ℓ의 황산아연 및 6g/ℓ의 탄산칼슘으로 구성된다. 탄산칼슘을 도입하기 전에 염산으로 pH를 6.0으로 조정한다. 엘렌마이어 플라스크를 27℃에서 325rpm의 속도로 회전 교반기 상에서 교반한다. 16h 후에, 표 3에 나열된 전구체 중 하나의 용액 1㎖ (일반적으로 5 내지 10g/ℓ)를 배양액에 첨가한다. 배양을 8 내지 24h 후에 종결한다. 머스트(must)의 부피를 즉시 측정하고, 34% 아세토니트릴 및 66%의 0.1M KH2PO4용액(농축 H3PO4로 pH 2.9로 조정된)을 포함하는 2 부피의 이동상을 첨가하여 프리스티나마이신을 추출한다. 교반한 후에, 전체를 원심분리하여, 상등액에 포함된 프리스티나마이신을 실시예 4에 설명된 것처럼 추출하고 정제한다. 또한 이들을 150㎕의 원심분리 상등액을 Nucleosil 5-C8 4.6×150mm 컬럼상에 주입하여, 40% 아세토니트릴 및 60% 0.1M 인산염 완충액, pH 2.9의 혼합물로 용출함에 의한 HPLC로 분석한다. 신규한 I 프리스티나마이신이 206nm에서의 UV 흡수에 의하여 및, 적절하다면, 형광 방출(370nm 필터, 306nm에서의 여기)에 의하여 검출된다.
[표 III]
Figure pct00005
Figure pct00006
다음의 표(표 4)는 생성된 신규한 PI의 상대적 잔류시간을 지시하며, 참고로서 PIA를 사용한다. 절대적 잔류 시간을 25℃에서 상기 기술된 HPLC에서 결정한다; 이들은 한 주입부에서 타른 주입부로 및, 또한 온도에 따라 약간씩 변한다.
[표 IV]
Figure pct00007
Figure pct00008
4-이소프로필페닐알라닌에 대해, 4.35의 tR을 갖는 신규한 PI는 실시예 14에서 기술된 neo PIE에 상응한다.
4-메틸티오페닐알라닌에 대해, 1.63의 tR을 갖는 신규한 PI는 실시예 5에서 기술된 5γ-히드록시 neo PIH에 상응한다.
그렇지 않다면, 뮤턴트(mutant) SP92::pVRC508을 4-디메틸아미노페닐알라닌의 존재하에 발효시킨다. 이러한 보충 조건하에서, 뮤턴트 SP92::pVRC508은 균주 SP92에 의해 생성된 것과 등량으로 IA프리스티나마이신을 생성한다.
실시예 4: 프리스티나마이신 I B [4ξ-메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A ] 및 4ξ-아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
4.1: 프리스티나마이신 I B [4ξ-메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A ]의 제조.
균주 SP92::pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 실시예 34-1에서와 같이 합성된 (R,S)-4-메틸아미노페닐알라닌의 10g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IB를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 65%의 물 및 35%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 6㎖에서 용해시켜 65% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 35%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출되는 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입한다. 프리스티나마이신 IB를 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 52mg의 프리스티나마이신 IB가 수득된다.
Figure pct00009
Figure pct00010
4.2: 4ξ-아미노-데-(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 (S)-4-아미노페닐알라닌의 5g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건존시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 65%의 물 및 35%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 6㎖에서 유해시켜 65% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 35%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출되는 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입한다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 5mg의 4ξ-아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 5: 4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A , 4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I H , 및 5-γ-히드록시-4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I H 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 실시예 33에서와 같이 합성된 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-메틸티오페닐알라닌의 10g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 65mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이를 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 6㎖에서 용해시켜 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출되는 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입한다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 45mg의 4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
프리스티나마이신 IH의 신규한 유도체를 포함하는 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 10mg의 4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH를 용출상에서 아세토니트릴의 분율이 50%에 이르는 것을 제외하고는 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
프리스티나마이신 I의 신규한 유도체를 포함하는 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 3mg의 5γ-히드록시-4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH를 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 용출상에서 아세토니트릴의 분율을 45%로 유지하며 분리시킨다.
Figure pct00017
실시예 6: 4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A , 및 4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I H 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-메틸페닐알라닌의 5g/l 수용액1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 49mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이러한 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 6㎖에서 용해시켜 두개의 배치에서 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 44mg의 4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00018
Figure pct00019
프리스티나마이신 IH의 신규한 유도체를 포함하는 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 21mg의 4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH(질량 분광계: M+H+=810)를 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리시킨다.
실시예 7: 4ξ-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 12 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 0.1N 수산화나트륨 용액내 (RS)-4-메톡시페닐알라닌의 5g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 12 엘렌마이어 플라스크로부티 회수된 0.35ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 14mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이러한 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 3㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 60% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 40%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 12mg의 4ξ-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 8: 4ξ-메톡시카보닐-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 실시예 33에서와 같이 합성된 (R, S)-4-메톡시카보닐페닐알라닌의 5g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 14mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이러한 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 3㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 9mg의 4ξ-메톡시카보닐-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00022
Figure pct00023
실시예 9: 4ξ-클로로-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-클로로페닐알라닌의 10g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 3㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 60% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 40%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 1mg의 4ξ-클로로-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00024
Figure pct00025
실시예 10: 4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A , 및 4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I H 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-브로모페닐알라닌의 10g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g)컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 6㎖에서 용해시켜 두개의 배치에서 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 60% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 40%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 6mg의 4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00026
Figure pct00027
프리스티나마이신 IH의 신규한 유도체를 포함하는 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 3mg의 4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH(질량 분광계: M+H+=874)를 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리시킨다.
실시예 11: 4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A , 및 4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I H 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 0.1N 수산화나트륨 용액내 (RS)-4-요오도페닐알라닌의 10g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 6㎖에서 용해시켜 두개의 배치에서 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 60% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 40%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 12mg의 4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00028
프리스티나마이신 IH의 신규한 유도체를 포함하는 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 6mg의 4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH(질량 분광계: M+H+=922)를 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리시킨다.
실시예 12: 4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A , 및 4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I H 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 0.1N 수산화나트륨 용액내 (RS)-4-트리플루오로메틸페닐알라닌의 5g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 매탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 3㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 5mg의 4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00029
프리스티나마이신 IH의 신규한 유도체를 포함하는 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 4mg의 4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH(질량 분광계: M+H+=864)를 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리시킨다.
실시예 13: 4ξ-3급-부틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 실시예 35-1에서와 같이 합성된, 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-3급-부틸페닐알라닌의 5g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 7㎖에서 용해시켜 두개의 배치에서 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 30mg의 4ξ-3급-부틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00030
Figure pct00031
실시예 14: 4ξ-이소프로필-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마아신 I A , 및 4ξ-이소프로필-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I E 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여, 실시예 36-1에서와 같이 합성된, 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-이소프로필페닐알라닌의 10g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 61mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이러한 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 9㎖에서 용해시켜 두개의 배치에서 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다.51mg의 4ξ-이소프로일-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00032
Figure pct00033
프리스티나마이신 IE의 신규한 유도체를 또한 포함하는, 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 5mg의 4ξ-이소프로필-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IE를 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리시킨다.
Figure pct00034
Figure pct00035
실시예 15: 4ε-메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여, 실시예 35-3에서와 같이 합성된, 물내 (R, S)-3-메틸아미노페닐알라닌의 5g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 19mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이러한 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 3㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 8mg의 4ε-메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00036
실시예 16: 4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A , 및 4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I H 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여 0.1N 수산화나트륨 용액내 (S)-3-메톡시페닐알라닌의 5g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 41mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이러한 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 6㎖에서 용해시켜 두개의 배치에서 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 28mg의 4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00037
Figure pct00038
프리스티나마이신 IH의 신규한 유도체를 포함하는 상기 기술된 실리카 컬럼으로부터 유도된 분획을 이용하여, 7mg의 4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH(질량 분광계: M+H+=826)를 상기 기술된 반-예비 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리시킨다.
실시예 17: 4ε-플루오로-4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 60 엘렌마이어 플라스크를 이용하여, 실시예 34-5에서와 같이 합성된, 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-3-플루오로-4-메틸페닐알라닌의 10g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 프리스티나마이신 IA의 신규한 유도체를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 15mg의 건조 잔여물이 수득된다. 이러한 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 3㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μC8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 55% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 45%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 신규한 프리스티나마이신을 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 9mg의 4ε-플루오로-4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00039
Figure pct00040
실시예 18: 4ξ-에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 50 엘렌마이어 플라스크를 이용하여, 실시예 33에서와 같이 합성된, 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-에틸아미노페닐알라닌의 20g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 50 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 4ξ-에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 65%의 물 및 35%의 아세토니트릴 혼합물 7㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 60% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 40%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 4ξ-에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 10mg의 4ξ-에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00041
Figure pct00042
실시예 19: 4ξ-디에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
군주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 50 엘렌마이어 플라스크를 이용하여, 실시예 33에서와 같이 합성된, 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-디에틸아미노페닐알라닌 디히드로클로라이드의 20g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 50 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.5ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 4ξ-디에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 7㎖에서 용해시켜 두 부분에서 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey ·Nagel)내로 주입하여, 68% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 32%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 4ξ-디에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 50mg의 4ξ-디에틸아미노-데(4ζ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00043
Figure pct00044
실시예 20: 4ξ-디알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 94 엘렌마이어 플라스크를 이용하여, 실시예 38-1에서와 같이 합성된, 물내 (R, S)-4-디알릴아미노페닐알라닌 디히드로클로라이드의 20g/l 수용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 94 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 2.8ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상에서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 4ξ-디알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴 혼합물 7㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 52% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 48%의 아세토니트릴의 혼합물로 용출시킨다. 4ξ-디알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 15mg의 4ξ-디알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00045
Figure pct00046
실시예 21: 4ξ-알릴에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92: pVRC508을 실시예 3에서 기술된 바와 같은 26 엘렌마이어 플라스크를 이용하여, 실시예 39-4에서와 같이 합성된, 0.1N 수산화나트륨 용액내 (R, S)-4-알릴에틸아미노페닐알라닌 디히드로클로라이드의 20g/l 용액 1㎖를 16h에 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양액의 40h 말기에서, 26 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 0.78ℓ의 머스트(must)를 66% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9 및 34%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 2-부피로 용출시킨 다음 원심분리시킨다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2회 추출한다. 클로로메틸렌 상을 물로 세척하여 합하고, 황산나트륨상애서 건조시켜 증발시킨다. 건조 추출물을 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄을 넣은 실리카(30g) 컬럼내로 주입하여 디클로로메탄내 0 내지 10%의 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출시킨다. 4ξ-알릴에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 증발시킨다. 건조 잔여물을 60%의 물 및 40%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물 7㎖에서 용해시켜 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10×250mm 컬럼(Macherey Nagel)내로 주입하여, 52% 100mM의 인산염 완충액, pH2.9, 및 48%의 아세토니트릴을 포함하는 혼합물로 용출시킨다. 4ξ-알릴에틸아미노-데(4ξ-디메틸아이노)프리스티나마이신 IA를 포함하는 분획을 합하여 디클로로메탄 1 부피로 추출한다. 유기상을 물로 세척하여, 황산 나트륨상에서 건조한 다음 증발시킨다. 20mg의 4ξ-알릴에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 수득된다.
Figure pct00047
Figure pct00048
실시예 22 : 4ξ-에틸프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조.
균주 SP92:pVRC508을 60 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 수산화나트륨 용액내의 실시예 39-6에서 합성된 1 ㎖의 20g/l (R,S)-4-에틸프로필아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20 ㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-에틸-프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물을 60 %물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입하고 63 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 37 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-에틸프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1 부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 16 mg의 4ξ-에틸-프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00049
Figure pct00050
실시예 23 : 4ξ-트리플루오로메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 60 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 물내의 실시예 34-8에서 합성된 1 ㎖의 20g/l (R,S)-4-O-트리플루오로메틸티로신 하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액을 2배[lacuna] 부피의 디클로로메탄으로 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 [lacuna] ㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-트리플루오로메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물을 60 % 물과 40% 아세토니트릴로 구성된 혼합물에서 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nusleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입하고 60 % 100 mM 인산염 완충액, pH2.9, 및 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-트리플루오로메톡시-데(4ζ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 조합되고 디클로로메탄한 부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 46.5 mg의 4ξ-트리플루오로메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00051
Figure pct00052
실시예 24 : 4ξ-알릴옥시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 90 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 염산내의 실시예 33에서 합성된 1 ㎖의 20g/l (S)-4-O-알릴티로신 하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 90 엘렌마이어 플라스크로부터 발견된 2.7 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 조합한후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-알릴옥시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물은 60 % 물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물에서 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입하고 52 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 48 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-알릴옥시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 29 mg의 4ξ-알릴옥시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00053
Figure pct00054
실시예 25 : 4ξ-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 90 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 염산내의 실시예 33에서 합성된 1 ㎖의 20g/l (S)-4-O-에틸티로신 하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 90 엘렌마이어 플라스크로부터 발견된 2.7 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물을 60 % 물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 7㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입하고 52 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 48 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 합하고 디클로로메탈 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 29 mg의 4ξ-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00055
실시예 26 : 4ξ-(2-클로로에톡시)데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 60 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 물내의 실시예 42-1에서 합성된 1 ㎖의 20g/l (S)-4-O-(2-클로로에톡시)티로신 하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 발견된 1.8 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-(2-클로로에톡시)-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물을 60 % 물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입하고 60 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-(2-클로로에톡시)-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 3.2 mg의 4ξ-(2-클로로에톡시)-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티니-마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00056
Figure pct00057
실시예 27 : 4ξ-아세틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA의 제조
균주 SP92:pVRC508을 60 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 수산화나트륨 용액내의 실시예 33에서 합성된 1 ㎖의 20 g/l (S)-4-아세틸페닐알라닌 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 발견된 1.8 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액을 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-아세틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물을 60 % 물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입하고 60 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-아세틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 4.2 mg의 4ξ-아세틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00058
Figure pct00059
실시예 28 : 4ε-디메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 60 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 수산화나트륨 용액내의 실시예 35-10에서 합성된 1 ㎖의 20 g/l (R,S)-3-디메틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액은 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ε-디메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물은 60 % 물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 3 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입되고 57 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 43 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ε-디메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 1.1 mg의 4ε-디메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00060
Figure pct00061
실시예 29 : 4ε-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 56 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 수산화나트륨 용액내의 실시예 34-11에서 합성된 1 ㎖의 20 g/l (R,S)-3-메틸티오페닐알라닌 하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 56 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.68 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액은 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ε-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물은 54 % 물과 46 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm(Macherey Nagel)관에 주입하고 55 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 45 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 새로운 프리스티나마이신을 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 20 mg의 4ε-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00062
Figure pct00063
실시예 30 : 4ε-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 60 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.2N 수산화나트륨 용액내의 실시예 37-1에서 합성된 1 ㎖의 20 g/l (S)-3-O-에틸티로신 하이드로클로라이드 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 60 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 1.8 L의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액은 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로연속적으로 용출된다. 4ε-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA을 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 19 mg의 건조 잔류몰이 얻어진다. 건조 잔류물은 60 % 물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 3 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입되고 60 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 새로운 프리스티나마이신을 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 15.8 mg의4ε-O-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00064
Figure pct00065
실시예 31 : 4ζ-에틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 2 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 수산화나트륨 용액내의 실시예 33에서 합성된 1 ㎖의 20 g/l (S)-4-에틸티오페닐알리닌 하이드로클로라이드 용액은 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 2 엘렌마이어 플라스크로부터 회수된 60 ㎖의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액은 0.5 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-에틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물은 60 % 물과 40 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm(Macherey Nagel)관에 주입하고 52 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 48 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-에틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA을 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. ? mg의 4ξ-에틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티니-마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00066
Figure pct00067
실시예 32 : 4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 I A 의 제조
균주 SP92:pVRC508을 2 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같이 0.1N 수산화나트륨 용액내의 실시예 33에서 합성된 1 ㎖의 20 g/l (R,S)-4-에틸페닐알라닌 용액을 16h에서 첨가하여 생성 배지에서 배양한다. 배양의 40h의 끝에, 2 엘렌마이어 플라스크로부터 발견된 60 ㎖의 머스트를 66% 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9 및 34% 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 2부피로 추출한 다음 원심분리한다. 상등액은 [lacuna] 부피의 디클로로메탄으로 2번 추출한다. 클로로메틸렌상을 물로 세척하고 합친후 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 건조 추출물은 20㎖의 디클로로메탄에서 용해시키고 디클로로메탄으로 장착된 실리카(30 g)컬럼에 주입되고 디클로로메탄에 0 내지 10 % 메탄올의 평판으로 연속적으로 용출된다. 4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획을 합하고 증발시킨다. 건조 잔류물을 52 % 물과 48 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물의 7 ㎖에 용해시키고 반-예비 Nucleosil 7μ C8 10 × 250 mm (Macherey Nagel)관에 주입하고 52 % 100 mM 인산염 완충액, pH 2.9, 및 48 % 아세토니트릴로 구성된 혼합물로 용출한다. 4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA를 함유한 분획은 합하고 디클로로메탄 1부피로 용출된다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시키고 증발시킨다. 0.50 mg의 4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA가 얻어진다.
Figure pct00068
Figure pct00069
전술한 실리카 컬럼으로부터 유도된, 또한 신 프리스티나마이신 IH유도체를 함유한 같은 분획을 사용하여 0.3 mg의 ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH가 전술한 반-예비 컬럼 크로마토그래피로 수행되어 분리된다.
Figure pct00070
실시예 33 : 페닐알라닌 및 이미 설명된 페닐피루브산 유도체의 제조
페닐알라닌 및 이의 유도체 4-메톡시페닐알라닌, 4-브로모페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-요오드페닐알라닌, 4-트리플루오로페닐알라닌, 4-아미노페닐알라닌, 및 3-메톡시페닐알라닌이 이 발명에서 사용되었고 시판되고 있다.
하기의 페닐알라닌의 유도체는 문헌에서 설명된 방법에 따라 제조될 수 있다.
(RS)-4-디메틸아미노페닐알라닌
Figure pct00071
(RS)-4-디에틸아미노페닐알라닌
Figure pct00072
(RS)-4-에틸아미노페닐알라닌
Figure pct00073
(RS)-4-페닐페닐알라닌
Figure pct00074
(RS)-4-메틸페닐알라닌
Figure pct00075
(RS)-4-메틸티오페닐알라닌 및 (R,S)-4-에틸티오페닐알라닌
Figure pct00076
(RS)-4-메톡시카보닐페닐알라닌
Figure pct00077
(RS)-2,4-디메틸페닐알라닌
Figure pct00078
(RS)-3,4-디메틸페닐알라닌
Figure pct00079
(RS)-3-트리플루오로메틸페닐알라닌 하이드로클로라이드
Figure pct00080
(S)-4-아미노메틸페닐알라닌
Figure pct00081
(RS)-3-메틸페닐알라닌
Figure pct00082
(RS)-4-아세틸페닐알라닌
Figure pct00083
(S)-4-O-알릴티로신
Figure pct00084
(S)-4-O-에틸티로신
Figure pct00085
(RS)-4-에틸페닐알라닌
Figure pct00086
4-3급-부틸페닐피루브산은 R. Breslow, J.W. Canary, M. Varney, S.T. Waddell and D. Yang, J. Am, Chem. Soc., 1990, 112, 5212-5219에 따라 제조될 수 있다.
페닐알라닌의 다른 유도체는 하기의 실시예 34-42에 따라 제조된다. 이 예에서 섬광 크로마토그래피가 Still et al., J. Org. Chem., 43, 2923, (1978)에 따라 40-53 ㎛ 입자 크기의 실리카를 사용하여 50 kPa의 평균 질소 압력하에서 수행된다.
실시예 34 : 방법 A를 사용한 페닐알라닌 및 페닐피루브산 유도체의 제조
[반응식 1]
Figure pct00087
34-1 (RS)-4-메틸아미노페닐알라닌, 디하이드로클로라이드
37 ㎖의 12 N 염산을 3.70 g의 N-아세틸-4-메틸아미노페닐알라니네이트에 첨가하고 그 혼합물을 가열하여 환류시키고, 8시간 교반한다. 실온에서 하룻밤후에, 반응 중간체는 감압(50 kPa)하에서 농축 건조하고 잔여물은 50 ㎖의 톨루엔과 50 ㎖의 에탄올 혼합물에 용해시키고 이 혼합물을 다시 한번 농축시킨다. 감압(2.6 kPa)하에 데시케이터내에서 건조시킨 후, 4.18 g(100%)의 (RS)-4-메틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 158 ℃에서 녹는 흡습성의 밝은 베이지 고체의 형태로 수득된다.
34-2 : 메틸(RS)-N-아세틸-4-메틸아미노페닐알라니네이트
0.4 g의 석탄상 10% 팔라듐, 및 50 ㎖의 무수 에탄올을 고압반응용기에서 질소 압력하에 놓인 4 g의 메틸 4-메틸아미노-2-아세트아미도시나메이트에 첨가한다. 혼합물을 5.5 bar 압력의 수소하에 놓고 50℃에서 가열하여 15시간 교반한다. 26℃의 온도로 안정화시키고, 압력도 대기압으로 돌아왔을때 중간체를 Clarcel?에 여과하고 에탄올로 씻은 후 감압(2.6 kPa)하에서 농축 건조시킨다. 이것은 118℃에서 녹는 백색 결정형의 3.73 g의 메틸 N-아세틸-4-메틸아미노페닐알라니네이트를 생성한다.
34-3 : 메틸 4-메틸아미노-2-아세트아미도시나메이트
5.75 g의 메틸 2-아세트아미도아크릴레이트, 0.185 g의 팔라듐 아세테이트, 8.1 g의 테트라부틸암모늄 클로라이드 및 6.03 g의 탄산수소나트륨을 질소하에 위치한 3경 플라스크애 첨가하고 200 ㎖의 DMF 용액내 6.5 g의 4-요오드-N-메틸알라닌을 이 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 82 ℃에서 16시간 30분 동안 가열하고 냉각시킨 후에 1000 ㎖ 증류수에 붓는다. 중간체는 250 ㎖의 CH2Cl2로 추출하고 유기상을 분리한다, 수성상은 250 ㎖의 CH2Cl2로 두 번 씻는다. 유기상을 합하여 황산나트륨으로 건조시키고 여과하여 70℃의 감압(50 kPa)하에서 농축시켜 섬광 크로마토그래피(용출액, AcOEt/시클로헥산 및 순수 AcOEt)에 의해 정제되어 갈색 기름이 얻어진다.
이 방법으로, 4 g의 메틸 4-메틸아미노-2-아세트아미도시나메이트가 황색 고체(Merck Silica 5719, Rf = 0.48), 이 형태로 사용된, 형태를 얻는다.
N-메틸-p-요오드아날린이 S. Krishnamurthy, Tetrahedron Letters, 33, 3315-3318, 1982.에 의해 제조될 수 있다.
34-4 : 4-메틸아미노페닐피루브산
2.4 g의 메틸 4-메틸아미노-2-아세트아미도시나메이트와 32 ㎖의 12 N 염산을 둥근-바닥 플라스크에 넣는다. 혼합물을 3h 동안 가열 환류시키고 냉각한 후 20 ㎖의 디에틸 에테르로 두 번 씻는다. 수성상은 -10 ℃로 냉각하고 여과 침전물은 최소한의 찬 염산으로 씻는다. 얻어진 고체는 감압하에 데시케이터내에서 건조시켜 1.1 g의 210 ℃에서 녹는 밝은 베이지 고체의 4-메틸아미노페닐피루브산을 수득한다.
34-5 : (R,S)-3-플루오로-4-메틸페닐알라닌 하이드로클로라이드
0.6 g의 (R,S)-3-플루오로-4-메틸페닐알라닌 하이드로클로라이드가 실시예 34-1의 방법으로 1.6 g의 메틸 N-아세틸(3-플루오로-4-메틸)페닐알라니네이트를 사용하여 260 ℃이상의 온도에서 녹는 백색 결정의 형태로 수득된다.
34-6 : 메틸 (R,S)-N-아세틸(3-플루오로-4-메틸)페닐알라니네이트
1.6 g의 메틸 N-아세틸(3-플루오로-4-메틸)페닐알라니네이트가 실시예 34-2의 방법으로 1.9 g의 메틸 (4-메틸-3-플루오로)-2-아세트아미도시나메이트 및 230 ㎖의 에탄올내 석탄상 0.2 g의 10% 팔라듐을 사용하여 무색 오일(Merck Silica 5719, Rf = 0.46; 용출액 CH2Cl2/AcOEt 50/50)을 수득한다.
34-7 : 메틸 ( 3-플루오로-4-메틸)-2-아세트아미도시나메이트
2.6 g의 메틸 (3-플루오로-4-메틸)-2-아세트아미도시나메이트가 실시예 34-3의 방법으로 3.6 g의 메틸 2-아세트아미도아크릴레이트, 0.12 g의 팔라듐 아세테이트, 5.2 g의 테트라부틸암모늄 클로라이드, 3.8 g의 탄산수소나트륨 및 120 ㎖의 무수 DMF용액내 4 g의 2-플루오로-4-브로모톨루엔을 사용하여 163 ℃에서 녹는 백색 고체의 형태로 수득된다.
34-8 : (R,S)-4-트리플루오로메톡시페닐알라닌 하이드로클로라이드 또는 (R,S)-O-트리플루오로메틸티로신 하이드로클로라이드
1.5 g의 (R,S)-4-트리플루오로메톡시페닐알라닌 하이드로클로라이드가 실시예 34-1의 방법으로 3 g의 메틸 N-아세틸-(4-트리플루오로메톡시)페닐알라니네이트 및 30 ㎖의 12 N 염산을 사용하며 260 ℃에서 녹는 백색 고체의 형태로 수득된다.
34-9 : 메틸 (R,S)-N-아세틸-(4-트리플루오로메톡시)페닐알라니네이트
3 g의 메틸 N-아세틸-(4-트리플루오로메톡시)페닐알라니네이트가 실시예 34-2의 방법으로 3.1 g의 메틸 (4-트리플루오로메톡시)-2-아세트아미도시나메이트 및 50 ㎖의 에탄올내 석탄상 0.3 g의 10% 팔라듐을 사용하여 80 ℃에서 녹는 백색 고체의 형태로 수득된다.
34-10 : 메틸 4-트리플루오로메톡시-2-아세트아미도시나메이트
3.1 g의 메틸 (4-트리플루오로메톡시)-2-아세트아미도시나메이트가 실시예 34-3의 방법으로 4.3 g의 메틸 2-아세트아미도 아크릴레이트, 0.14 g의 팔라듐 아세테이트, 6.1 g의 테트라부틸암모늄 클로라이드, 4.6 g의 탄산수소나트륨 및 150 ㎖의 무수 DMF 용액내 5 g의 4-트리플루오로메톡시브로모벤젠을 사용하여 135 ℃에서 녹는 백색 고체의 형태로 수득된다.
34-11 : (R,S)-3-메틸티오페닐알라닌 하이드로클로라이드
1.38 g의 (R,S)-3-메틸티오페닐알라닌 하이드로클로라이드가 실시예 34-1의 방법으로 3.3 g의 메틸 N-아세틸-3-메틸티오페닐알라니네이트 및 40 ㎖의 12 N 염산을 사용하여 190 ℃에서 녹는 백색 고체의 형태로 수득된다.
34-12 : 메틸 (RS)-N-아세틸-3-메틸티오페닐알라니네이트
100 ㎖의 메탄올에 용해된 3.72 g의 메틸 3-메틸티오-2-아세트아미도시나메이트 및 30 ㎖의 테트라하이드로퓨란을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 1.4 g의 망간을 첨가한다. 20분간 반응 후, 혼합물을 얼음욕에서 냉각하고 추가로 1.4 g의 망간을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 18h 동안 교반시킨 후 1.4 l의 증류수와 300 ㎖의 CH2Cl2에 붓는다; 이 혼합물을 Clarcel?을 통해 여과한다. 수성상은 12 N 염산을 첨가함으로써 pH 6으로 맞추고 분리한 후 100 ㎖의 CH2Cl2으로 씻는다. 유기상은 수집되고 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후 감압하에 농축 건조시켜 3.42 g의 무색 오일(Merck Silica 5719, Rf=0.5; AcOEt)의 메틸 N-아세틸-3-메틸티오페닐아알라니네이트을 얻는다.
34-13 : 메틸 3-메틸티오-2-아세트아미도시나메이트
4.8 g의 메틸 (3-메틸티오)-2-아세트아미도시나메이트가 실시예 34-3의 방법으로 5.6 g의 메틸 2-아세트아미도아크릴레이트, 0.18 g의 팔라듐 아세테이트, 8.2 g의 테트라부틸암모늄 클로라이드, 5.86 g의 탄산수소나트륨 및 160 ㎖의 무수 DMF내 용해된 6.5 g의 3-요오드-1-메틸티오벤젠을 사용하여 139 ℃에서 녹는 백색 고체의 형태로 얻어진다.
34-14 : 3-요오드메틸티오벤젠
20 ㎖의 증류수와 20 ㎖의 12 N 염산을 교반시키면서 3경 플라스크에 넣고, 10 ㎖의 3-메틸티오아닐린을 적가깔때기를 사용하여 첨가한다. 혼합물은 용해를 위해 데운 다음 5℃로 냉각시킨다. 15 ㎖의 물에 녹인 5.86 g의 아질산나트륨을 이어서 천천히 5 및 8℃사이의 온도를 유지시키는 동안 적가깔때기를 사용하여 첨가한다. 완전한 첨가 20분 후, 15 ㎖의 물에 녹인 13.57 g의 요오드칼륨을 10분 간격으로 첨가하고 15h 동안 실온에서 교반시킨다. 생성되는 기름은 기울여따르기로 수성상으로부터 분리하고, 티오황산나트륨 수용액을 첨가한다. 수성상을 기울여 따르고 생성물을 100 ㎖의 디클로로메탄으로 추출한다. 유기상은 100 ㎖의 물로 씻고, 수성상은 농축된 수산화나트륨 용액으로 pH 9로 조절한 다음, 분리한다. 유기상은 100 ㎖의 물로 2번 씻고, 분리한 후 황산마그네슘으로 건조하고 여과하여 40℃에서 감압(50 kPa)하에 농축 건조한다. 생성물은 섬광 크로마토그래피(용출액, 시클로헥산)로 정제하여 황색 액체(Merck Silica 5719, Rf=0.8/시클로헥산) 형태의 13 g의 3-요오드-1-메틸티오벤젠이 수득된다.
실시예 35 : 방법 B를 이용한 페닐알라닌 유도체의 제조
[반응식 2]
Figure pct00088
35-1 : (RS)-4-3급 부틸페닐알라닌
25 g의 디에틸 4-(3급-부틸)벤질 아세트아미도말로네이트와 250 ㎖의 37% 염산을 냉각기로 덮어 씌운 3경 플라스크에 첨가한다. 혼합물을 교반시키고 기체의 발생이 없을 때까지 가열하여 환류시킨다. 반응 중간체를 냉각시킨 후, 얻어진 침전물을 여과시키고 아세톤니트릴에서 재결정시켜 25.6 g의 234℃에서 녹는 백색 고체 형태의 (R,S)-3급-부틸페닐알라닌 하이드로클로라이드가 수득된다 다.
35-2 : 디에틸 4-(3급-부틸)벤질아세트아미도말로네이트
25 g의 4-(3급-부틸)벤질 브로마이드, 50 ㎖의 무수 톨루엔 및 오일중의 80% 현탁액내 3.1 g의 수소화나트륨이 냉각기로 둘러싸인 3경 플라스크에 첨가되고, 21.8 g의 디에틸 아세트아미도말로네이트가 이어서 첨가된다. 혼합물은 110℃에서 17h 동안 가열된다. 냉각시킨 후, 15 ㎖의 무수 에탄올, 15 ㎖의 50% 에탄올, 50 ㎖의 물을 적가깔때기를 사용하여 천천히 첨가한다. 유기상을 기울여따르고 수성상은 50 ㎖의 디에틸에테르로 3번 씻는다. 유기상은 합치고 물로 씻고 황산나트륨으로 건조시킨다. 감압하에서 여과 및 농축되고 생성물은 석유 에테르에서 재결정시켜 25 g의 80℃에서 녹는 백색 고체 형태의 디에틸 4-(3급-부틸)벤질아세트아미도말로네이트를 수득한다.
35-3 : (R,S)-3-메틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드
1.03 g의 황색-베이지 고체가 실시예 35-1의 방법으로 1.17 g의 디에틸 3-메틸아미노벤질아세트아미도말로네이트 및 20 ㎖의 12 N 염산을 사용하여 얻어진다. 이 황색-베이지 고체를 20 ㎖의 무수 에탄올에 녹이고, 0.4 g의 동물성 목탄을 이 용액에 첨가한다. 용액을 Clarcel을 통해 여과시키고 감압(50 kPa)하에 여과 농축시킨다. 같은 방법으로 1g의 동물성 목탄으로 시작하여 반복하고, 얻어진 고체를 20 ㎖의 에테르에서 분쇄한다. 50℃에서 감압(2.7 kPa)하에서 여과 및 건조한 후, 0.65 g의 135 ℃에 가까운 온도(분해)에서 녹는 백색 분말 형태의 (R,S)-3-메틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드를 얻는다.
35-4 : 디에틸 3-메틸아미노벤질아세트아미도말로네이트
3.11 ㎖의 아세트산 무수물을 3경 플라스크에 넣고 질소 압력하에 유지시킨다. 1.51 ㎖의 포름산을 다음으로 0℃에서 3분 안에 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 가열한다. 혼합물은 실온으로 식히고, 3h 20분 흔드는 동안 4 ㎖의 무수 THF를 질소하에 첨가하고 -20℃로 냉각시킨다. 15 ㎖의 무수 THF의 혼합물내 4 g의 디에틸 3-아미노벤질아세트아미도말로네이트 및 15 ㎖의 무수 디클로로메탄을 10분 안에 첨가한다 1h 10분 동안 -20℃에서, 20℃에서 16시간 동안 계속하여 교반한다. 반응 혼합물은 30℃에서 감압(50 kPa)하에서 농축되고 30 ㎖의 무수 톨루엔과 공증발되어 백색 고체를 얻고 이것을 10 ㎖의 무수 THF 및 20 ㎖의 무수 1,2-디클로로에탄에 녹인후, 용액을 질소하에 3경 플라스크에 놓는다.
중간체는 -5℃로 냉각시키고, 1.55 ㎖의 보란-디메틸 설파이드 복합체(THF내 2M 용액)를 10분안에 첨가한다. 혼합물을 실온이 되게하고 용액을 3시간 동안 가열하여 환류시키고 실온에서 15h 동안 교반한다. 반응 중간체는 0℃로 냉각시키고, 10 ㎖의 MeOH을 25분 내에 첨가한다. 혼합물을 0℃에서 45분 동안, 실온에서 30분 동안 교반시킨다. 0℃로 냉각시키고 pH 2가 될때까지 HCl 가스를 주입한다. 혼합물은 1h 동안 가열 환류시키고 30℃에서 감소된 압력하에 농축 건조시켜 30 ㎖의 NaHCO3수용액 및 30 ㎖의 CH2Cl2내에 용해되는 5 g의 생성물을 얻는다. 유기상은 기울여 따르고 수성상은 20 ㎖의 물로 씻는다. 유기상을 모으고 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하여 감압(2.6 kPa)하에 농축 건조하여 섬광 크로마토그래피(용출액, AcOEt/시클로헥산 50/50)에 의해 정제되는 3.43 g의 황색 오일을 수득한다. 20℃에서 감압(2.7 kPa)하에서 건조 후, 1.18 g의 디에틸 3-메틸아미노벤질아세트아미도말로네이트가 122℃에서 녹는 밝은 베이지 고체 형태로 수득된다.
35-5 : 디에틸 3-아미노벤질아세트아미도말로네이트
디에틸 3-아미노벤질아세트아미도말론에이트가
T.S. Osdens, D.N. Ward, W.H. Chapman and H. Rakoff, J. Am. Chem. Soc., 81, 1959, 3100-3102. 에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다.
35-6 : (R,S)-3-에틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드
1.7 g의 (R,S)-3-에틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 실시예 34-1의 방법으로 2 g의 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-에틸아미노페닐알라니네이트 및 30 ㎖의 12N 염산을 사용하여 10 몰%의 (R,S)-3-디에틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드를 함유한 흡습성의 밝은 베이지 고체 형태로 수득된다.
35-7 : (R,S)-N-아세틸-3-에틸아미노페닐알라니네이트
3 g의 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-아미노페닐알라니네이트, 40 ㎖의 에탄올 및 미리 증류수와 에탄올로 씻은 14 g의 라니 니켈을 질소 기압하에 둥근-바닥 플라스크에 넣는다. 혼합물을 가열하여 19h 동안 환류하여, 냉각시키고, Clarcel?통해 여과하여 감압(50 kPa)하에서 농축 건조시켜 10% 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-디에틸아미노페닐알라니네이트를 함유하는 무색 오일(Merck Silica 5719, Rf=0.6: AcOEt)의 형태에서 2.1 g의 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-에틸아미노페닐알라닌에이트를 얻기 위해 섬광 크로마토그래피(용출액, AcOEt)로 정제된 3.07 g의 무색 오일을 얻는다.
35-8 : 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-아미노페닐알라니네이트
25 g의 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-니트로페닐알라니네이트(75 mol %/mol) 및 디에틸 3-니트로벤질아세트아미도말로네이트(25 mol %/mol) 혼합물을 고압반응용기에서 질소하에 놓는다. 2.5 g의 석탄상 10% 팔라듐 및 200 ㎖의 디클로로메탄을 첨가한다. 혼합물을 9 bar의 수소 압력하에 놓고 18℃에서 4h 동안 교반한다. 압력을 대기압으로 바꾼후, 반응 중간체는 Clarcel?통해 여과한 후, 디클로로메탄으로 씻고, 감압(50 kPa)하에서 농축 건조하여 환류하에 450 ㎖의 증류수와 4 g의 3S 동물성 목탄의 존재에서 재결정된 고체를 수득한다. Clarcel?통한 열여과후에, 혼합물은 4℃에서 결정화되도록 두고, 결정을 여과하고 건조하여 5%의 디에틸 3-아미노벤질아세트아미도말로네이트를 함유한 106℃에서 녹는 밝은 베이지 고체 형태의 9.9 g의 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-아미노페닐알라니네이트를 수득한다.
35-9 : 에틸 (R,S)-N-아세틸-3-니트로페닐알라니네이트 및 디에틸 3-니트로벤질아세트아미도말로네이트
600 ㎖의 무수 에탄올 및 7.9 g의 나트륨을 질소 압력하에 냉각기로 둘러싸인 3경 플라스크에 넣는다. 용해가 완전히 되면, 74.5 g의 디에틸 아세트아미도말론에이트 및 200 ㎖의 무수 에탄올내 60 g의 4-니트로벤질클로라이드를 첨가한다. 혼합물은 16h 30분 동안 가열하여 환류시킨다. 냉각후, 반응 중간체는 감압(50 kPa)하에서 농축되고 500 ㎖의 CH2Cl2및 500 ㎖의 물의 혼합물에 용해시킨다. 0.5 N 황산을 첨가함으로서 pH를 7로 조절하고 유기상은 분리하고 수성상은 200 ㎖의CH2Cl2로 2번 씻는다. 유기상은 합쳐지고 중탄산나트륨으로 포화된 200 ㎖의 물로 씻고, 분리되고 황산마그네슘으로 건조시킨다. 감압(50 kPa)하에서 여과 농축후, 생성물은 환류에서 600 ㎖의 에탄올내에서 재결정되어 대기압하에서 결정후, 여과 및 건조되어 156℃에서 녹는 백색 결정형의 70.4 g의 디에틸 3-니트로벤질아세트아미도말론에이트를 얻는다. 모액체는 농축되고 섬광 크로마토그래피(용출액, AcOEt)로 정제되어 25.6 g의 밝은 베이지 고체 형태의 에틸 N-아세틸-3-니트로페닐알라닌에이트(75 mol %/mol) 및 디에틸 3-니트로벤질아세트아미도말론에이트(25 mol %/mol)가 수득되고, 이것은 하기의 단계에서 사용된다.
35-10 : (RS)-3-디메틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드
고체가 실시에 35-1의 방법으로 0.72 g의 에틸 (RS)-N-아세틸-3-디메틸아미노페닐아라닌에이트 및 8.6 ㎖의 10N 염산을 사용하여 증발 후에 수득된다; 고체는 다음으로 50 ㎖의 아세톤내에서 분쇄하고, 여과하여 40℃에서 감소된 압력(2.7 kPa)하에서 건조시킨다. 0.68 g(93%)의 (RS)-3-디메틸아미노페닐아라닌 디하이드로클로라이드가 120℃(분해)범위에서 녹는 백색 고체 형태로 수득된다.
35-11 : 에틸 (RS)-N-아세틸-3-디메틸아미노페닐알라니네이트
실시예 35-8에서 설멍된 바와 같이 제조된 15 ㎖의 DMF내 4 g의 에틸 (RS)-N-아세틸-3-디메틸아미노페닐알라닌에이트를 질소 압력하에 3경 플라스크에 넣고 5.5 ㎖의 트리에틸아민, 2.5 ㎖의 요오드 메틸, 4 ㎖의 디클로로메탄을 얼음욕을 사용하여 30℃ 범위의 온도를 유지하는 동안 첨가한다. 1 ㎖의 DMF에 용해된 1 ㎖의 요오드 메틸을 30℃ 범위의 온도를 유지하는 동안 천천히 첨가하고; 2.2 ㎖의 트리에틸아민을 첨가하고 혼합물은 이어서 35℃에서 5h 동안 데워진다. 혼합물은 실온으로 하고 100 ㎖의 에틸 아세테이트 및 150 ㎖의 증류수로 추출한다. 수성상을 분리하고 침강후에 70 ㎖의 에틸 아세테이트로 2번 다시 씻는다. 유기상을 합하고, 80 ㎖의 증류수로 씻고 NaCl로 포화된 50 ㎖의 증류수로 씻는다. 유기상은 침강 후 분리하여, 황산마그네슘으로 긴조하고 여과하고 감압하에서 농축 건조하여 섬광 크로마토그래피(디클로로메탄, MeOH 90/10)로 정제된 2.4 g의 생성물을 수득한다. 0.72 g(16%)의 에틸 (RS)-3-N-아세틸-3-디메틸아티노페닐알라닌에이트가 황색 결정의 형태로 수득된다.
실시예 36 : 방법 C를 사용한 페닐알라닌 유도체의 제조
[반응식 3]
Figure pct00089
36-1:(R,S)-4-이소프로필페닐알라닌
아세트산 무수물 47㎖중의 적린 7g 및 4-(이소프로필벤질리덴)-2-메틸-5-옥사졸론 8g을 3경 플라스크에 넣은 다음, 적가 깔때기를 사용하여 교반하에 35㎖의 57% 요오드화수소산을 서서히 가한다. 일단, 첨가가 완료되면, 혼합물을 3시간 30분간 환류 가열한 다음 실온에서 3일간 방치한다. 반응 혼합물을 여과하고 수득되는 고체를 각각의 경우에 대해 10㎖의 아세트산으로 2회 세정한 다음, 여액을 감압하에 농축 건조시킨다. 수득되는 잔여물을 100㎖의 증류수에 용해시키고, 이 용액을 감압하에 농축 건조시켜 고체를 수득하여 50㎖의 증류수에 용해시킨 다음, 이 용액을 0.5g의 아황산 나트륨을 가한 후 50㎖의 디에틸 에테르로 3회 추출한다. 에테르를 분리해내고 수성상을 감압하에 두어 미량의 디에틸 에테르를 제거한다. 2g의 동물성 목탄을 수성상에 가하여 이를 40 내지 50℃로 가열한 다음 Clarcel?을 통하여 여과하고; 이어서 최소량의 물로 세정한다. 4℃에서 32% 암모니아를 가하여 pH를 5로 조정한다. 수득되는 침전물을 빙수중에서 여과하고, 10㎖의 물로 2회, 10㎖의 에탄올로 및 이어서 10㎖의 에테르로 2회 세정하여 20℃에서 감압하에 건조시킨 후 융점이 260℃ 이상인 백색 고체 형태의 3.97g의 (R,S)-4-이소프로필페닐알라닌을 수득한다. [참조문헌:Journal of the Takeda Research Laboratories, vol 43; nos. 3/4, Dec. 1984, pp 53-76].
36-2: 4-(이소프로필벤질리덴)-2-메틸-5-옥사졸론
18.52g의 N-아세틸글리신, 10.6g의 나트륨 아세테이트, 20㎖의 4-이소프로필벤즈알데히드 및 57㎖의 아세트산 무수물을 응축기가 제공된 환저 플라스크에 넣는다. 혼합물을 30분간 교반하고 이어서 110℃에서 1시간 동안 교반한 다음 계속해서 실온에서 15시간 동안 교반한다. 반응 매질을 600㎖의 물과 사전에 50℃로 가열한 400㎖의 석유 에테르에 붓는다. 유기상을 분리해내고 수성상을 150㎖의 석유 에테르로 2회 세척한다.
유기상을 합하여 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 여과한 다음 용적이 100㎖가 되고 침전물이 수득될 때까지 감압하에 농축한다. 침전물을 여과하고 50㎖의 펜탄으로 2회 세척하여 융점이 77℃인 황색 고체 형태의 8.2g의 4-(이소프로필벤질리덴)-2-메틸-5-옥사졸론을 수득한다.
36-3: (R,S)-4-부틸페닐알라닌
1.49g의 적린, 1.8g의 4-(부틸벤질리덴)-2-메틸-5-옥사졸론, 9.23㎖의 아세트산 무수물, 및 7.39㎖의 57% 요오드화수소산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 36-1에서와 같이 수행함으로써 융점이 260℃ 이상인 옅은 베이지색 고체 형태로 0.35g의 (R,S)-4-부틸페닐알라닌이 수득된다.
36-4: 4-(부틸벤질리덴)-2-메틸-5-옥사졸론
8.43g의 N-아세틸글리신, 4.92g의 나트륨 아세테이트, 9.8g의 4-부틸벤즈알데히드 및 26㎖의 아세트산 무수물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 36-2에서와 같이 수행함으로써 융점이 74℃인 황색 고체 형태로 1.89g의 4-(부틸벤질리덴)-2-메틸-5-옥사졸론이 수득된다.
실시예 37:방법 D를 사용한 페닐알라닌 유도체의 제조
37-1: (R,S)-3-에톡시페닐알라닌히드로클로라이드(또는 (R,S)-3-O-에틸타이로신 히드로클로라이드 )
3.6㎖의 염산 디옥산중에 용해된 1g의 (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-에톡시페닐알라닌을 환저 플라스크에 넣고, 이어서 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한다. 형성되는 침전물을 여과하고, 디옥산 및 이어서 에테르로 세정한 다음, 감압하에(2.7 kPa) 40℃에서 건조시켜 융점이 200㎖인 백색 고체 형태의 0.65g의 (R,S)-3-에톡시페닐알라닌 하이드로클로라이드를 수득한다.
37-2: (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-에톡시페닐알라닌
8㎖의 메탄올중에 용해된 1.33g의 에틸 (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-에톡시페닐알라니네이트를 환저 플라스크에 넣고, 8㎖의 1N 수산화 나트륨 용액을 가한다. 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 감압하에 증발시키고 이어서 8.56㎖의 1N 염산으로 산성화한다. 생성물을 10㎖의 에틸 아세테이트로 2회 추출하고, 유기상을 모은 다음, 10㎖의 물로 2회 세척하고 건조하여 여과한 다음 감압하에 농축 건조시겨 황색 오일 형태의 1g의 (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-에톡시페닐알라닌을 수득한다(Merck Silica 5719, Rf=0,7, 용출제: 톨루엔 80/MeOh 10/디에틸아민 10)
37-3: (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-에톡시페닐알라니네이트
7.5㎖의 건조 DMF중에 용해된 1.5g의 (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-타이로신을 질소 대기하에 3경 플라스크에 넣고, 이어서 오일 중의 50% 분산액으로서 0.508g의 수소화 나트륨을 가한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 0.86㎖의 요오도에탄을 가한 다음 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한다. 매질을 여과하고 생성 고체를 10㎖의 물로 3회, 이어서 10㎖의 석유 에테르로 2회 세척하여, 감압하에(2.7kPa) 30℃에서 건조시킨 후 백색 고체 형태의 1.33g의 에틸(R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-에톡시페닐알라니네이트를 수득한다.
37-4: (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-타이로신
180㎖의 디옥산중에 용해된 18g의 (R,S)-3-타이로신을 교반하에 3경 플라스크에 넣은 다음, 99㎖의 1N 수산화 나트륨 용액, 이어서 160㎖의 디옥산중에 용해된 26g의 디-3급-부틸디카보네이트를 가한다. 혼합물을 36시간 동안 교반한 후, 30℃에서 감압하에 농축한 다음 잔여물을 100㎖의 증류수중에 용해시키며; 이 용액을 1N 염산을 사용하여 pH 5로 산성화한 다음 200㎖ 에틸 아세테이트로 2회 추출한다. 유기상을 황산 마그네슘상에서 건조시키고 여과한 다음 감압하에 30℃에서 농축 건조시켜 백색 고체 형태의 30g의 (R,S)-N-3급-부톡시카보닐-3-타이로신을 수득한다(Merck Silica 5719, Rf=0.25, 용출제: 톨루엔 80, MeOH 10, 디에틸아민 10).
실시예 38: 방법 E를 사용한 페닐알라닌 유도체의 제조
38-1: (R,S)-4-디알릴아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드
5.8g의 디에틸 4-디알릴아미노벤질아세트아미토 말로네이트 및 48㎖의 10N 염산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-1에서와 같이 수행함으로써, 증발 과정 후 고체가 수득되고; 이어서 고체를 50㎖의 아세톤중에서 연마하고, 여과한 다음, 10㎖의 디클로로메탄중에서 연마하고, 여과한 다음 10㎖의 에틸 에테르로 3회 세정한다. 감압하에(2.7 kPa) 40℃에서 건조시킨 후에, 4.41g의 (R,S)-4-디알릴아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 융점이 135℃ 영역인(분해) 회백색 고체형태로 수득된다.
38-2: (RS)-4-알릴아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드
3.27g의 디에틸 4-알릴아미노벤질아세탈아미도말로네이트 및 30㎖의 10N 염산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-1에서와 같이 수행함으로써, 증발 과정후 고체가 수득되고; 이어서 고체를 50㎖의 아세톤중에서 연마하고 여과한 다음 감압하에(2.7 kPa) 40℃에서 건조시킨다. 2.3g의 (R,S)-4-알릴아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 융점이 134℃(분해) 영역인 회백색 고체 형테로 수득된다.
38-3: 디에틸 4-디알릴아미노벤질아세트아미도말로네이트 및 디에틸 4-알릴아미노벤질아세트아미도말로네이트
150㎖의 DMF중에 용해된 10g의 디에틸 4-아미노벤질아세트아미도말로네이트를 적가 깔때기가 위에 배치되고 질소 대기하에서 유지된 3경 플라스크에 넣는다. 6.57㎖의 알릴 브로마이드, 이어서 10.76㎖의 트리에틸아민을 실온에서 교반하에 서서히 가한다. 19시간 동안 교반한 후, 추가로 1.31㎖의 알릴브로마이드 및 2.15㎖의 트리에틸아민을 가한 다음 혼합물을 26시간 동안 교반한다. 반응 매질을 1.5ℓ의 증류수에 붓고 이 혼합물을 1ℓ의 에틸 아세테이트로 추출한다. 침강시킨 후 수성상을 분리해내고 500㎖의 에틸 아세테이트로 2회 세척한다. 유기상을 합하고, 500㎖의 증류수로 세척한 다음 염화 나트륨으로 포화된 500㎖의 물로 세척하고, 분리해낸 다음, 황산 마그네슘상에서 건조시키고 여과하여 농축 건조시켜 밤색 오일을 수득하며; 이 오일을 섬광 크로마토그래피로(용출제, CH2Cl290/AcOEt 10) 정제하여 융점이 94 내지 96℃인 베이지색 고체 형태의 6.66g의 디에틸 4-디알릴아미노벤질아세트아미도말로네이트(Rf= 0.6, AcOEt 50/시클로헥산 50) 및 융점이 104 내지 106℃인 베이지색 고체 형테의 3.49g의 디에틸 4-알릴아미노벤질아세트아미도말로네이트(Rf=0.45 AcOEt 50/시클로헥산 50)를 수득한다.
디에틸 4-아미노벤질아세트아미도말로네이트는 문헌[참조: J. B. Burckhalter, VC Stephens, J. Am. Chem. Soc. 56, 1951, 73]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시예 39: 방법 F를 사용한 페닐알라닌 유도체의 제조
[반응식 4]
Figure pct00090
39-1: (R,S)-4-에틸이소프로필페닐알라닌 디하이드로클로라이드
2.9g의 디에틸 4-에틸이소프로필벤질아세트아미도말로네이트 및 24.6㎖의 10N 염산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-1에서와 같이 수행함으로써, 증발과정 후에 고체가 수득되고; 이어서 고체를 20㎖의 아세톤중에서 연마하여 여과한 다음 감압하에(2.7 kPa) 40℃에서 건조시킨다. 2g의 (R,S)-4-에틸이소프로필아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 융점이 147℃(분해) 영역인 백색 고체 형태로 수득된다.
39-2: 디에틸 4-에틸이소프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트
THF 70㎖중의 15g의 디에틸 4-에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트를 질소대기하에서 유지시킨 3경 플라스크에 넣고; 6.4㎖의 2-요오도프로판, 이어서 8.4㎖의 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔을 가한 다음 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 가열한다. 계속해서 2.13㎖의 2-요오도프로판, 이어서 8.4㎖의 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔을 가하고 이어서 혼합물을 60℃에서 추가로 24시간 동안 가열한다. 혼합물을 실온이 되게한 다음 50㎖의 디클로로메탄 및 50㎖의 증류수로 추출한다. 침강시킨 후 수성상을 분리해내고 30㎖의 디클로로메탄으로 2회 재세척한다. 유기상을 합하여 60㎖의 증류수로, 이어서 NaCl로 포화된 50㎖의 증류수로 세척한다. 유기상을 침강 후 분리해내고 황산 마그네슘상에서 건조시킨 다음 여과하고 감압하에 농축 건조시켜 16.2g의 생성물을 수득하며 이를 섬광 크로마토그래피(디클로로메탄, MeOH 90/10)로 정제한다. 이렇게하여 4.59g의 생성물이 생성되고 이를 45㎖의 시클로헥산중에서 재결정하여 융점이 80℃인 백색 결정 형태의 3.44g의 디에틸 4-에틸이소프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트를 수득한다.
39-3: 디에틸 4-에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트
22g의 디에틸 4-아미노벤질아세트아미도말로네이트, 500㎖의 에탄올 및 70g의 라니 니켈을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-7에서와 같이 수행함으로써 디에틸 4-에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트를 제조할 수 있다. 이렇게하여 융점이 136℃인 회백색 고체 형태의 23.8g의 디애틸 4-에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트가 생성된다.
39-4: (R,S)-4-알릴에틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드
4.54g의 디에틸 4-알릴에틸벤질아세트아미도말코네이트 및 37.9㎖의 10N 염산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-1에서와 같이 수행함으로써, 증발 과정 후에 고체를 수득하며; 이어서 고체를 감압하에(2.7 kPa) 40℃에서 건조시킨다. 3.67g의 (R,S)-4-알릴에틸아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 융점이 130℃(분해) 영역인 갈색 고체 형태로 수득된다.
39-5: 디에틸 4-알릴에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트
THF 50㎖중의 8g의 디에틸 4-에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트, 4㎖의 알릴 브로마이드 및 5.82㎖의 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 39-2에서와 같이 수행함으로써, 섬광 크로마토그래피(용출제, CH2Cl2/AcOET 90-10, 용적 기준) 정제 후 5.6g의 고체가 수득되며; 이어서 고체를 35㎖의 시클로헥산중에서 재결정한다. 이렇게하여 융점이 86℃인 백색 고체 형태의 5.43g의 디에틸 4-알릴에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트가 생성된다.
39-6: (R,S)-4-에틸프로필아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이트
2.5g의 디에틸 4-에틸프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트 및 21㎖의 10N 염산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-1에서와 같이 수행함으로써, 증발후에 고체가 수득된다. 이어서 고체를 감압하에(2.72a) 40℃에서 건조시킨다. 2g(97%)의 (R,S)-4-에틸프로필아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 융점이147℃(분해) 영역인 백색 고체 형테로 수득된다.
39-7: 디에틸 4-에틸프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트
THF 70㎖중의 10g의 디에틸 4-에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트, 5.6㎖의 1-요오도프로판 및 7.2㎖의 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 39-2에서와 같이 수행함으로써, 36시간 동안 반응시키고 이어서 섬광 크로마토그래피(용출제, CH2Cl2/MeOH 97-3, 용적 기준)로 정제한 후 2.8g의 고체가 수득되며; 이어서 고체를 26㎖의 시클로헥산중에서 재결정한다. 이렇게 하여 융점이 84 내지 86℃인 백색 고체 형태의 2.9g의 디에틸 4-에틸프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트가 생성된다.
39-8: (R,S)-4-에틸메틸시클로프로필아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드
3g의 디에틸 4-에틸메틸시클로프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트 및 25㎖의 10N 염산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-1에서와 같이 수행함으로써, 3일간 반응시키고 이어서 증발시킨 후 고체가 수득되며; 고체를 이어서 40㎖의 아세톤중에서 연마하고 여과한 다음 감압하에(2.7kPa) 40℃에서 건조시킨다. 2.24g의 (R,S)-4-에틸메틸시클로프로필아미노페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 융점이 140℃(분해) 영역인 백색 고체 형태로 수득된다.
39-9: 디에틸 4-에틸메틸시클로프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트
THF 50㎖중의 8g의 디에틸 4-에틸아미노벤질아세트아미도말로네이트, 2.6㎖의 브로모메틸시클로프로판 및 2.97㎖의 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 39-2에서와 같이 수행함으로써 3.3g의 디에틸 4-에틸메틸시클로프로필아미노벤질아세트아미도말로네이트가 3일간 반응시키고 이어서 섬광 크로마토그래피(용출제 CH2Cl2/ACOEt 90-10, 용적 기준)로 정제한 후 융점이 112 내지 114℃인 백색 고체 형태로 수득된다.
실시예 40: 방법 G를 사용한 페닐알라닌 유도체의 제조
[반응식 5]
Figure pct00091
40-1: (R,S)-4-(1-피롤리디닐)페닐알라닌 디하이드로클로라이드
1.5g의 디에틸 4-(1-피롤리디닐)벤질아세트아미도말로네이트 및 40㎖의 5N 염산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 35-1에서와 같이 수행함으로써 증발 후 고체가 수득되고; 이어서 고체를 15㎖의 아세톤중에서 연마하고 여과한 다음 감압하에(2.7kPa) 40℃에서 건조시킨다. 0.6g의 (R,S)-4-(1-피롤리디닐)페닐알라닌 디하이드로클로라이드가 회백색 고체 형태로 수득된다.
40-2: 디에틸 4-(1-피롤리디닐)벤질아세트아미도말로네이트
100㎖의 MeOH중에 용해된 4g의 에틸 4-(1-피롤릴)벤질아세트아미도말로네이트, 및 목탄상의 1g의 10% 팔라듐을 오토클레이브에 넣는다. 오토클레이브를 질소로 3회 퍼징한 후, 생성물을 14바의 수소 압력하에 19℃에서 수소화한다. 25시간 동안 교반한 후, 수소화를 멈추고 생성물을 Clarcel?을 통해 여과한 다음 디클로로메탄으로 세정하며; 이어서 용액을 감압하에 농축시켜 50㎖의 헵탄 및 10㎖의 에틸 에테르의 혼합물중에서 연마되는 3.85g의 고체를 수득한다. 생성 고체를 여과하고, 건조시킨 다음 섬광 크로마토그래피(용출제 CH2Cl2/아세톤 90/10, 용적 기준)로 정제하여 융점이 132℃인 백색 고체 형태의 1.6g의 디에틸 4-(1-피롤리디닐)벤질아세트아미도말로네이트를 수득한다.
40-3: 디에틸 4-(1-피롤릴)벤질아세트아미도말로네이트
질소하에 유지시킨 3경 플라스크에 아세트산 104㎖중의 4.6g의 디에틸 4-아미노벤질아세트아미도말로네이트를 넣는다. 7.02g의 나트륨 아세테이트를 가하고 이어서 1.87㎖의 2,5-디메톡시테트라하이드로푸란을 가한다. 혼합물을 65㎖에서 1시간 15분 동안 가열하고, 이어서 냉각한 다음 100㎖의 디클로로메탄 및 100㎖의 증류수로 추출한다. 침강후 수성상을 분리해낸 다음 100㎖의 디클로로메탄으로 3회 세척한다. 유기상을 합하여 100㎖의 물, 이어서 100㎖의 NaCl 포화 용액으로 세척한 다음 침강후 분리해내고 이어서 황산 마그네슘상에서 건조시키고; 상을 여과한 다음 감압하에(50 kPa) 증발 건조시켜 섬광 크로마토그래피(용출제 CH2Cl2/ 아세톤 75/25, 용적 기준)로 정제되는 6.2g의 고체를 수득한다. 이렇게하여 융점이 110℃인 베이지색 고체 형태의 3.57g의 디에틸 4-(1-피롤릴)벤질아세트아미도말로네이트가 생성된다.
실시예 41: 방법 H를 사용한 페닐알라닌 유도체의 제조
41-1: (RS)-4-에틸티오메틸페닐알라닌
질소하에서 유지시킨 3경 플라스크에 300㎖의 무수 메탄올을 넣고; 계속해서 1.72g의 나트륨 메톡사이드, 이어서 5.55㎖의 에틸 머캅탄을 교반하에 가한다. 용매를 감압하에 40℃에서 농축하여 8.5g의 에틸 머캅탄의 나트륨염을 수득하고 이를 100㎖의 무수 THF중에 용해시킨다. 3.6g의 (RS)-4-클로로메틸페닐알라닌을 실온에서 가하고 이어서 혼합물을 18시간 동안 환류 가열한다. 용매를 감압하에 40℃에서 증발시키고 잔여물을 100㎖의 중류수중에 용해시킨다. 수득되는 혼탁 용액을 5㎖의 아세트산으로 산성화한다. 생성되는 침전물을 여과하여 증류수로 세정한 다음 감압하에 60℃에서 건조시켜 3.6g의 고체를 수득하고 이를 섬광 크로마토그래피(용출제 AcOEt 60, AcOH 12, 물 10)로 정제한다. 이렇게하여 융점이 251℃인 백색 고체 형태의 256mg의 (R,S)-4-에틸티오메틸페닐알라닌이 생성된다.
(R,S)-4-클로로메틸페닐알라닌은 문헌[참조: R. Gonzalez-Muniz, F. Cornille, F. Bergeron, D. Ficheux, J. Pothier, C. Durieux and B. Roques, Int. J. Pept. Protein. Res., 1991, 37(41), 331-340]에 기술된 바와 같이 (S)-4-클로로메틸페닐알라닌을 사용하여 유사하게 수득될 수 있다.
실시예 42 : 방법 I를 사용한 페닐알라닌 유도체의 제조
42-1: (S)-4-0-(2-클로로에틸)타의로신 하이드로클로라이드
50㎖의 염산 디옥산중에 용해된 5g의 (S)-N-3급-부톡시카보닐-4-O-(2-클로로에틸)타이로신을 환저 플라스크애 넣는다. 28시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 감압하에 농축 건조시킨다. 이어서 생성되는 잔여물을 50㎖의 에테르중에 용해시키고 이 용액을 교반하고 여과한다. 생성되는 고체를 25㎖의 에테르로 2회 세척한 다음 감압하에 건조시켜 융점이 260℃인 백색 고체 형태의 1.58g의 (S)-4-O-(2-클로로에틸)타이로신 하이드로클로라이드를 수득한다.
42-2: (S)-N-3급-부톡시카보닐-4-O-(2-클로로에틸)타이로신
140㎖의 DMF중에 용해시킨 14g의 (S)-N-3급-부톡시카보닐타이로신을 질소 대기하에 3경 플라스크애 넣는다. 오일중 4.8g의 50% 수소화 나트륨을 스패튤라를 사용하여 서서히 가한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 16.87g의 1-토실-2-클로로에탄올을 가한다. 혼합물을 2일간 교반한 후 오일중 2.4g의 50% 수소화 나트륨, 및 추가로 8.4㎖의 1-토실-2-클로로에탄올을 가한다. 24시간 후 동일 과정을 수행하고 추가로 24시간 동안 교반을 계속한다. 100㎖의 증류수를 가하여 반응을 정지시키고, 반응 혼합물을 감압하에 농축 건조시킨다. 수득되는 잔여물을 100㎖의 증류수중에 용해시킨 다음 100㎖의 에틸 아세테이트로 3회 추출한다. 침강 후 수성상을 분리해내고 50㎖의 1N HCl로 pH3으로 산성화하며, 생성물을 100㎖의 에틸 아세테이트로 3회 추출한다. 유기상을 합하여 50㎖의 물로 2회 세척하고 분리해내며 황산 마그네슘상에서 건조시키고 여과한 다음 감압하에 농축건조시켜 그 자체로 후속 단계에 사용되는 밤색 오일 형태의(Rf=0.5, 톨루엔 70%/메탄올 20%/디에틸아민 10%) 13.51g의 (S)-N-3급-부톡시카보닐-4-O-(2-클로로에틸)타이로신을 수득한다.
[표 V]
Figure pct00092
Figure pct00093
사용된 약어
AcOEt 에틸 아세테이트
DNA 데옥시 리보 핵산
AMP 아데노신 5'-모노포스페이트
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
dCTP 데옥시사이토신 5'-트리포스페이트
DMF 디메틸포름아미드
DMPAPA 4-디메틸아미노-L-페닐알라닌
HCl 염산
HT7 Hickey Tresner 고체 배지
3-HPA 3-하이드록시피콜린산
IPTG 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드
kb 킬로염기
LB Luria 육즙 (이. 콜라이에 대한 풍부한 성장 배지)
MeOH 메탄올
MMPAPA 4-메틸아미노-L-페닐알라닌
NaOH 수산화 나트륨
PAPA 4-아미노-L-페닐알라닌
PEG 폴리에틸렌 글리콜
P I 프리스티나마이신 I
P II 프리스티나마이신 II
bp 염기쌍
SAM S-아데노실메티오닌
TE 10mM Tris-HCl 완충액, 1 mM EDTA, pH 7.5
THF 테트라하이드로푸란
Tris 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올
UV 자외선
X-gal 5-브로모-4-클로로-3-인도일-β-D-갈락토사이드
YEME 효모 추출물-말트 추출물 배지(스트렙토마이시즈에 대한 풍부한 성장 배지)
인용 문헌
Figure pct00094
Figure pct00095
서열 리스트
(1) 종합 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리명 : 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 도시명 : 앙토니
(E) 국명 : 프랑스
(F) 우편번호 : 92165
(ii) 발명의 명칭 : 신규 스트렙토그라민 및 돌연변이 합성에 의한 스트렙토그라민의 제조 방법
(iii) 서열수 : 8
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체형 : 테잎
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 운용 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 발매 #1.0, 버전 #1.25 (OEB)
(2) 서열 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 2888 염기쌍
(B) 유형 : 헥산
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티네스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 1 :
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
(3) 서열 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 888 염기쌍
(B) 유형 : 헥산
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티내스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 2 :
Figure pct00099
(4) 서열 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 387 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티네스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 3 :
Figure pct00100
(5) 서열 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 4496 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티내스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 4 :
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
(6) 서열 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1065 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티내스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 5 :
Figure pct00105
Figure pct00106
(7) 서열 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1194 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 분쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티내스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 6 :
Figure pct00107
Figure pct00108
(8) 서열 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1561 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티내스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 7 :
Figure pct00109
Figure pct00110
(9) 서열 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1233 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 본쇄형 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iii) 안티센스: 없음
(vi) 최초 공급원 :
(A) 유기체 : 스트렙토마이시즈 프리스티내스피랄리스
(xi) 서열 열거 : 서열 8 :
Figure pct00111
Figure pct00112

Claims (4)

  1. 화학식( I )로 표시되는 화합물.
    Figure pct00113
    상기식에서,
    R2및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸 그룹을 나타내고,
    R3는 수소 원자 또는 히드록실 그룹을 나타내며,
    X는 CO, CHOH 또는 CH2그룹을 나타내고,
    R1은
    Figure pct00114
    Figure pct00115
    이며,
    - 메타 유도체의 경우:
    A, C, D 및 E가 수소 원자를 나타내고,
    B가
    -할로겐,
    -모노알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹,
    -에테르 그룹,
    -티오에테르 그룹,
    -C1-C3알킬 그룹, 또는
    -트리할로게노메틸 그룹을 나타낼 수 있고,
    -파라 유도체의 경우.
    A, B, D 및 E는 수소 원자를 나타내고,
    C는
    -할로겐
    -NR1R2그룹[여기에서, R1및 R2는 각각 독립적으로
    -수소,
    -직쇄 또는 측쇄 C1내지 C4알킬 그룹(여기에서, 치환체 R1 또는 R2중 하나가 메틸 그룹을 나타낼 때, 다른 하나는 반드시 에틸 그룹을 나타낸다),
    -C3내지 C4시클로알킬을 갖는 알킬-시클로알킬메틸 그룹,
    -치환되거나 치환되지 아니한 C3내지 C4시클로알킬 그룹,
    -직쇄 또는 측쇄 C1내지 C4알케닐 그룹(여기에서, 치환체 R1 또는 R2중 하나가 알케닐 그룹을 나타낼 때, 다른 하나는 메틸 그룹 또는 C3내지 C6시클로알킬 그룹과는 상이하다)를 나타낸다],
    -치환되거나 치환되지 아니한 N-피롤리디닐 그룹,
    -에테르 그룹,
    -티오에테르 그룹,
    -아실 또는 알콕시카보닐 그룹,
    -직쇄 또는 측쇄인 C1내지 C6알킬 그룹,
    -알킬티오메틸 그룹,
    -아릴 그룹, 또는
    -트리할로게노메틸 그룹을 나타낼 수 있고,
    -메타-파라 이치환된 유도체의 경우:
    A, D 및 E는 수소 원자를 나타내고,
    B는
    -할로겐,
    -모노알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹,
    -에테르 그룹,
    -티오에테르 그룹,
    -C1내지 C3알킬 그룹을 나타낼 수 있으며,
    C는
    -할로겐,
    -아미노, 모노알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹(단, B는 브롬 또는 염소 원자와는 상이하다), 또는 치환되거나 치환되지 아니한 알릴 그룹,
    -에테르 그룹,
    -티오에테르 그룹,
    -C1내지 C6알킬 그룹, 또는
    -트리할로게노메틸 그룹을 나타낼 수 있으며,
    -오르쏘-파라 이치환된 유도체의 경우.
    B, E 및 D는 수소 원자를 나타내고 A 및 C는 메틸 그룹을 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    -메타 유도체의 경우:
    B가
    -불소 원자,
    -모노메틸아미노, 모노에틸아미노, 디메틸아미노 또는 디에틸아미노 그룹, 또는
    -트리플루오로메틸을 나타낼 수 있고,
    -파라 유도체의 경우:
    C는
    -메틸, 이소프로필 또는 3급-부틸 그룹,
    -페닐 그룹, 또는
    -트리플루오로메틸 그룹을 나타낼 수 있으며,
    -메타-파라 유도체의 경우:
    B는
    -불소 원자,
    -모노메틸아미노, 모노에틸아미노, 디메틸아미노 또는 디에틸아미노 그룹을 나타낼 수 있고,
    C는
    -불소 원자,
    -모노메틸아미노 또는 디메틸아미노 그룹(단, B는 브롬 또는 염소 원자와는 상이하다), 또는
    -트리플루오로메틸을 나타낼 수 있는 화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
    5γ-히드록시-4ξ-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
    4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
    4ξ-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-메톡시카보닐-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-클로로-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-브로모-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이진 IH,
    4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-요오도-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
    4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-트리플루오로메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
    4ξ-3급-부틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-이소프로필-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-이소프로필-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IE,
    4ε -메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ε-메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
    4ε-플루오로-4ξ-메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-디에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-디알릴아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-알릴에틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에틸프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에틸이소프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에틸메틸시클로프로필아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-(1-피롤리디닐)-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-트리플루오로메톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-알릴옥시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-메틸티오메틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-(2-클로로에톡시)-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-아세틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ξ-에틸-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IH,
    4ε-디메틸아미노-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA,
    4ε-메틸티오-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA, 및
    4ε-에톡시-데(4ξ-디메틸아미노)프리스티나마이신 IA인 화합물.
  4. A 그룹 스트렙토그라민과 회합되어 있거나 회합되어 있지 않을 수 있는 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 하나 이상의 화합물을 함유하는, 박테리아의 감염 치료용약학 조성물.
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