CZ5297A3 - Novel streptogramins and process for preparing streptogramins by mutasynthesis - Google Patents

Novel streptogramins and process for preparing streptogramins by mutasynthesis Download PDF

Info

Publication number
CZ5297A3
CZ5297A3 CZ9752A CZ5297A CZ5297A3 CZ 5297 A3 CZ5297 A3 CZ 5297A3 CZ 9752 A CZ9752 A CZ 9752A CZ 5297 A CZ5297 A CZ 5297A CZ 5297 A3 CZ5297 A3 CZ 5297A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pristinamycin
dimethylamino
group
des
seq
Prior art date
Application number
CZ9752A
Other languages
English (en)
Inventor
Veronique Blanc
Denis Thibaut
Nathalie Bamas-Jacques
Francis Blanche
Joel Crouzet
Jean-Claude Barriere
Laurent Debussche
Alain Famechon
Jean-Marc Paris
Gilles Dutruc-Rosset
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9465182&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ5297(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of CZ5297A3 publication Critical patent/CZ5297A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D295/155—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms separated by carbocyclic rings or by carbon chains interrupted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/34—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C229/36—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings with at least one amino group and one carboxyl group bound to the same carbon atom of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/40—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/42—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of at least one six-membered aromatic ring and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton with carboxyl groups linked to the six-membered aromatic ring, or to the condensed ring system containing that ring, by saturated carbon chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/12—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups
    • C07C233/15—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/24—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C233/25—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/62—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C323/63—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se zejména týká nových sloučenin blízkých streptograminům skupiny B a způsobu přípravy streptograminů. Vynález se rovněž týká nových genů uplatňujících se při biosyntéze prekurzorů streptograminů skupiny B, jakož i jejich použití.
Dosavadní stav techniky
Streptograminy tvoří homogenní skupinu antibiotik sestávajících z kombinace dvou chemicky odlišných typů molekul, tj. jednak z polynenasycených makrolaktonů (složky skupiny A) a jednak z depsipeptidů (složky skupiny B). Tato skupina antibiotik zahrnuje četná antibiotika známá pod různými jmény označujícími jejich původ, z nichž ize uvést pristinamyciny, mikamyciny a virginiamyciny (Cocito 1979, 1983).
Složky AaB vykazují synergickou antibakteriální účinnost, která může dosahovat až stonásobku účinnosti samotných složek A a B a která má na rozdíl od účinnosti samotných uvedených složek baktericidní charakter (Cocito 1979). Tato účinnost se zejména uplatňuje proti Gram-pozitivním bakteriím, jakými jsou stafylokoky a streptokoky (Cocito 1979, Videau 1982). Složky AaB inhibují proteinovou syntézu tím, že se fixují na podjednotku 50S ribosomu (Cocito 1979, Di Giambattista a kol. 1989).
Až dosud jsou biosyntézní mechanismy tvorby každé z uvedených složek známy jen částečně, i když studie popsané v patentové přihlášce PCT/FR93/0923 umožnily identifikovat několik proteinů a genů odpovídájících struktur, které se uplatňují při biosyntéze obou typů uvedených složek.
Při procesu biosyntézy streptograminů skupiny B lze rozlišit dvě následující etapy:
1) biosyntéza prekurzorů,nebo jejich analogů, makrocyklu: kyselina 3-hydroxypikolinová, kyselina L-2-aminomáselná, 4-dimethylamino-L-fenylalanin, kyselina L-pipekoLová, Lfenylglycin,
2) tvorba makrocyklu L-threoninu a L-prolinu nebo jejich analogů z výše uvedených prekurzorů a případná následující modifikace nebo případné následné modifikace typu N-peptidové methyláce, epimerace, hydroxylace a oxidace.
Předmětem mezinárodní patentové přihlášky PCT/FR93/ 0923 jsou enzymy katalyzující inkorporaci prekurzorů do peptidového řetězce streptograminů B v průběhu elongace řežezce, jakož i jejich strukturní geny. Tyto výsledky umožnily ozřejmit peptidový neribosomální charakter syntézy uvedených složek typu B.
vynález se zejména týká nových sloučenin blízkých streptograminům skupiny B a přesněji vymezeno, nových sloučenin skupiny pristinamycinů I (obr. 1 a 2), označovaných dále jako PI, nebo skupiny virginiamycinů S (obr. 3).
Hlavní složkou pristinamycinů I (PI) je PI (obr.l).
Λ který představuje asi 94 % pristinamycinů I, přičemž asi zbývající 6 % je tvořeno minoritními složkami depsipeptidu (ΡΙβ až ΡΙ^), jejich struktury jsou zobrazeny na obr.2. Pristinamycin I v podstatě rezultuje z kondenzace aminokyselin, z nichž některé jsou nezbytné pro proteinovou syntézu (threonin a prolin) a další jsou původní a považovány jako takové za sekundární metabolity (kyselina L-2-aminomáselná, 4-dimethylaminoL-f enylalanin (DMPAPA), kyselina L-pipekolová a L-fenylglycin pro PI^, jakož i aromatický prekurzor tvořený kyselinou 3-hydroxypikolinovou.
Pokud jde o deriváty virginiamycinů S, tyto deriváty rezultují z kondenzace stejných aminokyselin, které byly uvedeny pro PI s výjimkou DMPAPA, který je v tomto případě nahražen fenylalaninem (viz obr.3).
Produkce takovýchto různých sloučenin biosyntézou tedy předběžnou syntézu za použití produkčního kmene výše uvedených původních prekurzoru.
Přesně specifikováno, vynález rezultuje z původního způsobu přípravy streptograminů, při kterém se používá jako produkční kmen streptograminů kmen mikroorganismů, který je mutovaný tak, že pozměňuje biosyntézu prekurzoru streptograminů skupiny B. Podle tohoto způsobu je uvedený mutantní kmen kultivován v prostředí komplementovaném původním prekurzorem, který je odlišný od prekurzoru, jehož biosyntéza je modifikována. Zcela neočekávaně bylo takto dosaženo produkce nových sloučenin, které jsou strukturně blízké streptograminúm skupiny B, přičemž tyto nové sloučeniny jsou zajímamé v terapeutické oblasti.
Podstata vynálezu
Přesněni vymezeno, týká se vynález nových sloučenin obecného vzorce I
ve kterém nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo methylovou skupinu, znamená atom vodíku nebo hydroxylovou skupinu,
X znamená skupinu CO, CHOH nebo CH^ a
Rj znamená
CH, S
CH,
I nebo (4e)
Β
D
CW
E přičemž
-pro deriváty meta:
A,C,D a Ξ znamenají atom vodíku a
B může znamenat:
-atom halogenu a výhodně atom fluoru,
-moncalkylamino-skupinu nebo dialkylamino-skupinu, ve kterých alkylový zbytek výhodně znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu,
-etherovou skupinu, přičemž se zejména jedná o skupinu OR, ve které R výhodně znamená methylovou skupinu, ethylovou skupinu, trifluormethylovou skupinu nebo allylovou skupinu,
-thioetherovou skupinu, kterou je výhodně alkylthio-skupina, ve které alkylový zbytek výhodně znamená methylovou skupinu,
-alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy nebo -trihalogenmethylovou skupinu, výhodně trifluormethylovou skupinu ,
-pro deriváty para:
A, 3, D a Ξ znamenají atom vodíku a
C může znamenat:
-atom halogenu,
-skupinu NR^R^, ve které R^ a R2 nezávisle jeden na druhém znamenají
-atom vodíku,
-přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, přičemž v případě, že jeden ze substituentů R^ nebo R2 znamená methylovou skupinu, potom druhý obligatorně znamená ethylovou skupinu,
-alkylcykloalkylmethylovou skupinu, ve které cykloalkylový zbytek obsahuje 3 nebo 4 uhlíkové atomy, -případně substituovanou cykloalkylovou skupinu obsahující 3 nebo 4 uhlíkové atomy,
- přímou nebo rozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 3 nebo 4 uhlíkové atomy, přičemž v případě, že jeden ze substituentů R1 nebo R2 znamená alkenylovou skupinu, poto druhý z těchto substituentů je odlišný od methylové skupiny nebo cykloalkylové skupiny obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů,
-substituovanou nebo nesubstituovanou N-pyrrolidinylovou skupinu, -etherovou skupinu, přičemž se výhodně jedná o skupinu OR, ve které výhodně znamená methylovou skupinu, ethylovou skupinu případně substituovanou atomech chloru, trifluormethylovou skupinu a alkenylovou skupinu,
-thioetherovou skupinu, která výhodně znamená alkylthio-skupinu, ve které alkylový zbytek výhodně znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy,
-acylovou skupinu nebo alkoxykarbonylovou skupinu a zejména skupinu COR, ve které R výhodně znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy nebo alkoxy-skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy,
-lineární nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, výhodně methylovou skupinu, isopropylovou skupinu a terč.butylovou skupinu,
-alkylthiomethylovou skupinu a zejména skupinu CH^SR, ve které R znamená výhodně alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy,
-arylovou skupinu a výhodně fenylovou skupinu nebo
-trihalogenmethylovou skupinu a výhodně trifluormethylovou skupinu,
-pro disubstituované deriváty meta-para:
A, D a E znamenají atom vodíku a
B může znamenat:
-arom halogenu a výhodně atom fluoru,
-monoalkylamino-skupinu nebo dialkylamino-skupinu, ve které alkylový zbytek výhodně znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu,
-etherovou skupinu a výhodně skupinu OR, ve které R výhodně znamená methylovou skupinu, ethylovou skupinu a trifluormethylovou skupinu,
-thioetherovou skupinu a výhodně alkylthio-skupinu, ve které alkylový zbytek výhodně znamená ethylovou skupinu, nebo
-alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy a
C múze znamenat:
-atom halogenu a výhodně atom fluoru,
-amino-skupinu, monoalkylamino-skupinu nebo dialkylamino-skupinu, ve kterých alkylový zbytek výhodně znamená methylovou skupinu s podmínkou, že B je odlišný od atomu bromu nebo atomu chloru, nebo substituovanou nebo nesubstituovanou allylovou skupinu,
-etherovou skupinu a výhodně skupinu OR, ve které R výhodně znamená methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo trifluormetnylovou skupinu,
-thioetherovou skupinu a výhodně alkylthio-skupinu, ve které alkylový zbytek znamená methylovou skupinu,
-alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo -trihalogenmethylovou skupinu, výhodně trifluormetnylovou skupinu, a
-pro disubstituované deriváty ortho-para:
Β, E a D znamenají atom vodíku a A a C znamenají methylovou skupinu.
Jako výhodné sloučeniny lze zejména uvést:
4ζ-πιβύιγΙύύο-<1β5(4ζ-άυη6&γΙίΐηΊΐηο) pristinamycin 1^,
4ζ-π^±7ΐ±ΐο-άβ5(4ζ-<ϋηιε±γΐΗΠΐίηο) pristinamycin Ipj.
5y-hydroxy 4ζ-meΐhylthio-<les(4ζ-dimethylammo) pristinamycin· Ijj,
4ζ-methyl-des(4ζ-<ϋmethylamino) pristinamycin 1^,
4ζ-měthyl-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· Ijj.
4ζ-methoxy-děs(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· 1^,
4ζ^β±ο.^1«ώοη>-1-<ΐ63(4ζ-<1ϊπιβύητ^ΐηο) pristinamycin 1^,
4ζ-chlor -des^-dimethylamino) pristinamycin 1^,
4ζ-1)Γθπι des^-dimethylamino) pristinamycin· 1^,
4ζ-0Γ0Γη· -des^-diméthylamino) pristinamycin Ipj,
4ζυοά -des ^-dime thy lamino) pristinamycin· 1^,
4ζ^οά -des^-dimethylamino) pristinamycin Ip|,
4ζ-ίτϊ£1ιΐθΓ methyl-des^-dimethylamino) pristinamycin 1^,
4ζ-ΐτίί1ιΐθΓ methyl-des^-dimethylamino) pristinamycin Ij_£ , 4ζ-tert-butyl-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^, 4ζ-Ϊ3ορπ^1^3(4ζ-<ϋτη&ϋ·ψΐ3Γηΐηο) pristinamycin 1^, 4ζ-ΐ5ορΓορνΙ-άβ3(4ζ-ά1τηβ±νΙαπιίηο) pristinamycin Ig. 4ε-methylamino-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin' 1^, 4e-methoxy-děs^-dimethylamino) pristinamycin' I 4€-methoxy-des (4ζ-diméthylamino) pristinamycin I h4e-fluor 4ζ-ηΐ6±νΙ-θε3(4ξ-ύύη&ύη'ΐ3πώιο) pristinamycin1 I *
4ζ-3Γηίηο-<1β3(4ζ-ύΐπΐ6^ΐΗΐη1ηο) pristinamycin- I a 4ζ-ethylamino-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 4ζ-άιβ±ν^ΐηο-άδ3(4ζ-ύΰη&±ν^ίηο) pristinamycin 1^ 4ζ^11ν^Γηϊηο-άβ5(4ζ-4ΪΓηκϋΊνΐ3Γηίηο) pristinamycin» 1^ 4ζ-diallylamino-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· 1^
4ζ-α1ΙνΙ ethylamino-des^-dimethylamino) pristinamycin· Iá\
4ζ-ethyl propylamino-des^-dimethylamino) pristinamycin 1^
4ξ-βϋινΙ isopropylamino-des^-dimethylamino) pristinamycin· Iá\
4ζ-βύινΙ methylcyclopropylamino-des^-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4ζ-(1-ρνπ·οϋ<ϋηνΙ) -děs^ζ-ύϊτηβϋιν^Γηίηο) pristinamycin 1^
4^-crifluor methoxy-dés ^-dimethylamino) pristinamycin 4ζ-allyloxy-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin4ξ-€ύιοχν-ύέ3(4ζ-άΰηβ thy lamino) pristinamycin 1^
4ζ-ethylthio-děs(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4ζ-ω6ύ^Ιΐίύοηΐ6ύ^1-<1έ3(4ζ<ΙΐπιβΐΙη'·ΐΗηιΐηο) pristinamycin- 1^
4ζ-(2-chlor ethoxy)-des^-diměthylamino) pristinamycin» 1^ 4ζ^βΓνΙ-<ΐ£3(4ζ-ύίπΗ:ϋινΙητηίηο) pristinamycin 1^
4ζ-ethyl-dés(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^
4ζ-ethyl-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin Ij-j 4€-dimethylamino-des^-dimechylamino) pristinamycin 1^ 4£-methylthio-des^-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4£-ethoxy-des^-dimethylamino) pristinamycin·
Vynález se rovněž týká způsobu zejména vhodného pro přípravu sloučenin obecného vzorce I.
Přesněji specifikováno, vynález se týká způsobu přípravy streptograminů, jehož podstata spočívá v tom, že se použije kmen mikroorganismů produkjící streptograminy, mající alespoň jednu genetickou modifikaci postihující biosyntézu prekurzoru streptograminů skupiny V, a v tom, že se uvedený mutantna kmen kultivuje v kultivačním prostředí, které je adekvátní a komplementované alespoň jedním původním prekurzorem, který je jiný než prekurzor,jehož biosyntéza byla pozměněna, v tom, že se izolují uvedené streptograminy.
Kmeny použitými v rámci vynálezu jsou tedy mutovanými kmeny produkujícími streptograminy. Uvedená genetická modifikace nebo uvedené genetické modifikace mohou být lokalizovány buď v úrovni genů uplatňujících se při biosyntéze uvedených prekurzorů nebo mimo kódující oblast, například v oblasti zodpovědné za expresi nebo/a transkripční nebo post-transcripční regulaci uvedených genů anebo v oblasti náležející k transkriptu obsahujícímu uvedené geny.
Podle specifického způsobu provedení vynálezu mají mutantní kmeny jednu nebo několik genetických modifikací v úrovní alespoň jednoho z jejich genů uplatňujících se biosyntéze prekurzorů streptograminů skupiny B.
Uvedená nebo uvedené genetické modifikace pozměňují expresi uvedeného genu, to znamená činí tento gen a případně další geny uplatňující se při biosyntéze prekurzorů částečně nebo zcela neschopnými kódovat přírodní enzyl uplatňující se při biosyntéze alespoň jednoho prekurzoru.
Neschopnost uvedených genů kodovat přírodní proteiny se může projevit buď produkcí neaktivního proteinu v důsledku strukturních nebo konformačnícn modifikací nebo absencí produkce nebo produkcí proteinu majícího změněnou enzymatickou účinnost nebo ještě produkcí přírodního proteinu ve zmenšené míře. Soubor těchto možných projevů má za následek zhoršení nebo dokonce zablokování v úrovni syntézy alespoň jednoho z prekurzorů streptograminů skupiny B.
Geny, schopnými mutace v rámci vynálezu, jsou výhodně geny uplatňující se při biosynfcéze následujících prekurzorů: kyselina L-2-aminomáselná, 4-dimethylamino-L-fenylalanin (DMPAPA), kyselina L-pipekolová, L-fenylglycin nebo/a kyselina 3-hydroxypikolinová (3-HPA).
Výhodněji se jedná o geny papA, papM, papB (SEQ ID č.3), papC (SEQ ID č.2), hpaA (SEQ ID č.8), snbF (SEQ ID č.6) a pipA (SEQ ID č.5), které budou popsány dále.
Pokud jde o geny papA a papM, jsou tyto geny popsané v mezinárodní patentové přihlášce PCT/FR93/0923. Tyto geny jsou přítomné v kosmidu pIBV2. Gen papA patrně odpovídá genu biosyntézy 4-amino-L-fenylalaninu z chorismatu. 4-Amino-L-fenylalanin se potom dimethyluje produktem genu papM, kterým je N-methyltransřeráza, za vzniku 4-dimethylamino-L-fenylalaninu (DMPAPA, který se potom inkorporuje do prostinamycinu 1^. Tyto dva geny tedy specifičtěji zasahují v úrovni syntézy prekurzoru, kterým je uvedený DMPAPA.
Pokud se jedná o ostatní geny papB, papC, pipA, snbF a hpaA, tyto geny jsouidentifikovány a charakterizovány v rámci vynálezu. Tyto geny jsou seskupeny s geny snbA, papA a papM v chromosomální oblasti asi 10 kb (obr.7).
Sekvenční homologie prokázané pro proteiny PapB a PapC ukazují, že tyto proteiny se rovněž uplatňují při biosyntéze prekurzoru DMPAPA a to společně s proteiny PapA a PapM.
Oba nové korespondentní geny papB a papC byly izolovány a identifikovány subklonováním provedeným z kosmidu pI3V2, popsaného v mezinárodní patentové přihlášce PCT/FR93/0923, a plasmidu pVRC900, odvozeného z pIBV2 delecí HindlII a rovněž popsaného v uvedené mezinárodní patentové přihlášce PCT/FR93/0923.
Ze srovnání proteinu kódovaného genem papC s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro vyplývá 27% homologie s oblastí uplatňující se na aktivitě prifenát-dehydroge10 názy bifunkčních proteinů TyrA z Escherichia coli (Hudson a Davidson, 1984) a z Erwinia herbicola (EMBL data library,1991). Tato oblast TyrA katalyzuje aromatizaci prefenátu na 4-hydroxyfenylpyrohroznan při biosyntéze tyrosinu. Obdobná aromatizace vycházející z 4-deoxy-4-aminoprefenátu a vedoucí k 4-aminofenylpyrohroznanu působí velmi pravděpodobně i při syntéze DMPAPA. Byla by katalyzována proteinem PapC (SEG ID č.2).
Pokud jde o protein PapB, má tento protein 24 až 30% homologii s oblastí uplatňující se v rámci aktivity chorismat-mutázy bifunkčních proteinů TyrA a PheA z Escherichia coli (Hudson a Davidson, 1984) a proteinu TyrA z Erwinia herbicola. Tato oblast katalyzuje izomeraci chorismatu na prefenát při biosyntéze tyrosinu a fenylalaninu. Protein PapB (SEQ ID č.3) působí pravděpodobně v obdobné izomerační úrovni vycházející z 4-deoxy-4-aminochorismatu a vedoucí k 4-deoxv-4aminoprefenátu při syntéze DMPAPA.
Pokud jde o geny pipA, snbF a hpaA, tyto geny byly lokalizovány v oblastech obsažených mezi genem snbA kódujícím kyselinu 3-hydroxypikolinovou/AMP-ligázu, popsanou v mezinárodní patentové přihlášce PCT/FR93/0923, a geny papA nebo snbR. Tyto byly přesně lokalizovány sub-klonováním provedeným z plasmidu pVRC900 a kosmidu pIBV2, které jsou popsané v mezinárodní patentové přihlášce PCT/FR93/0923.
Ze srovnání proteinu kódovaného, genem hpaA a proteinových sekvencí obsažených v bance Genpro byla prokázána 30 až 40% homologie se skupinou proteinů, která se pravděpodobně uplatňuje (Thorson a kol., 1993) při transaminaci meziproduktů biosyntézy různých antibiotik (DnrJ, EryC1, TylB, StrS, PrgL). Syntéza prekurzoru 3-HPA, který je pravděpobně odvozen od lysinu, jinou cestou, než je cyklodeaminace (viz příklady 1-2 a 2-1), pravděpodobně vyžaduje transaminační etapu schopnou katalýzy produktem tohoto genu nazvaným hpaA (SEQ ID č.8). Výsledky mutace provedené v tomto genu ukazují ostatně jasné uplatnění tohoto genu při syntéze prekurzoru 3-HPA.
Ze srovnání produktu kódovaného genem označeným jako pipA s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro vyplývá 30% homologie s ornithin-cyklodeaminázou z Agrobacterium tumefasciens (Scnindler a kol. 1989). Tento enzym působí· v poslední etapě katabolismu oktopinu a převádí L-ornithin na Lprolin mechanismem cyklodeaminace. Autoři prokázali inkorporací značeného lysinu, že kyselina 4-oxopipecolová a kyselina 3-hydroxypikollnová, nalezené jak v tak i ve virginiamycinu S1, jsou odvozené od lysinu (Molinero a kol.,1989, Reed a kol., 1989. Cykiodeaminační reakce lysinu obdobná s reakcí popsanou pro ornithin by vedla k tvorbě kyseliny pipekolové.
Když byla vzata v úvahu tato hypotéza, byl tento produkt označen jako PipA (SED ID č.5). Výsledky mutace v genu pipA, uvedené v dále zařazených příkladech, ukazují na skutečnost, že se uvedený gen pipA uplatňuje při samotné syntéze kyseliny pipekolové. Je třeba uvést, že tato mutace neovlivňuje biosyntézu kyseliny 3-hydroxypikolinové, která je také odvozena od lysinu a jejímž prekurzorem by mohla být kyselina pipekolová.
Konečně ze srovnání produktu genu označeného jako snbF s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro byla zjištěna 30 až 40% homologie s několika hydroxylázami typu cytochrom P450, uplatňujícími se při biosyntéze sekundárních metabolitů (Omer a kol., 1990, Trower a kol.,1992). Některé hydroxylace lze předpokládat při biosyntéze prekurzoru pristinamycinu I, zejména v úrovni biosyntézy 3-HPA (hydroxylace v poloze 3 kyseliny pikolinové) a kyseliny 4-oxopipekolové (hydroxylace v poloze 4 kyseliny pipekolové). Odpovídající protein byl označen jako SnbF (SEQ ID č.6).
Výsledky mutace v genu pipA s polárními účinky na expresi genu snbF ukazují na působení genu snbF při hydroxylaci zbytku kyseliny pipekolové streptograminů skupiny B. Takto je exprese genu snbF modifikována v důsledku genetické modifikace v úrovni genu pipA.
Výhodně uvedená genetická modifikace nebo uvedené genetické modifikace činí uvedený gen částečně nebo zcela neschopným kódovat přírodní protein.
Genetickou modifikací je třeba rozumět zejména jakoukoliv supresi, substituci, deleci nebo adici jedné nebo několika bází v uvažovaném genu nebo v uvažovaných genech. Takových modifikací může být dosaženo in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, například za použití technik genového inženýrství, nebo také vystavením uvedených mikroorganismů účinku mutagenních činidel. Jako taková mutagenní činidla lze například uvést fyzikální činidla, jakými jso-'ύ energetická záření (rentgenové záření, gama-záření, ultrafialové záření a pod.), nebo chemická činidla, která jsou schopná reagovat s různými funkčními skupinami bází DNA a kterými jsou například alkylační činidla /ethylmethansulfonát (EMS), N-methyl-Ν'-nitro-N-nitrosoguanidin, N-nitrochinolin-1-oxid (NQO)/, bialkylační činidla, interkalační činidla, atd.. Deleci se rozumí jakékoliv potlačení části nebe celku zvažovaného genu. Může se zejména jednat o oblast kódující uvedené proteiny nebo/a o celou promoční oblasr nebo o část promoční oblasti transkripce, translace nebo také transkriptu.
Genetických modifikací může být také dosaženo genovou poruchou, realizovanou například podle protokolu původně popsaného Rothsteinem /Meth. Enzymol. 101 (1983) 202/ nebo výhodně dvojitou homologovou rekombinací. V tomto případě nudě kódující sekvence přerušena, aby bylo případně umožněno nahrazení homologovou rekombinací divoké genomová sekvence nefunkční nebo mutantni sekvencí.
V rámci jiného alternativního provedení vynálezu mohou uvedené genetické modifikace spočívat v zavedení genu nebo genů kódujících uvedené proteiny pod kontrolou regulovaného promotoru.
Mutantni kmeny mikroorganismů podle vynálezu mohou být získány z libovolného mikroorganismu produkujícího streptograminy (viz tabulka V). Podle specifického provedení vynálezu se jedná o kmen odvozený od S. pristinaespiralis a zejména od
S. pristinaespiralis SP92.
Jako výhodný mutantní kmen může být v rámci vynálezu zejména uveden kmen SP92::pVRC508, mutovaný při biosyntéze prekurzoru DMPAPA přerušením mechanismem crossing-over genu papA nebo kmen SP212 mutovaný při biosyntéze prekurzoru DMPAPA přerušením genu papA mecnanidme dvojitá homologové rekombinace. Tyto kmeny již neprodukují PI s výjimkou případu, kdy jsou komplementovány prekurzorem DMPAPA. Neočekávaně bylo zjištěno, že když se do produkčního prostředí přidá původní prekurzor odlišný od DMPAPA a schopný po případné metabolizaci inkorporace PI-syntetázou (protein SnbD odpovídající za inkorporaci zbytků L-prolin a DMPAPA), potom se oba tyto stávají schopnými produkovat nové pristinamyciny I nebo virginiaamyciny nebo produkovat majoritně složku, která je normálně minorit ní složkou PI, zejména složku PIg (obr.2).
V rámci vynálezu byly připraveny dva další mutantní kmeny. Jedná se o kmen SP92pipA: iRam přerušený v genu pipA homologovou rekombinací a kmen SP92hpaA: :$2am přerušený v genu hpaA. Kmen SP92pipA:^am jednak již neprodukuje PI za standardních fermentačních podmínek a jednak v přítomnosti kyseliny pipekolové umožňuje vysokou produkci původně minoritní slož ky složek B streptrograminů, ve kterých je kyselina 4-oxopipekolová nahražena kyselinou L-pipekolovou. Pokud jde o kmen S.pristinaespiralis SP92hpaA:^am , také tento kmen již za standardních £ermentačních podmínek neprodukuje PI, ale je schopen produkovat nové streptograminy skupiny B v přítomnosti původních prekurzorů.
Ukazuje se, že je možné komplementací kultivačního prostředí obsahujícího mutantní kmeny podle vynálezu alespoň jedním původním prekurzorem orientovat biosyntézu buď směrem k no vým streptograminům nebo k jedné z minoritních forem anebo privilegovat tvorbu jedné z nich.
Prekurzory použitými v rámci vynálezu mohou být deriváty nebo analoga aminokyselin a zejména £enylalani.nu, jakož i organických kyselin a zejména alfaketokarboxylových kyselin a zejména deriváty kyseliny fenylpyrohroznové.
Původním prekurzorem je samozřejmě takový prekurzor, který způsobí pozměnění nebo dokonce blokádu v rámci vynálezu v úrovni biosyntézy jednoho z přirozených prekurzorů streptograminů skupiny Β , což vede k syntéze streptograminů. V rámci specifického provedení vynálezu se tento původní prekurzor zvolí tak, aby byl blízký prekurzoru, jehož syntéza je pozměněna. Takto ve specifickém případě mutantu blokovaného při biosyntěze DMPAPA je původním prekurzorem výhodně derivát fenylalaninu.
Jako prekurzory, které mohou být vhodné pro použití v rámci vynálezu, lze zejména úvést následující prekurzory: fenylalanin,
4-dimethylaminofenylalanin,
4-methylaminofenylalanin,
4-aminofenylaianin,
4-diethylaminofenylaianin,
4-ethylaminofenylaianin,
4-methyIthiofenylalanin,
4-methylfenylaianin,
4-methoxyfenylaianin,
4-trifluormethoxyfenylalanin,
4-methoxykarbonylfenylaianin,
4-chlorfenylalanin,
4-bromfenylaianin,
4-jodfenylaianin,
4-trifluormethylfenylalanin,
4-terč.butylfenylalanin,
4-isopropylfenylalanin,
3-methylaminofenylalanin,
3-methoxyfenylaianin,
3-methyIthiofenylalanin,
3-fluor-4-methylfenylalanin, kyselina L-pipekolová, kyselina 4-terc.butylfenylpyrohroznová, kyselina 4-methylaminofenylpyrohroznová,
2- naftyIrenylalanin,
4-fluorfenylalanin,
3- fluorfenylalanin,
3-ethoxyfenylalanin,
2.4- dimethylfenylalanin,
3.4- dimethylfenylalanin,
3- methylfenylalanin,
4- fenylfenylalanin,
4-butylfenylalanin,
2- thienyl-3-alanin,
3- trifluormethy1fenylalanin, hydroxyfenylalanin,
3- ethylaminofenylalanin,
4- allylaminofenylalanin,
4-dialiylaminofenylalanin,
4-allylethy1aminofenylalanin,
4-ethylpropylaminofenylalanin,
4-ethylisopropylaminofenylalanin,
4-ethyImethyIcyklopropylaminofenylalanin, 4-(1-pyrrolidinyl)£enylalanin, 4-0-allyltyrosin,
4-O-ethyltyrosin,
4-ethyIthiofenylalanin,
4-ethylthiomethylfenylalanin,
4-0-(2-chlorethyl)tyrosin,
4-acetylfenylalanin,
4-ethylfenylalanin,
3-dimethylaminofenylalanin,
3-dimethylaminofenylalanin,
3-ethoxyfenylalanin,
3- fluor-4-methylfenylalanin a
4- amincmethylfenylalanin.
Z těchto prekurzoru jsou 4-trifluormethoxyfenylalanin,
3- methylaminofenylalanin, 3-methylthiofenylalanin, 3-fluor4- methylfenylalanin, kyselina 4-methylaminofenylpyrohroznová,
3- ethoxyfenylalanin, 4-allylaminofenylalanin, 4-diallylamino£enylalanin., 4-allylethylaminofenylalanin, 4-ethylpropylaminofenylalanin, 4-ethylisopropylaminofenylalanin, 4-ethylmethylcyklopropylaminofenylalanin, 4-(1-pyrrolidinyl)fenylalanin,
4- ethylthiomethylfenylalanin, 4-0-(2-chlorethyl)tyrosin, 3-dimethylaminofenylalanin a 3-ethylaminofenylalanin novými látkami, které byly připraveny a charakterizovány v rámci vynálezu.
Tyto prekurzory se ukázaly obzvláště užitečnými pro přípravu streptograminů podle vynálezu.
Nárokovaný způsob se ukázal obzvláště zajímavým pro přípravu nových streptograminů skupiny B nebo také pro privilegovanou tvorbu některých z nich. Tento způsob je obzvláště vhodný pro přípravu PIB.
Předmětem vynálezu je rovněž nukleotidová sekvence zvolená z množiny zahrnující:
a) celek nebo část genů papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3) pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.6) a hpaA (SEQ ID
č.8) ,
b) hybridní sekvence s celkem nebo částí genů a) a
c) sekvence odvozené od sekvencí a) a b) v důsledku degenerace genetického kódu.
Ve specifickém případě hybridních sekvencí b), tyto sekvence výhodně kódují polypeptid uplatňující se při biosyntéze streptograminů.
Ještě výhodněji jsou předmětem vynálezu nukleotidové sekvence reprezentované geny papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.6) a hpaA (SEQ ID č.8).
Další předmět vynálezu se týká rekombinantní DNA obsahující gen papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pípB (SEQ ID
č.3), pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.6) a hpaA (SEQ ID č,8).
Výše definované nukleotidové sekvence mohou být samozřejmě součástí vektoru typu expresního vektoru, který může být vektorem s autonomní nebo integrační replikací nebo sebevražedním vektorem (vecteur suicide). Vynález se rovněž vztahuje na tyto vektory, jakož i na libovolné použití sekvence podle vynálezu nebo odpovídajícího vektoru, zejména pro přípravu zajímavých metabolitů. Vynález se kromě toho vztahuje na libovolný polypeptid rezultující z exprese nárokované sekvence .
Vynález se rovněž týká libovolného mutovaného kmene S. pristinaespiralis, který má alespoň jednu genetickou modifikaci v úrovni některého z genů papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.6) a hpaA (SEQ ID č.8) a zejména kmenů SP92pipA:: am , SP92hpaA:: am , jakož i kmene S. pristinaespiralis majícího genetickou modifikaci spočívající v přerušení genu papA dvojitou homologovou rekombinací, jakým je SP212.
Kombinace složky streptograminů skupiny A a sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu tvoří kompozice, které jsou obzvláště zajímavé v terapeutické oblasti. Tyto kompozice jsou zejména používané pro léčení nemocí způsobenými Gram-pozitivními bakteriemi ( rodů Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcu a Enterococcus) a Gram-negativních bakterií (rodů Haemophilus, Gonococcus, Meningococcus). Sloučeniny podle vynálezu takto synergizují antibakteriální účinek pristinamycinu 113 na Staphy lococcus aureus IP8203 in vivo u myší při dávkách, které se v podstatě pohybují mezi 30 mg/kg a 100 mg/kg pro perorální podání v případě, že jsou kombinovány v poměru PI/PII rovném asi 30:70.
Vynález se vztahuje na každou farmaceutickou kompozici obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I v případ né kombinaci se streptograminem skupiny A.
V následující části popisu bude vynález blíže popsán pomocí příkladů jeho konkrétního provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.
Stručný popis obrázků
Na připojených výkresech obr.l znázorňuje strukturu pristinamycinu 1^, obr.2 znázorňuje strukturu minoritních složek pristinamycinu I, obr.3 znázorňuje příklady struktur složek B streptograminů, obr.4 znárorňuje zobrazení oblasti Pstl-Xhol s 2,9 kb, obr.5 znázorňuje zobrazení oblasti Xhol-Pstl s 4,5 kb, obr.6 znázorňuje zobrazení oblasti HindIII-BglII s 1,6 kb, obr.7 znázorňuje zobrazení oblasti BglII-XhoI s asi 10 kb, obr.8 znázorňuje zobrazení plasmidu pVRC415, obr.9 znázorňuje zobrazení plasmisu OVRC420, obr.10 znázorňuje zobrazení plasmidu pVRC411, obr.11 znázorňuje zobrazení plasmidu pVRC421, obr.12 znázorňuje zobrazení plasmidu pVRC414 a obr.13 znázorňuje strategii konstrukce SP212.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Sekvencování a identifikace genů uplatňujících se při biosyntéze pristinamycinu I a jeho prekurzorů
Identifikace sekvencováním genů situovaných za a před genem kódujícím enzym PapA popsaná v patentu PCT/FR93/0923, jakož i genu umístěného za genem kódujícím enzym SnbA, rovněž popsaná v patentu PCT/FR93/0923.
Tento příklad popisuje, jak je možné z kosmidu pIBV2, popsaného v patentu PCT/FR93/0923 a obsahujícího strukturní geny enzymů PapA a PapM intervenující do syntézy prekurzoru 4-dimethylamino-L-fenylalaninu (DMPAPA) pristinamycinu I a strukturní gen enzymu SnbA zodpovědný za aktivaci aromatického prekurzoru pristinamycinu I, kterým je kyselina 3-hydroxy19 pikolinová (3-HPA), identifikovat sekvencováním okolo uvedených genů a studií odpovídajících mutantů i ostatní geny uplatňující se při biosyntéze prekurzorů DMPAPA nebo při biosyntéze dalších prekurzorů pristinamycinů I.
Za tímto účelem byla provedena subklonování vycházející z kosmidu pIBV2 a plasmidu pVRC900, odvozeného od pIB72 delecí HindlII a rovněž popsaného v patentu PCT/FR93/0923.
Tento příklad ilustruje, jak mohou být získány nukleotidové sekvence fragmentů situovaných za a před geny papA a snbA z S.pristinaespiralis.
Techniky klonování uvažovaných fragmentů DNA ve vektorech M13mp18/19 (Messing a kol.,1981) jsou klasickými klonovacími technikami v Escherichia coli, které jsou popsané v Maniatis a kol. (1989).
1-1 Sekvencování a analýza oblasti za genem papA
Za účelem sekvencování této oblasti, obsažené mezi geny papA a papM, byly fragmenty Pstl-Pstl s 1,5 kb, Pstl-Xhol s 0,7 kb a Xhol-Xhol s 0,7 kb subklonovány ve vektorech M13mp18 a M13mp19, přičemž se vychází z plasmidu pVRC900. Klonovací místa byla traverzována sekvencováním na dvouřetězcové DNA za použití plasmidů pTRC900 a pVRC409, popsaných v patentu PCT/FR93/ 0923. Uvedená klonování byla provedena následujícím způsobem. Asi 2/ug plasmidu pVRC900 bylo štěpeno restrikčním! enzymy Pstl nebo/a Xhol (New England Biolabs) za podmínek uvedených dodavatelem. Takto získané restrukční fragmenty byly separovány na 0,8% agarosovém gelu, přičemž se požadované fragmenty Pstl-Pstl s 1,5 kb, Pstl-Xhol s 0,7 kb a Hhol-Xhol s 0,7 kb izolují a přečistí systémem Geneclean (BiolOI, La Jolla, Californie). Pro každé klonování se asi 10 ng M13mp19 nebo/a M13mn18 štěpených za použití Pstl nebo/a Xhol váže 100 ng fragmentu ke klonování za podmínek popsaných Maniatisem a kol,1989.
Po transformaci kmene TG1 (K12, delta(lac-pro) supE thi hsd deltaS F traD36 proA+B+ laclq lacZ deltaM15, Gibson, 1984) a selekci oblastí lyže na prostředí LB+X-gal+IPTG technikou popsanou Maniatisem a kol. (1989) se izolují fagy nesoucí požadované fragmenty. Jednotlivé inzerty byly sekvencovány metodou terminace řetězce za použití ve funkci iniciátoru syntézy univerzálního primerů nebo syntetických a komplementárních oligonukleotidů sekvence 20 nukleotidů inzertu k sekvencování. Reakce byly provedeny za použití fluoresvenčních dideoxynukleotidů (Prism Ready Reaction DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequncing Kit-Applied Biosystem) a analyzovány na zařízení pro sekvencování DNA typu Applied Biosystems Model 373A. Vykrytí mezi těmito různými inzerty umožnilo sestavit celou nukleotidovou sekvenci přítomnou mezi geny papA a papM (SEQ ID č. 1 ) .
Z této nukleotidové sekvence je možné stanovit čtecí otevřené fáze a identifikovat takto geny uplatňující se při biosyntéze Pl nebo jeho prekurzorů u S.pristinaespiralis, jakož i polypeptidy kódované těmito geny.
Byla zkoumána přítomnost otevřených čtecích fází vsfragmentu Pstl-Xhol s 2,9 kb obsahujícím nukleotidovou sekvenci mezi geny papA a papM, přičemž se využívá skutečnosti, že DNA ze Streptomyces obsahuje vysoký procentický podíl bází G a C, jakož i vhodného použití kodonů, které tvoří kódující fáze /Bibb a kol. 1984). Metoda Stadena a Mc Lachlana (1982) umožňuje vypočítat pravděpodobnost kódujících fází v závislosti na použití kodonů genů Streptomyces již sekvencovaných a shrnutých v souboru obsahujícím 19673 kodonů získaných z informační báze Bosance (Dessen a kol.).
Tato metoda umožňuje ve fragmentu Pstl-Xhol s 2,9 kb charakterizovat čtyři silně pravděpodobné oevřené čtecí fáze, které jsou uvedeny v následující tabulce (Tabulka I). Tyto fáze jsou označeny jako fáze 1 až 4 podle jejich polohy od místa Pstl. Pro každou z těchto fází je uvedena její délka co do počtu bází a její poloha ve fragmentu (místo Pstl je situováno v poloze 1). Pro otevřené čtecí fáze 2 a 3 je rovněž uveden počet aminokyselin kódovaného polypeptidů. Fáze 1, 3 a 4 jsou kódované stejným řetězcem a fáze 2 je kódována komplementárním řetězcem (obr.4). Fáze 1 a 4 odpovídají C-terminální oblasti proteinu PapA resp. N-terminální oblasti proteinu PapM, které předtím byly identifikovány a popsány v patentu PCT/FR93/OO923.
Tabulka I
Číslo fáze nebo/a označení genu Poloha Počet nukleotidů Počet aminokyselin
1 (PapA) 1 -634 684 -
2 (PapC)(inv) 949-1336 833 296
3 (PapB) 1873-2259 387 1 29
4 (PapM) 2259-2387 629 -
Ze srovnání produktu fáze 2 (tabulka I) s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro vyplývá 27% homologie s oblastí uplatňující se v rámci aktivity prefenát-dehydrogenázy bifunkčních proteinů TyrA odvozených od Escherichia coli (Hudson a Davidson, 1984) a od Erwinia herbicola (EMBL datová banka,1991). Tato oblast TyrA katalyzuje aromatizaci prefenátu na 4-hydroxyfenylpyrohroznan při biosyntéze tyrosinu. Obdobná aromatizace vycházející z 4-deoxy-4-aminoprefenátu a vedoucí k 4-aminofenyIpyrohroznanu probíhá velmi pravděpodobně při syntéze prekurzoru DMPAPA. Tato reakce by byla katalyzová na produktem fáze 2, označeným jako PapC (SEQ ID č.2).
Ze srovnání produktu fáze 3 (Tabulka I) s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro vyplývá 24 až 30% homologie s oblastí uplatňující se v rámci aktivity chorismat-mutázy bifunkčních proteinů TyrA a PheA odvozených od Escherichia coli (Hudson a Davidson, 1984) a proteinu TyrA odvozeného od Erwinia herbicola. Tato oblast katalýzuje izomeraci chorismatu na prefenát při biosyntéze tyrosinu a fenylalaninu.
Obdobná izomerace vycházející z 4-deoxy-4-aminochorismatu a vedoucí k 4-deoxy-4-aminoprefenátu velmi pravděpodobně působí při syntéze prekurzoru DMPAPA. Tato reakce by byla katalyzována produktem fáze 3, označovaným jako PapB (SEQ ID č.3).
V případě TyrA a PheA jsou aktivity chorismat-mutázy a prefenát-dehydratázy nebo prefenát-dehydrogenázy katalyzovány stejným proteinem. U S.pristinaespiralis jsou enzymatické aktivity chorismat-mutázy a prefenát-dehydrogenázy katalyzovány dvěma různými proteiny a sice PapB a PapC.
Sekvenční homologie prokázané pro proteiny PapB a PapC ukazují, že se tyto dva proteiny uplatňují při biosyntéze aromatického derivátu DMPAPA a to společné s proteiny PapA a PapM. Stejně tak jako v případě papA musí přerušení (disruption) genů papB a papC vést ke konstrukci kmenů S.pristinaespiralis, které nejsou schopné produkovat PI, ale jsou schopné produkovat v přítomnosti původních prekurzoru nové PI modifikované v úrovni zbytku DMPAPA.
1-2. Sekvencování a analýza oblasti před genem papA
Tato oblast je obsažena mezi genem snbA kódujícím enzym kyselina 3-hydroxypikolinová-AMP-ligázu, popsaný v PCT/ FR93/00923, a genem papA.
Klonování byla provedena způsobem popsaným v příkladu
1-1, přičemž se vycházelo z plasmidu pVRC900 a kosmidu pIBV2, popsaných v patentu PCT/FR93/00923. Fragmenty Xhol-Xhol s
1,3 kb, Xhol-Xhol s 0,2 kb, Xhol-Xhol s 3,3 kb, HindlII-Pstl s 1,1 kb Pstl-PstI s 2,2 kb byly subklonovány do vektorů M13mp18 a M13mp19. Tato různá klonování umožnila travsrzovat všechna klonovací místa. Jednotlivé inzerty byly sekvenco vány způsobem popsaným v příkladu 1-1, přičemž jako iniciátor syntézy byl použit univerzální primer nebo komplementární syntetické oligonukleotidy sekvence 20 nukleotidů inzertu k sekvencování.
Pokrytí mezi různými inzerty umožnilo stanovit celkovou nukleotidovou sekvenci přítomnou mezi geny snbA a papA (SEQ ID č.4).
Z této nukieotidové sekvence je možné stanovit otevřené čtecí fáze a identifikovat geny uplatňující se při biosyntéze prekurzorů produktů PI z S.pristinaespiralis, jakož i po lypeptidy kódované těmito geny.
Byla zkoumána přítomnost otevřených čtecích fází uvnitř fragmentu Xhol-Pstl s 4,5 kb obsahujícím nukleotidovou sekvenci mezi geny snbA a papA, jak to již bylo popsáno v příkladu 1-1. Tato metoda umožnila charakterizovat uvnitř fragmentu Xhol-Pstl s 4,5 kb čtyři silně pravděpodobné otevřené čtecí fáze, které jsou uvede v následující tabulce (tabulka II). Tyto fáze jsou označeny jako fáze 1 až 4 podle jejich polohy od místa Xhol. Pro každou z těchto fází je zde uvedena její délka co do počtu bází a její poloha uvnitř fragmentu (přičemž místi Xhol je situováno v poloze 1). Pro otevřené čtecí fáze 2 a 3 je rovněž uveden počet aminokyselin kódovaného polypeptidu. Fáze 2, 3 a 4 jsou kódovány stejným řetězcem a fáze 1 je kódována komplementárním řetězcem (obr.5). Fáze 1 a 4 odpovídají N-terminální oblasti proteinů SnbA a PapA, které byly předtím identifikovány a popsány v v patentu PCT/FR93/00923.
Tabulka II
Číslo fáze nebo/a označení genu Poloha Počet nukleotidů Počet aminokyselin
1 (SnbA)(inv) 1-329 329 -
2 (PipA) 607-1671 1065 355
3 (SnbF) 1800-2993 1 194 398
4 (PapA) 3013-4496 1479 -
Ze srovnání produktu fáze 2 (Tabulka II) s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro vyplývá 30% homologie s ornithin-cykoodeaminázou odvozenou od Agrobacterium tumefasciens /Schindler a kol. 1989). Tento enzym působí při poslední etapě katabolismu oktopinu, přičemž převádí L-otnithin na L-prolin mechanismem cyklodeaminace. Autoři prokázali inkorporaci značeného lysinu., že kyselina 4-oxopipekolová a kyselina 3-hydroxypikolinová, nalezené jak v PI^, tak i ve virginiamycinu S1, jsou odvozeny od lysinu (Molinero a kol., 1989, Reed a kol·., 1989). Cyklodeaminační reakce Lysinu obdobná s reakcí popsanou pro ornithin by vedla k tvorbě kyseliny pipekolové. Při přijmuté této hypotézy byL produkt fáze 2 označen jako PipA (S2Q ID č.5). Výsledky mutace v genu pipA, uvedené v 2-1, ukazují působení genu pipA při samotné syntéze kyseliny pipekolové, nebot tato mutace neovLivňuje byiosyntézu kyseliny 3-hydroxypikolinové, od které je odvozen také lysin a jejímž prekurzorem by mohla být kyselina pipekolové.
Ze srovnání produktu fáze 3 (Tabulka II) s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro vyplývá 30 až 40% homologie s několika hydroxylázami typu cytochromu P450 uplatňujícími se při biosyntéze sekundárních metabolitů (Omer a kol. 1990, Tower a kol., 1992). Při biosyntéze prekurzorů pristinamycinu I sa předpokládá několik hydroxylací, zejména v úrovni biosyntézy 3-HPA (hydroxylace v poloze 3 kyseliny pikolinové) a kyseliny 4-oxopipekolové (hydroxylace v poloze 4 kyseliny pipekolové). Výsledky mutace v genu pipA, uvedené v 2-1-3, ukazují na působení produktu fáze 3 při hydroxylací zbytku kyseliny pipekolové produktu PI_. Odpovídající gen byl tedy označen jako snbF a odpovídající protein jako SnbF (SEQ ID č.6).
1-3. Sekvencování oblasti za genem snbA
Tato oblast je obsažena mezi genem snbA kódujícím enzym Kyselina 3-hydroxypikolinová-adenylát-ligázu a genem snbR kódujícím menbránový protein, který je pravděpodobně zodpovědný za transport a rezistenci k PI, přičemž oba dva geny jsou popsány v patentu PCT/FR93/00923. Sekvence byly realizovány z izolovaného fragmentu kosmidu pI3V2, jak je to popsáno v příkladu 1-1.
Fragment HindIII-BgLII s 1,6 kb byl subklonován do vekto rů M13mp13 a M13mp19 z kosmidu pI3V2. Inzert byl sekvencován způsobem popsaným v příkladu 1-1, přičemž byl jako iniciátor syntézy použit univerzální primer nebo komplementární syntetické oligonukleotidy sekvence 20 nukleotidů inzertu k sekvencování. Z takto získané nukleotidové .sekvence (SEQ ID č.7) je možné stanovit otevřené čtecí fáze a identifikovat geny uplatňující se při biosyntéze prekurzorů produktu PI odvozeného od S.pristinaespiralis, jakož i polypeptidy kódované těmito geny. Byla zkoumána přítomnost otevřených čtecích fází uvnitř fragmentu HindlII-BglII s 1,6 kb odpovídájících konci genu snbA v oblasti za tímto genem, jak to bylo popsáno v příkladu 1-1. Byla prokázána úplná otevřená fáze kódovaná stej26 ným řetězcem jako gen snbA (obr.6). Vzhledem k poloze 1 odpovídající místu Hindlll, začíná tato fáze u nukleotidu 249, tj. 30 nukleotidů za koncem genu snbA, a končí u nukleotidu 1481. Její velikost činí 1233 nukleotidů odpovídajících proteinu se 411 aminokyselinami.
Ze srovnání produktu této otevřené fáze s proteinovými sekvencemi obsaženými v bance Genpro vyplývá 30 až 40% homologie se skupinou proteinů pravděpodobně se uplatňujících (Thorson a kol., 1993) při transaminaci meziproduktů biosyntézy různých antibiotik (DnrJ, EryC1, TylB, StrS, PrgL). Syntéza prekurzoru 3-HPA, který se zdá být odvozen od lysinu jiným mechanidmem, než je cyklodeaminace (viz příklady 1-2 a 2-1), by mohla vyžadovat transaminační etapu schopnou katalyzování produktem uvedené fáze 3, označované jako HpaA (SEQ ID č.8). Výsledky mutace v tomto genu, uvedené v 2-2, jednoznačně působení tohoto genu při syntéze prekurzoru 3-HPA a potvrzují výše uvedenou hypotézu.
Geny papB, papC, pipA, snbF a hpaA popsané v rámci vynálezu jsou seskupeny s geny snbA, papA a papM na chromosomální oblasti s asi 10 kb (obr.7). To potvrzuje přítomnost shluku genů uplatňujících se při biosyntéze PI a jeho prekurzorů. Studium oblastí před a za tímto shlukem genů by měla umožnit identifikaci ostatních genů uplatňujících se při biosyntéze prekurzoru produktu PI, zejména L-fenylglycinu a kyseliny L-2-aminomáselné.
Příklad 2
Konstrukce kmenů rekombinovaných přerušením identifikovaných genů
Tento příklad ilustruje, jak je možné prokázat působení genů popsaných v příkladu 1 při biosyntéze prekurzoru pristinamycinů, jakož i konstruovat kmeny S.pristinaespiralis schopné produkovat nové pristinamyciny. Tyto kmeny se získají přerušením genů uplatňujících se při biosyntéze zbytku, který má být substituován, přičemž nové prisinamyciny jsou produkoványkomplementaci těchto mutantů původními prekurzory.
Kmen SP92::pVRC508 použitý v rámci vynálezu pro produkci nových derivátů PI nahražením prekurzoru DMPAPA dalšími molekulami, je poosán v patentu PCT/FR93/0923. Tento kmen rezultuje z přerušení mechanismem crossing-over genu papA uplatňujícího se při biosyntéze prekurzoru DMPAPA a domněle působícího při rané etapě týkající se transaminacs chorismatu Toto přerušení má polární charakter, poněvadž v tomto mutantu je velmi redukována exprese genu papM (PCT/FR93/0923), situovaného 1,5 kb za genem papA a uplatňujícího se při dvojí té methylaci 4-amino-L-fenylalaninu na DMPAPA. Ve skutečnosti stanovení aktivity enzymu methylace 4-amino-L-fenylalaninu (PAPA) na DMPAPA, indikuje pro mutant SP92::pVRC5Q8 pouze aktivitu rovnou 5 % aktivity divokého kmene.
V rámci vynálezu tento kmen SP92::pVRC508 umožňuje za adekvátních komplementačních a fermentačních podmínek produko vat nové pristinamyciny modifikované v úrovni zbytku DMPAPA, jak to bude uvedeno v příkladu 3. Mutanty stejného fenotypu mohou být získány přerušením genů pap3 nebo papC, popsaných v rámci vynálezu.
Obdobným způsobem může být získán další typ kmene S. pristinaespiralis,přerušený v genu papA a mající stejný fenotyp jako kmen 3P92::pVRC508, přerušením mechanismem crossingover genu papA. Tato konstrukce byla provedena za použití výchozího fragmentu DphI-HindlII s 4,6 kb, izolovaného z kosmidu pIBV2 a obsahujícího oblast 3' genu pipA, geny snbF a papA v celku, jakož i část 3' genu papC. Tento fragment byl klonován do sebevražedného'vektoru pDH5, schopného replikovat se pouze u Escherichia coli, avšak nesoucího rezistenční znač kováč (marqueur de resístence) exprimující se u Streptomyces (gen rezistence k thiostreptonu nebo k nohiheptidu, tsr). Tento vektor pDH5 byl vyvinut Wohíebbenem a kol. (1991 Nuciei Acid.Res.19,727-731). Potom byla provedena delece 3cII-3cII s 1,1 kb v genu papA a fragment HindiII-HindlII s 2,2 kb nesoucí gen amR (rezistence ke genecitinu a apramycinu) byl zaveden po doplnění kohezivních .konců. Rekombinantní vektor byl označen jako pVRC414 a je zobrazen na obr.12. Po transformaci kmene produkujícího pristinamyciny piasmidem pVRC4l4 byly izolovány a analyzovány transformanty rezistentní ke geneticinu a citlivé k thiostreptonu. Tyto klony rezultují z dvojité homologové rekombinace mezi oblastmi DNA kmene S.pristinae spiralis plasmidu pVRC414 a odpovídající chromosomální oblastí kmene S. pristinaespiralis tak, jak je popsána na obr.13. Jeden z těchto klonů, byl označen jako SP212. Jeho fenotyp je identický s fenotypem kmene SP92::pVRC508 pokud jde o neschop nost produkce Pl a schopnost produkovat nová antibiotika v př tomnosti původních prekurzorů. Výhodně má tento typ kmene, získaného dvojitým mechanismem crossing-over, lepší stabilitu ve srovnání s kmeny získanými jednoduchým mechanismem crrossing-over.
2-1. Konstrukce mutantu odvozeného od S.pristinaespiralis SP92 přerušeného v genu pippA
Tento příklad ilustruje, jak je možné přerušením genu pipA konstruovat kmen 5.pristinaespiralis, který již neprodukuje Pl za standardních fermentačních podmínek a který je schopný produkovat nové pristinamyciny, modifikované v úrovni zbytku kyseliny 4-oxopipekolové produktu PIA, v případě, že se k fermetačnímu prostředí přidají původní prekurzory.
Jeho konstrukce byla provedena za pomoci sebevražedného vektoru, který se replikuje pouze u Escherichia coli, přičemž tímto vektorem je vektor pUC1318. Tento vektor nenese značkovač rezistence exprimující se u Streptomyces. Jeho přítomnost v genomu Streptomyces může být detekována pouze hybri dací na koloniích.
2-1-1. Konstrukce plasmidu pVRC420
Tento příklad ukazuje, jak je možné konstruovat plasmid nereplikující se u S.prisinaespiralis SP92, který může být použit pro přerušení genu pipA mechanismem dvojité homologové rekombinace.
Plasmid pVRC420 byl konstruhován za účelem realizace chromosomálního mutantu SP92 přerušeného v genu pipA, přičemž se vychází z kosmidu pIBV2, popsaného v patentu PCT/FR93/0923. Kosmid pI3V2 byl štěpen restrikčním enzymem Pstl a po separaci takto generovaných fragmentů elektroforézou na agarosovém gelu (0,8%) se izoluje fragment Pstl-Psrl s 2,8 kb obsahující začátek genů snbA a snbF a celý gen pipA a tento fragment se přečistí systémem Geneclean (Bio101, La Jolla, Kalifornice) . 50 ng vektoru pUC1318 linearizovaného digescí Pstl, bylo vázno s 200 ng fragmentu s 2,8 kb, jak je to popsáno v příkladu 1. Klon nesoucí požadovaný fragment byl izolován po transformaci kmene TG1 a selekci na prostředí LB-i-ampicilin 150/Ug/ml+X-gal+IPTG. Tento rekombinantní plasmid byl označen jako pVRC415 (obr.8). Kazeta obsahující R gen am , kódující rezistenci k apramycinu nebo ke geneticinu (Kuhstoss a kol., 1991) byla takto zavedena na výlučné místo
HindlII plasmidu pVRC415, přičemž toto místo je situováno
530 pb za počátkem genu pipA. Tato konstrukce byla provedena následujícím způsobem. Fragment DNA s 2,5 kb obsahující R gen am , promotor PermE (Bibb a kol., 1985), jakož i 158 prvních aminokyselin genu rezistence k erythromycinu, ermE byl izo lován dvojitou digescí SalI-BglII z plasmidu odvozeného z plasmidů pIJ4026 (nosný plasmid genu ermE pod kontrolou promotoru PermE) a pHP4 5jiam . Po naplnění kohezních konců 5' vystupujících z Sall a BGLII Klenowovým enzymem podle protokolu popsaného Maniatisem a kol, 1989, se fragment obsahující
R gen am klonuje na místo HindlII plasmidu pVRC415, jehož vystupující kohezní konce 5' byly rovněž naplněny Klenowovým enzymem, jak to již bylo popsáno výše. Takto získaný rekombinantní plasmid byl nazván pVRC420. Jeho restrikční mapa je zobrazena na obr. 9.
2-1-2. Izolace mutantu SP92plpA: :&am přerušeného v genu pipA homologovou rekombinací
Tento příklad ilustruje, jak byl konstruován mutant od S.pristinaespiralis přerušen v genu pipA.
Tento mutant byl izolován transformací kmene SP92 sebevražedným plasmidem pVRC420.
Příprava protoplastů, jejich transformace, jakož i extrakce celkové DNA rekombinovaných kmenů byly provedeny způsoby popsanými Hopwoodem a kol. (1985).
Kmen SP92 byl kultivován na prostředí YEME (Hopwood a kol·., 1985): 34% sacharóza, 5 mM MgC^, 0,25% glycin - po dobu 40 hodin při teplotě 30 °C- Mycelium bylo protoplast.ováno v přítomnosti lysozymu a 5 x 1^ug pVRC420 bylo použito pro transformaci (metodou používající PEG) protoplastů. Po etapě jedné noci, kdy proběhla refenerace protoplastů na prostředí R2YE (D.Hopwood a kol., 1985), byly rekombinanty podrobeny selekci rozložením 3 ml prostředí SNA (D.Hopwood a kol.,1985) obsahujícího 1500/Ug/ml geneticinu.
Na 5 provedených transformací bylo izolováno 100 klonů rezistentních ke geneticinu. Tyto rekombinanty rezultují z integrace provedené jednoduchou nebo dvojitou homologovou rekombinací mezi genem pipA neseným chromosomem kmene SP92 a částmi genu pipA obsaženými ve fragmentu s 5,3 kb neseném sebevražedným plasmidem pVRC420. Za účelem selekce rekombinantů získaných dvojitým mechanismem crossing-over (tj. neobsa hu jících ve svém genomu část p(JC1318 plasmidu pVRC420) byly provedeny hydridace na koloniích o 90 klonech, přičemž jako sonda byl použit pUC19 značený v /alfa- P)dCTP, jak to popisu je Maniatis a kol. (1989). Selekcí bylo získáno 10 klonů rezistentních ke geneticinu, avšaj nehydujících vektor pUC19. Spory rekombinantů byly izolovány rozložením a růstem na prostředí HT7+10/Ug/ml geneticinu a opětovným rozložením na stejném prostředí za účelem získání izolovaných kolonií.
Za účelem ověření integrační polohy plasmidu pVRC420 bylo provedeno několik Southernových přenosů s celkovou DNA několika rekombinantních klonů, purifikovaných způsobem popsaným Hopwoodem a kol (1985), a hydridovaných fragmentem Pstl-Pstl s 2,8 kb použitým jako sonda po značeni /alfa- P/dCTP. Získané výsledky potvrzují, že tyto rekombinanty byly získány dvojitým mechanismem crossing-over mezi vektorem pVCR420 a chromosomem kmene SP92, vedoucím k nahrazení fragmentu PstlPstl s 2,8 kb obsahujícím gen pipA fragmentem Pstl-Pstl s 5,3 kb obsahujícím gen pipA přerušený zavedením genu am .
v w R
Jeden z těchto mutantu byl označen jako SP92pipA: :2.am .
2-1-3. Produkce pristinamycinú mutantem SP92pipA::Qam
Tento příklad ilustruje, jak se stanoví, že mutant kmene S.pristinaespiralis SP92 přerušený v genu pipA integrací plasmidů pVR420 jednak již neprodukuje PI za standardních fermentačních podmínek a jednak umožňuje vysokou produkci minoritní formy složek B streptograminů, ve kterých je kyselina 4-oxopipekolová nahrazena kyselinou pipekolovou.
Mutant SP92pipA::$am , jakož i kmen SP92 jako referend ní kmen byly kultivovány v produkčním kapalném prostředí. Fer mentace byla provedena následujícím způsobem: 0,5 ml suspenze spor výše uvedeného kmene se za sterilních podmínek přidá ke 40 ml inokulačního prostředí v Erlenmeyerově baňce o obsahu 300 ml. Uvedené inokulační prostředí je tvořeno 10 g/1 kukuřičného výluhu (Corn Steep), 15 g/1 sacharózy, 10 g/1 síranu amonného, 1 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 3 g/1 chloridu sodného, 0,2 g/1 heptahydrátu síranu hořečnatého a 1,25 g/1 uhličitanu vápenatého. pH se nastaví hydroxidem sodným na hodnotu 6,9 a to ještě před zavedením uhličitanu vápenatého. Erlenmeyerovy baňky se míchají po dobu 44 hodin při teplotě 27 °C v rotační míchačce při 325 otáčkách za minutu. 2,5 ml výše uvedeného prostředí starého 44 hodin se sterilně přidá do 30 ml produkčního prostředí v Erlenmeyerově baňce o obsahu 300 ml. Produkční prostředí je tvořeno 25 g/1 sójové moučky, 7,5 g/1 škrobu, 22,5 g/1 glukózy, 3,5 g/1 krmných kvasnic, 0,5 g/1 síranu zinečnaténo a 6 g/1 uhličitanu vápenatého. pH se nastaví na hodnotí 6,0 kyseLinou chlorovodíkovou a to ještě před zavedením uhličitanu vápenatého. Erlemmeyerovy baňky se míchají po dobu 24, 28 a 32 hodin při teplotě 27 °C. Po uplynutí každého z uvedených časových interva lů se 10 g prostředí zavede do Erlenmeyerovy baňky, do které se potom přidá 20 ml mobilní fáze tvořené 34 % acetonitrilu a 66 % 0,1M roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného (jehož hodnota pH je nastavena 2,9 koncentrovanou kyselinou fosforečnou) a umožňující extrakci pristinamycinů Po promíchání se celý podíl odstředí a prisinamyciny obsažené v supernatantu se stanoví vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií, přičemž se 150/Ul centrifugačního supernatantu zavede na sloupec produktu Nucleosil 5-C8 o rozměrech 4,6 x 150 mm a eluce se prove de eluční soustavou tvořenou směsí 40 % acetonitrilu a 60 % O,1M fosfátového pufru s pH 2,9. Prisinamyciny I se detekují pomocí jejich absorbance v ultrafialovém světle s vlnovou délkou 206 nm.
Získané výsledky ukazují, že za výše uvedených standard nich fermentacnich podmínek mutantní kmen SP92pipA: :2.am nepro dukoval PI a to ani po 24, 28 a 32 hodinách fermentace, zatímco referenční kmen 3P92 produkoval při uvedených třech časových etapách standardní množství PI. Oba uvedené kmeny produkovaly stejné množství PII. Mutantní kmen SP92pipA: :S?am je takto účinně blokován ve stupni biosyntézy PI.
Rovněž byly provedeny komplementární fermentační testy, při kterých byly po 16 kultivace přidány k produkčnímu prostředí různé prekurzory PI a to odděleně nebo společně. Výsledky těchto komplementací umožnily prokázat, že v případě, že se k fermentačnímu prostředí přidá 100 mg/1 kyseliny pipekolové a 100 mg(l DMPAPA a to současně, potom mutantní kmen produkuje normálně minoritní derivát PI a sice PI_ (jehož produkce je nižší než 5 % u kmene SP92) v množství ekvivalentním množství PI produkovaném referenčním kmenem. K takové produkci nedochází v případech, kdy jsou kyselina pipekolová a DMPAPA přidány odděleně. PI^ se liší od PI^(což je hlavní složka PI) nepřítomností ketonové funkce v poloze 4 kyseliny pipekolové. Skutečnost, že komplementace mutantního kmene SP92pipA::Ram může být realizována pour současným přidáním kyseliny pipekolové a DMPAPA, ukazuje, že geny papA a pravdě33 podobně papB a papM byly přerušeny polárním účinkem konstrukce. Ve skutečnost všechny tyto geny jsou situovány za genem pipA a jsou pravděpodobně kontraskriptovány s pipA. Přerušení tohoto posledně uvedeného genu způsobuje tedy i přerušení genů pap a tudíž i absenci syntézy DMPAPA. Skutečnost, že kom plementace mutantního kmene SP92pipA::£am kyselinou pipekolo vou způsobí produkci PI„ a nikoliv produkci PI., vede ke dvěma závěrům: prvním z těchto závěrů je, že konstrukce cyklu PI se děje inkorporací kyseliny pipekolové a nikoliv kyseliny 4-oxo-pipekolové a že k hydroxylaci poskytující ketonovou funkci v poloze 4 se tedy děje až později. Druhým závěrem je, že tato hydroxylace je pravděpodobně realizována enzymem SnbF jehož strukturní gen je situován přímo za genem pipA. Ve skutečnosti evidentní polarita přerušení genu pipA na geny pap implikuje pravděpodobně polární účinek ne gen snbF, který je situován mezi genem pipA a geny pap, což má za následek inhibici hydroxylační funkce zbytku kyseliny pipekolové v ΡΙσ na kyselinu 4-hvdroxvoioekolovou nalezenou v PI a PI (obr.2),
F která se potom oxiduje na kyselinu 4-oxopipekolovou v PI..
A
Realizace takového mutantního kmene umožnila konstruovat kmen S.prisinaespiralis, který je schopen produkovat PI pouze v přítomnosti prekurzoru produktu PI, kterými jsou DMPAPA a kyselina pipekolové, ze kterých je tento kmen schope produkovat,v množství ekvivalentním množství produkovanému nemutantní kmenem, derivát PI, který je normálně minoritním derivátem v pristinamycinové směsi. Stejně tak v přítomnosti původních prekurzorů nebo směsi původních prekurzorů a prekur zorů normálně přítomných v PI bude moc tento kmen produkovat nové pristinamyciny modifikovanými v jednom nebo druhém anebo v obou zbytcích DMPAPA a kyseliny 4-oxopipekolové.
2-2. Konstrukce mutantního kmene S.pristinaespiralis SP92 přerušeného v genu hpaA
Tento příklad ilustruje, jak je možné přerušením genu hpaA konstruovat kmen S.pristinaespiralis SP92, který nepro34 dukuje PI za normálních standardních fermentačních podmínek a který je schopen produkovat nové pristinamyciny modifikované v úrovni prekurzoru 3-HPA v případě, že se k fermentačnímu prostředí přidají původní prekurzory.
Konstrukce uvedeného kmene byla provedena pomocí plasmidu, který se nereplikuje u S.pristinaespiralis SP92 a který může být použit pro přerušení genu hpaA dvojitou homologovou rekombinací.
2-2-1. Konstrukce sebevražedného plasmidu pVRC421
Konstrukce plasmidu pVRC421 byla provedena pomocí sebevražedného vektoru, který je schopen replikovat se pouze u Escherichia coli, avšak který nese rezistenční značkovač exprimunící se u Streptomyces, tj. gen rezistence k thiostreptonu nebo k nosiheptidu tsr. tento vektor pDH5 byl vyvinut Hillemannem a kol. (1991).
Plasmis pVRC421 byl konstruován za účelem realizace chromosomálního mutantního kmene SP92 přerušeného v genu hpaA z kosmidu pI3V2, popsaného v patentu PCT/FR93/0923. Kosmid pIBV2 byl digerován restrikčním enzymem Sphl a po separaci takto generovaných fragmentů elektrolýzou na agarosovém gelu (0,6%) byl izolován fragment SphI-Sphl s 4,8 kb, obsahující celý gen hpaA a téměř celý gen snbA, a tento fragment by purifikován výše popsaným systémem Geneclean. 50 ng vektoru pDH5 linearizovaného digescí Sphl bylo ligováno 200 ng fragmentu s 4,8 kb, který bude popsán později. Klon nesoucí požadovaný fragment byl izolován po transformaci kmene TG1 a selekci na prostředí LB+ampicilin 150/Ug/ml+IPTG+X-gal. Rekombinantní plasmid byl označen jako pVRC411 (obr.10). Kazeta obsahující R * gen am kódující rezistenci k apramycinu nebo ke geneti.ci.nu byla potom zavede do výlučného místa PfIml plasmidu pVRC411, přičemž toto místo je situováno 610 pb za počátkem genu hpaA. Tato konstrukce byla provedena následujícím způsobem. Fragment DNA s 2,2 kb obsahující gen am byl izolován po digesci plasmidu pHP45 am ,obsahujícího gen am , pomocí HindlII. Po naplnění vystupujících kohezních konců 5' HindiII KLenowovým enzymem podle protokolu popsanémo Maniatisem a kol. (1989) byl fragment obsahující gen am klonován do místa PfImi plasmidu pVRC411, jehož vystupující kohezní konce 3'byly uvolněny enzymem T4-polymerázou, jak je to popsáno Maniatisem a kol.(1989). Rekombinantní plasmid, který byl takto získán, byl označen jako pVRC421. Jeho restrikční mapa je zobrazena na obr.11.
2-2-2. Izolace mutantního kmene SP92hpaA:: am přerušeného v genu hpaA homologovou rekombinací.
Tento příklad ilustruje, jak se konstruje mutantní kmen S.pristinaespiralis přerušený v genu hpaA.
Tento mutant byl izolován transformací kmene SP92 sebevražedným plasmidem pVRC421.
Příprava protoplastů a jejich transformace byly provedeny způsoby, které již byly popsány výše.
Kmen 3P92 byl kultivován na prostředí ΥΕΜΞ (34% sacharóza, 5 mM MgCl^, 0,25% glycin) po dobu 40 hodin při teplotě 30 °C. Mycelium bylo protoplastováno v přítomnosti lysozymu a 5 X 1/Ug plasmidu pVRC421 bylo použito pro transformaci (metodou používající PEG) protoplastů. Po dobu noci, kdy proběhla regenerace protoplastů na prostředí R2YE, byly rekombinanty podrobeny selekci rozložením 3 ml prostředí SNA obsahujícího 1500yUg/ml geneticinu.
Na 5 realizovaných transformací bylo izolováno 600 klonů rezistentních ke geneticinu. Tyto rekombinanty rezultují z integrace realizované jednoduchou nebo dvojitou homologovou rekombinací mezi genem hpaA, neseným chromosomem kmene SP92, a fragmentem s 6 kb sebevražedného plasmidu pVRC421. Za účelem selekce rekombinantů získaných dvojitým mechanismem crossing-over (tj. klony, které již neobsahují ve svém genomu část pDH5 plasmidu pVRC421), byly uvedené klony opětovně zaočkovány na prostředí HT7 obsahující 400/Ug/mi thiostreptonu. Selekcí bylo získáno 6 klonů rezistentních ke geneticinu, avšak citlivých k thiostreptonu. Spory rekombinantú byly izolovány rozložením a růstem na prostředí HT7+10yug/ml geneticinu a opětovným rozložením na stejném prostředí za účelem získání izolovaných kolonií. Za účelem ověřené integrační polohy plasmisu pVRC421 byly provedeny různé Southernovy přenosy celkové DNA 6 rekombinantních klonů purifikovaných způsobem popsaným Hopwoodem a kol (1985) a hybridovaných fragmentem SphI-Sphl s 4,8 kb použitým jako sonda po značení /alfa- P/dCTP. Získané výsledky potvrzují, že tyto rekombinanty byly získány dvojitým mechanismem crossing-over mezi vektorem pVRC421 a chromosomem kmene SP92, vedoucím k nahrazení fragmentu SphI-Sphl s 4,8 kb obsahujícího gen hpaA fragmentem SphI-Sphl s 6 kb obsahujícím gen hpaA přerušený genem am . Jeden z těchto mutantů byl označen jako SP92hpaA: :2.am .
p
2-2-3. Produkce pristinamycinů mutantem SP92hpaA: :j^am
Tento příklad ilustruje, jak se stanoví, že mutant kmene S.pristinaespiralis SP92 přerušený v genu hpaA integrací plasmidů pVRC421 již neprodukuje PI za standardních fermentačních podmínek.
p
Mutantni kmen 5P92hpaA: :¾am , jakož i kmen SP92 jako referenční kmen, byly kultivovány v kapalném produkčním prostředí. Fermentace byla provedena způsobem popsaným v přikladu 2-1-3, načež byly pristinamyciny extrahovány a stanoveny výše uvedeným způsobem. Výsledky ukazují, že za realizovaných fermentacnrch podmínek mutantni kmen SP92hpaA:: am neprodukoval PI a to ani po 24, 28 a 32 hodinách fermentace, zatímco referenční kmen produkoval v uvedených třech časových etapách standardní množství PI. Oba dva kmeny produkovaly stejná w p množství PII. Mutantni kmen SP92hpaA:: am je takto účinně blokován ve stupni biosyntézy PI. Byly také provedeny komplementární fermentační testy, při kterých byly po 16 hodinách kultivace ke kultivačnímu produkčnímu prostředí přidány různé prekurzory PI a ro odděleně nebo společně. Když se k fermentacnímu prostředí přidá 100 mg/1 kyseliny 3-hydroxypikolinové, potom mutantní kmen produkuje PI v množství, které je ekvivalentní množství PI produkovanému referenčním kmenem. Skutečnost, že komplementace mutantního kmene SP92hpaA:: am může být realizována jedině po přidání kyseliny 3-hydroxypikolinové, ukazuje, že gen hpaA se uplatňuje při syntéze tohoto prekurzoru.
Konstrukce tohoto mutantu umožnila získat kmen S.pristinaespiralis mutovaný pro produkci PI, který je však v přítomnosti prekurzoru 3-HPA schopný produkovat PI v množství, které je ekvivalentní množství produkovanému výchozím kmenem. Stejně jako v předcházejících příkladech lze očekávat, že takový kmen v přítomnosti původních prekurzoru bude produkovat nové pristinamyciny modifikované v úrovni zbytku kyseliny 3-hydroxypikolinové .
Příklad 3
Produkce sloučenin obecného vzorce I mutantním kmenem 3P92::pVRC508
Tento příklad ilustruje, jak je mutant kmene S.pristinae spiralis SP92 přerušený v genu papA integrací plasmidu pVRC508 schopný syntetizovat nové streptograminy v přítomnosti prekurzorů přidaných do produkčního prostředí. Tyto prekurzory mohou být deriváty aminokyseln a zejména fenylalaninu, avšak také alfa-ketokarboxylových kyselin a zejména kyseliny fenylpyrohroznové.
Mutantní kmen SP92::pVRC508 byl kultivován v kapalném produkčním prostředí. Fermentace byla provedena následujícím způsobem: 0,5 ml suspenze spor výše uvedeného kmene byla přidána do 40 ml inokulačního prostředí do Erlenmeyerovy baňky opatřené přepážkou o obsahu 300 ml. Toto inokulční prostředí je tvořeno 10 g/1 kukuřičného výluhu (Corn Steep), 15 g/1 sacharózy, 10 g/1 síranu amonného, 1 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 3 g/1 chloridu sodného, 0,2 g/1 heptahydrátu síranu hořečnatého a 1,25 g/1 uhličitanu vápenatého. pH se upraví na hodnotu 6,9 hydroxidem sodným a to ještě před přidáním uhličitanu vápenatého. Erlenmeyerovy baňky se míchají po dobu 44 hodin při teplotě 27 °C v rotační míchačce při rychlosti otáčení 325 otáček za minutu. 2,5 ml výše uvedené kultury staré 44 h se sterilně přidají ke 30 ml produkčního prostředí v Erlenmeyerově baěce o oobsahu 300 ml. Produkční prostředí je tvořeno 25 g/1 sójové moučky, 7,5 g/1 škrobu, 22,5 g/1 glukózy, 3,5 g/1 krmných kvasnic, 0,5 g/1 síranu zinečnatého a 6 g/1 uhličitanu vápenatého. pH se nastaví na hodnotu 6,0 kyselinou chlorovodíkovou a to ještě před zavedením uhličitanu vápenatého. Erlenmeyerovy baňky se míchají při teplotě 27 °C v rotační míchačce při rychlosti otáčení 325 otáček za minutu. Po 16 hodinách se ke kultivačnímu prostředí přidá 1 ml roztoku jednoho z prekurzoru uvedených v následující tabulce ΠΗ obecně 5 nebo 10 g/1). Kultivace se potom přeruší 3 nebo 24 hodin později. Změří se objem kultivačního rmutu, načež se k němu přidají 2 objemy mobilní fáze tvořené 34 % acetonitrilu a 65 % 0,1M roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného (s pH 2,9 nastaveným koncentrovanou kyselinou fosforečnou), umožňující extrakci pristinamycinu. Po rozmíchání se veškerá směs odstředí a pristinamyciny obsažené v supernatantu se extrahují a purifikují způsoby popsanými v příkladu 4. Tyto produkty se rovněž stanoví vysokovýkonnou kapalinovou chromatograf ií, při které se 150/Ul výše uvedeného centrifugačního supernatantu zavede na sloupec produktu Nucleosil 5-C8 o rozměrech 4,6 x 150 mm a eluce se provádí eluční soustavou tvořenou směsí 40 % acetonitrilu a 60 % 0,1M fosfátového pufru s pH 2,9. Nové pristinamyciny jsou detekovány pomocí jejich absorbance v ultrafialovém záření o vlnové délce 206 nm a popřípadě pomocí jejich fluorescenční emise (filtr 370 nm, excitace při 306 nm).
Tabulka III
Prekurzor fenylalanin
Původ
Janssen
Tabulka III (pokračování)
4-dimethylamínofenylalanin 4-tne thy lamí nof eny la lani n 4-aminofanylalanin 4-diethvlaminofenylalanin 4-ethylaminofanylalanin 4-methyIthiofanylalanin 4-msthylfsnylalanin 4-methoxyfenylalanin 4-trifluormethoxyfanylalanin 4-methoxykarbonylfanylalanin 4-chlorfanylalanin 4-bromfenylalanin 4-jodfenylalanin 4-trifluormethy1fanylalanin 4-terč.butylfanylalanin 4-isopropylfanylalanin
3-methyLaminofenylalanin
3-methoxyfenylalanin 3-methyIthiofenylalanin
3- fluor-4-methylfanylalanin kyselina 4-terc.butylfsnylpyrohroznová kyselina 4-methylaminofenylpyrohroznová
2- naftylfenylalanin
4- fluorfenylalanin
3- fluorfanylalanin
3-ethoxyfanylalanin
2.4- dimethylfenylalanin
3.4- dimethylfenylalanin
3- methyl fenylalanin
4- fenylfenyLalanin
4-butylfenylalanin
2-thienyl-3-alanin
Příklad 33
Příklad 34-1
Janssen 22.794.96 Příklad 33 Příklad 33 Příklad 33
J.P.S101-312-4/příklad 33
Janssen 16.975.97
Příklad 34-8
Příklad 33
Janssen 15.728.14
Jansen 22.779.81
Bachem F 1675
P.C.R.Inc.12 445-3
Příklad 35-1
Příklad 36-1
Příklad 35-3
J.P.S.101-313-2
Příklad 34-11
Příklad 34-5
Příklad 33
Příklad
Bachem F
Bachem F
Bachem F
Příklad
Příklad
Příklad
Příklad
Příklad
Příklad
Aldrich
34-4
1865
1535
2135
37-1
36-3
28.728.8
Tabulka III (pokračování)
3-trifluormethylfenylalanin Příklad 33
3-hydroxyfenylalanin Aldrich T 9.039.5
3-ethylaminofenylalanin Příklad 35-6
4-aminomethylfenylalanin Příklad 33
4-allylaminofenylalanin Příklad 38-2
4-diallylaminofenylalanin Příklad 38-1
4-allylethylaminofenylalanin Příklad 39-4
4-ethyIpropylaminofenylalanin Příklad 39-6
4-ethyiisopropylaminofenylalanin Příklad 39-1
4-ethyImethyIcyklopropylamino-
fenylalanin Příklad 39-8
4-(1-pyrrolidinyl)fenylalanin Příklad 40-1
4-0-allyltyrosin Příklad 33
4-O-ethyItyrosin Příklad 33
4-ethylthiofenylalanin Příklad 33
4-ethyIthiomethvlfenylalanin Příklad 41-1
4-0-(2-chlorethyl)tyrosin Příklad 42-1
4-acetylfenylalanin Příklad 33
4-ethylfenylalanin Příklad 33
3-dimethylaminofenylalanin Příklad 35-10
V následující tabulce (Tabulka IV) jsou uvedeny retenční doby týkající se nových produktů PI, přičemž se jako referenční látka používá PIA· Absolutní retenční doby byly stanoveny při teplotě 25 °C ve vysokovýkonném kapalinovém chromátografickém systému, který je definován níže. Tyto retenční doby se mírně mění jednak od jednoho nástřiku do hlavy kolony ks druhému a jednak v závislosti na teplotě.
Tabulka IV
Prekurzor tR(relativní retenční doba) nových PI (NeoPi)_
Ne°PIA NeoPIH další neofi
4-methylamínofenylalanin
0,85
Tabulka IV (pokračování)
4-aminofenylalanin 0,64
4-methylthiofenylalanin 1,93
4-methylfenylalanin 1,77
4-methoxyfenylalanin 1 ,46
4-methoxykarbonylfenylalanin 1,49
4-chlorfenylalanin 2,04
4-bromfenylalanin 2,16
4-jodfenylalanin 2,42
4-trifluormethylfenylalanin 2,56
4-terč.butylfenylalanin 3,34
4-isopropylfenylalanin 2,80
3-methylaminofenylalanin 1,15
3-methoxyfenylalanin 1,49
3-fluor-4-methylfenylalanin 2,93
kyselina 4-terc.butylfenyl-
pyrohroznová 3,34
kyselina 4-methylaminofenyl-
pyrohroznová 0,85
4-ethylaminofenylalanin 0,94
4-diethylaminofenylalanin 0,61
4-allylamonofenylalanin 1 ,83
4-diallylaminofenylalanin 2,64
4-allylethylaminofenylalanin 2,4
4-ethylpropylaminofenylalanin 1,06
4-ethylisopropylaminofenyl-
alanin 0,89
4-ethylmethylcyklopropyl-
aminofenylalanin 1,1
4-(1-pyrrolidinyl)fenylalanin 2,0
4-0-trifluormethyltyrosin 2,42
4-O-allyltyrosin 2,62
2,73 1,63 b
2,65
3,74
4,35
2,04
Tabulka IV (pokračování)
4-O-ethyltyrosin 2,2
4-ethylthiofenylalanin 1 ,96
4-methyIthiomethylfenylalanin 1,98
4-0-(2-chlorethyl)tyrosin 2,45
4-acetylfenylalanin 1,61
4-ethylfenylalanin 1,86
3-dimethylaminofenylalanin 1 ,49
3-methylthiofenylalanin 1,93
3-0-ethyltyrosin 1,78
Nový PI s tR pro 4-isopropylfenylalanin odpovídá neoPIg popsanému v příkladu 14.
Nový PI s tR 1,63 pro 4-methylthiofenylalanin odpovídá 5gama-hydroxy nebo PI popsanému v příkladu 5.
Mutantní kmen SP92::pVRC5Q8 byl jinak fermentován v přítomnosti 4-dimethylaminofenylalaninu. Za těchto komplementačních podmínek mutantní kmen SP92::pVRC508 produkuje množství pristinamycinu 1^, které je ekvivalentní množství produkovanému kmenem SP92.
Příklad 4
Příprava pristinamycinu Ιβ /4 ζ-methylaminodes ( 4 ζ -dimethylamino)pristinamycin 1^ a 4ζ -aminodes(4ζ -dimethylamino)pristin amycinu
4.1: Příprava pristinamycinu IR /4ζ -methylamino-des(4ζ -dimethylamino ) pristinamycin I /
A
V měřítku 60 Erlenmeyerovýcn baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC5Q8 v produkčním prostředí, přičemž se k produkčnímu prostředí po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml vodného roztoku (10 g/1) 4-methyl43 aminořenylalaninu s konfigurací (R,S) syntetizovaného v příkladu 34-1. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního prostředí pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje objemy směsi tvořené 66 % 1Q0mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a zavede na sloupec silíkagelu (30 g) v dichlormethanu, načež se sloupec eluuje postupně elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující pristinamycin I tí se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 6 ml směsi tvořené % vody a 35 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparaticní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x
250 mm (Macherey Nagel) a sloupec se eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 65 % 1OOmMfosfátového pufru s pH 2,9 a 35 % acetonitrilu. Frakce obsahující pristinamycin I se sloučí a tí extrahují jedním objemecm dichlormethanu. Organická fáze se pro myje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 52 mg pristinamvcinu .
tí ^-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0.71 (dd. J= ; 6 Hz. IH, 5 &), 0.92 (t, J= 7.5 Hz. 3H: CH3 2 γ). od l.lOdo 1.40 (mt, 2H: 3 & a γ2), 1.34 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ).οΰ 1.50dol.85 (mt, 3H: 3 γχ a CHj 2 β), 2.03 (mt, IH, 3 &), 2.22 (mt, IH, 5 δ2), 2.33 (d šir.. J= 16 Hz, IH: 5 δ3), 2.40 (d, J= 16 Hz, IH: 5 Pt), 2.82 (mt, IH: 5 ε^, 2.81 (s, 3H: 4 NCH3 v para k fenylu ), 2.90 (dd,
J= 12 a 4 Hz, IH: 4 β2), 3.29 (s, 3H: 4 NCHj), od 3.20 3.45 do 3.60 (2 mts, IH teždý ; 0¾ 3 δ), 3.40 (t, J= 12 Hz, IH: 4 βχ), 4.57 (dd, J= 7 a 8 Hz, IH, 3 a), 4.75 (dd šir., J= 13 a 7 Hz, IH: 5 83). 4.83 (mt, IH: 2a), 4.89 (d šir. , J= 10 Hz, IH: la). 5.24 (dd, J= 12 a 4 Hz, IH: 4 a), 5.32 (d šir., J= 6 Hz, IH: 5 a), 5.89 (d, J= 9 Hz, IH: 6 a), 5.90 (q šir. J= 7.5 Hz, IH: 1β), 6.53 (d, J= 9 Hz, IH: NH 2), 6.53 (d,
J= 8 Hz, 2H: 4ε), 7.03 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), cd 7.10 do7.35 (mt, 5H: H Aromatický
6), 7.46 (mt, 2H: 1' Hs a 1' HJ, 7.85 (dd, J = 5.5 a 2 Hz, IH: 1' H^, 8.44 (d, J= 10
Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.63 (s, IH: OH).
4.2: Příprava 4ζ -amino-des(4 £ -dimethylamino)pristinamycinú ΣΑ
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, do kterého se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml vodného roztoku (5 g/1) (S)-4-aminofenylalaninu. Po 40 hodinách kultivace se produkční rmut . pocházející z 60 Erlenmeyerových baněk (1,8 litru) extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a zavede na sloupec (30 g) silikagelu v dichlormethanu, načež se sloupec eluuje elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinú 1^ se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 6 ml směsi tvořené 65 % vody a 35 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7^uC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 65 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 35 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 5 mg 4ξ amino-des(4^ -dimethylamino)pristinamycinú 1^.
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0.72 (dd, J= et 5.5 Hz, IH, 5 &), 0.90 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), od l.lOdol.40 (mt, 2H: 3 β, a 3 γ2), 1.33 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 1 γ),ο5 1.50do 1.85 (mt, 3H: 3 γ, a CH, 2 β),
2.02 (mt, IH, 3 fr), 2.19 (mt, IH, 5 δ,), 2.33 (d šir. , J= 16 Hz, IH: 5 δ3), 2.42 (d,
J= 16 Hz, IH: 5 fr), 2.81 (dt, J= 13 a 4 Hz, IH: 5 ε,), 2.90 (dd, J= 12 et 4 Hz, IH: 4 β—), 3.24 (s, 3H: NCH3 4), od 3.20 <±3.40 a 3.54 (2 mts, lHkaááý CH2 3 δ), 3.30 (t, J= 12 Hz, IH: 4 ft), 3.72 (mf, 2H: ArNH,), 4.54 (dd, J= 7.5 a 7 Hz, IH, 3 a),
4.73 (dd šir., J= 13 8 Hz, IH: 5 ε3), 4.82 (mt, IH: 2a), 4.89 (d šir., J= 10 Hz,
IH: la), 5.22 (dd, J= 12 a. 4 Hz, IH: 4 a), 5.32 (d šir. , J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.89 (mt, 2H: 6 a a 1β), 6.51 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 6.61 (d, J= 8 Hz, 2H: 4e), 6.98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), cd 7.15ά3 7.35 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.45 (dd, J= 8.5 a
1.5 Hz, IH: Γ H4), 7.48 (dd, J= 8.5 a 4 Hz, IH: 1' Hj), 7.82 (dd. J = 4 a 1.5 Hz. IH:
1' Hj), 8.43 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1). 8.76 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.63 (s, IH:
OH).
Příklad 5
Příprava 4^ -methylthio-des(4-dimethylamino)pristinamycinu IA, 4^ -methylthio-des(4^ -dimethylamino)pristinamycinu I a 5gamahydroxy-4ζ -methylthio-des(4ξ -dimethylamino)pristinamycinu I„
Π
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příklad u 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (10 g/1) (R,S)-4-methylthiofenylalaninu v 0,1N hydroxidu sodném, přičemž uvedený (R,S)-4-methylthiofenylalanin byl syntezizován způsobem popsaným v příkladu 33. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu, který se potom postupně eluuje elučním gradientem 0 až 10% methanolem v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu se sloučí a odpaří. Získá se 65 mg suchého zbytku. Tento zbytek se vyjme 6 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede ve dvou podílech na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se porom eluuje eluční soustavou tvořenou směsí obsahující 55 % 100 mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpa46 ří. Získá se 45 mg 4C -methylthio-des(4ζ -dimethylamino)pristinamycinu I .
^-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0.68 (dd,
J= 16 a 5.5 Hz, IH, 5 &), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.13 (mt, IH: 3 &), od
1.25ažl.40 (mt, IH: 3 γ2), 1.33 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ), cd 1.55cd 1.85 (mt, 3H: 3 γ3 a CH2 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 β/, 2.18 (mt, IH, 5 δ2). 2.38 (d šir. , J= 16.5 Hz, IH:
δ3), 2.46 (s, 3H: SCHj), 2.48 (d, J=16 Hz, IH, 5 β3), 2.85 (dt, J= 13.5 a 4 Hz, IH:
ε,), 3.00 (dd, J= 12 a 5 Hz, IH: 4 β,), 3.23 (s, 3H: NCH3 4), 3.37 (t, J= 12 Hz, IH:
β3), 3.37 a 3.58 (2 mts, lHkažý : CHj 3 δ), 4.55 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.77 (dd šir. , J= 13.5 a 8 Hz, IH: 5 ε3). 4.86 (mt, IH: 2c.), 4.89 (dd, J= 10 a 1.5 Hz, IH: la), 5.30 (d šir., J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.32 (dd, J= 12 a 5 Hz, IH: 4 a), 5.90 (d, J=
9.5 Hz, IH: 6 a), 5.92 (dq, J= 7.5 a 1.5 Hz, 1Η:1β), 6.55 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2),
7.13 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), ca 7.15dc7.35 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.19 (d, J= §
Hz, 2H: 4ε), 7.45 (mt, 2H: 1' H4 a 1' Hj), 7.76 (t, J = 5 Hz, IH: Γ H^, 8.42 (d, J= 10 Hz, IH: ΝΉ 1), 8.76 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.65 (s, IH: OH).
Z frakcí opouštějících výše popsaný sloupec silikagelu obsahujících nový derivát pristinamycinu se izoluje 10 mg 4^ -methylthio-des(4ξ -dimethylamino)pristinamycinu v případě, že se provede chromatografie na semipreparativním sloupci silikagelu, která byla popsána výše, s výjimkou spočívající v tom, že obsah acetonitrilu v eluční soustavě činí 50 %.
^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v porn, ref.TMS):
0.32 (mt, IH, pj), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 7),od 1.20dol.35 (mt, 2H: 3 β, et 3 γ2), 1.30(d,
J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ), od 1.35do2.05 (mt, 9H: 3 7l - 3 β3 - CH, 2 β - 0¾ 5 δ - CH2 5γ a 5 β3), 2.44 (dt, J= 13.5 et 1.5 Hz, IH: 5 &$, 2.49 (s, 3H: SCH^, 2.99 (dd, J= 12 a 5 Hz, IH: 4 β,), 3.09 (dd, J= 12.5 a 12 Hz, IH: 4 β3), 3.54 a 3.64 (2 mts, IH každý : CH2 3 δ), 4.17 (dd, J= 7 a 6 Hz, IH: 3 a), 4.49 (d šir., J= 13.5 Hz: IH: 5 ε,), ad4.70do4.80 (mt, 3H: 2a - 5 a a 4 a), 4.84 (dd, J=10 a 1.5 Hz, IH: la), 5.51 (d, J= 7 Hz, IH: 6 a), 5.73 (mt, IH: 1β), 6.65 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7.22 (d, J= 8 Hz, 2H: 4e),od 7.20dn7.40 (mt, 7H: H Aromatický 6 ~ 1 H4 a 1' H,), 7.87 (d. J=4 Hz, IH: 1’ H^, 8.55 (mi, IH: NH 6), 8.55 (d, J= 10 Hz, IH:
NH 1), 11.70 (s, IH: OH).
- 47 Z frakcí opouštějících výše popsaný sloupec silikagelu obsahujících nový derivát pristinamycinu I se izolují 3 mg 5gama-hydroxy-4ζ -methylthio-des(4 £ -dimethylamino)pristinamycinu IH v případě, že se provede výše popsaná chromatografie na semipreparativním sloupci, při které udržuje obsah acetonitrilu v eluční soustavě rovný 45 %.
Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): lze pozorovat jednoznačně majoritní iso mer: -OH v 5gama v axiální poloze. .__ T
0.37 (d nit, J= 16
Hz, IH, 5 Pj). 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH, 2 γ), od 1.20± 1.45 (mt, 2H: 3 & a 3 γ2),
1.31 (d. J= 7.5 Hz, 3H: CH, 1 7),od 1.40 ±1.85 (mt, 5H: 3 γ, - CHj 2 β a CH, 5 δ),
1.98 (mt, IH, 3 β,), 2.17 (d, J= 16 Hz, IH: 5 β,), 2.50 (s, 3H: SCH,), 2.77 (dt, J=
13.5 a 2 Hz, IH: 5 ε,), 2.99 (dd, J= 12 a 4 Hz, IH: 4 βρ, 3.11 (t, J= 12 Hz, IH: 4 βχ), cd 3.45 <±3.70 (mt, 2H: CH, 3 δ), 3.73 (mt, IH: 5 γ v ácatariální pcte ), 4.13 (t, J= 7 Hz, IH, 3'aj; 4.37 (d šir. , J= 13.5 Hz, IH: 5 ε,), cd 4.75±>4.95 (mt, 3H: 2a - 4 a a 5 a), 4.89 (dd. J= 10 a 1 Hz, IH: la), 5.70 (d, J= 8 Hz, IH: 6 a), 5.80 (dq,
J= 7.5 a 1 Hz, IH: 1β), 6.37 (d, J= 5 Hz, IH: NH 4), 6.71 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2),
7.10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7.22(d, J= 8 Hz, 2H: 4 ε), cd 7.20dc7.40 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.43 (dd, J= 8.5 a 1.5 Hz, IH: Γ H4), 7.47 (dd, J= 8.5 a 4 Hz, IH:
1' HJ, 7.89 (dd, J = 4 a 1.5 Hz, IH: 1' Hj), 8.55 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 9.15 (d, J=
Hz, IH: NH 6), 11.70 (s, IH: OH).
Příklad 6
Příprava 4ζ -methyl-des(4ζ -dimethylamino)pristinamycinu a 4 ξ·-methyl-des (4 -dimethylamino) pristinamycinu Ig
V měřítku 69 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, do kterého se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (5 g/1) (R,S-4-methylfenylalaninu v O,1N hydroxidu sodném. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litrů produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 1OOmMfosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlorme48 thylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a sloupec se eluuje elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu se sloučí a odpaří. Získá se 49 mg suchého zbytku. Tento zbytek se vyjme 6 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede ve dvou podílech na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil Z/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 55 % 100mM fosfátového pufru s pH
2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 44 mg 4 ζ-methyl-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycinu 1^.
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): ,
Q.o2 (dd,
J= 16 a 6 Hz, IH, 5 fr), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.15 (mt, IH: 3 fr), odl.20 dol.40 (mt, IH: 3 γ2), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 y),cd 1.50*1.85 (mt, 3H: 3 Yla (3¾ 2 β), 2.04 (mt, IH, 3 fr). 2.18 (mt, IH, 5 δ2), cd 2.25 ác2.45 (mt, 2H: 5 δχ a 5 fr), 2.36 (s, 3H: ArCHj), 2.83 (dt, J= 13 a 4 Hz, IH: 5 ^), 2.99 (dd, J= 13 a 4 Hz,
IH: 4 fr), 3.28 (s, 3H: NCH34), 3.31 a 3.59 (2 mts, IH kaáčy CHj 3 δ), 3.40 (t, J=
Hz, IH: 4 fr), 4.59 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.74 (dd šir. , J= 13 a 7 Hz, IH: 5 ^), 4.85 (mt, IH: 2a), 4.89 (dšir. , J= 10 Hz, IH: la), ad 5.25i 5.35 (mt, 2H: 5 a a 4 a), * 5.85*5.95 (mt, 2H: 6 a a 1β), 6.52 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.14 (AB limit., J= 9 Hz, 4H: 4δ a 4ε),cd 7.15*7.35 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.50 (mt,
2H: 1’ H4 a p Hj), 7.81 (dd, J = 4 a 2Hz, IH: 1' Hj), 8.41 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1),
8.74 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6). 11.63 (s, IH: OH).
Z frakcí opouštějících výše popsaný sloupec silikagelu obsahujících nový derivát pristinamycinů se izoluje 21 mg 4 ξ-methyl-des(4ξ -dimethylamino)pristinamycinu 1^ (hmotová spektrometrie: M-ťH+ = 810) v případě, že se provede chromatograf ie na výše popsaném semipreparativním sloupci.
Příklad Ί
Příprava 4ζ -methoxy-des(4ζ -dimethylamino)pristinamycinu I
A
V měřítku 12 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, do kterého se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (5 g/1) (R,S)-4-methoxyfenvlalaninu v 0,1N hydroxidu sodném. Po 40 hodinách kultivace se 0,35 litru produkčního rautu pocházejícího z 12 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi obsahující 66 % 1Q0mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a sloupec se potom eluuje elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu 1^ se sloučí a odpaří. Získá se 14 mg suchého zbytku. Tento suchý zbytek se vyjme 3 ml směsi obsahující 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 60 % 1Q0mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 12 mg 4^-methoxy-des(4^-dimethylamino)pristinamycinu 1^.
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v pom, ref.TMS):
0.63 (dd. J= 16 a 5.5 Hz, IH, 5 β^, 0.96 (t. J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.17 (mt, IH: 3 (¾). cd 1.30doi.45 (mt, IH: 3 72). 1-38 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 1 7), od 1.55do 1.85 (mt,
3H: 3 7i a CH2 2 β). 2.05 (mt, IH, 3 βχ), 2.20 (mt, IH. 5 δ^, 2.40 (d šir. , J= 16
Hz, IH: 5 δχ). 2.47 (d, J= 16 Hz, IH: 5 βχ). 2.88 (dt, J= 13 a 4 Hz. IH: 5 zf), 2.99 (dd, J= 12.5 a 5 Hz, IH: 4 fá), 3.30 (s. 3H: NCH3 4), 3.32 a 3.60 (2 mts, IH loááý ; CH2 3 δ), 3.40 (t, J= 12.5 Hz, IH: 4 βχ), 3.80 (s, 3H: OCH3), 4.60 (t, J= 7.5
Hz, IH, 3 a), 4.80 (dd šir., J= 13 a 8.5 Hz, IH: 5 εχ), 4.88 (mt, IH: 2a), 4.92 (d šir. , J= 10 Hz, IH: la), 5.31 (dd, J= 12.5 a 5 Hz. IH: 4 a), 5.34 (dšir. , J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.90(d, J= 9 Hz, IH: 6 a), 5.93 (q šir. , J= 7.5 Hz. IH: 1β), 6.54 (d, J=
Hz, IH: NH 2), 6.87 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 7.16 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), cd 7.15 ď>7.40 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.50 (mt, 2H: 1' H5 a 1' H4), 7.80 (dd, J = 4 a 2.5 Hz,
IH: 1' Hó), 8.43 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.78 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.65 (s, IH:
OH).
Příklad 8
Příprava 4^ -methoxykarbonyl-des(4^ -dimethylamino)pristinamycínu ΙΑ
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, do kterého se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (10 g/1) (R,S)-4-methoxykarbonylfenylalaninu, syntetizovaného v příkladu 33. Po 24 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího ze 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pří 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu, načež se tento sloupec eluuje elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinů 1^ se sloučí a odpaří. Získá se 14 mg suchého zbytku. Tento suchý zbytek se vyjme 3 ml směsi obsahující 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel) a tento sloupec se potom eluuje směsí obsahující 55 % 100mM fosfátového pufru s pH
2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 9 mg 4ζ -methoxykarbonyl-des(4ζ-dimethylamino<~ pristinamycinů 1^.
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0.70 (dd
J= 16 a 6 Hz, IH, 5 &), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.08 (mt, IH: 3 &),od 1.30 dol.40 (mt, IH: 3 γ2), 1.33 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 y),od 1.55dol.85 (mt, 3H: 3 ^a CH, 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 fr), 2.13 (mt, IH, 5 δ2), 2.40 (d šir. . J= 16.5 Hz, IH: 5 Ój), 2.48 (d, J=16 Hz, IH, 5 ft), 2.89 (dt, J= 14.5 a 4.5 Hz, IH: 5 ε), 3.10 (dd, J=
13.5 a 6 Hz, IH: 4 β,), 3.24 (s ,3H: NCH3 4), 3.38 a 3.61 (2 mts, IH kaž# : CH, 3 δ), 3.47 (t, J= 13.5 Hz, IH: 4 βχ), 3.96 (s, 3H: COOCH3), 4.55 (t. J= 7.5 Hz, IH, 3
a), 4.78 (dd šir. , J= 14.5 .8 Hz, IH: 5 e^, 4.86 (mt, IH: 2a), 4.89 (d šir. , J= 10 Hz, IH: la), 5.33 (d šir. , J= 6 Hz, IH: 5 a), 5.42 (dd, J= 13.5 a 6 Hz, IH: 4 a),
5.92 (d (J= 9.5 Hz) et mt, IH kaž# : respective 6 a a 1β), 6.52 (d, J= 10 Hz,
IH: NH 2), de 7.15 á 7.35 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.28 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ),
7.43 (dd, J= 9 a 1.5 Hz, IH: Γ H4), 7.47 (dd, J= 9 a 5 Hz, IH: 1' Hs), 7.66 (d, J = 5 a 1.5 Hz, IH: 1' H^, 7.98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4e), 8.38 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.70 (s, IH: OH).
Příklad 9
Příprava 4ζ -chlor-des(4ξ -dimethylamino)pristinamycinu
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede zpúspbem popsaným v příkladu 3 kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 honách kultivace přidá 1 ml roztoku (10 g/1) (R,S)-4-chlorfenylalaninu v 0,1 hydroxidu sodném. PO 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího ze 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Dupernatant se extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se eluuje elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu 1^ se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 3 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získá ná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 60 % IQOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 1 mg 4ζ -chlor-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycinů 1^.
^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
ť . 0.93 (t. J=
7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 0.95 (dd, J= 16 a 5 Hz, IH, 5 ^), 1.09 (mt, IH: 3 &), od 1.20 dol;40 (mt, IH: 3 γ2), 1.35 (d. J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ), cd 1.50dbl.85 (mt, 3H: 3 γχ a CHj 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 &), 2.17 (mt, IH, 5 δ2), 2.43 (d šir. , J= 16 Hz, IH: 5 δ,),
2.59 (d, J=16 Hz, IH, 5 β,), 2.90 (dt, J= 13.5 a 4 Hz, IH: 5 ε,), 3.04 (dd, J= 13 a 6 Hz, IH: 4 β2), 3.21 (s, 3H: 4 NCH3), 3.36 (t, J= 13 Hz, IH: 4 β3), 3.39 a 3.59 (2 mts, lHkaž^ : CH, 3 δ), 4.53 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.76 (dd šir., J= 13.5 a 8 Hz,
IH: 5 eý, 4.86 (mt, IH: 2a), 4.87(d šir., J= 10 Hz, IH: la), 5.38 (mt, 2H: 5 a a 4
a), 5.93 (mt, 2H: 6 a a 1β), 6.52 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2), 7.12 (d, J = 8 Hz, 2H:
4δ), od 7.15do7.35 (mt, 7H: H Aromatický 6 et 4ε), 7.38 (dd, J= 9 a 4.5 Hz, 1H.T Hj), 7.43 (dšir. , J= 9 Hz, 1H:1’ H4), 7.68 (dd, J=4.5 a 1 Hz, IH: 1' H^, 8.36 (d,
J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.75 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.65 (s, IH: OH).
Příklad 10
Příprava 4ξ-brom-des(4^-dimethylamino)pristinamycinů IA a 4 ζ-brom-des(4 ζ-dimethylamino)prostinamycinu I„
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (10 g/1) (R,S)-4-bromfenylalaninu v 0,1N hydroxidu sodném. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího ze 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 1Q0mM fosfátového pufru s pH
2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlorme53 thylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu IA se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 6 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se potom dvakrát zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje směsí tvořenou 60 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 6 mg 4 ζ> -brom-des ( 4Č, -dimethylamino)pristinamycinu 1^.
^H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0.93 (t, J= 7.5
Hz, 3H: CH3 2 γ), 0.95 (dd, J= 16 a 5 Hz, 1H, 5 &). 1.10 (mt, 1H: 3 &), 1.35 (d, J=
7.5 Hz, 3H: CH3 i γ), 1.36 (mt, 1H: 3 γ2), odl.50dol.85 (mt, 3H: 3γ, a CHj 2 β),
2.02 (mt, 1H, 3 β3), 2.18 (mt, 1H, 5 δ2), 2.43 (d šir , J= 16 Hz, 1H: 5 δχ), 2.59 (d,
J=16 Hz, 1H, 5 β,), 2.90 (dt, J= 13 a 4 Hz, 1H: 5 ε,), 3.02 (dd, J= 13 et 5.5 Hz, 1H:
β,), 3.21 (s, 3H: 4 NCH3), 3.33 (dd, J= 13 - 11 Hz, 1H: 4 β3), 3.39 a 3.59 (2 mts.
1H každ/ ; CH, 3 δ), 4.53 (t, J= 7.5·Ηζ, 1H, 3 a), 4.76 (dd šir.,, J= 13 a 7 Hz, 1H:
ex), 4.86 (mt, 1H: 2a), 4.89 (d šir., J= 10 Hz, 1H: let), 5.37 (d šir., J= 5 Hz, 1H:
a), 5.39 (dd, J= 11 a 5.5 Hz, 1H: 4 a), 5.92 (mt, 2H: 6 α a 1β), 6.56 (ď, J= 9.5 Hz, 1H: NH 2), 7.08 (d, J = 8 Hz, 2H: 4δ), od 7.15do7.35 (mt, 5H: H Aromatický
6), 7.40 (mt, 4H: 1’ H4 - Γ Hs a 4ε), 7.70 (d šir. , J = 5 Hz, 1H: 1’ H^, 8.40 (d, J=
Hz, 1H: NH 1), 8.77 (d, J= 9 Hz, 1H: NH 6), 11.68 (s, 1H: OH).
Z frakcí opouštějících sloupec silikagelu, který byl popsán výše, a obsahujících nový derivát pristinamycinu I„ se
Π izolují 3 mg 4 ξ-brom-des(4ξ -dimethylamino)pristinamycinu IH (hmotová spektrometrie: M+H-1 = 874 ) v případě, že se provede chromatografie na výše popsaném semipreparativním sloupci.
Příklad 11
Příprava 4 ζ-jod-des(4ζ, -dimethylamino)pristinamycinu a 4 Čj -jod-des(4 -dimethylamino)pristinamycinu 1^
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (10 g/1) (R,S)-4- jodfenylalaninu v 0,1N hydroxidu sodném. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího ze 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH
2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 gj v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje elučním gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu 1^ se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 6 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se potom dvakrát zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje směsí tvořenou 60 % 1Q0mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 12 mg 4^-jod-des(4ξ-dimethylamino) pristinamycinu IA· ^-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0 93 (t J7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 0.95 (dd, J= 16a 5.5 Hz, 1H, 5 &), 1.10 (mt. 1H: 3 β-), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ), 1.38 (mt, 1H: 3 γ2), od 1.55 dbl.85 (mt, 3H: 3 γ3 a CH2 2 β). 2.02 (mt, 1H, 3 β3), 2.17 (mt, 1H. 5 δ2). 2.43 (d šir., J= 16.5 Hz, 1H: 5 Óý, 2.60 (d, J=16 Hz, 1H, 5 β3), 2.89 (dt, J= 14 a 4.5 Hz, 1H: 5 ^), 3.02 (dd, J= 13 a 5.5 Hz,
1H: 4 β,), 3.21 (s, 3H: NCH3 4), 3.31 (dd, J= 13 a 11 Hz, 1H: 4 β3), 3.39 a 3.59 (2 mts, 1H I-ežzý : CH2 3 δ), 4.53 (t, J= 7.5 Hz, 1H, 3 a), 4.75 (dd šir. , J= 14 a 8 Hz
1H: 5 e3), 4.83 (mt, 1H: 2a), 4.88 (d šir., J= 10 Hz, 1H: la), 5.37 (d šir., J= 5.5
Hz, IH: 5 a), 5.39 (dd, J= 11 a 5.5 Hz, IH: 4 a), 5.92 (mt, 2H: 6 a a 1β), 6.54 (d,
J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 6.94 (d, J = 7.5 Hz, 2H: 46), ad 7.15do 7.50 (mt, 5H: H Aromati cký 6), 7.36 (dd, J = 9 a 4 Hz, IH: 1' Hs), 7.43 (d šir. , J= 9 Hz, IH: 1' H4),
7.62 (d, J= 7.5 Hz, 2H: 4e), 7.68 (d, J = 4 Hz, IH: 1' H/, 8.38 (d, J= 10 Hz, IH: NH
1), 8.76 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.60 (s, IH: OH).
Z frakcí opouštějící výše popsaný sloupec sílikagelu a obsahujících nový derivát pristinamycinu IR se izoluje 6 mg 4 ζ-jod-des( 4ξ-dimethylamino)pristinamycinu I„ (hmotová spektro4- w Π skopie: M+H = 922) v případě, še se provede chromatografie na výše popsaném semipreparativním sloupci.
Příklad 12
Příprava 4 ξ-trifluormethyl-des(4 -dimethylamino)pristinamycinu a 4ξ -trifluormethyl-des(4 ξ-dimethylamino)pristinamycinu I„ ti
V měřítku 60 Erle.nmaeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá roztok (5 g/1) ( S)-4-trifluormethylfenylalaninu v 0,1N hydroxidu sodném. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu a získaná směs se potom odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu diehlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml diehlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec sílikagelu (30 g) v dichlormethanu, který se eluuje gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlorme thanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu Ia se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 3 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje směsí 55 % 100mM fosfátového pufru s pří 2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 5 mg 4ξ -trifluormethyl-des(4ζ 56 dimethylamino) pristinamycinu.
^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0.86 (dd,
J= 16 a 5.5 Hz, IH, 5 β,), 0.91 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.13 (mt, IH: 3 β,), 1.31 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ), 1.42 (mt, IH: 3 γ2), od 1.55 <±>1.80 (mt, 3H: 3 γχ a CH2 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 βχ), 2.15 (mt, IH, 5 δ2), 2.40 (d šir., J= 16.5 Hz, IH: 5 δ,), 2.55 (d, J=16 Hz, IH, 5 β^, 2.83 (dt, J= 14 a 4 Hz, IH: 5 ε,), 3.18 (s, 3H: NCH3 4), 3.20 a 3.31 (2 dd, respective J= 13 a 6 Hz et J= 13 a 10 Hz„ IH každý ; 4 β, a 4 βχ), 3.42 a 3.60 (2 mts, IH teááý ; CH, 3 δ), 4.50 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.73 (dd šir. . J= 14 a 7.5 Hz, IH: 5 εχ), 4.83 (mt, IH: 2a). 4.91 (d šir. .·, J= 10 Hz, IH: la),
5.40 (d šir., J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.55 (dd, J= 10a 6 Hz, IH: 4 a), 5.87 (d, J= 9.5 Hz, IH: 6 a), 5.90 (q šir. , J= 7.5 Hz, 1Η:1β), 6.68 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), cd 7.15dt7.40 (mt, 9 Η: 4δ - H Aromatický 6 - 1' H5 a Γ HJ, 7.52 (d, J= 8 Hz, 2H:
4ε), 7.68 (d. J = 4 a 1.5 Hz, IH: Γ Hý, 8.43 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6). 11.70 (s, IH: OH).
Z frakcí opouštšjících výše popsaný sloupec silikagelu a obsahujících nový derivát pristinamycinu I se izolují 4 mg 4 ξ-trifluormethyl-des(4^-dimethylamino)pristinamycinu
-» ·+· v. n (hmotová spektrometrie: M+H = 864) v případě, že se provede chromatografie na výše popsaném semipreparativním sloupci.
Příklad 13
Příprava 4 %-terc. butyl-des ( 4 ^-dimethylamino) pristinamycinu
V
V měřítku 60 Erlenmaeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prosrředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá roztok (5 g/1) (R,S)-4-terc.butylfenylalaninu v 0,1N hydroxidu sodném. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 obje my směsi tvořené 66 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu a získaná směs se potom odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sod57 ným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu, který se eluuje gradientem 0 až 10 % methanolu v dichlorme thanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu Ift se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se 2x zavede ra semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje směsí 55 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 30 mg 4‘ζ,-terc.butyl-des(4ζ-dimethylamino ) pristinamycinu iA.
^-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0.21 (dd, J= 16 a 5.5 Hz, IH, 5 &), 0.91 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.17 (mt, IH: 3 (i,), adl.20cbl.40 (mt, IH: 3 γ2), 1.33 (s, 9H: CH3 tert-butylu), 1.35 (d, J= 7.5 Hz,
3H: CH3 1 y),od 1.50dol.85 (mt, 3H: 3 γ3 a 0¾ 2 β), 2.04 (mt, IH, 3 β3), 2.13 (mt,
IH, 5 δ2), 2.30 (mt, 2H: 5 δ3 a 5 β3), 2.80 (dt, J= 13 et 4 Hz, IH: 5 ej, 3.00 (dd, J= a 4 Hz, IH: 4 β^, 3.29 (s, 3H: NCH34), 3.31 a 3.59 (2 mts, IH každý : CH, 3 δ), 3.40 (t, J= 12 Hz, IH: 4 β3), 4.57 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.74 (dd šir., J= 13 a 7 Hz, IH: 5 ε,), 4.85 (mt, IH: 2a), 4.90 (d šir. , J= 10 Hz, IH: la), 5.21 (d šir., J=
5.5 Hz, IH: 5 a), 5.25 (dd, J= 12 a 4 Hz, IH: 4 a).5.87(d, J= 9 Hz, IH: 6 a), 5.92 (q šir., J= 7.5 Hz, IH: 1
Příklad 14
Příprava 4ζ-isopropyl-des(4?^-dimethylamino)pristinamycinu a 4ζ-isopropyl-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycinu I£
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmenu SO92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (R,S)-4-isopropylfenylalaninu (10 g/1) v 0,1N roztoku hydroxidu sodného, přičemž uvedený (R,S)-4-isopropylalanin byl syntetizován způsobem popsaným v příkladu 36-1. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního řinutu pocházejícího ze 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi 66 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu. Supernatant se potom extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silíkagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu se sloučí a odpaří. Získá se 61 mg suchého zbytku. Tento zbytek se vyjme 9 ml směsi 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede třikrát na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 55 % 1Q0mM fosfátového pufru s pH
2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 51 mg 4^-isopropyl-des(4 t^-dimethylamino)pristinamycinu I .
0.31 (dd, J= 16 a 5.5 Hz, IH, 5 β,), 0.91 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), cdl.OOdo 1.45 (mt, 2H: 3 |3j a 3 γ2), 1.25 (d, J= 7.5 Hz, 6H: CH3 isopropyh), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CHj 1 γ), cd 1.50dol.85 (mt, 3H: 3 γ3 a CH2 2 β), od 1.95do2.20 (mt, 2H, 3 β3 a 5 δ2), 2.30 (mt, 2H: 5 δ3 a 5 β1), 2.80 (dt, J= 13 a 4 Hz, IH: 5 ε,), 2.88 (mt, IH: CH isopropylu), 2.98 (dd, J= 12 a 4 Hz, IH: 4 β,), 3.30 (s, 3H: NCH3 4), 3.32 a
3.55 (2 mts, IH kaž^ : CH, 3 δ), 3.38 (t, J= 12 Hz, IH: 4 β3), 4.55 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.72 (dd šir., J= 13 a 7 Hz, IH: 5 ε3), 4.85 (mt, IH: 2a), 4.88 (d šir.
Hz, IH: la), 5.21 (d šir. , J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.25 (dd, J= 12 a 4 Hz, IH: 4 a), 5.87(d, J= 9 Hz, IH: 6 a), 5.90 (q šir. , J= 7.5 Hz, IH: 1β), 6.50 (d, J= 9.5 Hz, IH:
Ze stejných frakcí opouštějících výše popsaný sloupec
NH 2), cd 7.05do7.35 (mt, 9H: H Aromatický 6 - 4e a 4δ)„ 7.50 (mt, 2H: Γ Hj a Γ
HJ, 7.86 (dd. J = 4 a 1.5 Hz, IH: Γ HJ, 8.40 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.72 (d, J= 9
Hz, IH: NH 6), 11.60 (s, IH: OH).
silikagelu a obsahujících rovněž nový derivát pristinamycinu lg se izoluje 5 mg 4ξ -isopropyl-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycinú I v případě, že se provede chromatografie na výše popsaném semipreparativním sloupci.
^Η-Nukleární magnecickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0.20 (mt. IH, &), 0.92 (t, J= 7.5 Hz. 3H: CH3 2 γ). od 1.15 <±>1.40 (mt. 2H: 3 β, et 3 γ2), 1.24(d, J= 7.5 Hz, 6H: CH3 isopropylu), 1.34 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 1 γ), od 1.35<±>2.05 (mt, 9H: 3 7l - 3 β3 - CH, 2 β - CH, 5 δ - CH2 5γ a 5 β3), 2.45 (dt, J= 13 a 1.5 Hz, IH: 5 ej, 2.89 (mt, IH: ArCH), 3.09 (dd, J= 14 a 7 Hz, IH: 4 β,), 3.17 (s, 3H: NCH34),3.25 (dd, J= 14 a 9 Hz, IH: 4 β:), 3.32 a 3.52 (2 mts, IH : 0¾ 3 δ),
4.55 (mt, 2H: 3 α a 5 ε3), 4.80 (mt, IH: 2a), 4.89 (dd, J=10 a 1.5 Hz, IH: la), 4.90 (mt, IH: 5 a), 5.35 (dd, J= 9 a 7 Hz, IH: 4 a), 5.60 (d, J= 8 Hz, IH: 6 a), 5.89 (dq,
J= 7.5 a 1.5 Hz, IH: 1β), 6.65 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.08 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ),
7.14 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), od 7.20 dd7.40 (mt, 7H: H Aromatický 6 - 1' H4 a 1' H5), 7.77 (d šir. , J=4 Hz, IH: 1’ H^), 8.46 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.48 (d, J= 8 Hz, IH: NH 6),11.70 (s, IH: OH).
Příklad 15
Příprava 4 £ -methylamino-des(4^-dimethylamino)pristinamycinú I
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml vodného roztoku (10 g/1) (R,S)-3-methylaminofenylalaninu, který byl syntetizován způsobem popsaným v příkladu 35-3. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu a získaná směs se odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormentanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu, který se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinů I se sloučí a odpaří. Získá se 19 mg suchého zbytku. Tento zbytek se vyjme 3 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7yuC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 55 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 8 mg 4 -methylamino-des ( 4 -dimethylamino )pristinamyciU IA.
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0 93 (t
J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.00 (dd, J= 16 a 6 Hz, IH, 5 &), 1.17 (mt, IH: 3 &), cd 1.25dbl.4O (mt, 2H: 3 γ2), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ), cd 1.55 dol.80 (mt, 3H: 3 γ3 a. CH. 2 β), 2.03 (mt, IH, 3 β3), 2.23 (mt, IH, 5 δ2), 2.39 (d šir. , J= 16 Hz, IH: 5 δ3), 2.52 (d, J= 16 Hz, IH: 5 β,), 2.78 (s, 3H: ArNCH3 4), 2.85 (dt, J= 13 a 4 Hz,
IH: 5 ej), 2.99 (dd, J= 13 a 4.5 Hz, IH: 4 β^, 3.23 (s, 3H: NCH3 4), 3.25 (t, J= 13 Hz, IH: 4 ft), 3.38 a 3.58 (2 mts, IH každý CH2 3 δ), 4.05 (mf, IH: ArNH), 4.58 (dd, J= 6.5 a 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.76 (dd šir. , J= 13 a 8 Hz, IH: 5 ε3), 4.85 (mt, IH:
2a), 4.87 (d šir. , J= 10 Hz, IH: la), 5.35 (dd, J= 13 a 4.5 Hz, IH: 4 a), 5.38 (d šir. , J= 6 Hz, IH: 5 a), 5.90 (d, J=9.5 Hz, IH: 6 a), 5.91 (mt, IH: 1β), 6.36 (s šir. , IH: H 2 aromatický v 4), cd 6.45do6.55 (mt, 2H: H 4. a H 6 aromatický v 4), 6.53 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2), 7.12 (t, J= 8 Hz, IH: H 5 aromatický v 4), cd7.15do7.45 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.35 (mt, 2H: 1' H4 a 1'
Hj), 7.75 (t, J = 3 Hz, IH: 1' H*), 8.40 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.78 (d, J= 9.5 Hz,
IH: NH6), 11.60 (s, IH: OH).
Příklad 16
Příprava 4 £-methoxy-des(4 ξ-dimethylamino)pristinamycinů a 4 8-methoxy-des(4-dimethylamino)pristinamycinů IH
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (S)-3-methoxyfenylalaninu) (5 g/1) v 0,1N roztoku hydroxydu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího ze 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % lOOmM fosfátového pufru s pří 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu, načež se tento sloupec eluuje za použi tí elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu IA se sloučí a odpaří. Získá se 41 mg suchého zbytku. Tento zbytek se vyjme 6 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 55 % lOOmM fosfátového pufru s oH 2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin sa sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 28 mg 4 £-methody-des(4^-dimethylamino) pristinamycinu I 1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0.52 (dd,
J= 16 a 5.5 Hz, IH, 5 fr), 0.90 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), od 1.10*1.34 (mt, 2H: 3 fr a 3 γ2), 1.34 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 lY),cd 1.50*1.80 (mt, 3H: 3 Yla CH, 2 β),
2.04 (mt, IH, 3 fr), 2.20 (mt, IH, 5 δ2), 2.35 (d sir., J= 16 Hz, IH: 5 δ3), 2.38 (d,
J= 16 Hz, IH: 5 fr), 2.83 (dt, J= 13 a 4 Hz, IH: 5 ε,), 2.97 (dd, J= 12 a 4 Hz, IH: 4 fr), 3.28 (s, 3H: NCH3 4), 3.28 a 3.56 (2 mts, lHkaá# : CHj 3 δ), 3.40 (t, J= 12 Hz, IH: 4 fr), 3.80 (s, 3H: OCH3), 4.58 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.76 (dd šir. , J= 13 a 8 Hz, IH: 5 ε3), 4.85 (mt, IH: 2a), 4.90 (d šir., J= 10 Hz, IH: la), 5.27 (dd, J= a 4 Hz, IH: 4 a), 5.30 (d šir.., J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.89 (d, J= 9.5Hz, IH: 6 a),
5.91 (q sir., J= 7.5 Hz, IH: 1β), 6.51 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2), od 6.80*6.90 (mt,
3H: H 2 - H 4 a H 6 aromatika v 4), od 7.15*7.40 (mt, 6H: H 5 aromatika v 4 et H Aromatický 6), 7.45 (dšir. , J= 9 Hz, IH: 1' HJ, 7.50 (dd, J= et 4 Hz, 1Η:Γ HJ, 7.80 (d šir., J = 4 Hz, IH: 1’ HJ, 8.40 (d, J= 10 Hz, IH: NH
1), 8.73 (d, J= 9.5 Hz. IH: NH 6), 11.62 (s, IH: OH).
Z frakcí opouštějící výše popsaný sloupec silikagelu a obsahujících nový derivát pristinamycinu se izoluje 7 mg 4 £-methoxy-des(4 ζ -dimethylamino)pristinamycinu I„ (hmotová
4spektroskopie: M+H = 826) v případě, že se provede chromatograf ie na výše popsaném semipreparativním sloupci.
Příklad 17
Příprava 4 £-fluor-4 ζ-methyl-des(4 “^-dimethylamino)pristinamycinu iA
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se způsobem popsaným v příkladu 3 provede kultivace kmenu SP92::pVRC508 v· produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (10 g/1) (R,S)-3-fluor-4-methylfenylalaninu v 0,1N roztoku hydroxidu sodného, přičemž uvedený (R,S)-3-fluor4-methylfenylalanin byl syntetizován způsobem popsaným v příkladu 34-5. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího ze 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se potom dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu, načež se tento sloupec eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu I se sloučí a odpaří. Získá se 15 mg suchého zbytku. Tento suchý zbytek se vyjme 3 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nuclesil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 55 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 9 mg 4 čč-fluor-4 ^-methyl-des63 (4 -dimethylamino)pristinamycinu
J= 16 a 5.5 Hz, IH, 5 ^), 0.91 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.12 (mt, IH: 3 &), od 1.25dol.35 (mt, IH: 3 γ2), 1.33 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH31 γ), cd 1.50do 1.85 (mt, 3H: 3 γ, a CHj2 β), 2.02 (mt, IH, 3 β1), 2.13 (mt, IH, 5 δ2). 2.27 (s, 3H: AiCH3), 2.36 (d šir. , J= 16 Hz, IH: 5 δ3). 2.45 (d, J= 16 Hz. IH: 5 β3), 2.85 (dt, J= 13 a 4.5 Hz, IH: 5 ε,), 2.97 (dd, J= 12.5 a 4.5 Hz, IH: 4 β2), 3.23 (s. 3H: NCH34), 3.30 a 3.56 (2 mts, IH každý : CHj 3 δ), 3.37 (t, J= 12.5 Hz, IH: 4 βχ), 4.55 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a),
4.75 (dd šir. J= 13 a 8 Hz, IH: 5 nj, 4.83 (mt, IH: 2a), 4.89 (d šir. , J= 10 Hz, IH: la), 5.29 (dd, J= 12.5 a 4.5 Hz, IH: 4 a), 5.32 (d šir., J= 5.5 Hz, IH: 5 a),
5.89 (d, J= 9.5 Hz, IH: 6 a), 5.92 (mt, IH: 1β), 6.49 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2), 6.90 (mt, 2H: H 2 a H 6 aromatio. v 4), 7.11 (t, J= 8 Hz, IH: H 5 aromatite v 4),cd 7.10do7.30 (mt, 5H: H Aromatický 6), 7.43 (dd, J= 8.5 a 1 Hz, IH: Γ H4),
7.49 (dd, J= 8.5 a 4.5 Hz, IH: Γ Hj), 7.75 (dd, J = 4.5 a 1Hz, IH: 1' H^, 8.48 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.70 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.60 (s, IH: OH).
Příklad 13
Příprava 4 -ethylamino-des(4 -dimethylamino pristinamycinu
V měítku 50 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (R,S)-4-ethylaminofenylalanin-hydrogenchloridu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 33, v 0,1N roztoku hydroxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se
1,5 litru produkčního rmutu pocházejícího z 50 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetobitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. ChlormeChylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4 -ethylamino-des(4%-dimethylamino)pristinamycin se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 65 % vody a 35 % acetonitrilu, načež se získaná směs zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucle sil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 60 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4ξ-ethylamino-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycin I se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 10 mg 4^-ethylamino-des(4ζ-dimethylamino)pristi namycinu I .
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0,72 (dd, J = a 6 Hz, IH : IH odCH, v 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH, v 2 γ) ; 1,15 (mt,
IH : IHod CH2 v 3 β) ;ad l,20aol,40 (mt, IH : IH cd CH, v 3 γ) ; 1,27 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CHj éthylu); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CH, v 1γ);* 1,50*1,65 (mt, IH : drJý H od (3¾ v 3 γ) ; 1,60 et 1,74 (2 mts, IH kažžý : CH, v 2 β) ; 2,02 (mt,
IH : druhý H cd CH, v 3 β) ; 2,21 et 2,33 (respective mt a d šir.. J = 16,5 Hz,
IH : CH, v 5 δ); 2,40 (d, J = 16 Hz, IH : dniý H od CH, v 5 β) ; 2,82 (dt,
J = 13 a 4,5 Hz, IH : IH* CHj v 5 ε) ; 2,89 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH cd CH, v 4 β) ; 3,10 (mt. 2H : NCH, éthylu); cd 3,20*3,35 (mt, IH : IH od CH, v 3 δ); 3,26 (s, 3H : NCH,); 3,31 (t. J = 12 Hz, IH : druhý Hod CH, v 4 β) ; 3,54 (mt,
IH : dnhý H cd CH, v 3 δ) ; 3,67 (mf. IH : NH) ; 4,56 (dd, J = 6,5 et 7 Hz, IH : 3
a); 4,75 (dd šir. , J = 13 a8 Hz, IH : druhý Had. CH, v 5 ε); 4,84 (mt, IH : 2 a) ; 4,90 (d šir. . J = 10 Hz, IH : 1 a) ; 5,24 (dd, J = 12 v 4 Hz, IH : 4 a) ; 5,32 (d šir. , J = 6 Hz, IH : 5 a) ; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 a) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,52 (d, J = 8 Hz, 3H : NH v 2 a H Aromatický v 4 ε); 7,00 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ); cd 7,103o 7,35 (mt, 5H : H Aromatický v 6) ; 7,46 (AB limit··,
2H : 1' H4a l1 Hj); 7,84 (dd, J = 4 a 1 Hz, IH : Γ ; 8,45 (d, J = 10 Hz, IH : NH v . 1); 8,77 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH v 6); 11,65 (s, IH : OH).
Příklad 19
Příprava 4 ζ-diethylamino-des(4 ζ-dimethylamino)pristinamyci65 nu ΙΑ
V měřítku 50 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (R,S)-4-diethvlaminofenylalaninu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 33, v 0,1N roztoku hydroxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 1,5 litru produkčního rmutu pocházejícího z 50 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4ξ-diethylamino-des(4ζ-dimethylamino ) pristinamycin se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se nadvakrát zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/ugC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Na gel), který se potom eluuje za použití eluční soustavy tvořené 68 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 32 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4ζ-diethylamino-des(4^-dimethylamino)pristinamycin IA se sloučí a extrahují jedním objemem dicnlormetha nu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 50 mg 4ŽS, -diethylamino-des (4^-dimethylamino)pristinamycinů 1^.
^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0.65 (dd, J = a 6 Hz, IH : IH od CHj v 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,14 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3 ‘ethylu) 1,15 (mt, IH : IH od CH, v 3 β) ; 1,26 (mt, IH : IH od CH, v 3 γ) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH, v 1 γ) ; 1,55 (mt, IH : drJý Hod CH, v 3 γ) ; 1,63 a 1,75 (2 mts, IH každý .: CH, v 2 β) ; 2,02 (mt, IH : drdý H od CH, v 3 β) ; 2,22 et 2,31 (respective mt a d šir., J = 16,5 Hz, IH každý :
CH, v 5 δ); 2,37 (d. J = 16 Hz, IH ;drdý H cd CH, v 5 β) ; 2,80 (dt, J = 13 a 4,5
Hz, 1H : 1H od 0¾ v 5 ε) ; 2,89 (dd, J = 12,5 et 4 Hz. 1H : 1H a3 CHj v 4 β) ;<£ 3,20do3,40 (mt, 6H : NCH, ethylu- 1H CHj v 3 δ a <3rdý H od CH2 · v 4 β) ; 3,27 (s, 3H : NCHý ; 3,55 (mt, 1H : drJý H od CHj v 3 δ) ; 4,58 (dd, J = 8 a 6 Hz, 1H : 3 a) ; 4,76 (dd šir. , J = 13 a 7,5 Hz, 1H : drdý Hod CH, v 5 ε) ; 4,84 (mt, 1H : 2 a); 4,89 (dd, J = 10 a 1 Hz, 1H : 1 a); 5,21 (dd, J = 12,5 a 4 Hz, 1H : 4
a); 5,28 (d šir.:, J = 6 Hz, 1H : 5 a) ; 5,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H : 6 a) ; 5,90 (mt, 1H :
β); 6,52 (d, J = 9,5 Hz, 1H : NH v 2); 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 ε) ; 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ) ; od 7,10 do7,35 (mt, 5H : H Aromatický v 6) ; 7,46 (AB limit., 2H : 1* H4 a 1' Hý ; 7,88 (dd, J = 4,5 a 2,5 Hz,
1H : 1' H*) ; 8,43 (d, J = 10 Hz, 1H : NH v 1) ; 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H : NH v 6) ;
11,62 (s, 1H : OH).
Příklad 20
Příprava 4 ξ-diallylamino-des(4 ζ-dimethylamino)pristinamycin“ V
V měřítku 94 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVPC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá roztok (20 g/1) (R,S)-4-diallylaminofenylalaninu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 38-1, ve vodě. Po 40 hodinách kultivace se 2,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 94 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu díchlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormenthanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v díchlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v diehiórmethanu. Frakce obsahující 4ζ-diallylaminodes(4ζ-dimethylamino)pristinamycin I se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7^uC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 48 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4ζ-diallylamino-des(4 -dimethylamino)pristinamycin IA se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 15 mg 4ζ-diallylamino-des(4 ζ-dimethylamino)pristinamycinu 1^.
1H-Nukleárn£ magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0,55 (dd, J = a 6 Hz, IH : lHcd CH2 v 5 β) ; 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,18 (mt, IH : IH cd CH2 v 3 β) ; 1,25 (mt, IH : IH cdCH2 v 3 γ) ; 1,34 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH3 v 1 γ) ; 1,59 (mt, IH : druhý H od CH2 v. 3 γ) ; 1,68 a 1,78 (2 mts,
IH kažřz : CH2 v 2 β) ; 2,04 (mt, IH : druhý H od 0¾ v 3 β) ; 2,25 a 2,34 (respecáve mt a d šir. , J = 16,5 Hz, IH kaž^ : CH2 v 5 δ) ; 2,40 (d, J = 16 Hz, IH : druhý Hod CH2 v 5 β) ; 2,83 (dt, J = 13 a 4,5 Hz, IH : IH odCH2 v 5 ε) ; 2,92 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH odCH2 v 4 β) ; od 3,20 *3,30 (mt, IH : IH od CH2 v 3 Ó) ; 3,29 (s, 3H : NCH3) ; 3,33 (t, J = 12 Hz, IH : druhý. Hod CHp v 4 β) ; 3,57 (mt, IH : druhý Hod CH2 v. 3 δ) ; 3,93 (AB limit , 4H: NCH2 allylu) ; 4,60 (dd, J = 8 a 6,5Hz, IH : 3 a) ; 4,78 (dd šir., J = 13 a 7,5 Hz, IH : druhý H od CH2 v 5 ε) ; 4,87 (mt, IH : 2 a) ; 4,92 (dd, J = 10 a l Hz, IH : 1 a) ; od 5,10*5,25 (mt, 5H : 4 a a =CH2 allylu); 5,28 (d šir·, J = 6 Hz, IH : 5 a) ;
5,85 (mt, 2H : CH= allylu); 5,92 (d, J = 9,5 Hz, IH :6a); 5,94 (mt, IH : 1 β) ;
6,54 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 2) ; 6,65 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 ε) ;
7,05 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ) ; od 7,10 *7,35 (mt, 5H :
H Aromatický v 6) ; 7,51 (AB limit., 2H : 1' H4 a 1' H5) ; 7,88 (dd, J = 4 a 2 Hz,
IH : 1' Hg) ; 8,43 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 1) ; 8,77 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH v 6) ; 11,65(3,1H:OH).
Příklad 21
Příprava 4 ξ-allylethylamino-des(4 ζ-dimethylamino)pristinamycinu iA
V měřícku 26 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem poosaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v prodkučním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá ml roztoku (20 g/1) (R,S)-4-allylethylaminofenylalanin-hydro genchloridu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 39-4, v 0,1N roztoku hydroxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 0,78 litru produkčního rmutu pocházejícího z 26 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % TOOmM
V fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu a získaná směs se odstředí. Supernatant se potom extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4ξ-allylethylamino-des (4ξ-dimethylamino)pristinamycin 1^ se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 52 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 48 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4 -allylethylamino-des(4% -dimethylamino)pristinamycin 1^ se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a po tom odpaří. Získá se 20 mg 4ζ -allylethylamino-des(4^-dimethylamino ) pristinamycinu IA· ^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0,58 (dd, J =
6 Hz, IH : IH odCl·^ v 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,16 (t, J = 7 Hz, 3H : CH3 ethylu) ; 1,16 (mt, IH : IH cd. CHj v 3 β) ; 1,25 (mt, IH : IH cd CHj v 3 γ) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH3 v 1 γ) ; 1,54 (mt, IH : dr±ý Hod CHj v 3 γ) ; 1,63 a 1,75 (2 mts, IH každý : CHj v 2 β) ; 2,02 (mt, IH :drůý H od CHj v 3 β) ; 2,23 a 2,31 (respective mt a d šir. , J = 16,5 Hz, IH každz :
CH, v 5 5); 2,37 (d, J = 16 Hz, IH : drřý Hed CH2 v 5 β) ; 2,80 (dt, J = 13 a 4,5 Hz, IH : IH cdCH, v. 5 ε) ; 2,87 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH cd CH, v 4 β) ; od
3,15 <±3,30 (mt, IH : IH odCř^ v 3 δ); 3,26 (s. 3H : NCHý ; 3,30 (t, J = 12 Hz, IH : dniý H ad CH2 v 4 β) ; 3,36 (mt, 2H : NCH, ethylu;; 3,54 (mt, IH : áxřý H cdCHj v3 δ); 3,90 (AB limit.. 2H : NCH, allylu) ; 4,57 (dd, J = 8 a 6 Hz, IH :
a); 4,76 (dd šir., J = 13 a 7,5 Hz, IH : detřý H od CH, v 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2
- 69 α) ; 4,89 (dd, J = 10 a 1 Hz, 1H : 1 α) ;od 5,05 <±ó,20 (mt, 3H : 4 α a allyJu); 5,27 (d šir , J = 6 Hz, 1H : 5 a); 5,83 (mt, 1H : CH= allyW; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H : 6 a); 5,91 (mt, 1H : 1 β) ; 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H : NH v 2) ; 6,60 (d,
J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 ε) ; 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ) ; cd 7,10do 7,35 (mt, 5H : H Aromatický v 6) ; 7,47 (AB limit., 2H : 1’ H< a 1’ Hj) ; 7,88(dd,J = 4a 2 Hz. 1H : 1* Hj) ; 8,41 (d, J = 10 Hz, 1H : NH v 1) ; 8,75 (d, J =
9,5 Hz, 1H: NH v 6); 11,62 (s, 1H : OH).
Příklad 22
Priprava 4 ^-ethyl-propylarnino-des ( 4 -dimethylamino) pristinamycinu I
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se přidá po 16 hodinách kultivace 1 ml roztoku (20 g/1) (R,S)-4-ethylpropylaminofenyl-hydrogenchloridu, syntetizovaného způsobem popsaný v příkladu 39-6, v 0,1N roztoku hydroxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu. Supernatant se potom extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethykenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4^ethylpropylamino-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycin se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 63 % IQOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 37 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4ζ-ethylpropylaminodes(4-dimethylamino)pristinamycin I se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou a vysuší nad síranem sodným a následně odpaří. Získá se 16 mg 4 ζ -ethylpropylamino-des ( 4 -dimethylamino) pristinamycinu ςα· 1H-Nukieární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0,67 (dd, J = et 6 Hz, 1H : 1H du CH, v 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 0,95 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH, propyU) ; 1,14 (t. J = 7 Hz, 3H : CH3 1'éthylu) ; 1,15 (mt,
1H : 1H od CH, v 3 β) ; 1,25 (mt, 1H : lHod CH, v 3 γ) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H :
CH3 v 1 γ) ; od 1,45 <±1,65 (mt, 3H : druhý H odCH, v 3 γ v CH, propylu) ; 1,63 a 1,75 (2 mts, 1H kažý : v 2 β) ; 2,02 (mt, 1H : druhý H cd CH, v 3 β) ;
2,23 2,33 (respective mt a dšir. , J = 16,5 Hz, 1H každý : CH, v 5 δ) ;
2,37 (d, J = 16 Hz, 1H : druhý H od CH, v 5 β) ; 2,80 (dt, J = 13 a 5 Hz, 1H : 1H od CH, v 5ε); 2,89 (dd, J = 12 a 4 Hz, 1H : 1H od CH, v 4 β) ; cd3,10 ±3,25 (mt, 3H : 1H ± CH, v 3 δ et NCH, . propylu) ; 3,26 (s, 3H : NCHj); od 3,25 ±
3,40 (mt, 2H : NCH, ethylu) ; 3,34 (t, J = 12 Hz, 1H : druhý Hod CH, v 4 β) ;
3,54 (mt, 1H : druhý H odCH, v 3 δ) ; 4,57 (dd, J = 7,5 a 6 Hz, 1H : 3 a) ; 4,76 (dd šir. , J = 13 a 7,5 Hz, 1H : druhý H od CH, v 5 ε) ; 4,84 (mt, 1H : 2 a) ; 4,89 (dd, J = 10 a 1 Hz, 1H : 1 a) ; 5,21 (dd, J = 12 a 4 Hz, 1H : 4 a) ; 5,28 (d šir. , J =
Hz, 1H : 5 a) ; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H :6a); 5,91 (mt, 1H : 1 β) ; 6,48 (d, J = 10 Hz, 1H: NH v 2) ; 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromatický v 4 ε) ; 7,03 (d, J - 8 Hz,
2H : H Aromaticý v 4 δ) ; cd 7,10 ±7,35 (mt, 5H : H Aromatický v 6) ; 7,47 (AB limit., 2H : Γ H4 a 1' Hj); 7,89 (mt, 1H : 1’ H^ ; 8,42 (d, J = 10 Hz, 1H : NH v
1) ; 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H : NH en 6); 11,62 (s, 1H : OH).
Příklad 23
Příprava 4 -trifluormethoxy-des(4^-dimethylamino)pristinamycinu iA
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (R,S)-4-O-trifluormethyltyrosinu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 34-8. Po 40 hodinách kultivace se 1,8.litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se potom extrahuje dvěma objemy dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme jedním ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silíkagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4Čý-trifluormethoxy-des4^dimethylamino)pristinamycin 1^ se sloučí a odpaří. Zbytek po odpaření se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % aceto nitrilu a získaná směs se nadvakrát zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 60 % 100mM fosfátového pufru s pří 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4^-trifluormethoxy-des(dimethylamino)pristinamycin 1^ se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 46,5 mg 4^-tri fluormethoxy-des-(4%-dimethylamino)pristinamycinu I .
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0 77 (dd J 16 et 5,5 Hz, IH : IH cd 0¾ v 5 β) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,08 (mt, IH : IH odCH, v 3 β) ;cd l,30dol,40 (mt, IH : IH cd (3¾ do 3 γ); 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CH3 v 1 γ) ; od 1,55 <±>1,70 (mt, IH : druhý H dCH, v 3 γ) ; 1.65 a
1,76 (2 mts, IH kaž# :0¾ v 2 β); 2,02 (mt, IH : druhý ; H od 0¾ v 3 β) ; 2,11 a 2,40 (respective mt a dšir. , J = 16,5 Hz, IH každý : (3¾ v 5 δ) ; 2,54 (d,
J = 16Hz, IH: dcdxý Hcd^ v 5 β); 2,88 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH v
ε); 3,08 (dd, J = 12 a 5 Hz, IH : IH od. 0¾ v 4 β); 3,22 (s, 3H : NCHJ ; cd3,30 Φ3.45 (mt, IH : IH od 0¾ v 3 δ) ; 3,39 (t, J = 12 Hz, IH : drdý H od CH2 v 4 β) ; 3,59 (mt, IH : drd-ý H ώΟί, v 3δ) ; 4,53 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 a) ; 4,75 (dd šir. . J = 13 a 8 Hz. IH : druhý H cd (3¾ v 5 ε): 4,85 (mt, IH : 2 a) ; 4,89 (dd, J = 10 a 1,5 Hz, IH : 1 a) ; 5,35 (d šir. , J = 5,5 Hz, IH : 5 a) ; 5,41 (dd, J = 12 a 5 Hz, IH : 4 a) ; 5,92 (d, J = 10 Hz, IH : 6 a) ; 5,93 (mt, IH : 1 β) ; 6,53 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH v 2); ad7,15 dV,35 (mt, 5H : H Aromatický v 6) ; 7,16 (d, J = 8 Hz,
2H : H Aromatický v 4 ε); 7,26 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromati cký v 4 δ) ; 7,37 (dd, J = 8,5 a 4 Hz, IH : 1' HJ ; 7,42 (dd. J = 8,5 a 1,5 Hz, IH : Γ HJ ; 7,70 (dd, J
-12= 4 a 1,5 Hz, IH : l’Hj) ; 8,37 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 1) ; 8,75 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 6) ; 11,66 (s, IH : OH).
Příklad 24
Příprava 4 ζ-allyloxy-des(4ζ -dimethylamino)pristinamycinu I,
A
V měřítku 90 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (S)-4-O-allyltyrosinu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 33, v 0,1N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Po 40 hodinách kultivace se 2,7 litru produkčního rmutu pocházejícího z 90 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 100mM fosfátovým pufrem s pK 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4ξ -allyloxy-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycin IA se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7yuC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje směsí tvořenou 52 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 48 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4 -allyloxy-des(4 ^-dimethylamino)pristinamycinu IA se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 29 mg 4ζ-allyloxy-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycinu I,.
Λ ^-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0,63(dd,J = a 6 Hz, IH : IH očCHj v 5 β) ; 0,91 (t. J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,13 (mt,
IH : lHod CH2do 3 β) ; 1,29 (mt, IH : IH od CH2 v 3γ) ; 1,33 (d, J = 6.5 Hz, 3H :
CH3 V 1 γ) ; 1,57 (mt, IH : druhý H od CH, v 3 γ) ; 1,65 a 1,74 (2 mts, IH : Cl·^ v 2 β) ; 2,02 (mt, IH : druhý. H od CH, v 3 β) ; 2,14 et 2,34 (respective mtetd šir., J = 16,5 Hz, IH kaž^ : CH, v 5 δ); 2,43 (d, J = 16 Hz, IH :druhý h od CH, co 5 β); 2,85 (dt, J = 13 a 4 Hz, IH : IH odCH, do 5 e) ; 2,95 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH cd CH, v4 β) ; 3,25 (s, 3H : NCHý ; 3,33 (mt, IH : IH odCH, v 3 δ); 3,36 (t, J = 12 Hz, IH : dn±ý H cd CH, v 4 β) ; 3,56 (mt, IH : druhý H odCH, v 3 δ) ; 4,51 (AB limit., 2H : OCH, allylu); 4,56 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 a) ; 4,75 (dd šir., J = 13 a 8 Hz, IH :družý H al CH, v 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 a) ; 4,88 (dd, J = 10 a 1 Hz, IH : 1 a) ; 5,27 (dd, J = 12 a 4 Hz. IH : 4 a) ; 5,32 (d šir., J =
Hz, IH : 5 a) ; 5,30 a 5,40 (respective mt a dd, J = 17 et 1,5 Hz, IH kažčý : =CH, allylu); 5,89 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 a) ; 5,91 (mt, IH : 1 β) ; 6,02 (mt, IH : CH= allylu) ; 6,50 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 2) ; 6,85 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 ε); 7,12 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ) ; od 7,10do7,35 (mt, 5H : H Aromatický v 6); 7,45 (dd, J = 8.5 a 1,5 Hz, IH : 1' H^ ; 7,57 (dd, J = 8,5a 4 Hz, IH : Γ Hý ; 7,77 (dd, J = 4 a 1,5 Hz, IH : Γ Hý ; 8,41 (d,J = 10Hz, IH : NH v 1); 8,74 (d, J = 9,5 Hz, IH ; NH v 6); 11,63 (s, IH : OH).
Příklad 25
Příprava 4 ζ-ethoxy-des(4^-dimethylamino)pristinamycinu 1^
V měřítku 90 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmene SP92::pVRC508 v produkč ním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (S)-4-O-ethyltyrosin-hydrochloridu, syntetizovaného v příkladu 33, v 0,1N roztoku kyseliny chloro vodíkové. Po 40 hodinách kultivace se 2,7 litru produkčního rmuti pocházejícího z 90 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi obsahující 66 % 100mM fosfátového pufru s pH
2,9 a 34 % acetonitrilu a získaná směs se odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlor methanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichoormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frak ce obsahující 4 -ethoxy-des(4 -dimethylamino)přístinamycin I se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvoře né 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje směsí tvořenou 52 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 48 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4 -ethoxy-des(4 -dimethylamino)pristinamycin IA se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 29 mg 4 -ethoxy-des(4 -dimethylamino)pristinamycinu IA· 1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): ~ ,, , Λ, ,
0,64 (dd, J = a 5,5 Hz, IH : IH od CH,do 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,12 (mt, IH : IH odCH, v 3 β) ; 1,25 (mt, IH : IH od CH, v 3 γ) ; 1,33 (d, J = 7 Hz,
3H : CH3 v 1 γ) ; 1,42 (t, J = 7 Hz, 3H : CH3 éthylu) ; 1,57 (mt, IH : dnřý Hod CH, v 3 γ) ; 1,63 a 1,74 (2 mts, IH kaš# : CH, v 2 β) ; 2,02 (mt, IH : kaš# H od CH, v 3 β) ; 2,16 a 2,35 (respective mta d šir. , J = 16,5 Hz, IH kaš# :
CH, v 5 δ) ; 2,43 (d, J = 16 Hz, IH : drd# H od CH, v 5 β) ; 2,83 (dt, J = 13 a 4 Hz, IH : IH od CH, v 5 ε) ; 2,93 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH od CH, v 4 β) ;cri 3,15do3,30 (mt, IH: IH od CH, v 3 δ); 3,24 (s, 3H : NCHý ; 3,35 (t, J = 12 Hz, IH : dru# H odCH, v 4 β) ; 3,55 (mt, IH :dniý Hod t CH, v 3 δ) ; 3,95 (AB limit,,
2H : OCH, ethylu); 4,56 (dd, J = 7,5 a 6 Hz, IH : 3 <x) ; 4,75 (dd šir., J = 13 a 8 Hz, IH : dni# Had. CH, v 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 a) ; 4,87 (dd, J = 10 a 1 Hz,
IH : 1 a) ; 5,26 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : 4 a) ; 5,32 (d šir. ,J = 5,5 Hz, IH : 5 a) ;
5,88 (d, J = 10 Ηζ,ΪΗ :6a); 5,92 (mt, IH : 1 β) ; 6,48 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 2) ; 6,83 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 ε) ; 7,10 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ) ; cd 7,10 do7,35 (mt, 5H : H Aromatčký v 6) ; 7,44 (dd, J =
8,5a 1,5 Hz, IH : 1’HJ ; 7,57 (dd, J = 8,5 a 4,5 Hz, IH : Γ Hý ; 7,77 (dd, J = 4,5 a
1,5 Hz, IH : 1' H^ ; 8,38 (d. J = 10 Hz, IH : NHv 1) ; 8,75 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 6); 11,60 (s, IH : OH).
EPříklad 26
Příprava 4 ξ-(2-chlorethoxy)des(4 ξ-dimethylamino)pristinamycinu IA
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se způsobem popsaným v příklad 3 provede kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) ( S)-4-0-(2-chlorethyl)tyrosin-hydrochloridu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 42-1, ve vodě.
Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu. Supernatant se potom dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4^-(2-chlorethoxy)-des(4^-dimethylamino)pristinamycinú 1^ se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná smés se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC3 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se potom eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 60 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4^-(2chlorethoxy)-des(4 ζ-dimethylamino)pristinamycin I se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 3,2 mg 4'ζ-(2-chlorethoxy)-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycinu I..
A
Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
ť 0,66 (dd, J = a 5.5 Hz, IH : IH od CH, v 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz. 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,13 (mt, IH ; IH od CH, v 3 β) ; 1,28 (mt. IH : IH cd CH, v 3 γ) ; 1,33 (d, J = 7 Hz,
3H : CH3 v 1 γ) ; 1,57 (mt, IH : driý H od CH, v 3 γ) ; 1,66 a 1,76 (2 mts, IH kaádz ; CH, v 2 β) ; 2,02 (mt, IH : druhý H od CH, v 3 β) ; 2,16 a 2,37 (respective mt a d šir., J = 16,5 Hz, IH kaážý : CH, v 5 δ) ; 2,47 (d, J = 16 Hz, IH : drúý H oáCHj v 5β); 2,86 (dt, J = 13 a 4 Hz, IH : IH odCH, v 5 ε);
2,95 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH ožCHjdt 4 β) ; 3,23 (s, 3H : NCH,) ; 3,32 (mt, IH zlHcdCH, v3 δ) ; 3,37 (t, J = 12 Hz, IH :drdý H od CH, v 4 β) ; 3,57 (mt, IH :
druhý H cd CH, v 3 δ); 3,82 (t, J = 6 Hz, 2H : CK^Cl) ; 4,19 (AB limit, 2H : OCH, ethylu) ; 4,55 (dd, J = 7,5 a 7 Hz, IH : 3 a) ; 4,75 (dd šir. , J = 13 a8 Hz, IH :
dnlý H cd CHj v 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 a) ; 4,87 (dšir. J = 10 Hz, IH : 1 a) ;
5,28 (dd, J = 12a 4 Hz, IH : 4 a) ; 5,32 (d šir., J = 5,5 Hz, IH : 5 a) ; 5,88 (d, J =
Hz, IH : 6 a) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,50 (d, J = 10 Hz. IH : NH v 2) ; 6,86 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 ε) ; 7,13 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 6); od 7,10*7,35 (mt, 5H : H Aromatický v 6) ; 7,45 (AB limit., 2H : Γ H< a 1' HJ ;
7,75 (dd, J = 4 a 2 Hz, IH : 1' HJ ;-8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 1) ; 8,74 (d, J =
Hz, IH : NH v 6); 11,62 (s. IH : OH).
Příklad 27
Příprava 4 ^-acetyl-des-4 ^ζ-dime thy lamino) pristinamycinu I
V měřítku 6é Erlenmeyerových baněk se způsobem popsaným v příkladu 3 provede kultivace kmene SP92::pVPC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (S)-4-acetylfenylalaninu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 33, v 0,1N roztoku hydroxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 10mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se dvakrát extrahuje 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 h) v dichlormethanu a tento sloupec se eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4^acetyl)des(4ζ-dimethylamino)pristinamycin IA se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi 60 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje ve směsi tvořené 60 % lOOmM fosfátového pufru a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4 ^-acetyl-des (4^-dimethylami.no) pristinamycin IA se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 4,2 mg 4ζ-acetyl-des(4 ^-dimethylamino)pristinamycinu IA· ^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0,73 (dd, J =
6 Hz, IH : IH od. CHj v 5 β) ; 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2γ);1,12(ιηΐ,
IH : IH od CHj v 3 β) ; od l,25dol,45 (mt, IH : lHcd 0¾ v 3 γ) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CH3 v 1 γ); 1,62 (mt, IH: druhý H od CHj v 3 γ) ;cd l,60dol,85 (mt, 2H :0¾ v 2 β) ; 2,02 (mt, IH : dni# H cd CH2 v 3 β) ; 2,20 a 2,42 (respectíve mta d šir., J = 16,5Hz, IH kaž# :CHjV 5 6); 2,52 (d, J = 16 Hz, IH : dru# H cd CH, v 5 β); 2,60 (s, 3H : ArCOCH,); 2,88 (dt, J = 13 a 4,5 Hz. IH : IH cd CH, v 5 ε) ; 3,13 (dd, J = 13,5 a 5,5 Hz, IH : IH cd. CH, v 4 β) ; 3,21 (s, 3H : NCHj) ; od 3,30do3,50 (mt, IH :druhý H cd CH, v 4 β) ; od 3,30do3,50 a 3,63 (2 mts, IH kaž# :0¾ v 3 6) ; 4,53 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 a) ; 4,75 (dd šir., J = 13 a 8 Hz,
IH : dni# H cd CH2 v 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 a) ; 4,88 (dd. J = 10 a 1 Hz, IH : 1
a); 5,35 (d šir. , J = 6 Hz, IH: 5 a); 5,43 (dd, J = 10,5 a 4 Hz, IH : 4 a) ; 5,90 (d,
J = 9,5 Hz, IH : 6 a) ; 5,92 (mt, IH : 1 β) ; 6,56 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH v 2) ; cd 7,10dc7,35 (mt, 5H : H Aromaticky v 6) ; 7,28 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 6) ; 7,38 (dd, J = 8,5 a 2 Hz, IH : 1' HJ ; 7,42 (dd, J = 8,5 a 4,5 Hz, IH : Γ Hj) ;
7.66 (dd, J = 4,5 a 2 Hz, IH : 1' H^ ; 7,88 (d, J = 8 Hz. 2H : H Aromatický v . 4 ε) ;
8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 1); 8,74 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH v 6) ; 11,65 (s, IH :
OH).
Příklad 28
Příprava 4 £-dimethylamino-des(4 ^-dimethylamino)pristinamycinu IA
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se způsobem popsaným v příkladu 3 provede kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivacepřidá 1 ml roztoku (20 g/1) (R,S)-3-dimethylaminofenylalanin-hydrochlori, syntetizovaného v příkladu 35-10, v 0,1N roztoku hy droxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkč ního rmutu pocházejícícho z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru a 34 % acetonitrilu a získaná směs se odstředí. Supernatant se extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dixhlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a sloupec se eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4 £-dimethylaminodes ( 4 ζ-dimethy lamino) pristinamycin se sloučí a odpaří. Zby tek po odpaření k suchu se vyjme 3 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativ ní sloupec produktu Nucleosil 7^uC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 57 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 43 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4 £ -dimethylamino-des(4^-dime thylamino)pristinamycin IA se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 1,1 mg 4£-dimethylamino-des (4 ^-dimethylamino)pristinamycinu I .
1H-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v porn, ref.TMS):
0,63 (dd,
J = 16 a 5 Hz, IH : IH od CH, v 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,13 (mt, IH : IH od CH, v 3 β) ; od l,20± 1,35 (mt, IH : lHcd CH, v 3 γ) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH3 v 1 γ) ; 1,57 (mt, IH : dniý H od Cí^ v 3 γ) ; 1,63 a 1,76 (2 mts, IH kažý : CH, v 2 β) ; 2,02 (mt, IH : dniý H odCH, v 3 β) ; 2,08 a 2,31 (respective: mt a d šir., J = 16,5 Hz, IH kažý : CH, v 5 δ) ; 2,35 (d, J = 16
Hz, IH: druhý H od CH, v 5 β) ; 2,81 (dt, J = 13 a 4 Hz, IH : IH od CH, v 5 ε);
2,90 (s, 6H : N(CHj)2) ; 2,97 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH od CH, v 4 β) ; cd 3,20 ±
3,30 (mt, IH : IH od CH, v 3 δ) ; 3,28 (s, 3H : NCHj) ; 3,37 (t, J = 12 Hz, IH : dniý Hod CH, v 4 β); 3,57 (mt, IH: dn±ý H od CH, v 3 δ) ; 4,58 (t, J = 7,5 Hz,
IH : 3 a); 4,74 (ddšir. , J = 13a 8 Hz, IH : drdý H od. CH, v 5 ε) ; 4,86 (mt, IH :2a); 4,89 (d šir., J = 10 Hz, IH : 1 a) ; 5,27 (dd, J = 12 a4 Hz, IH : 4 a) ; 5,29 (d šir. , J = 5 Hz, IH : 5 a) ; 5,89 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 a) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ;
6,50 (d, J - 10 Hz, IH : NH v 2) ;od 6,50 ±6,70 (mt, 3H : H Aromatický v ortho a k. dimethylamino) ; od 7,15±7.35 (mt, 5H : H Aromatický v 6) ; 7,20 (t,
J =
- 79 Příklad 29
Příprava 4 £-methylthio-des(4Č^-dimethylamino)pristinamycinu
V měřítku 5 o Erlenmeyerových baněk se způsobem popsaným v příkladu 3 provede kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (R,S)-3-methylthiofenylalanin¥.hydrochloridu, sysntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 34-11, v 0,1N roztoku hydroxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 1,68 litru produkčního rmutu extrahuje dvěma objemy směsi tvořené 66 % IQOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrili a získaná směs se odstředí. Supernatant se extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 54 % vody a 46 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 55 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 45 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 20 mg 4 £. -methylthio-des ( 4 ζ-dimethylamino) pristinamycinu I .
^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): „ ,,
0,o6 (dd,
J = 16 a 5,5 Hz, IH : IH od CH2 v 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,13 (mt, IH : IH cdCH2 v 3 β) ; 1,28 (mt, IH : lHcd CH, v 3 γ) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz,
3H : CH3 v 1 7) ; 1,58 (mt, IH : dniý Hod CH2 v 3 γ) ; 1,62 a 1,74 (2 mts, IH každz : CH, v 2 β) ; 2,02 (mt, IH : dniý. H od CH, v 3 β) ; 2,25 a 2,35 (respective mt a dšir. , J = 16,5 Hz, IH každý : CH2 v 5 δ) ; 2,39 (d, J = 16
Hz, IH : drdý H odCH, v 5 β); 2,43 (s, 3H : SCHj); 2,82 (dt, J = 13 a 4 Hz. IH :
IH od CH2 do 5 ε); 2,98 (dd, J = 12 a 4,5 Hz, IH : IH cd CH2 v 4 β) ; 3,26 (s, 3H : NCHJ ; 3,30 (t, J = 12 Hz IH : IH cdCH2 v 3 6); 3,38 (mt, IH : dniý H cd CH2 v 4 β) ; 3,57 (mt, IH : dniý Hed CH2 v 3 6) ; 4,56 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 a) ; 4,74 (dd šir., J = 13 a 8 Hz, IH ; druhý H cd 0¾ v 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 a) ; 4,89 (dd, J = 10 a 1 Hz, IH : 1 a) ; 5,29 (dd, J = 12 a 4,5 Hz, IH : 4 a) ; 5.32 (d šir.,
J = 5,5 Hz, IH : 5 a) ; 5,88 (d, J = 9.5 Hz. IH : 6 a) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,51 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 2) ; 6,99 (d šir. ., J = 8 Hz, IH : H Aromatický v para k methylthio) ; 7,10 a 7,15 (respective s šir. a d šir. , J = 8 Hz, IH každý ; H Aromatický v ortho k methylthio) ; ad 7,15±> 7,35 (mt, 6H : H Aromatický v 6
a. H Aromatiký v meta k méthylthio) ; 7,43 (d šir.J = 8 Hz, IH : 1' HJ ; 7,52 (dd, J = 8 a 4 Hz, IH : Γ HJ ; 7,79 (d šir. J = 4 Hz, IH : Γ HJ ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH: NH v 1) ; 8,73 (d. J = 9,5 Hz, IH : NH v 6); 11,62 (s. IH : OH).
Příklad 30
Příprava 4 2.-ethoxy-des(4ζ-dimethylamino)pristinamycinu I
V měřítku 60 Erlenmeyerových baněk se provede způsobem popsaným v příkladu 3 kultivace kmenu SP29::pVRC508 v produkč ním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (S)-3-0-ethyltyrosin-hydrochloridu, syn tetizovaného způsobem popsaným v příkladu 37-1. Po 40 hodinách kultivace se 1,8 litru produkčního rmutu pocházejícího z 60 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Supernatant se extrahuje dvakrát 0,5 objemu dichlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a ten to sloupec se eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující nový derivát pristinamycinu IA se sloučí a odpaří. Získá se 19 mg suchého zbytku. Tento zbytek se vyjme 3 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7/UC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 60 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 40 % acetonitrilu. Frakce obsahující nový pristinamycin se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se 15,8 mg 4 £-O-ethoxy-des ( 4 ζ-dimethylamino)pristinamycinu ZA’ ^Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS):
0,bo (dd,
J = 16 a5,5 Hz, IH : IH odCHj v 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; 1,12 (mt, IH : IH odCHj v 3 β) ; 1,20 (mt, IH : IH odCH,, v 3 γ); 1,31 (d, J = 6,5 Hz,
3H : CH3 v 1 γ); 1,49 (t, J = 7 Hz, 3H : CH3 éthylu); 1,54 (mt, IH : drubý H cd CHj v 3 γ) ; 1,63 a 1,73 (2 mts, IH každý : CHg v2 β) ; 2,02 (mt, IH : druřý H cd CHj v 3 β) ; 2,22 et 2,33 (respective . mt a d šir., J = 16,5 Hz, IH každý :
CHj v 5 δ) ; 2,46 (d, J = 16 Hz, IH : druhý H od (¾ v 5 β) ; 2,83 (dt, J = 13 a 4 Hz, IH : IH odCH2 v 5 ε) ; 2,95 (dd, J = 12 a 4 Hz, IH : IH cd 0¾ v 4 β) ; 3,22 (mt, IH : IH cd CHj v 3 δ) ; 3,27 (s, 3H : NCHý ; 3,39 (t, J = 12 Hz, IH : druhý H cd. CHj v 4 β) ; 3,53 (mt, IH : druhý H od 0¾ v 3 δ) ; 3,93 a 4,03 (2 mts, IH kažý : OCHj éthylu) ; 4,56 (dd, J = 7 a 5,5 Hz, IH :3a); 4,75 (dd sir. , J =
13a 8 Hz, IH : druhý Hed CHj v 5 ε) ; 4,82 (mt, IH : 2 a) ; 4,88 (dd, J = 10 a
1Hz, IH : 1 a); 5,23 (dd, J = 12 a4Hz, IH : 4 a) ; 5,23 (d šir., J = 5,5 Hz, IH : 5
a) ; 5,87 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 a) ; 5,92 (mt, IH : 1 β) ; 6,47 (d, J = 10 Hz, IH : NH v 2) ; 6,80 (mt, 3H : H Aromatidý v ortho a para k éthoxy); cd 7,10 0:7,35 (mt, 6H : H Aromatický v 6 et H Aromatický v meta k éthoxy); 7,43 (dd, J = 8 a 1 Hz, IH: Γ H^); 7,50 (dd, J = 8 a4Hz, IH : Γ Hg); 7,77 (dd, J = 4a ΙΗζ,ΙΗ:
1' Hg); 8,38 (d, J = 10 Hz, IH: NH v 1); 8,70 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH v 6) ; 11,60 (s, IH: OH).
Příklad 31
Příprava 4ζ-ethylthio-des(4^-dimethylamino)pristinamicinu IA
V měřítku 2 Erlenmeyerových baněk se způsobem popsaným v příkladu 3 provede kultivace kmene SP92::pVRC v produkčním prostředí, ke kterému se po 16 hodinách kultivace přidá 1 ml roztoku (20 g/1) (S)-4-ethylthiofenylalanin-hydrochloridu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 33, v 0,1N roztoku hydroxidu sodného. Po 40 hodinách kultivace se 60 ml produkčního rmutu pocházejícího ze dvou Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % 100mM fosfátového pufru s pH
2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstředí. Super natant se extrahuje dvakrát 0,5 objemu díchlormethanu. Chlormethylenové fáze se promyjí vodou a potom sloučí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se zavede na sloupec silikagelu (30 g) v díchlormethanu a tento sloupec se eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v diehiórmethanu. Frakce obsahující 4 ζ -ethylthio-des ( 4 t^-dimethylamino)pristinamycin I se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 60 % vody a 40 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semiprepa rativní sloupec produktu Nucleosil 7^uC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Macherey Nagel), který se eluuje eluční soustavou tvořenou směsí 52 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 48 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4 -ethylthio-des(4 -dimethylamino)pris tinamycin I se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormetha nu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a potom odpaří. Získá se ? mg -ethylthio-des-(4 %-dimethylamino)pristinamycinu IA·
Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDC1.
J delta v ppm, ref.TMS): „ ,n £
0,68 (dd, J = 16 a 6
Hz, 1H: IHod CHj v 5 β) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H; CH3 v 2 γ) ; cd 1,10*1,40 (mt, 5H : 1H od CH, v 3 β a 1H od 0¾ v 3 γ CH3 .ethylu); 1,32 (d, J = 7 Hz, 3H: CH3 v 1 γ); od 1,45*1,85 (mt, 3H : dn±ý H od CHj ν3γ CH, v 2 β) ; 2,02 (mt, 1H H od CH, v 3 β) ; 2,18 a 2,37 (respective mt a d šir· , J = 16,5 Hz, 1H --eždý : CH, v 5 δ) ; 2,45 (d šir. , J = 16 Hz, 1H : dn±ý H ošCH, v 5 β) ; 2,85 (dt, J = 13 a 4 Hz, 1H : IHod. CH, v 5 ε) ; 2,90 (mt, 2H : ArSCH, ethyl ) ; 2,98 (dd, J = 12 a 4 Hz, 1H : IHod CH, v 4 β); 3,25 (s, 3H : NCHj) ; 3,35 (mt, 1H : 1H *CH, v 3 δ) ; 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H : dn±ý H cd CH, v 4 β) ; 3,57 (mt, 1H : čfcuý H od CH, v 3 δ) ; 4,55 (t, J = 7,5 Hz, 1H : 3
a) ; 4,75 (dd šir., j = 13 a 7,5 Hz, 1H : dedý H od CH, v 5 ε); 4,85 (mt, 1H :
a) ; 4,89 (dd, J = 10 a l Hz, 1H : 1 a) ;ad 5,25*5,40 (mt. 2H : 5 a a 4 a) ;
5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H : 6 a) ; 5,91 (mt, 1H : 1 β) ; 6,55 (d, J = 9,5 Hz, 1H : NH v 2) ; 7,10 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ) ; ad 7,10 *7,35 (mt, 7H : H
Aromaticky v 6 4 ε); 7,44 (AB limit ·, 2H : 1' H4 a 1' HJ ; 7,74 (mt, IH : 1'
HJ ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH v i); 8,75 (d, J = 9,5 Hz, IH ; NH v 6) ; 11,62 (s, IH: OH).
Příklad 32
Příprava 4ζ-ethyl-des(4ξ-dimethylamino)pristinamycinu I
V měřítku 2 Erlenmeyerových baněk se způsobem popsaným v příkladu 3 provede kultivace kmenu SP92::pVRC508 v produkčním prostředí, ke kterému se přidá po 16 hodinách kultivace 1 ml roztoku (20 g/1) (R,S)-4-ethylfenylalaninu, syntetizovaného způsobem popsaným v příkladu 33. Po 40 hodinách kultivace se 60 ml produkčního rmutu pocházejícího ze 2 Erlenmeyerových baněk extrahuje 2 objemy směsi tvořené 66 % lOOmM fosfátového pufru s pH 2,9 a 34 % acetonitrilu, načež se získaná směs odstře dí. Supernatant se extrahuje dvěma objemy dichlormethanu. Chlormethylenová fáze se promyjí vodou a potom sločí, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Suchý extrakt se vyjme 20 ml dichlormethanu a získaná směs se injikuje na sloupec silikagelu (30 g) v dichlormethanu a tento sloupec se potom eluuje za použití elučního gradientu 0 až 10 % methanolu v dichlormethanu. Frakce obsahující 4ζ -ethyl-des(4ξ-dimethylamino)pristinamycin IA se sloučí a odpaří. Suchý zbytek se vyjme 7 ml směsi tvořené 52 % vody a 48 % acetonitrilu a získaná směs se zavede na semipreparativní sloupec produktu Nucleosil 7yuC8 o rozměrech 10 x 250 mm (Maxherey Nagel), který se eluuje za použití eluční soustavy tvořené směsí 52 % 100mM fosfátového pufru s pH 2,9 a 48 % acetonitrilu. Frakce obsahující 4^-ethyl-des(4-dimethylamino)pristinamycin 1^ se sloučí a extrahují jedním objemem dichlormethanu. Organická fáze se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Získá se 0,50 mg 4ξ-ethyldes (4 ζ-dimethylamino)pristinamycinu 1^.
^-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^, delta v ppm, ref.TMS): 0,42 (dd, J = 16 a 5,5 Hz, IH : IH odCHjdo 5 β) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 v 2 γ) ; od
1,10 dd,40 (mt, 2H : IH odCHa v 3 β a IH odCHj v 3 γ) ; 1,23 (t, J = 7,5 Hz,
3H : CH3 ethylu); 1,35 (d, J = 7 Hz, 3H : CH3 v 1 γ) ; odl,45 dů.85 (mt, 3H : drdý H cd (¾ v 3 γ a CHj v 2 β) ; 2,02 (mt, IH ; drdý H od CHj v 3 β) ;
- 84 2,15 a od 2,25 ±2,40 (2 mts, 1H každý : CH, v 5 δ) ; ad 2,25 ±2,40 (mt, 1H : druhý H ad CH, v 5 β) ; 2,60 (q, J = 7,5 Hz, 2H : ArCH, ethylu) ; 2,83 (dt, J = 13 a 4 Hz, 1H : 1H od CH, v 5 ε); 2,98 (dd, J = 12 a 4 Hz, 1H : 1H ad CH, v 4 β) ; ±3,25 ±3,35 (mt, 1H : 1H cd CH, v 3 δ) ; 3,27 (s, 3H : NCH,) ; 3,39 (t, J - 12 Hz, 1H : druhý H od CH, v 4 β) ; 3,59 (mt, 1H : druhý H ad CH, v 3 δ); 4.58 (dd, J = 7 a 6,5 Hz, 1H : 3 a) ; 4,75 (dd šir., J = 13 8 Hz, 1H : druhý
H ad CH, v 5 ε) ; 4,87 (mt, 1H : 2 a) ; 4,89 (dd, J = 10 a 1 Hz, 1H : 1 a) ; 5,24 (d šir., J = 5,5 Hz, 1H : 5 a); 5,29 (dd, J = 12 a 4 Hz, 1H : 4 a) ; 5,88 (d,J = 10 Hz, 1H : 6 a) ; 5,92 (mt, 1H : 1 β) ; 6,73 (d, J = 10 Hz, 1H : NH en 2) ; cd 7,10* 7,35 (mt, 9H : H Aromatický v .6 · 4 e a 4 δ) ; 7,44 (dd, J = 8,5a 1,5 Hz, 1H : 1’ HJ ; 7,50 (dd, J = 8.5 a 4,5 Hz, 1H : 1* Hg) ; 7,80 (dd, J = 4,5 a 1,5 Hz, 1H : 1’ Hg); 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H ; NH v 1); 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H : NH v 6) ; 11,66 (s, 1H: OH).
Ze stejných frakcí opouštějících výše popsaný sloupec silikagelu a obsahujících rovněž nový derivát pristinamycinu IH se izoluje 0,3 mg ξ,-ethyl-des(4 %-dimethylamino)pristinamycinu Ι^ν případě, že se provede chromatografie na semipreparativním sloupci, který byl popsán výše.
Η-Nukleární magnetickorezonanční spektrum (400 MHz, CDCl^ delta v ppm): 0.04 (mt, 1H : 1H od
CÍÍ2 v 5 β); 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 v 2 γ) ; od 1,10 *.40 (mt, 2H : 1H od CH^ v 5 δ 1H “ CHj *5 γ) ; 1,18 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 ethylu) ; 1,30 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH3 v 1 γ); od 1,45 *,85 (mt, 7H : druhý H od Cl·^ v 5 γ H ^CH, v5§_ lHad.CHj v3β-CH^v3γaCH^ ν2β) ; 1,81 (d :,J = 13 Hz, 1H : oruhý H * CHj v 5 β) ; 2,02· (mt, 1H : druhý H odCH^v
β) ; 2,40 (dt, J = 13 a 4 Hz, 1H : 1H ad CHj* 5 ε) ; 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H :
Ar CHj ethylů ; 2,97 et 3,09 (respective dd a t, J = 12 a 5 Hz et J = 12 Hz, 1H ; CH, v 4 β) ; 3,50 a 3,60 (2 mts, 1H každý : CH2 v 3 δ) ; 4,13 (dd, J = 8 a 5 Hz, 1H : 3 a) ; 4,49 (d šir., J = 13 Hz, 1H : druhý H od CHj v 5 ε); 4,70 (mt, 2H : 5 α a 4 a) ; 4,77 (mt, 1H : 2 a) ; 4,83 (dd, J = 10 a 1 Hz, 1H :
a) ; 5,50 (d, J = 7 Hz, 1H : 6 a) ; 5,74 (mt, 1H : 1 β) ; 6,09 (d, J = 4 Hz, 1H : NH v 4); 6,72 (mf, 1H : NH v 2); 7,07 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromatický v .4 ε) ; 7,15 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatický v 4 δ) ; cd 7,15 ±7,35 (mt, 5H :
H Aromatický v .6) ;7.40 (dd, J = 8 al Hz, 1H : 1'HJ ; 7,45 (dd, J = 8 a 4 Hz, 1H: Γ Hg); 7,92 (dd, J =4 a 1 Hz, 1H : Γ Hj); 8,40 (mf, 1H : NH v 6) ; 8,50 (d,
J = 10 Hz, 1H : NH v 1); 11,72 (s, 1H : OH).
Příklad 33
Příprava již popsaných derivátů fenylalaninu a kyseliny feny Ipyrohroznové
Fenylalanin a deriváty 4-methoxyfenylalanin, 4-bromfenylalanin, 4-chlorfenylalanin, 4-jodfenylalanin, 4-trifluor methylfenylalanin, 4-aminofenylalanin, 3-methoxyfenylalanin jsou komerčně dostupnými sloučeninami.
Následující deriváty fenylalaninu mohou být připraveny způsoby popsanými v literatuře.
(R,S)-4-dimethylaminofenylalanin:
D.F.Elliot, A.T.Fuller,C.R.Harrington,J.Chem.,1948, 85-89, (R,S)-diethylaminofenylalanin:
Moldarsv B.L., Pushkarsva Z.V.,Znur. Obshchei Khim.,31,15601469 ( 1961 ) ,
C.A.1961, 22226f, J.A.Stock, J.Chem.Soc,1959,90-97, (R,S)-4-ethylaminofenylalanin:
F.Bergel, J.A.Stock, J.Chem.Soc,1959,90-97, (R,S)-4-fenylalanin:
J.V.Braun, J.Nelles, Berichte, 663, 1933, 1464-1470, (R,S)-4-methylfenylalanin:
R.R.Herr, T.Enjoki,J.P.Dailey, J.Am.Chem.Soc.,1957,79,42294231 , (R,S)-4-methylthiofenylalanin a (R,S)-4-ethylthiofenylalanin: R.L.Colescott, R.R.Herr, J.P.Dailey, J.Am.Chem.Soc.1957,79, 4232-4235, (R,S)-4-methoxykarbonylfenylalanin:
H.Cleland, J.Org.Chem.,1969, 34, 747, (R,S)-2,4-dimethylfenylalanin:
R.R.,Herr, T.Enjoki,JDailey, J.Am.Chem.Soc, 1957, 79, 4229 423 1 , (R,S)-3,4-dimethylfenylalanin:
R.R.,Herr, T.Enjoki, J.P.Dailey, J.Am.Chem.Soc.,1957,79,4229423 1 , (R,S)-3-trifluormethylfenylalanin-hydrochlorid:
R.Filler a H.Novar, J.Org.Chem, 1960,25,733-736, (S)-4-aminomethylfenylalanin:
G.E.Stokker, W.F.Hoffman a C.F.Homnick, J.Org.Chem.,1993,53, 5015-5017, (R,S)-3-methylfenylalanin:
J.H.Burckhalter, V.C.Stephens, J.A.C.S. 1951,73,56-58, (R,S)-4-acetylfenylalanin:
J.I.Degaw a kol., J.Med.Chem., 1969,1 1,225-227, (S)-4-O-allyltyrosin:
A-Loffet, H.Zang, Int.J.Pept.Protein Res.,1993,42,346, (S)-4-O-ethyltyrosin:
Y.Sasaki a kol., Chem.Pharm.Bull., 1 982,30,4435 , (R,S)-4-etnylfenylalanin:
A.Zhuze a kol., Coli.,Czech.Chem.Commun.1965,62,26-48, kyselina 4-terc.butylfenylpyrohroznová může být připravena podle: R.Breslow, J.W. Canary, M.Varney, S.T.Waddell a D.Yang J.Am.Chem.Soc., 1990, 112, 5212-5219.
Ostatní deriváty fenylalaninu se připraví způsoby popsanými v dále uvedených příkladech 34 až 42. V těchto příkladech se mžikové chromatografie provádí za středního tlaku dusíku 50 kPa za použití sílikagelu s granulometrií 40 až 53 /Um podle Stilla a kol., J.Org.Chem., 43, 2923 (1978).
Příklad 34
Příprava derivátů fenylalaninu a derivátu kyseliny fenylpyrohroznové způsobem A
V tomto příkladu se postupuje podle následujícího reakčního schématu:
ným chladičem, načež se ochladí a dvakrát promyje 20 ml diethyletheru. Vodná fáze se ochladí na teplotu -10 °C a získaná sraženina se odfiltruje a potom promyje minimálním množstvím chladné kyseliny chlorovodíkové. Získaný pevný produkt se vysuší v exsikátoru za sníženého tlaku, přičemž se získá 1,1 g kyseliny 4-methylaminofenylpyrohroznové ve formě pevného světlebéžového produktu tajícího při teplotě 210 °C.
34-5: (R,S)-3-fluor-4-methylfenylalanin-hydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 34-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 1,6 g methyl-N-acetyl-(3-fluor-4methyl)fenylalaninátu získá 0,6 g (R,S)-3-fluor-4-methylfenylalaninu ve formě bílých krystalů tajících při teplotě vyšší než 260 °C.
34-6 : (R,S)-Methyl-N-acetyl-(3-fluor-4-methyl)fenylalaninát
Postupuje se stejně jako v příkladu 34-2 s výjimkou spočívající v tom, že se z 1,9 g methyl-(4-methyl-3-fluor)-2acetamidocinnamátu, 0,2 g 10% palladia na uhlí ve 230 ml ethanolu získá 1,6 methyl-N-acetyl-(3-dluor-4-methyl)fenylalaninátu ve formě bezbarvého oleje (silikagel Merck 5719,Rf=0,46, eluční soustava methylenchlorid/ethylacetát v objemovém poměru 50:50).
34-7: Methyl-(3-fluor-4-methyl)-2-acetamidocinnamát
Postupuje se stejně jako v příkladu 34-3 s výjimkou spočívající v tom, že se z 3,6 g methyl-2-acetamidoakrylátu, 0,12 octanu palladnatého, 5,2 g tetrabutylamoniumchloridu,
3,8 g hydrogenuhličitanu sodného a 4 g 2-fluor-4-bromtoluenu v roztoku ve 120 ml dimethylformamidu (bezvodého) získá
2,6 g methyl-(3-fluor-4-methyl)-2-acetamidocinnamátu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 163 °C.
34-8: (R,S)-4-Trifluormethoxyfenylalanin-hydrochlorid nebo a 30 ml tetrahydrofuranu a k získané směsi se přidá 1,4 g hořčíku. Po 20 minutách se reakční směs ochladí na ledu, načež se k ní znovu přidá 1,4 g hořčíku. Reakční směs se míchá při okolní teplotě po dobu 18 hodin, načež se nalije do 1,4 litru destilované vody a 300 ml methylenchloridu a směs se zfiltruje za použití pomocného filtračního Clarcel . pH vodné fáze se nastaví na hodnotu 6 přidáním 12N kyseliny chlorovodíkové a vodná fáze se potom dekantuje a promyje 100 ml methylenchloridu. Organické fáze se sloučí, vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltrují a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku, přičemž se získá 3,42 g methyl-N-acetyl-3-methylthiofenylalaninátu ve formě bezbarvého oleje (silikagel Merck, Rf=0,5, eluční činidlo: ethylacetát).
34-13: Methyl-3-methylthio-2-acetamidocinnamát
Postupuje se stejně jako v příkladu 34-3 s výjimkou spočívající v tom, že se z 5,6 methyl-2-acetamidoakrylátu,
0,18 g octanu palladnaténo, 8,2 g tetrabutylamoniumchloridu, 5,86 g hydrogenuhličitanu sodného a 6,5 g 3-jod-1-methylbenzenu v roztoku ve 160 ml bezvodého dimethylformamidu získá 4,8 g methyl-(3-methylthio)-2-acetamidocinnamátu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 139 °C.
34-14: 3-Jodmethylthiobenzen
Do tříhrdlé baňky se za míchání zavede 20 ml destilované vody a 20 ml 12N kyseliny chlorovodíkové, načež se k této směsi přidá 10 ml 3-methylthioanilinu. Směs se mírně zahřeje za účelem zajištění rozpuštění pevného podílu a potom ochladí na teplotu 5 °C. Potom se pozvolna přidá 5,86 g dusitanu sodného v roztoku v 15 ml vody a teplota reakční směsi se udržuje mezi 5 a 8 °C. 20 minut po ukončení přídavku se v průběhu 10 minut přidá 13,57 g jodidu draselného v roztoku v 15 ml vody a směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 15 hodin Vytvořený olej se oddělí od vodné fáze dekantací, načež se k němu přidá vodný roztok sirnatanu sodného. Vodná fáze se děkan tuje a produkt se extrahuje 100 ml dichlormethanu. Organická fáze se promyje 100 ml vody, pH vodné fáze se nastaví na hodnotu 9 koncentrovaným roztokem hydroxidu sodného a potom dekantuje. Organická fáze se dvakrát promyje 100 ml vody, děkan tuje, vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (50 kPa) při teplotě 40 °C. Rezultující produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční činidlo: cyklohexan), přičemž se získá 13 g 3-jod-1-methyl thiobenzenu ve formě žluté kapaliny (silikagel Merck 5719, Rf=0,8, eluční činidlo: cyklohexan).
Příklad 35
Příprava derivátů fenylalaninu způsobem B
fcfefytalLEn
35—1: (R,S)-4-terc.Butylfenylalanin
Do tříhrdlé baňky s nasazeným chladičem se zavede 25 g diethyl-4-(terč.butyl)benzylacetamidomalonanu a 250 ml 37% kyseliny chlorovodíkové. Směs se míchá a zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem až do okamžiku, kdy již nedochází k uvolňování plynu. Po ochlazení reakční směsi se vyloučená sraženina odfiltruje a potom rekrystalizuje z acetonitrilu, přičemž se získá 25,6 g (R,S)-4-terc.butylfenylalanin-hydrochloridu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 234 °C (viz rovněž Journal of the Takeda Research Laboratories, sv.43, č.3/4, prosinec 1984, str. 53-76).
35-2: Diethyl-4-(terč.butyl)benzylacetamidomalonan
Do tříhrdlé baňky s nasazeným chladičem se zavede pod dusíkovou atmosférou 25 g 4-terc.butylbenzylbromidu, 50 ml bezvodého toluenu a 3,1 g hydridu sodného ve formě 80% suspenze v oleji a potom 21,8 g diethylacetamidomalonanu. Reakční směs se potom zahřívá na teplotu 110 °C po dobu 17 hodin. Po ochlazení se přidá pozvolna 15 ml absolutního ethanolu, dále 15 ml 50% alkoholu a nakonec 50 ml vody. Organická fáze se dekantuje a vodná fáze se promyje třikrát vždy 50 ml diethyletheru. Organické fáze se sloučí, promyjí vodou a potom vysuší nad síranem sodným. Po filtraci a zahuštění za sníženého tlaku se produkt ponechá vykrystalizovat z petroletheru, přičemž se získá 25 g diethyl-4-(terč.butyl)benzylacetamidomalonanu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 80 °C
35-3: (R,S)-3-Methylaminofenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 1,17 g diethyl-3-methylaminobenzylacetamidomalonanu a 20 ml 12N kyseliny chlorovodíkové získá 1,03 g pevného světle béžového produktu. Tento produkt se rozpustí've 20 ml absolutního ethanolu a k roztoku se přidá 0,4 g živočišného uhlí. Roztok se zfiltruje za použití pomocněho filtračního prostředků ClarceV a zahustí za sníženého tlaku (50 kPa). Stejná operace se provede znovu s 1 g živočišného uhlí a získaný pevný podíl se rozetře ve 20 ml etheru.
Po filtraci a vysušení za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 50 °C se získá 0,65 g (R,S)-3-methylaminofenvlalanin-dihydrochloridu ve formě bílého prášku tajícího při teplotě
135 °C (za rozkladu).
35-4: Diethyl-3-methylaminobenzylacetamidomalonan
Do tříhrdlé baňky se pod atmosférou dusíku zavede 3,11 ml acetanhydridu. Potom se v průběhu 3 minut a při teplotě 0 °C přidá 1,51 ml kyseliny mravenčí a směs se zahřívá na teplotu 50 °C po dobu dvou hodin. Reakční směs se potom ponechá vychladnout na okolní teplotu za míchání a v průběhu 3 hodin a 20 minut, načež se k ní přidají 4 ml tetrahydrofuranu (bezvodého) pod atmosférou dusíku, načež se reakční směs ochladí na teplotu 20 °C. V průběhu 10 minut se přidá roztok 4 g diethyl-3-aminobenzylacetamidomalonanu ve směsi 15 ml bezvodéhó tetrahydrofuranu a 15 ml bezvodého dichlormethanu. V míchání se pokračuje po dobu jedné hodiny a 10 minut při teplotě -20 °C a potom ještě po dobu 16 hodin při teplotě 20 °C. Reakční směs se zahustí k suchu za sníženého tlaku (50 kPa) při teplotě 30 °C, načež se odpaří společně s 30 ml bezvodého toluenu, přičemž se získá pevný bílý produkt, který se rozpustí ve směsi 10 ml bezvodého tetrahydrofuranu a 20 ml bezvodého 1,2-dichlorethanu a získaný roztok se zavede pod atmosférou dusíku do tříhrdlé baňky.
Reakční směs se ochladí na teplotu -5 °C, načež se k ní v průběhu 10 minut přidá komplex boran-dimethylsulfid (2M roztok v tetrahydrofuranu. Reakční směs se potom ponechá ohřát na okolní teplotu, načež se pobu 3 hodin zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a potom ještě 15 hodin při okolní teplotě. Reakční směs se ochladí na teplotu 0 °C a potom se přidá v průběhu 25 minut 10 ml methanolu. Reakční směs se potom míchá po dobu 45 minut při teplotě 0 °C a potom ještě po dobu 30 minut při okolní teplotě. Směs se ochladí na 0 °C, načež se směsí probublává plynný chlorovodík až k dosažení hodnoty pH 2. Směs se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu jedné hodiny a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku při teplotě’30 °C, přičemž se získá 5 g produktu, který se vyjme 30 ml vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 30 ml methylenchloridu. Organická fáze se dekantuje a vodná fáze se promyje 20 ml vody. Organické fáze se sloučí, vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltrují a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (2,6 kPa), přičemž se získá 3,43 g Žlutého oleje, který se přečistí mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a cyklohexanu v objemovém poměru 50:50, Takto se získá po vysušení za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 20 °
C 1,18 g diethyl-3-methylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě světlebéžového pevného produktu tajícího při teplotě 122 °C.
35-5: Diethyl-3-aminobenzylacetamidomalonan
Diethyl-3-aminobenzylacetamidomalonan může být připraven způsobem popsaným v : T.S.Osdene, D.N.Ward, W.H.Chapman a H.Rakoff, J.Am.Chem.Soc., 81,1959, 3100-3102.
35-6: (R,S)-3-Ethylaminofenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 34-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 2 g (R,S)-ethyl-N-acetyl-3-ethylaminofenylalaninátu a 30 ml 12N kyseliny chlorovodíkové získá 1,7 g (R,S)-3-ethylaminofenylalaninát-dihydrochloridu ve formě světlebéžového pevného produktu, který je hygroskopický a obsahuje 10 mol.% (R,S)-3-diethylaminofenylalanin-dihydrochloridu.
35-7: (R,S)-Ethyl-N-acetyl-3-ethylaminofenylalaninát
Do baňku s kulatým dnem se pod atmosférou dusíku zavedou 3 g (R,S)-ethyl-N-acetyl-3-aminofenylalaninátu, 40 ml ethanolu a 14 g Raneyova niklu, který byl předběžně promyt destilovanou vodou a ethanolem. Reakční směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 19 hodin, načež se ochladí, zfiltruje přes filtrační prostředek Clarcel a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (50 kPa), přičemž se získá 3,07 g bezbarvého oleje, který se přečistí mžikovou chromatografií za použití elučního činidla tvořeného ethylacetátem, přičemž se získá 2,1 g (R,S)-ethyl-N-acetyl-3-ethylaminofenylalaninát ve formě bezbarvého oleje (silikagel Merck 5719,
Rf=0,6, ethylacetát) obsahující 10 % (R,S)-ethyl-N-acetyl3-diethylaminofenylalaninátu.
35-8: (R,S)-ethyl-N-acety1-3-aminofenylalaninát g směsi (R,S)-ethyl-N-acetyl-3-nitrofenylalaninátu 75 mol.%/mol) a diethyl-3-nitrobenzylacetamidomalonanu (25 mol.%/ mol) se zavede pod atmosférou dusíku do autoklávu. Přidá se 2,5 g 10% palladia na uhlí a potom ještě 200 ml dichlormethanu. Směs se vystaví tlaku vodíku 0,9 MPa za míchání, při teplotě 18 °C a po dobu 4 hodin. Po přechodu na atmosférický tlak se reakční směs zfiltruje přes filtrační prostředek Clarcel , promyje dichlormethanem a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku (50 kPa), přičemž se získá pevný produkt, který se re~ krystalizuje ze 450 ml destilované vody, která byla předtím zahřívána na teplozu varu pod zpětným chladičem v přítomnosti 4 g živočišného uhlí 3S. Po zfiltrování za tepla přes filtrační prostředek Clarcel se provede krystalizace produkttu při teplotě 4 °C a krystaly se odfiltrují a potom vysuší, přičemž se získá 9,9 g (R,S)-ethyl-N-acetyl-3-aminofenylalaninátu ve formě světlebéžového pevného produktu, který taje při teplotě 106 °C a obsahuje 5 % diethyl-3-aminobenzylacetamidomalonanu.
35-9: (R,S)-Ethy1-N-acety1-3-nitrofenylalaninát a diethyl3-nitrobenzylacetamidomalonan
Do tříhrdlé baňky s nasazeným chladičem se zavede pod atmosférou dusíku 600 ml absolutního ethanolu a potom 7,9 g sodíku. Po úplném rozpuštění se přidá 74,5 g diethylacetamidomalonanu a potom 60 g 4-nitrobenzylchloridu ve 200 ml bezvodého ethanolu. Reakční směs se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin a 30 minut.
Po ochlazení se reakční směs zahustí za sníženého tlaku (60 kPa) a potom vyjme směsí 500 ml methylenchloridu a 500 ml vody. pH se nastaví na hodnotu 7 přidáním Q,5N kyseliny sírové, načež se organická fáze dekantuje a vodná fáze se promyje dvakrát 200 ml methylenchloridu. Organické fáze se sloučí, promyjí 200 ml nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, dekantuje a potom vysuší nad síranem horečnatým. Po filtraci a zahuštění za sníženého tlaku (50 kPa) se produkt rekrystalizuje ze 600 ml ethanolu zahřívaného pod zpětným chladičem na teplotu varu, přičemž se po krystalizací při okol ní teplotě, filtraci a vysušení získá 70,4 g diethyl-3-nitrobenzylacetamidomalonanu ve formě bílých krystalů tajících při teplotě 156 °C. Matečné louhy se zahustí a potom přečistí mžikovou chromatografií (eluční čnidlo: ethylacetát), přičemž se získá 25,6 g směsi ethyl-N-acetyl-3-nitrofenylalaninátu (70 mol.%/mol) a diethyl-3-nitrobenzylacetamidomalonanu (25 mol.%/mol) ve formě světlebéžového pevného produktu, který se použije jako takový v následujícím reakčním stupni.
35-10: (R,S)-3-Dimethylamínofenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 0,72 g (R,S)-ethyl-N-acetyl-3-dimethylaminofenylalaninátu a 8,6 ml 10N kyseliny chlorovodíkové získá po odpaření pevný produkt, který se rozetře s 50 ml acetonu, směs se zfiltruje a vysuší za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 40 °C. Získá se 0,68 g (93 %) (R,S)-3-dimethylaminofenylalaninu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě blízké (120 °C (za rozkladu).
35-1 1 : (R,S)-Ethyl-N-acety1-3-dimethylaminofenylalaninát
Do tříhrdlé baňky se pod dusíkatou atmosférou zavedou 4 g (R,S)-ethyl-N-acetyl-3-aminofenylalaninátu, připraveného způsobem popsaným v příkladu 35-8, v 15 ml dimethylformamidu, načež se k této směsi přidá 5,5 ml triethylaminu a potom ještě 2,5 ml methyljodidu a 4 ml dichlormethanu přičemž se udržuje teplota blízká 30 °C pomocí ledu. Směs se potom zahřívá na teplota 35 °C po dobu 18 hodin. Potom se pozvolna přidá 1 ml methyljodidu v roztoku v 1 ml dimethylformamidu, přičemž se udržuje teplota blízká 30 °C, načež se přidá 2,2 ml triethylaminu a směs se zahřívá po dobu 5 hodin na teplotu 35 °C.
Směs se potom ponechá vychladnou na okolní teplotu, načež se extrahuje 100 ml ethylacetátu a 150 ml destilované vodyVodná fáze se dekantuje a potom opětobmě dvakrát promyje 70 mú ethylacetátu. Organické fáze se sloučí, promyjí dvakrát 80 ml destilované vody a potom 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného v destilované vodě. Organická fáze se dekantuje, vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku, přičemž se získá 2,4 g produktu, který se přečistí mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí diehlormethanu a methanolu v objemovém poměru 90:10. Takto se získá 0,72 g (16 %) (R,S)-ethyl-3-N-acetyl3-dimethylaminofenylalaňinátu ve formě žlutých krystalů.
Příklad 36
Příprava derivátů fenylalaninu způsobem C
36-1: (R,S)-4-Isopropylfenylalanin
Do tříhrdlé baňky se zavede 7 g červeného fosforu a 8 g 4-(isopropylbenzyliden)-2-methyl-5-oxazolonu ve 45 ml anhydridu kyseliny octové, načež se k této směsi pozvolna přidá 35 ml kyseliny jodovodíkové o koncentraci 57 %. Po ukončení přídavku se směs zahřívá po dobu 3 hodin a 30 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem, načež se ponechá po dobu tří dnů při okolní teplotě. Reakční směs se zfiltruje, oddělený pevný podíl se dvakrát promyje 10 ml kyseliny octové a filtrát se zahustí k suchu za sníženého tlaku. Získaný zbytek se vyjme 100 ml destilované vody, zahustí k suchu za sníženého tlaku, přičemž se získá pevný produkt, který se vyjme 50 ml destilované vody a potom třikrát extrahuje vždy ml diethyletheru po přidání 0,5 g siřičitanu sodného.
Ether se dekantuje a vodná fáze se vystaví účinku sníženého tlaku za účele, odstranění stop diethyletheru. K vodné fáze se přidají 2 g živočišného uhlí, směs se zahřeje na teplotu 40 až 50 °C, zfiltruje na filtračním prostředku ClarcelR a opláchne minimálním množstvím vody. pH se nastaví na hodnotu 5 přidáním při teplotě 4 °C 32% vodným roztokem hydroxidu amonného. Získaná sraženina se zfiltruje za chladu, dvakrát opláchne 10 ml vody, 10 ml ethanolu a potom dvakrát 10 ml etheru, přičemž se po vysušení za sníženého tlaku při teplotě 20 °C získá 3,97 g (R,S)-4-isopropylfenylalaninu ve formě bílého pevného produktu, který taje při teplotě vyšší než 260 °c (viz rovněž článek: Takeda Research sv.43,č.3/4, prosinec 1984, str.53-76).
36-2: 4-(Isopropylbenziliden)-2-methy1-5-oxazolon
Do baňky s kulatým dnem opatřeným chladičem se zavede 18,52 g N-acetylglycinu, 10,6 g octanu sodného, 20 ml 4-isopropylbenzaldehydu a 57 ml anhydridu kyseliny octové. Směs se rozmíchá po dobu 30 minut, načež se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 110 °C a potom ještě 15 hodin při okolní teplotě. Reakční směs se potom nalije do 600 ml vody a 400 ml petroletheru, který byl předběžně zahřát na teplotu 50 °C. Organická fáze se dekantuje a vodná fáze se dvakrát promyje 150 ml petroletheru. Organické fáze se sloučí, vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltrují a zahustí za sníženého tlaku až na objem 100 ml a získání sraženiny. Tato sraženina se odfiltruje, promyje dvakrát 50 ml pentanu, přičemž se získá 8,2 g 4-(isopropylbenzyliden)-2-methyl-5-oxazolonu ve formě žlutého pevného produktu tajícího při teplotě 77 °C.
36-3: (R,S)-4-Butylfenylalanin
Postupuje se stejně jako v příkladu 36-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 1,49 g červeného fosforu, 1,8 g
4-(butylbenzyliden)-2-methyl-5-oxazolonu v 9,23 ml anhydridu kyseliny octové a 7,39 ml 57% kyseliny jodovodíkové získá
0,35 g (R,S)-4-butyifenylalaninu ve formě světlebéžového pevného produktu tajícího při teplotě vyšší než 260 °C.
36- 4: 4-(Butylbenziliden)-2-methy1-5-oxazolon
Postupuje se stejné jako v příkladu 36-2 s výjimkou spočívající v tom, že se z 8,43 g N-acetylglycinu, 4,92 g octanu sodného, 9,8 g 4-butylbenzaldehydu a 26 ml anhydridu kyseliny octové získá 1,89 g 4-(butylbenzyliden)-2-methyl-5oxazolonu ve formě pevného žlutého produktu tajícího při teplotě 74 °C.
Příklad 37
Příprava derivátu fenylalaninu způsobem D
37- 1: (R,S)-3-Ethoxyfenylalanin-hydrochlorid (nebo (R,S)-3O-ethyltyrosin-hydrochlorid)
Do baňky s kulatým dnem se zavede 1 g (R,S)-N-terc.butoxykarbonyl-3-ethoxyfenylalaninu v roztoku v 3,6 ml dioxanu nasycenného plynným chlorovodíkem a získaná směs se míchá po dobu 5 hodin při okolní teplotě. Vyloučená sraženina se odfiltruje, promyje dioxanem a potom etherem a nakonec vysuší za sníženého tlaku (2,7 kPaú, přičemž se získá 0,65 g (R,S)-3-ethoxyfenylalanin-hydrochloridu ve formě pevného bílého produktu tajícího při teplotě 200 °C.
37-2: (R,S)-N-terc.butoxykarbonyl-3-ethoxyfenylalanin
Do baňky s kulatým dnem se zavede 1,33 g (R,S)-ethylN-terc.butoxykarbonyl-3-ethoxyfenylalaninátu v roztoku v 8 ml methanolu, načež se do baňky přidá ještě 8 ml 1N roztoku hydroxidu sodného. Po 13 hodinách míchání při okolní teplotě se směs odpaří za sníženého tlaku, načež se okyselí přidáním
8,56 ml 1N kyseliny chlorovodíkové. Produkt se dvakrát extrahuje 10 ml ethylacetátu, organické fáze se sloučí, dvakrát promyjí 10 ml vody, vysuší, zfiltrují a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku, přičemž se získá 1 g (R,S)-N-terc.bu
100 toxykarbonyl-3-ethoxyfenylalaninu ve formě žlutého oleje (silikagel Merck 5719, Rf=0,7, eluční soustava: toluen, methylalkohol a diethylamin v objemovém poměru 80:10:10.
37-3: (R,S)-Ethyl-N-terc.butoxykarbony1-3-ethoxyfenylalaninát
Do baňky s kulatým dnem se pod atmosférou dusíku zavede 1,5 g (R,S)-N-terc.butoxykarbonyl-3-tyrosinu v roztoku v 7,5 ml dimethylformamidu (bezvodého), načež se do baňky přidá 0,508 g 50% hydridu sodného v oleji. Po 2 hodinovém míchání při okolní teplotě se přidá 0,86 ml jodmethanu, načež se směs míchá po dobu 4 hodin při okolní teplotě. Směs se zfiltruje, rezultující pevný podíl se promyje třikrát 10 ml vody a pod dvakrát 10 ml petroletheru, přičemž se získá po vysušení za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 30 °C 1,33 g (R,S)-ethyl-N-terc.butoxykarbonyl-3-ethoxyfenylalaninátu ve formě bílého pevného produktu.
7-4 :· (R, S) -N-terc .Butoxykarbonyl-3-tyrosin
Do tříhrdlé baňky se za míchání zavede 18 g (R,S)-3tyrosinu v roztoku ve 180 ml dioxanu, načež se do baňky přidá 99 ml 1N roztoku hydroxidu sodného a potom ještě 26 g di-terc.· butyldikarbonátu v roztoku ve 160 ml dioxanu. Po 36 hodinách míchání se reakční směs zahustí za sníženého tlaku při teplotě 30 °C, vyjme 100 ml destilované vody, okyselí 1N kyselinou chlorovodíkovou až k dosažení hodnoty pH 5 a potom extrahuje dvakrát 200 ml ethylacetátu. Organická fáze se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku při teplotě 30 °C, přičemž se získá 30 g (R,S)-N-terc.butoxykarbonyl-3-tyrosinu ve formě bílého pevného produktu (silikagel Merck 5719, Rf=0,25, eluční soustava: směs toluenu a diethylaminu v objemovém poměru 80:10).
Příklad 38
Příprava derivátů fenylalaninu způsobem E
101
38-1: (R,S)-4-Diallylamoniumfenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 5,8 g diethyl-4-diallylaminobenzylacetamidomalonanu a 48 ml 10N kyseliny chlorovodíkové získá po odpaření pevný produkt, který se rozetře v 50 ml acetonu, zfiltruje a znovu rozetře v 10 ml dichlormethanu, zfiltruje a potom promyje třikrát 10 ml diethyletheru. Po vysušení za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 40 °C se získá 4,41 g (R, S )-4-diallylaminof enylalanin-fdihydrochloridu ve formě bílého pevného křehkého produktu tajícího při teplotě blízké 135 °C (za rozkladu).
38-2: (R,S)-4-Allylaminofenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou , spočívající v tom, že se z 3,27 g diethyl-4-allylaminobenzy1acetamidomalonanu a 30 ml 10N kyseliny chlorovodíkové získá po odpaření pevný produkt, který se rozetře v 50 ml acetonu, zfiltruje a potom vysuší za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 40 °C. Získá se 2,3 g (R,S)-4-allylaminofenylalanin-dihydrochloridu ve formě bílého pevného produktu, který taje při teplotě blízké 134 °C (za rozkladu).
38-3: Diethyl-4-diallylaminobenzylacetamidomalonat a diethyl4-allylaminobenzylacetamidomalonan
Do tříhrdlé baňky opatřené kapací nálevkou a udržovanou pod atmosférou dusíku se zavede 10 g diethyl-4-aminobenzylacetamidomalonanu v roztoku ve 150 ml dimethylformamidu. Potom se pozvolna přidá při okolní teplotě 6,57 ml allylbromidu a potom ještě 10,76 ml triethylaminu za míchání.
Po 19 hodinách míchání se znovu přidá 1,31 ml allylbromidu a
2,15 ml triethylaminu a směs se míchá po dobu 26 hodin. Reakční směs se potom nalije do 1,5 1. destilované vody a extrahuje 1 litrem ethylacetátu. Vodná fáze se dekantuje, dvakrát promyje 500 ml ethylacetátu. Organické fáze se sloučí, promyjí 500 ml destilované vody a potom 500 ml nasyceného roztoku chlo102 ridu sodného, dekantují, vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltrují a potom zahustí k suchu, přičemž se získá hnědý olej, který se přečistí mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a ethylacetátu v objemovém poměru 90:10, přičemž se získá 6,66 g diethyl4-diallylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě béžového pevné ho produktu tajícího při 94 až 96 °C (Rf = 0,6, ethylacetát/ cyklohexan v objemovém poměru 50:50 a 3,49 g diethyl-4allylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě pevného béžového produktu tajícího při teplotě 104 až 106 °C (Rf = 0,45, ethyl acetát/cyklohexan v objemovém poměru 50:50).
Diethyl-4-aminobenzylacetamidomalonan může být připraven podle: J.B.Burckhalter, V.C.Stephens, J.Am.Chem.Soc.56, 1951, 73.
Příklad 39
Příprava derivátů fenylalaninu způsobem F
R
103
39-1: (R,S)-4-Ethylisopropylfenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 2,9 g diethyl-4-ethylisopropylbenzylacetamidomalonanu a 24,6 ml 10N kyseliny chlorovodíkové získá po odpaření pevný produkt, který se rozetře ve 20 ml acetonu, zfiltruje a potom vysuší za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 40 °C. Získají se 2 g (R,S)-4-ethylisopropylaminofenylalanin-dihydrochloridu ve formě bílého pevného produktu, který taje při teplotě blízké 147 °C (za rozkladu).
39-2: Diethyl-4-ethylisopropylaminobenzylacetamidomalonan
Do tříhrdlé baňky udržované pod dusíkovou atmosférou se zavede 15 g diethyl-4-ethylaminobenzylacetamidomalonanu v 70 ml tetrahydrofuranu, načež se k obsahu baňky přidá 6,4 ml 2-jodpropanu a potom 8,4 ml 1,5-diazabicyklo/4-3-Q/non-5-enu a směs se potom zahřívá po dobu 24 hodin na teplotu 60 °C. Potom se přidá 2,13 ml 2-jodpropanu a potom ještě 8,4 ml 1,5-diazabicyklo/4-3-0/non-5-enu, načež se reakční směs zahřívá po dobu dalších 24 hodin při teplotě 60 °C. Směs se potom ochladí na okolní teplotu a extrahuje se 50 ml dichlormethanu a 50 mi destilované vody. Vodná fáze se dekantuje a potom znovu dvakrát promyje 30 ml dichlormethanu. Organické fáze se sloučí, promyjí 60 ml destilované vody a potom 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného v destilované vodě, organická fáze se dekantuje, vysuší nad síranem horečnatým, zfiltruje a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku, přičemž se získá 16,2 g produktu, který se přečistí chromatograficky (mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí dichlormethanu a methanolu v objemovém poměru 90:10). Takto se získá 4,59 g produktu, který se rekrystalizuje ze 45 ml cyklohexanu, přičemž se získá 3,44 g diethyl-4-ethylisopropylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě bílých krystalů tajících při teplotě 80 °C.
39-3- Diethyl-4-ethylaminobenzylacetamidomalonan
104
Diethyl-4-ethylaminobenzyLacetamidomalonan může být připraven způsobem popsaným v příkladu 35-7 s výjimkou spočívající v tom, že se z 22 g diethyl-4-aminobenzylacetamidomalonanu, 500 ml ethanolu a 70 g Raneyova niklu získá 23,8 g diethyl-4-ethylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě bílého křehkého produktu tajícího při teplotě 136 °C.
39-4: (R,S)-4-Allylethylamínofenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 4,54 g diethyl-4-allylethylbenzylacetamidomalonanu a 37,9 ml 10N kyseliny chlorovodíkové získá po odpaření pevný produkt, který se vysuší za sníženého tlaku (2,7 k?a) při teplotě 40 °C. Získá se 3,67 g (R,S)-4allylethylaminofenylalaninu ve formě hnědého pevného produktu, který taje při teplotěblízké 130 °C (za rozkladu).
39-5: Diethyl-4-allylethylaminobenzylacetamidonialonan
Postupuje se stejně jako v příkladu 39-2 s výjimkou spočívající v tom, že se z 8 g diethyl-4-sthylaminobenzylacetamidomalonanu, 4 ml allylbromidu, 5,82 ml 1,5-diazabicyklo/4-3-0/non-5-enu v 50 ml tetrahydrofuranu získá po přečištění mžikovou chromatografii za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a ethylacetátu v objemovém poměru 90:10 5,6 g pevného produktu, který se rekrystalizuje z 35 ml cyklohexanu. Takto se získá 5,43 g dieťnyl-4-allyl ethylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 86 °C.
39-6: (R,S)-4-Ethylpropylaminofenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 2,5 g dieťnyl-4-ethylpropyiaminobenzylacetamidomalonanu a 21 ml 10N kyseliny chlorovodíkové získá po odpaření pevný produkt, který se vysuší za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 40 °C získají 2 gramy (97 %) (R,S)-4-ethylpropylaminofsnylalanin-dihydrochloridu ve for105 mě pevného bílého produktu tajícího při teplotě blízké 147 °C (za rozkladu).
39-7: Diethyl-4-ethylpropylaminobenzylacetamidomalonan
Postupuje se stejně jako v příkladu 39-2 s výjimkou spočívající v tom, že se z 10 g diethyl-4-ethylaminobenzylacetamidomalonanu, 5,6 ml 1 -jodpropanu, 7,2 ml 1,5-diazabicyklo/4-3-0/non-5-enu v 70 ml tetrahydrofuranu získá po 36 ho- * dinách reakce a potom po chromatografickém přečištění mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí methy- T lenchloridu a methanolu v objemovém poměru 97:3 2,8 g pevného produktu, který se rekrystalizuje z 26 ml cyklohexanu. Takto se získá 2,9 g diethyl-4-ethylpropylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 84 až 86 °C.
39-8: (R,S)-4-Ethylmethylcyklopropylaminofenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se ze 3 g doethyl-4-ethylmethylcyklopropylaminobenzylacetamidomalonanu a 25 ml 10N kyseliny chlorovodíkové získá po 3 dnech reakce a potom po odpaření získá pevný produkt, který se rozetře ve 40 ml acetonu, odfiltruje, vysuší za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 40 °C. Získá se 2,24 g (R,S)-4-ethylmethylcyklopropylaminofenylalanin-dihydrochloridu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě blízké 140 °C (za rozkladu).
39-9: Diethyl-4-ethylmethylcyklopropylaminobenzylacetamidomalonan
Postupuje se stejně jako v příkladu 39-2 s výjimkou spočívající v tom, že se z 8 g diethyl-4-ethylaminobenzylacetamidomalonanu, 2,6 ml brommethylcyklopropanu, 2,97 ml
1,5-diazabícyklo/4-3-0/non-5-enu v 50 ml tetrahydrofuranu získá po 3 dnech reakce a po chromatografickém přečištění
106 mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a ethylacetátu v objemovém poměru 90:
3,3 g diethyl-4-ethylmethylcyklopropylaminobenzylacetamidomalonanu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplo tě 112 až 114 °C.
Příklad 40
Příprava derivátů fenylalaninu způsobem G
40-1: (R,S)-4-(Pyrrolidinyl)fenylalanin-dihydrochlorid
Postupuje se stejně jako v příkladu 35-1 s výjimkou spočívající v tom, že se z 1,5 g diethyl-4-(1-pyrrolidinyl)benzylacetamidomalonanu a 40 ml 5N kyseliny chlorovodíkové získá po odpaření pevný produkt, který se rozetře v 15 ml acetonu, odfiltruje a vysuší za sníženého tlaku (2,7 kPa) při teplotě 40 °C. Získá se 0,6 g (R,S)-4-(1-pyrrolidinyl) fenylalanin-dihydrochloridu ve formě křehkého bílého produktu.
40-2: Diethyl-4-(1-pyrrolidinyl)benzylacetamidomalona
Do autoklávu se zavedou 4 g diethyl-4-(1-pyrrolyl)benzylacetamidomalonanu v roztoku ve 100 ml methanolu a 1 g
10% palladia na unií. Po trojnásobném propláchnutí dusíkem se produkt hydrogenuje za tlaku 1,4 MPa a při teplotě 19 °C.
107
Po 25 hodinách míchání se hydroge.nace přeruší, hydrogenační katalyzátor se odstraní filtrací přes filtrační prostředek £
Clarcel , promyje se dichlormethanem a filtrát se zahustí za sníženého tlaku, přičemž se získá 3,85 g pevného produktu, který se rozetře ve směsi 50 ml heptanu a 10 ml diethyletheru. Pevný podíl se odfiltruje, vysuší a přečistí mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a acetonu v objemovém poměru 90:10, přičemž se získá 1,6 g diethyl-4-(1-pyrrolidinyl)benzylacetamidomalonanu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě *Ť32 °C.
40- 3: Diethyl-4-(1-pyrrolyl)benzylacetamidomalonan
Do tříhrdlé baňky udržované pod dusíkovou atmosférou se zavede 4,6 g diethyl-4-aminobenzylacetamidomalonanu ve 104 ml kyseliny octové. Přidá se 7,02 g octanu sodného a potom 1,87 ml 2,5-dimethoxytetrahydrofuranu. Reakční směs se zahřeje na teplotu 65 °C a na téno teplotě se udržuje po dobu jedné hodiny a 15 minut, načež se extrahuje 100 ml dichlormethanu a 100 ml destilované vody. Vodná fáze se dekantuje a potom třikrát promyje 100 ml diehlormethanu. Organické fáze se sloučí, promyjí 100 ml vody a potom 100 ml nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, dekantují a potom vysuší nad síranem hořečnatým, načež se zfiltrují a odpaří k suchu za sníženého tlaku (50 kPa), přičemž se získá 6,2 g pevného produktu, který se přečistí mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a acetonu v objemovém poměru 75:25. Získá se takto 3,57 g diethyl4-(1-pyrrolyl)benzylacetamidomalonanu ve formě béžového pevného produktu tajícího při teplotě 110 °C.
Příklad derivátu fenylalaninu způsobem H
41- 1: (R,S)-4-EthyIthiomethylfenylalanin
Do tříhrdlé baňky udržované pod dusíkovou atmosférou
108 se zavede 300 ml bezvodého methanolu, načež se přidá za míchání 1,72 g methoxidu sodného a potom ještě 5,55 ml ethylmerkaptanu. Rozpouštědlo se zahustí za sníženého tlaku při teplotě 40 °C, přičemž se získá 8,5 g sodné soli ethylmerkaptanu, která se uvede do roztoku rozpuštěním ve 100 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Při okolní teplotě se přidá 3,6 g (R,S)4-chlormethylfenylalaninu, načež se směs zahřívá po dobu 10 hodin na teplotu varu pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku při teplotě 40 °C a zbytek se vyjme 100 ml destilované vody. Získaný kalný roztok se okyselí 5 ml kyseliny octové. Vyloučená sraženina se odfiltruje, promyje destilovanou vodou a potom vysuší za sníženého tlaku při teplotě 60 °C, přičemž se získá 3,6 g pevného produktu, který se přečistí mžikovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu, kyseliny octové a vody v objemovém poměru 60:12:10. Takto se získá 256 mg (R,S)-4-ethylthiomethylfenylalaninu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 251 °C.
(R,S)-4-chlormethylfenylalanin může být získán analogicky jako (S)-4-chlormethylfenylaianin podle: R.GonzalezMuniz, F.Cornille, F.Bergeron, D.Ficheux, J.Pothier, C.Durieux a B.Roques, Int.J.Pept.Protein.Res.,1991,37(41,331-340.
Příklad 42
Příprava derivátů fenylalaninu způsobem I
42-1: (S)-4-0-(2-Chlorethyl)tyrosin-hydrochlorid
Do baňky s kulatým dnem se zavede 5 g (S)-N-terc.butoxykarbonyl-4-0-(2-chlorethyl)tyrosin v roztoku v 50 ml dioxanu nasyceného kyselinou chlorovodíkovou. Po 28 hodinovém míchání se směs zahustí k suchu za sníženého tlaku. Získaný zbytek se vyjme 50 ml etheru, míchá a potom zfiltruje. Pevný podíl se dvakrát promyje 25 ml diethyletheru, vysuší za sníženého tlaku, přičemž se získá 1,58 g (S)-4-0-(2-chlorethyl)tyrosinu ve formě bílého pevného produktu tajícího při teplotě 260 °C.
109
42-2: (S)-N-terc.Butoxykarbonyl-4-O-(2-chlorethyl)tyrosin
Do tříhrdlé baňky se pod atmosférou dusíku zavede 14 g (S)-N-terc.butoxykarbonyltyrosinu v roztoku ve 140 ml dimethylformamidu. Přidá se 4,8 g 50% hydridu sodného v oleji, přičemž tento přídavek se provádí pozvolna pomocí špachtle.
Po 2 hodinách při okolní teplotě 16,87 g 1-tosyl-2-chlorethanolu. Po dvouhodinovém míchání se přidá 2,4 g 50% hydridu sodného v oleji a 8,4 ml dalšího podílu 1-tosyl-2-chlorethanolu. Stejná operace se provede po 24 h a v míchání se pokračuje po dobu dalších 24 hodin. Reakce se přeruší přidáním 100 ml destilované vody a reakční směs se zahustí k suchu za sníženého tlaku. Získaný zbytek se vyjme 100 ml destilované vody, směs se extrahuje třikrát 100 ml ethylacetátu.
Vodná fáze se dekantuje, okyselí 50 ml 1N kyseliny chlorovodíkové až k dosažení pH 3 a produkt se extrahuje třikrát 100 ml ethylacetátu. Organické fáze se sloučí, dvakrát promyjí 50 ml vody, dekantují, vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltrují a potom zahustí k suchu za sníženého tlaku, přičemž se získá 13,51 g (S)-N-terc.butoxykarbonyl-4-O-(2-chlorethyl)tyrosinu ve formě hnědého oleje (Rf=0,5, směs toluenu, methanolu a diethylaminu v objemovém poměru 70:20:10), který se použije jako takový v následujícím reakčním stupni.
Tabulka V
Mikroorganismy Antibiotika
Houby
Micromonospora sp. Vemamyciny
STREPTOMYCES
S. alborectus Virginiamyciny
S. conganensis (ATCC13528)- F1370 A, B
5· diasiaticus Plauracin y, Streptogramim y
S. graminofasciens Streptograminy
S. grijeus (NRRL2426) Viridogriséin' (Etamycine)
S. griseoviridus Griseoviridin
S. griseoviridus (FERMP3562) Néoviridogriséiny
S· laYsntfalae Etamyciny
S. loidensis (ATCC 11415) Vemamycin y
S. mitakaensis (ATCC15297) Mikamyciny
S. olivaceus (ATCC12019) Synergistiny (PA114 A, B)
s. ostréogriseus (ATCC27455) Ostréogryciny
S. orisrinaespíralis (ATCC25486) Pristinamyciny
S. virsiniae (ATCC13161) Virginiamyciny (Staphylomyciny )
ACTINOMYCETES
A. auranticolor(ATCC31011) Plauracin'y
Δ· azureus (ATCC31157) Plauracin y
Δ· daghestanicus Etamycin
A. philippinensis A-2315 A, B, C
Actinoplanes sp. (ATCC33002) A15104
Actinoplanes sp. A17002 A, B, C, F
Actinomadura flava Madumyciny
Použité zkratky:
DNA kyselina deoxyribonukleová
AMP adenosin-5'-monofosfát dCTP deoxycytosin-5'-trifosfát
DMPAPA 4-dimethylamino-L-fenylalanin
HT7 Hickey-Tresnerovo pevné kultivační prostředí
3-HPA kyselina 3-hydroxypikolinová
IPTG isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosid kb kilobáze
LB kultivační prostředí Luria (obohacené růstové prostředí pro Escherichia coli)
MMPAPA 4-methylamíno-L-fenylalanin
PAPA 4-amino-L-fenylalanin
PEG polyethylenglykol
PI prystinamycin I
PII prystinamycin II pb pár bází
SAM S-adenosylmethionin
TE pufr 10mM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 7,5
Tris amino-2-hydroxymethyl-2-propan-1,3-diol
X-gal 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galaktosid
ΥΞΜΕ kultivační médium na bázi kvasničného extraktu a sladového extraktu (obohacené růstové prostředí pro Streptomyces).
Bibliografie:
- Bibb M. J., Findlay P. R.a Johnson M. W. (1984) Gene, 30 : 157-166.
- Bibb M. J., Janssen G. R.,a Ward J. M. (1985) Gene, 38 : 215-226.
- Cocito C. G. (1979) MicrobioL Rev., 43 : 145-198.
- Cocito C. G. (1983) In Antibiotics, 6 : (Ed. F. E. Hahn), 296-332.
- Dessen P. C., Fondrat C., Valencien C. a Mugnier C. (1990) Comp. Appl. in
Biosciences, 6 : 355-356,
- Di Giambattista M., Chinali G. a Cocito C. G. (1989) J. Antim. Chemother., 24 :
485-507.
- Gibson TJ. (1984) Ph.D. thesis, Cambridge University, England.
- Hillemann D., Piilher A. a Wohlleben W. (1991) NucL Acids Res., 19 : 727-731.
- 112 - Hopwood D. A., Bibb M. J., Cháter K. F., Kieser T., Bruton C. J., Kieser Η. M., Lydiate D. J., Smith C. P., Ward J. M. a Scrempf H. (1985) A laboratory manual., The John Innes Fondation, Norwich, England.
- Hudson G. S. a Davidson Β. E. (1984) J. Mol. Biol., 180 : 1023-1051.
- Kuhstoss S., Richardson M. A., a Rao R. N. (1991) Gene 97 :143-146.
- Maniatis T., Fritsh E. F. a Sambrook J. (1989) Molecuiar cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y,
- Messing J., Crea R. a Seeburg Ρ. H. (1981) Nucleic Acids Res., 9 : 309.
- Molinero A. A., Kingston D. G. I., a Reed J. W. (1989) J. Nat. Prod., 52 : 99108.
- Omer C. A., Lenstra R., Litle P. J., Dean J., Tepperman J. M., Léto K. J., Romesser J. A., a 0'Keefe D. P. (1990) J. Bact. 172 : 3335-3345.
- Reed J. W., Purvis Μ. B., Kingston D. G. I., Biot A., a Gosselé F. (1989) J. Org. Chem. 54 :1161-1165.
- Staden R. a McLachlan A. D. (1982) Nucleic Acids Res., 10 : 141-156.
- Schindler U., Sans N., a Schróder J. (1989) J. Bact. 171 : 847-854.
- Thorson J. S.; Lo S. F., a Liu H-W. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115 : 6993-6994.
- Videau D. (1982) Path. Biol., 30 : 529-534.
Seznam sekvencí
Informace pro SEQ ID č.1:
charakteristiky sekvence:
délka: 2888 párů bází typ: nukleová kyselina počet řetězců: dvouřetězec konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetický: ne antimediátorová: ne původ: organismus Streptomyces pristinaespiralis popis sekvence: SEQ ID č.1:
20 30 40 50 60
CTGCAGTTCC CCGGGGCCAC CGTGCTCAGC TCCTCACCCG AACGGTTCCT GCGCATCGGC
30 90 100 110 120
GCGGACGGCT GGGCGGAGTC CAAACCCATC AAGGGCACCC GCCCCCGCGG CGCCGGCCCC
130 140 150 160 170 180
GCGCAGGACG CCGCCGTCAA GGCCTCCCTC GCCGCGGCCG AGAAGGACCG CAGCGAGAAC
190 CTGATGATCG 200 TCGACCTGGT 210 CCGCAACGAC 220 CTCGGCCAGG 230 TCTGCGACAT 240 CGGCTCCGTC
250 CACGTACCGG 260 GCCTGTTCGA 270 GGTGGAGACC 280 TACGCCACCG 290 TCCACCAGCT 300 CGTCAGCACG
310 GTCCGCGGCC 320 GCCTGGCGGC 330 CGACGTCTCC 340 CGCCCCCGCG 350 CGGTACGGGC 360 CGCCTTCCCC
370 GGCGGGTCGA 380 TGACCGGCGC 390 GCCCAAGGTC 400 CGCACCATGC 410 AGTTCATCGA 420 CCGGCTCGAG
430 AAGGGCCCGC 440 GCGGCGTGTA 450 CTCGGGCGCG 460 CTGGGCTACT 470 TCGCCCTCAG 480 CGGCGCGGCC
490 GACCTCAGCA 500 TCGTCATCCG 510 CACCATCGTC 520 GCCACCGAGG 530 AGGCCGCCAC 540 CATCGGCGTG
550 GGCGGCGCCG 560 TCGTCGCCCT 570 GTCCGACCCC 530 GACGACGAGG 590 TCCGCGAAAT 600 GCTCCTCAAG
610 GCGCAGACCA 620 CCCTCGCCGC 630 CCTGCGCCAG 640 GCACACGCGG 650 GCGCCACCGC 660 CTCGGACCGT
670 GAACTCCTGG 680 CCGGCAGCCT 690 GCGGTGACCC 700 ACCCACCGCC 710 CCACCCCGGC 720 CACCGCAACC
730 CCGGCTCACC 740 CCCGGGGCGG 750 CCGCGCGCGG 760 TGCCGCCCGG 770 CGGCCGACCC 780 GGCGACGGGT
790 CCGCTCGCGG 800 ACCGGGTGAC 810 GGACCCGGCG 820 GCGGGGCCGG 830 CGGCGGGCCG 840 GGACGTGGGC
850 CGGGACGTGG 860 GCCCGGCGTC 870 CCCGGCGACC 880 GGCACGGCGG 890 CGGGCCCGGA 900 CGTGGGCCCG
910 GCGTGCCCGG 920 CGACCGGCAC 930 GGTGGCGGGG 940 CGGGGCGGGG 950 GACGGTCAGT 960 GCAGGGCGGT
970 GAACATCCGC 980 GCGCACAGCC 990 GTTCCAGCTC 1000 CGCGCCGTGC 1010 TCGCCCAGCA 1020 CACCGCGCAG
1030 TTCGGCGAAC 1040 AGGGCGGCGA 1050 ACGTCTCCTC 1060 GTCGCCCCTC 1070 TCGACGGCCT 1080 GCCCCAGCCG
1090 CACCAGGCCG 1100 CGGCCCAGCG 1110 CCTGCCGCGC 1120 GGCCGGCGCG 1130 CCGGGGTTGG 1140 CGGCCTGGAT
1150 GTCGAAATAC 1160 ACCTCCGGCG 1170 TCCCGCCGGC 1180 GATCCGGGCC 1190 AGCAGCGCCA 1200 GCATCGCCAG
1210 ATGGGGCGGC 1220 GGGGCACTGT 1230 CCCGCAGCGC 1240 CCCCACGTCC 1250 ACCGACAGCT 1260 CACCCAGGCC
1270 CAGCCCGAAG 1280 GCCAGCACCG 1290 CGGCATGCGT 1300 GGCGGCCTGC 1310 TGCGCGGCGG 1320 TCAGCTCGTC
1330 GTGCCGCCGC 1340 GCCGGCATCT 1350 CCACCACCCG 1360 GGCCCCCCAC 1370 CCGGCCACCA 1330 GCTCCACCAG
. 1390 GGCCCGCACA 1400 CCGGGCCCGT 1410 CGGTGACCAC 1420 CACCGCCGCC 1430 ACCGGCCGCC 1440 CCTGAAGACC
1450 CAGCGAGGGG 1460 GCGAACATCG 1 470 GGTTCAGCCC 1480 CACCGCCTGC 1490 AGCCCCGGCG 1500 CCGCCTCACG
1510 CAGCCGCCCG 1520 GCGATCCGGC 1530 TCTTGACCGA 1540 CAAGGTGTCC 1550 GCGAGCACCG 1560 CACCGGGCCG
1570 CATCACCCCC 1580 GCCAGCACCT 1590 CCACCGCCTC 1600 CCACGCCACC 1610 GGCTCCGGCA 1620 CCGCCAGCAC
14
1630 CACCACGTCC 1640 GCCGCCGCCA 1650 GCGCCGCGAC 1660 CGCCTCCGGC 1670 CCCGGCCGCC 1680 GCACATCACC
1690 1700 1710 1720 1730 1740
GGCCACCACC CGCACCCCGT CCGCCGCACC GGCCCCGGCC ACGTCCAGCC AGGTCACCGC
1750 CACCCCCGAA 1760 CGCACCAGCC 1770 AGTGGCTGAA 1780 CATGCGGCCC 1790 ACCGCACCGG 1300 CCCCGCCCAC
1810 CACCACACAA 1820 CGCCCGAACA 1830 CCGAACCACC 1840 CCTCATCCGC 1850 GTTCCCGATC 1860 CCCCCGGTAC
1870 GGAGGAAGAA 1830 CCATGACCCC 1890 GCCCGCCATC 1900 CCCGCCGCCC 1910 CGCCCGCCAC 1920 ČGGGCCCGCC
1930 CCCGCCACCG 1940 ACCCCCTCGA 1950 CGCGCTGCGC 1960 GCCCGCCTGG 1970 ACGCCGCGGA 1980 CGCCGCCCTG
1990 CTGGACGCCG 2000 TCCGCACACG 2010 CCTGGACATC 2020 TGCCTGCGCA 2030 TCGGCGAGTA 2040 CAAGCGCCTC
2050 CACCAGGTGC 2060 CGATGATGCA 2070 GCCCCACCGG 2080 ATCGCCCAGG 2090 TCCACGCCAA 2100 CGCCGCCCGC
2110 TACGCCGCCG 2120 ACCACGGCAT 2130 CGACCCCGCC 2140 TTCCTGCGCA 2150 CCCTGTACGA 2160 CACGATCATC
21 70 ACCGAGACCT 2180 GCCGCCTCGA 2190 GGACGAGTGG 2200 ATCGCCTCCG 2210 GCGGCGCCCC 2220 CGTCCCCACG
2230 CCCGTGCACG 2240 CGTCCGCGTC 2250 CGCGCGGGGG 2260 GCCGTGTCGT 2270 GACCGCCGCC 2280 GCACCCACCC
2290 TCGCCCAGGC 2300 GCTGCACGAG 2310 GCCACCGGGC 2320 AGC7GACCGG 2330 CGCCGGGATC 2340 ACCGCCGACG
2350 CCGCCCGGGC 2360 CGACACCCGG 2370 CTGCTGGCCG 2380 CCCACGCCTG 2390 CCAGGTCGCC 2400 CCGGGGGACC
2410 TCGACACCTG 2420 CCTGGCCGGC 2430 CCGGTGCCGC 2440 CCCGGTTCTG 2450 GCACTACGTC 2460 CGGCGCCGTC
2470 TGACCCGCGA 2480 ACCCGCCGAA 2490 CGCATCGTCG 2500 GCCACGCCTA 2510 CTTCATGGGC 2520 CACCGCTTCG
2530 ACCTGGCCCC 2540 CGGCGTCTTC 2550 GTCCCCAAAC 2S60 CCGAGACCGA 2570 GGAGATCACC 2530 CGGGACGCCA
2590 TCGCCCGCCT 2600 GGAGGCCCTC 2610 GTCCGCCGCG 2620 GCACCACCGC 2630 ACCCCTGGTC 2640 GTCGACCTGT
2650 GCGCCGGACC 2660 GGGCACCATG 2670 GCCGTCACCC 2630 TGGCCCGCCA 2690 CGTACCGGCC 2700 GCCCGCGTCC
2710 TGGGCATCGA 2720 ACTCTCCCAG 2730 GCCGCCGCCC 2740 GCGCCGCCCG 2750 GCGCAACGCC 2760 CGCGGCACCG
2770 GCGCCCGCAT 2780 CGTGCAGGGC 2790 GACGCCCGCG 2800 ACGCCTTCCC 2310 CGAACTGAGC 2820 GGCACCGTCG
2330 ACCTCGTCGT 2340 CACCAACCCG 2850 CCCTACATCC 2860 CCATCGGACT 2370 GCGCACCTCC 2880 GCACCCGAAG
TGCTCGAG
15
Informace pro SEQ ID č.2:
charakteristiky sekvence:
délka: 888 páru bází typ: nukleová kyselina počet řetězců: dvouřetězec konfigurace: linaární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne původ: organismus Streptomyces pristinaespiralis » popis sekvence SEQ ID č.2:
ATG AGG GGT GGT TCG GTG TTC GGG CGT TGT GTG GTG GTG GGC GGG GCC GGT GCG 54
Met Arg Gly Gly Ser val Phe Gly Arg Cys Val Val Val Gly Gly Ala Gly Ala 18
GTG GGC CGC ATG TTC AGC CAC TGG CTG GTG CGT TCG GGG GTG GCG GTG ACC TGG 108
Val Gly Arg Met Phe Ser His Trp Leu Val Arg Ser Gly Val Ala Val Thr Trp 36
CTG GAC GTG GCC GGG GCC GGT GCG GCG GAC GGG GTG CGG GTG GTG GCC GGT GAT 1 62
Leu Asp Val Ala Gly Ala Gly Ala Ala ASp Gly Val Arg Val Val Ala Gly Asp 54
GTG CGG CGG CCG GGG CCG GAG GCG GTC GCG GCG CTG GCG GCG GCG GAC GTG GTG 216
Val Arg Arg Pro Gly Pro Glu Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp Val Val 72
GTG CTG GCG GTG CCG GAG CCG GTG GCG TGG GAG GCG GTG GAG GTG CTG GCG GGG 270
Val Leu Ala Val Pro Glu Pro Val Ala Trp Glu Ala Val Glu Val Leu Ala Gly 90
GTG ATG CGG CCC GGT GCG GTG CTC GCG GAC ACC TTG TCG GTC AAG AGC CGG ATC 324
Val Met Arg Pro Gly Ala val Leu Ala Asp Thr Leu Ser val Lys Ser Arg Ile 108
GCC GGG CGG CTG CGT GAG GCG GCG CCG GGG CTG CAG GCG GTG GGG CTG AAC CCG 378
Ala Gly Arg Leu Arg Glu Ala Ala Pro Gly Leu Gin Ala Val Gly Leu Asn Pro 126
ATG TTC GCC CCC TCG CTG GGT CTT CAG GGG CGG CCG GTG GCG GCG GTG GTG GTC 432
Met Phe Ala Pro Ser Leu Gly Leu Gin Gly Arg Pro Val Ala Ala Val Val Val 144
ACC GAC GGG CCC GGT GTG CGG GCC CTG GTG GAC- CTG GTG GCC GGG TGG GGG GCC 486
Thr Asp Gly Pro Gly Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Val Ala Gly Trp Gly Ala 162
CGG GTG GTG GAG ATG CCG GCG CGG CGG CAC GAC GAG CTG ACC GCC GCG CAG CAG 540
Arg Val Val Glu Met Pro Ala Arg Arg His Asp Glu Leu Thr Ala Ala Gin Gin 1 30
GCC GCC ACG CAT GCC GCG GTG CTG GCC TTC GGG CTG GGC CTG GGT GAG CTG TCG 5 9 >1
Ala Ala Thr His Ala Ala Val Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Glu Leu Ser 198
GTG GAC GTG GGG GCG CTG CGG GAC AGT GCC CCG CCG CCG CAT CTG GCG ATG CTG 54 3
Val Asp Val Gly Ala Leu Arg Asp Ser Ala Pro Pro Pro His Leu Ala Met Leu 716
GCG CTG CTG GCC CGG ATC GCC GGC GGG ACG CCG GAG GTG TAT TTC GAC ATC CAG
Ala Leu Leu Ala Arg Ile Ala Gly Gly Thr Pro Glu Val Tyr Phe Asp Ile Gin 23 4
16
GCC GCC AAC CCC GGC GCG CCG GCC GCG CGG CAG GCG CTG GGC CGC GGC CTG GTG 756
Ala Ala Asn Pro Gly Ala Pro Ala Ala Arg Gin Ala Leu Gly Arg Gly Leu Val 252
CGG CTG GGG CAG GCC GTC GAG AGG GGC GAC GAG GAG ACG TTC GCC GCC CTG TTC 810
Arg Leu Gly Gin Ala Val Glu Arg Gly Asp Glu Glu Thr Phe Ala Ala Leu Phe 270
GCC GAA CTG CGC GGT GTG CTG GGC GAG CAC GGC GCG GAG CTG GAA CGG CTG TGC 364
Ala Glu Leu Arg Gly Val Leu Gly Glu His Gly Ala Glu Leu Glu Arg Leu Cys 283
GCG CGG ATG TTC ACC GCC CTG CAC 883
Ala Arg Met Phe Thr Ala Leu His 296
Informace pro SEQ ID č.3: charakteristiky sekvence:
délka: 387 párů bází typ: nukleová kyselina počet řetězců: dvouřetězec konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne
původ: popis organismus Streptomyces pristinaespi .ral .is
sekvence SEQ ID Č. 3:
ATG ACC CCG CCC GCC ATC CCC GCC GCC CCG CCC GCC ACC GGG CCC GCC CCC GCC 54
Met Thr Pro Pro Ala Ile Pro Ala Ala Pro Pro Ala Thr Gly Pro Ala Ala Ala 18
ACC GAC CCC CTC GAC GCG CTG CGC GCC CGC CTG GAC GCC GCG GAC GCC GCC CTG 108
Thr Asp Pro Leu Asp Ala Leu Arg Ala Arg Leu Asp Ala Ala Asp Ala Ala Leu 36
CTG GAC GCC GTC CGC ACA CGC CTG GAC ATC TGC CTG CGC ATC GGC GAG TAC AAG 162
Leu Asp Ala val Arg Thr Arg Leu Asp Ile Cys Leu Arg Ile Gly Glu Tyr Lys 54
CGC CTC CAC CAG GTG CCG ATG ATG CAG CCC CAC CGG ATC GCC CAG GTC CAC GCC 215
Arg Leu His Gin Val Pro Met Met Gin Pro His Arg Ile Ala Gin Val His Ala 72
AAC GCC GCC CGC TAC GCC GCC GAC CAC GGC ATC GAC CCC GCC TTC CTG CGC ACC 270
Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Ala Asp His Gly Ile Asp Pro Ala Phe Leu Arg Thr 90
CTG TAC GAC ACG ATC ATC ACC GAG ACC TGC CGC CTC GAG GAC GAG TGG ATC GCC 324
Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Thr Glu Thr Cys Arg Leu Glu ASp Glu Trp Ile Ala 108
TCC GGC GGC GCC CCC GTC CCC ACG CCC GTG CAC GCG TCC GCG TCC GCG CGG GGG 378
Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Thr Pro Val His Ala Ser Ala Sar Ala Arg Gly 126
387 1 29
GCC GTG TCG Ala Val Ser
Informace pro SEQ ID č.4:
charakteristiky sekvence:
délka: 4496 párů bází typ: nukleová kyselina počet řetězců: dvouřetězec konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne původ: organismus Streptomyces pristinaespiralis popis sekvence ID č.4:
10 CTCGAGCAGG 20 TGCCCCACCT 30 CGGCGGCACG 40 GTGCGCGGGC 50 AGCGCGAACA 60 CCGGCAGCGC
70 GCCCAGACGG 30 AACAGCGCGA 90 AGCACACCGC 100 GACGAACTCG 110 GGCGTGTTCG 120 GCAGCTGCAC
i30 CAGCACCCGC 142 TCGCCGGCGC 150 CGATCCCGCG 1 60 CGCCGCGAAC 170 CCCGCCGCCA 180 GCCGGTCGCA
’ 90 CCAGCGGtCC 200 AGGGCACGGT 210 AGGTGACACG 220 GGAGCACCCG 230 TCCGCGCCGA 240 CCAGCGCCTC
250 CCGCTCGCCG 260 TACTGCTCCG 270 CCCAGCGGCC 280 CAGCAGCA7G 290 CCCAGCGGCT 300 CGCCCCGCCA
310 GTAGCCGGCG 320 GCCCGGTACT 330 TCGCGGCCAC 340 ATCCTCGGGC 350 CAGGGAACGC 360 ATCCGTCCAG
3“0 380 390 400 410 420
CATCGTTGGT CCTTTCCGGC TTCGTCCTCG CGTCGCGCCC AGTGTCGGCA GCGCCGTTGA
430 CACGCCGCTG 440 ATGCGCCGCG 450 CCCGCGCGCC 460 GCCGCTCCGT 470 CAGGAGCCGA 430 TCAGGGCGGC
490 GTCAGCCGGG 500 CCGGACAGGA 510 TGCCGCCCAC 520 GGGGCCCGGC 530 ACACCGGGCC 540 GCGGCGACAG
550 CGGGCCGGCG 560 ACCGGCAGGC 570 CGACACCACG 580 CACGGACGAG 590 AAGAAACAAC 600 ACAAGGGGAG
610 CACCCGATGG 620 AGACCTGGGT 630 CCTGGGCCGG 640 CGCGACGTCG 650 CCGAGGTGGT 660 GGCCGCCGTC
670 GGCCGCGAGG 680 AACTCATGCG 690 CCGCATCATC 700 GACCGCCTCA 710 CCGGCGGACT 720 GGCCGAGATC
730 GGCCGCGGCG 740 AGCGGCACCT 750 GTCCCCGCTG 760 CGCGGCGGAC 770 TGGAACGCAG 780 CGAACCCGTG
790 CCCGGCATCT 800 GGGAATGGAT 810 GCCGCACCGC 820 GAACCCGGCG 830 ACCACATCAC 840 CCTCAAGACC
350 GTCGGCTACA 860 GCCCCGCCAA 870 CCCCGGCCGC 830 TTCGGCCTGC 890 CGACCATCCT 900 GGGCACCGTC
910 GCCCGCTACG 920 ACGACACCAC 930 CGGCGCCCTG 940 ACCGCCCTGA 950 TGGACGGCGT 960 GCTGCTCACC
18
970 GCCCTGCGCA 980 CCGGCGCCGC 990 CTCCGCCGTC 1000 GCCTCCCGCC 1010 TGCTGGCCCG 1020 CCCCGACAGC
1030 CACACCCTGG 1040 GACTGATCGG 1050 CACCGGCGCC 1060 CAGGCCGTCA 1070 CCCAACTGCA 1080 CGCCCTGTCC
1090 CTGGTACTGC 1100 CCCTGCAACG 1110 GGCCCTGGTG 1120 TGGGACACCG 1130 ACCCCGCCCA 1140 CCGGGAAAGC
1150 TTCGCCCGGC 1160 GCGCCGCGTT 1170 CACCGGCGTC 1180 AGCGTCGAGA 1190 TCGCCGAGCC 1200 CGCCCGGATC
1210 GCCGCCGAGG 1220 CCGACGTCAT 1230 CTCCACCGCC 1240 ACCTCGGTAG 1250 CCGTCGGCCA 1260 GGGCCCGGTC
1270 CTGCCCGACA 1280 CCGGCGTCCG 1290 CGAGCACCTG 1300 CACATCAACG 1310 CCGTCGGCGC 1320 GGACCTCGTC
1330 GGCAAGACGG 1340 AACTGCCGCT 1350 CGGCCTGCTC 1360 GAGCGGGCGT 1370 TCGTCACCGC 1380 CGACCACCCC
1390 GAGCAGGCGC 1 400 TGCGCGAGGG 1410 CGAGTGCCAG 1420 CAACTCTCCG 1430 CCGACCGGCT 1440 CGGCCCGCAG
1450 CTGGCCCACC 1460 TGTGCGCCGA 1470 CCCGGCGGCC 1 480 GCCGCCGGCC 1490 GGCAGGACAC 1500 CCTGAGCGTC
1510 TTCGACTCCA 1520 CCGGCTTCGC 1530 CTTCGAGGAC 1 540 GCCCTGGCGA 1550 TGGAAGTGTT 1550 CCTCGAGGCC
1570 GCCGCCGAAC 1580 GGGACCTGGG 1590 CATCCGGGTG 1600 GGCATCGAAC 1610 ACCACCCCGG 1 620 CGACGCCCTG
1530 GACCCCTACG 1640 CCCTCCAGCC 1650 CCTGCCCCTG 1660 CCCCTGGCCG 1670 CCCCCGCCCA 1680 CTGACCCCCC
1590 CCTTTTTTCG 1700 GGACCCCCGC 1710 TCTTTTTCGA 1720 GACCCCCGCC 1730 CGGCCGGCCC 1740 GGCCCTCCTC
1750 CCGCCGGCCC 1760 CCATGCCCGG 1770 CCGGGCCGGG 1780 GCACCCACGA 1790 CGCCCTCGCG 1800 AGGAGAGAGA
1810 TGCCCCCCAC 1820 CCCCCGGCCC 1830 ACCACCGACG 1840 ACGGCGGCCG 1850 TGAACTGCTC 1 860 GCCTGGCTGC
1870 GCGAGATGCG 1880 CCACCACCAC 1890 CCCGTCCACG 1900 AGGACGAATA 1910 CGGTGCCTTC 1920 CACGTCTTCC
1930 GGCACGCCGA 1940 CGTCCTCACC 1950 GTCGCCTCCG 1960 ACCCCGGCGT 1970 CTACTCCTCC 1980 CAGCTCAGCC
1990 GGCTACGGCC 2000 CGGCTCCCAG 2010 GCGTTGAGCG 2020 AACAGATCCT 2030 GTCGGTCATC 2040 GACCCGCCGA
2050 TGCACCGCAC 2060 CCTGCGCCGC 2070 CTGGTCAGCC 2080 AGGCCTTCAC 2090 CCCCCGCACC 2100 GTCGCCGACC
2110 TCGAACCACG 2120 CGTCACCGAA 2130 CTGGCCGGGC 2140 aactgctcga 2150 CGCCGTCGAC 21 60 GGCGACACGT
2170 TCGACCTCGT 2180 CGCCGACTTC 2190 GCCTACCCGC 2200 TGCCCGTGAT 2210 CGTGATCGCC 2220 GAACTCCTCG
2230 GCGTGCCGCC 2240 CGCCGACCGC 2250 ACCCTGTTCC 2260 GCTCCTGGTC 2270 CGACCGGATG 2280 CTGCAGATGC
2290 AGGTCGCCGA 2300 CCCGGCGGAC 2310 ATGCAGTTCG 2320 GCGACGACGC 2330 CGACGAGGAC 2340 TACCAACGCC
2350 TCGTCAAAGA 2360 ACCCATCCGC 2370 GCCATGCACG 2380 CCTACCTCCA 2390 CGACCACGTC 2400 ACCGACCGCC
19
2410 GCGCCCGCCC 2420 CGCGAACGAC 2430 CTGATCTCCG 2440 CACTCGTCGC 2450 CGCCCGCGTG 2460 GAGGGCGAAC
2470 GACTCACCGA 2480 CGAGCAGATC 2490 GTCGAATTCG 2500 GGGCGCTGCT 2510 GCTGATGGCC 2520 GGCCACGTCT
2530 CCACCTCCAT 2540 GCTGCTCGGC 2550 AACACCGTGC 2560 TGTGCCTGAA 2570 GGACCACCCC 2580 CGGGCCGAGG
2590 CCGCCGCCCG 2600 CGCCGACCGG 2610 TCCCTGATCC 2620 CCGCCCTGAT 2630 CGAAGAAGTA 2640 CTGCGGCTGC
2650 GGCCGCCGAT 2660 CACCGTCATG 2670 GCCCGCGTCA 2630 CCACCAAGGA 2690 CACCGTCCTC 2700 GCCGGCACCA
2710 CCATCCCCGC 2720 CGGACGCATG 2730 GTCGTGCCCT 2740 CCCTGCTGTC 2750 CGCCAACCAC 2760 GACGAACAGG
2770 TCTTCACCGA 2780 CCCCGACCAC 2790 CTCGACCTCG 2800 CCCGCGAAGG 2810 CCGCCAGATC 2820 GCCTTCGGCC
2830 ACGGGATCCA 2840 CTACTGCCTG 2350 GGCGCCCCGC 2860 TCGCCCGCCT 2870 GGAGGGCCGC 2330 ATCGCCCTGG
2890 AAGCCCTCTT 2900 CGACCGATTC 2910 CCCGACTTCT 2920 CGCCCACCGA 2930 GGGGGGAAAA 2940 CTGCGCTACC
2950 ACCGCGACGG 2960 ACTGTTCGGC 2970 GTCAAGAACC 2980 TGCCGCTGAC 2990 CGTACGGCGC 3000 GGCTGACACA
3010 GACAAGGGGG 3020 CCACCTGGTG 3030 CGCACCGTGC 3040 GAACCCTGCT 3050 GATCGACAAC 3060 TACGACTCGT
3070 TCACCTACAA 3030 CCTCTTCCAG 3090 ATGCTGGCCG 3100 AGGTGAACGG 3110 CGCCGCTCCG 3120 CTCGTCGTCC
3130 GCAACGACGA 3140 CACCCGCACC 3150 TGGCAGGCCC 3160 TGGCGCCGGG 3170 CGACTTCGAC 3180 AACGTCGTCG
3190 TCTCACCCGG 3200 CCCCGGCCAC 3210 CCCGCCACCG 3220 ACACCGACCT 3230 GGGCCTCAGC 3240 CGCCGGGTGA
3250 TCACCGAATG 3260 GGACCTGCCG 3270 CTGCTCGGGG 3280 TGTGCCTGGG 3290 CCACCAGGCC 3300 CTGTGCCTGC
3310 TCGCCGGCGC 3320 CGCCGTCGTC 3330 CACGCACCCG 3340 AACCCTTTCA 3350 CGGCCGCACC 3360 AGCGACATCC
3370 GCCACGACGG 3380 GCAGGGCCTG 3390 TTCGCGAACA 3400 TCCCCTCCCC 3410 GCTGACCGTG 3420 GTCCGCTACC
3430 ACTCGCTGAC 3440 CGTCCGGCAA 3450 CTGCCCGCCG 3460 ACCTGCGCGC 3470 CACCGCCCAC 3480 ACCGCCGACG
3490 GGCAGCTGAT 3500 GGCCGTCGCC 3510 CACCGCCACC 3520 TGCCCCGCTT 3530 CGGCGTGCAG 3540 TTCCACCCCG
3550 AATCGATCAG 3560 CAGCGAACAC 3570 GGCCACCGGA 3530 TGCTCGCCAA 3590 CTTCCGCGAC 3600 CTGTCCCTGC
3610 GCGCGGCCGG 3620 CCACCGCCCC 3630 CCGCACACCG 3640 AACGCATACC 3650 CGCACCCGCA 3660 CCCGCCCCCG
3670 CCCCCGCCCC 3680 CGCACCGGCA 3690 CCGCCCGCGT 3700 CCGCGCCGGT 3710 GGGGGAGTAC 3720 CGGCTGCATG
3730 TGCGCGAGGT 3740 CGCCTGGGTG 3750 CCCGACGCGG 3760 ACGCCGCGTT 3770 CACCGCCCTG 3780 TTCGCCGACG
3790 CCCCGGCCCG 3800 GTTCTGGCTC 3810 GACAGCAGCC 3820 GCGTCGAGCC 3830 GGGCCTCGCC 3840 CGCTTCACCT
20
3850 TCCTCGGCGC 3860 CCCCGCCGGC 3870 CCGCTCGGCG 3880 AACAGATCAC 3890 CTACGACGTC 3900 GCCGACCGGG
3910 CCGTGCGCGT 3920 CAAGGACGGT 3930 TCAGGCGGCG 3940 AGACCCGCCG 3950 GCCCGGCACC 3960 CTCTTCGACC
3970 ACCTGGAACA 3980 CGAACTGGCC 3990 GCCCGCGCCC 4000 TGCCCGCCAC 4010 CGGCCTGCCC 4020 TTCGAGTTCA
4030 ACCTCGGCTA 4040 CGTCGGCTAC 4050 CTCGGCTACG 4060 AGACCAAGGC 4070 CGACAGCGGC 4080 GGCGAGGACG
4090 CCCACCGCGG 4100 CGAACTGCCC 4110 GACGGCGCCT 4120 TCATGTTCGC 4130 CGACCGGATG 4140 CTCGCCCTCG
4150 ACCACGAACA 4160 GGGGCGGGCC 4170 TGGCTCCTGG 4180 CACTGAGCAG 4190 CACCCGACGG 4200 CCCGCCACCG
4210 CACCCGCCGC 4220 CGAACGCTGG 4230 CTCACCGACG 4240 CCGCCCGGAC 4250 CCTCGCCACC 4260 ACCGCCCCCC
4270 GCCCGCCCTT 4230 CACCCTGCTG 4290 CCCGACGACC 4300 AACTGCCCGC 4310 CCTGGACGTC 4320 CACTACCGCC
4330 ACAGCCTGCC 4340 CCGCTACCGG 4350 GAACTGGTCG 4360 AGGAATGCCG 4370 CCGCCTGATC 4380 ACCGACGGCG
4390 4400 4410 4420 4430 4440
AGACCTACGA GGTGTGCCTG ACGAACATGC TCCGGGTGCC CGGCCGGATC GACCCGCTCA
4450 CCGCCTACCG 4460 CGCCCTGCGC 4470 ACCGTCAGCC 4430 CCGCCCCCTA 4490 CGCCGCCTAC CTGCAG
Informace pro sekvenci SEQ ID č.5:
charakteristiky sekvence:
délka: 1065 párů bází typ: nukleová kyselina počet řetězci: dvouřetězec konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne původ: organismus Streptomyces pristinaespiralis popis sekvence SEQ ID č.5:
ATG GAG ACC TGG GTC CTG GGC CGG CGC GAC GTC GCC GAG GTG GTG GCC GCC GTC 54
Met Glu Thr Trp Val Leu Gly Arg Arg Asp Val Ala Glu Val Val Ala Ala Val 13
GGC CGC GAC GAA CTC ATG CGC CGC ATC ATC GAC CGC CTC ACC GGC GGA CTG GCC 108
Gly Arg Asp Glu Leu Met Arg Arg Ile Ile Asp Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala 36
GAG ATC GGC CGC GGC GAG CGG CAC CTG TCC CCG CTG CGC GGC GGA CTG GAA CGC 162
Glu Ile Gly Arg Gly Glu Arg His Leu Ser Pro Leu Arg Gly Gly Leu Glu Arg 54
AG^. GAA CCC GTG CCC GGC ATC TGG GAA TGG ATG CCG CAC CGC GAA CCC GGC GAC 215
Ser Glu Pro Val Pro Gly Ile Trp Glu Trp Met Pro His Arg Glu Pro Gly Asp 72
1
CAC ATC ACC CTC AAG ACC GTC GGC TAC AGC CCC GCC AAC CCC GGC CGC TTC GGC 270
His Ile Thr Leu Lys Thr Val Gly Tyr Ser Pro Ala Asn Pro Gly Arg Phe Gly 90
CTG CCG ACC ATC CTG GGC ACC GTC GCC CGC TAC GAC GAC ACC ACC GGC GCC CTG 324
Leu Pro Thr Ile Leu Gly Thr val Ala Arg Tyr Asp Asp Thr Thr Gly Ala Leu 108
ACC GCC CTG ATG GAC GGC GTG CTG CTC ACC GCC CTG CGC ACC GGC GCC GCC TCC 378
Thr Ala Leu Met Asp Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Arg Thr Gly Ala Ala Ser 1 25
GCC GTC GCC TCC CGC CTG CTG GCC CGC CCC GAC AGC CAC ACC CTG GGA CTG ATC 432
Ala Val Ala Ser Arg Leu Leu Ala Arg Pro Asp Ser His Thr Leu Gly Leu Ile 1 44
GGC ACC GGC GCC CAG GCC GTC ACC CAA CTG CAC GCC CTG TCC CTG GTA CTG CCC 436
Gly Thr Gly Ala Gin Ala val Thr Gin Leu His Ala Leu Ser Leu Val Leu Pro 162
CTG CAA CGG GCC CTG GTG TGG GAC ACC GAC CCC GCC CAC CGG GAA AGC TTC GCC 540
Leu Gin Arg Ala Leu Val Trp Asp Thr Asp Pro Ala His Arg Glu Ser Phe Ala 130
CGG CGC GCC GCG TTC ACC GGC GTC AGC GTC GAG ATC GCC GAG CCC GCC CGG ATC 594
Arg Arg Ala Ala Phe Thr Gly Val Ser Val Glu Ile Ala Glu Pro Ala Arg Ile 193
GCC GCC GAG GCC GAC GTC ATC TCC ACC GCC ACC TCG GTA GCC GTC GGC CAG GGC 643
Ala Ala Glu Ala Asp Val Ile Ser Thr. Ala Thr Ser Val Ala Val Gly Gin Gly 21 6
CCG GTC CTG CCC GAC ACC GGC GTC CGC GAG CAC CTG CAC ATC AAC GCC GTC GGC 702
Pro Val Leu Pro Asp Thr Gly Val Arg Glu His Leu His Ile Asn Ala Val Gly 234
GCG GAC CTC GTC GGC AAG ACG GAA CTG CCG CTC GGC CTG CTC GAG CGG GCG TTC 755
Ala Asp Leu Val Gly Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Leu Leu Glu Arg Ala Phe 252
GTC ACC GCC GAC CAC CCC GAG CAG GCG CTG CGC GAG GGC GAG TGC CAG CAA CTC 810
Val Thr Ala Asp His Pro Glu Gin Ala Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gin Gin Leu 270
TCC GCC GAC CGG CTC GGC CCG CAG CTG GCC CAC CTG TGC GCC GAC CCG GCG GCC 864
Ser Ala Asp Arg Leu Gly Pro Gin Leu Ala His Leu Cys Ala Asp Pro Ala Ala 238
GCC GCC GGC CGG CAG GAC ACC CTG AGC GTC TTC GAC TCC ACC GGC TTC GCC TTC 913
Ala Ala Gly Arg Gin Asp Thr Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Phe Ala Phe 306
GAG GAC GCC CTG GCG ATG GAA GTG TTC CTC GAG GCC GCC GCC GAA CGG GAC CTG 972
Glu Asp Ala Leu Ala Met Glu Val Phe Leu Glu Ala Ala Ala Glu Arg Asp Leu 324
GGC ATC CGG GTG GGC ATC GAA CAC CAC CCC GGC GAC GCC CTG GAC CCC TAC GCC 1026
Gly Ile Arg val Gly Ile Glu His His Pro Gly Asp Ala Leu Asp Pro Tvr Ala 342
CTC CAG ccc CTG CCC CTG CCC CTG GCC GCC CCC GCC CAC 1065
Leu Gin Pro Leu Pro Leu Pro Leu Ala Ala Pro Ala His 355
Informace pro SEQ ID č.6: charakteristiky sekvence:
122 délka: 1194 párů bází typ: nukleová kyselina počet řetězců: dvouřetězec konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne původ: organismus Streptomyces pristinaespiralis popis sekvence SEQ ID č.6:
ATG ccc CCC ACC CCC CGG CCC ACC ACC GAC GAC GGC GGC CGT GAA CTG CTC GCC 54
Met Pro Pro Thr Pro Arg Pro Thr Thr Asp Asp Gly Gly Arg Glu Leu Leu Ala 18
TGG CTG CGC GAG ATG CGC CAC CAC CAC CCC GTC CAC GAG GAC GAA TAC GGT GCC 108
Trp Leu Arg Glu Met Arg His HiS His Pro Val His Glu Asp Glu Tyr Gly Ala 36
TTC CAC GTC TTC CGG CAC GCC GAC GTC CTC ACC GTC GCC TCC GAC CCC GGC GTC 162
Phe His Val Phe Arg His Ala Asp Val Leu Thr Val Ala Ser Asp Pro Gly Val 54
TAC TCC TCC CAG CTC AGC CGG CTA CGG CCC GGC TCC CAG GCG TTG AGC GAA CAG 216
Ser Ser Gin Leu Ser Arg Leu Arg Pro Gly Ser Gin Ala Leu Ser Glu Gin 72
ATC CTG TCG GTC ATC GAC CCG CCG ATG CAC CGC ACC CTG CGC CGC CTG GTC AGC 270
Ile Leu Ser Val Ile Asp Pro Pro Met His Arg Thr Leu Arg Arg Leu Val Ser 90
CAG GCC TTC ACC ccc CGC ACC GTC GCC GAC CTC GAA CCA CGC GTC ACC GAA CTG 324
Gin Ala Phe Thr Pro Arg Thr Val Ala Asp Leu Glu Pro Arg Val Thr Glu Leu 108
GCC GGG CAA CTG CTC GAC GCC GTC GAC GGC GAC ACG TTC GAC CTC GTC GCC GAC 378
Ala Gly Gin Leu Leu Asp Ala Val Asp Gly Asp Thr Phe Asp Leu Val Ala Asp 126
TTC GCC TAC CCG CTG CCC GTG ATC GTG ATC GCC GAA CTC CTC GGC GTG CCG CCC 432
Phe Ala Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile Ala Glu Leu Leu Gly Val Pro Pro 144
GCC GAC CGC ACC CTG TTC CGC TCC TGG TCC GAC CGG ATG CTG CAG ATG CAG GTC 486
Ala Asp Arg Thr Leu Phe Arg Ser Trp Ser Asp Arg Met Leu Gin Met Gin Val 162
GCC GAC CCG GCG GAC ATG CAG TTC GGC GAC GAC GCC GAC GAG GAC TAC CAA CGC 540
Ala Asp Pro Ala Asp Met Gin Phe Gly Asp Asp Ala Asp Glu Asp Tyr Gin Arg 1 80
CTC GTC AAA GAA CCC ATG CGC GCC ATG CAC GCC TAC CTC CAC GAC CAC GTC ACC 594
Leu Val Lys Glu Pro Met Arg Ala Met His Ala Tyr Leu His Asp His Val Thr 193
GAC CGC CGC GCC CGC CCC GCG AAC GAC CTG ATC TCC GCA CTC GTC GCC GCC CGC 648
Asp Arg Arg Ala Arg Pro Ala Asn Asp Leu Ile Ser Ala Leu Val Ala Ala Arg 216
GTG GAG GGC GAA CGA CTC ACC GAC GAG CAG ATC GTC GAA TTC GGG GCG CTG CTG 702
Val Glu Gly Glu Arg Leu Thr Asp Glu Gin Ile Val Glu Phe Gly Ala Leu Leu 234
CTG ATG GCC GGC CAC GTC TCC ACC TCC ATG CTG CTC GGC AAC ACC GTG CTG TGC 756
Lee Met Ala Gly His Val Ser Thr Ser Met Leu Leu Gly Asn Thr Val Leu Cys 252
123
CTG AAG GAC CAC CCC CGG GCC GAG GCC GCC GCC CGC GCC GAC CGG TCC CTG ATC 310
Leu Lys Asp His Pro Arg Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Asp Arg Ser Leu Ile 270
CCC GCC CTG ATC GAA GAA GTA CTG CGG CTG CGG CCG CCG ATC ACC GTC ATG GCC 864
Pro Ala Leu Ile Glu Glu Val Leu Arg Leu Arg Pro Pro Ile Thr val Met Ala 288
CGC GTC ACC ACC AAG GAC ACC GTC CTC GCC GGC ACC ACC ATC CCC GCC GGA CGC 918
Arg Val Thr Thr Lys Asp Thr Val Leu Ala Gly Thr Thr Ile Pro Ala Gly Arg 306
ATG GTC GTG CCC TCC CTG CTG TCC GCC AAC CAC GAC GAA CAG GTC TTC ACC GAC 972
Met Val Val Pro Ser Leu Leu Ser Ala Asn His Asp Glu Gin Val Phe Thr Aso 324
CCC GAC CAC CTC GAC CTC GCC CGC GAA GGC CGC CAG ATC GCC TTC GGC CAC GGC 1026
Pro Asp His Leu Asp Leu Ala Arg Glu Gly Arg Gin Ile Ala Phe Gly His Gly 342
ATC CAC TAC TGC CTG GGC GCC CCG CTC GCC CGC CTG GAG GGC CGC ATC GCC CTG 1080
Ile His Tyr Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Gly Arg Ile Ala Leu 360
GAA GCC CTC TTC GAC CGA TTC CCC GAC TTC TCG CCC ACC GAC GGC GCA AAA CTG 1134
Glu Ala Leu Phe Asp Arg Phe Pro Asp Phe Ser Pro Thr Asp Gly Ala Lys Leu 378
CGC TAC CAC CGC GAC GGA CTG TTC GGC GTC AAG AAC CTG CCG CTG ACC GTA CGG 1188
Arg Tyr His Arg Asp Gly Leu Phe Gly Val Lys Asn Leu Pro Leu Thr Val Arg 396
CGC GGC 1194
Arg Gly 398
Informace pro SEQ ID č.7 charakteristiky sekvence:
délka: 1561 párů bází typ: nukleová kyselina počet řetězců: dvouřetězec konfigurace: linaární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne původ: organismus Streptomyces pristinaespiralis popis sekvence SEQ ID č.7
10 20 30 40 50 60
AAGCTTCCCG ACCGGGTGGA GGTCGTCGAC GCGTTCCCGC TGACCGGCCT CAACAAGGTC
70 80 90 100 110 1 20
GACAAGAAGG CCCTGGCGGC CGACATCGCC GCCAAGACCG CCCCCACCCG CCCCACCACC
130 1 40 150 160 170 130
GCCGGCCACG GCCCGACCAC GGACGGCGAT ACGGCCGGTG GGGGTGGGTC CGCGGGCGuG
190 200 210 220 230 240
GTGACGGCCG CCGGTGGCGG GCGGGAGGAG GCGGCGTGAG CGGGCCCGGG CCCGAGGGCG
124
250 GCTACCGGGT 260 GCCGTTCGCG 270 CGACGCGGTT 280 CGGTGGTGGG 290 CGAGGCGGAC 300 CTGGCGGCGC
310 TGGGCGAACT 320 GGTCCGCTCG 330 GGCCGGTCGC 340 TGACGTCGGG 350 GGTGTGGCGG 360 GAGCGGTTCG
370 AGGAACAGTT 330 CGCCCGCCTG 390 ACCGGCGCCC 400 GGCACGCGCT 410 CAGTGTCACC 420 AGCGGCACCG
430 TCGCGCTGGA 440 ACTGGCGGTG 450 CGGATGCTGG 460 ACCTGGCGCC 470 GGGCGACGAG 480 GTGATCGCCA
490 CCCCGCAGAC 500 GTTCCAGGCG 510 ACGGTGCAGC 520 CGCTGCTCGA 530 CCACGACGTG 540 CGGCTGCGGT
550 TCTGCGACAT 560 CGACCCGGAC 570 ACCCTCAACC 580 TCGACCCGGC 590 GGTGCTGGAG 600 ACGCTGATCA
610 CCGACCGCAC 620 CCGGGCGATC 630 CTGCTCGTCC 640 ACTACGGCGG 650 CAACCCGGCC 660 GACATGGACC
670 GCATCATGGC 630 CCTGGCCCGC 690 AAGCGCGGCA 700 TCATCGTCGT 710 CGAGGACAGC 720 GCGCACGCGC
730 TGGGCGCCGT 740 GTACCGGGGG 750 CGGCGGCCGG 760 GGGCACTGGC 770 GGACATCGGC 780 TGCTTCACTT
790 TCCACTCCAC 300 GAAGAACATC 810 ACCACCCTCG 820 GCGAGGGCGG 830 CATGATCACC 840 CTGTCGCGTG
350 ACGAGTGGGC 360 CCAGCGGGTG 370 GGACGTATCC 880 GCGACAACGA 890 GGCCGACGGC 900 GTGTACGCGG
910 CGCTGCCGGA 920 CTCCGCGCGG 930 GCGGGTGCTC 940 CGGCGCTGCT 950 GCCGTGGATG 960 AAGTTCGCGG
970 AGGGTGTGTA 930 CGGTCACCGG 990 GCGGTCGGGG 1000 TCCGCGGGGC 1010 GGGCACGAAC 1020 GCGACGATGT
1030 CGGAGGCGGC 1040 GGCGGCGGTG 1050 GGCGTGGTGC 1060 AACTGGCGTC 1070 GCTGGAGCGG 1080 TTCGTGCCCC
1090 GGCGCCGGAG 1100 CATCGCGCAG 1110 CGGCTGGACG 1120 AGGCCGTGGC 1130 CTCGGTGGCC 1140 GGCACCCGGC
1150 TGCACCGGGC 1160 GGCGGCGGAC 1170 AGTCTGCACG 1180 CCTACCACCT 1190 GTACACGTTC 1200 TTCCTCACCG
1210 GCGGCCGGCA 1220 GGTGCGGGAG 1230 CGGTTCGTGC 1240 GCGCCCTGGA 1250 CCGGCTGGGT 1260 GTGGAGGTCC
1270 AGTTGCGGTA 1280 CTTCCCGCTC 1290 CATCTGTCGC 1300 CCGAGTGGCG 1310 GCTGCGCGGC 1320 CACGGGCCGG
1330 GCGAGTGTCC 1340 GACGGGGGAA 1350 CGGGTCTGGT 1360 TCGAGGAGCA 1370 CATGAACCTG 1330 CCGTGCCA7C
1390 CCGGTCTGAG 1400 TGACGGCCAG 1410 GTCGACTACA 1420 TGGTCGAGGC 1430 GGTCACCCGC 1440 GCCCTGCACG
1450 AGGCCCACGG 1460 CACGGGGACG 1 470 CGGGTGGCGG 1 480 CCGGGCACCT 1490 GTGACACCGT 1500 CCGCATCCGG
1510 CCGGTGGTTT 1520 TCCAAGACCG 1530 AOOGAGAGvjO 1540 AGGCGTATGC 1550 CGTTCATCGA 1560 AGTGAAGATC
rp
125
Informace pro SEQ ID č.8:
charakteristiky sekvence:
délka: 1233 párů bází typ: nukleová kyselina počet řetězců: dvouřetězec konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne « antimediátorová: ne půvoD: organismus Streptomyces pristinaespiralis * popis sekvence SEQ ID č.8:
GTG CCG TTC GCG CGA CGC GGT TCG GTG GTG GGC GAG GCG GAC CTG GCG GCG CTG 54
Val Pro Phe Ala Arg Arg Gly Ser Val Val Gly Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu 13
GGC GAA CTG GTC CGC TCG GGC CGG TCG CTG ACG TCG GGG GTG TGG CGG GAG CGG 103
Gly Glu Leu Val Arg Ser Gly Arg Ser Leu Thr Ser Gly Val Trp Arg Glu Arg 36
TTC GAG GAA CAG TTC GCC CGC CTG ACC GGC GCC CGG CAC GCG CTC AGT GTC ACC 162
Phe Glu Glu Gin Phe Ala Arg Leu Thr Gly Ala Arg His Ala Leu Ser Val Thr 54
AGC GGC ACC GTC GCG CTG GAA CTG GCG GTG CGG ATG CTG GAC CTG GCG CCG GGC 216
Ser Gly Thr Val Ala Leu Glu Leu Ala Val Arg Met Leu Asp Leu Ala Pro Gly 72
GAC GAG GTG ATC GCC ACC CCG CAG ACG TTC CAG GCG ACG GTG CAG CCG CTG CTC 270
Asp Glu Val Ile Ala Thr Pro Gin Thr Phe Gin Ala Thr Val Gin Pro Leu Leu 90
GAC CAC GAC GTG CGG CTG CGG TTC TGC GAC ATC GAC CCG GAC ACC CTC AAC CTC 324
Asp His Asp val Arg Leu Arg Phe Cys Asp Ile Asp Pro Asp Thr Leu Asn Leu 103
GAC CCG GCG GTG CTG GAG ACG CTG ATC ACC GAC CGC ACC CGG GCG ATC CTG CTC 373
Asp Pro Ala Val Leu Glu Thr Leu Ile Thr Asp Arg Thr Arg Ala Ile Leu Leu 126
GTC CAC TAC GGC GGC AAC CCG GCC GAC ATG GAC CGC ATC ATG GCC CTG GCC CGC 432
Val His Tyr Gly Gly Asn Pro Ala Asp Met Asp Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg 144
AAG CGC GGC ATC ATC GTC GTC GAG GAC AGC GCG CAC GCG CTG GGC GCC GTG TAC 486
tys Arg Gly Ile Ile Val Val Glu Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ala Val Tyr 1 62
CGG GGG CGG CGG CCG GGG GCA CTG GCG GAC ATC GGC TGC TTC ACT TTC CAC TCC 540
Arg Gly Arg Arg Pro Gly Ala Leu Ala Asp Ile Gly Cys Phe Thr Phe His Ser 1 80
ACG AAG AAC ATC ACC ACC CTC GGC GAG GGC GGC ATG ATC ACC CTG TCG CGT GAC 594
Thr Lys Asn Ile Thr Thr Leu Gly Glu Gly Gly Met Ile Thr Leu Ser Arg Asp 198
GAG TGG GCC CAG CGG GTG GGA CGT ATC CGC GAC AAC GAG GCC GAC GGC GTG TAC 643
Glu Trp Ala Gin Arg Val Gly Arg Ile Arg Asp Asn Glu Ala Asp Gly Val Tyr 216
GCG GCG CTG CCG GAC TCC GCG CGG GCG GGT GCT CCG GCG CTG CTG CCG TGG ATG 702
Ala Ala Leu Pro Asp Ser Ala Arg Ala Gly Ala Pro Ala Leu Leu Pro Trp Met 234
126
AAG TTC GCG GAG GGT GTG TAC GGT CAC CGG GCG GTC GGG GTC CGC GGG GCG GGC 756
Lys Phe Ala Glu Gly Val Tyr Gly His Arg Ala Val Gly Val Arg Gly Ala Gly 252
ACG AAC GCG ACG ATG TCG GAG GCG GCG GCG GCG GTG GGC GTG GTG CAA CTG GCG 310
Thr Asn Ala Thr Met Ser Glu Ala Ala Ala Ala Val Gly Val Val Gin Leu Ala 270
TCG CTG GAG CGG TTC GTG GCC CGG CGC CGG AGC ATC GCG CAG CGG CTG GAC GAG 864
Ser Leu Glu Arg Phe Val Ala Arg Arg Arg Ser Ile Ala Gin Arg Leu Asp Glu 283
GCC GTG GCC TCG GTG GCC GGC ACC CGG CTG CAC CGG GCG GCG GCG GAC AGT CTG 91 8
Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Thr Arg Leu His Arg Ala Ala Ala Asp Ser Leu 306
CAC GCC TAC CAC CTG TAC ACG TTC TTC CTC ACC GGC GGC CGG CAG GTG CGG GAG 97Z
His Ala Tyr His Leu Tyr Thr Phe Phe Leu Thr Gly Gly Arg Gin Val Arg Glu 324
CGG TTC GTG CGC GCC CTG GAC CGG CTG GGT GTG GAG GTC CAG TTG CGG TAC TTC 1026
Arg Phe Val Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gly Val Glu Val Gin Leu Arg Tyr Phe 342
CCG CTC CAT CTG TCG CCC GAG TGG CGG CTG CGC GGC CAC GGG CCG GGC GAG TGT 1080
Pro Leu His Leu Ser Pro Glu Trp Arg Leu Arg Gly His Gly Pro Gly Glu Cys 360
CCG ACG GCC GAA CGG GTC TGG TTC GAG GAG CAC ATG AAC CTG CCG TGC CAT CCC 11 34
Pro Thr Ala Glu Arg Val Trp Phe Glu Glu His Met Asn Leu Pro Cys His Pro 373
GGT CTG AGT GAC GGC CAG GTC GAC TAC ATG GTC GAG GCG GTC ACC CGC GCC CTG 1 1 33
Gly Leu Ser Asp Gly Gin Val Asp Tyr Met Val Glu Ala Val Thr Arg Ala Leu 396
CAC GAG GCC CAC GGC ACG GGG ACG CGG GTG GCG GCC GGG CAC CTG 1233
His Glu Ala His Gly Thr Gly Thr Arg Val Ala Ala Gly HiS Leu 41 1
rj?

Claims (29)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1 . Sloučenina obecného vzorce I ve kterém
    R^ a R^ nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo methylovou skupinu,
    R-j znamená atom vodíku nebo hydroxylovou skupinu,
    X znamená skupinu CO, CHOH nebo CH^ a
    R^ znamená \r přičemž
    -pro deriváty meta:
    A,C,D a Ξ znamenají atom vodíku a
    B může znamenat:
    -atom halogenu a výhodně atom fluoru,
    -monoalkylamino-skupinu nebo dialkylamino-skupinu, ve kterých alkylový zbytek výhodné znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu,
    128
    -etherovou skupinu,
    -thioetherovou skupinu
    -alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy nebo -trihalogenmethylovou skupinu, výhodně trifluormethylovou skupinu,
    -pro deriváty para:
    A, B, D a E znamenají atom vodíku a
    C může znamenat:
    -atom halogenu,
    -skupinu ve které R1 a R2 nezávisle jeden na druhém znamenají
    -atom vodíku,
    -přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, přičemž v případě, že jeden ze substituentů R^ nebo R2 znamená methylovou skupinu, potom druhý obligatorně znamená ethylovou skupinu,
    -alkylcykloalkylmethylovou skupinu, ve které cykloalkylový zbytek obsahuje 3 nebo 4 uhlíkové atomy, -případně substituovanou cykloalkylovou skupinu obsahující 3 nebo 4 uhlíkové atomy,
    - přímou nebo rozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, přičemž v případě, že jeden ze substituentů R1 nebo R2 znamená alkenylovou skupinu, poto druhý z těchto substituentů je odlišný od methylové skupiny nebo cykloalkylové skupiny obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů,
    -substituovanou nebo nesubstituovanou N-pyrrolidinylovou skupinu, -etherovou skupinu,
    -thioetherovou skupinu,
    -acylovou nebo alkoxykarbonylovou skupinu,
    -lineární nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až
    6 uhlíkových atomů, výhodně methylovou skupinu, isopropylovou skupinu a terč.butylovou skupinu,
    -alkylthiomethylovou skupinu,
    1 29
    -arylovou skupinu a výhodně fenylovou skupinu nebo -trihalogenmethylovou skupinu a výhodně trifluormethylovou skupinu,
    -pro disubstituované deriváty meta-para:
    A, D a E znamenají atom vodíku a
    B může znamenat:
    -atom halogenu a výhodně atom fluoru,
    -monoalkylamino-skupinu nebo dialkylamino-skupinu, ve které alkylový zbytek výhodně znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu,
    -etherovou skupinu,
    -thioetherovou skupinu,
    -alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy a C muže znamenat:
    -atom halogenu a výhodně atom fluoru,
    -amino-skupinu, monoalkylamino-skupinu nebo dialkylamino-skupinu, ve kterých alkylový zbytek výhodně znamená methylovou skupinu s podmínkou, že B je odlišný od atomu bromu nebo atomu chloru, nebo substituovanou nebo nesubstituovanou allylovou skupinu,
    -etherovou skupinu,
    -thioetherovou skupinu,
    -alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo -trihalogenmethylovou skupinu, výhodně trifluormethylovou skupinu, a
    -pro disubstituované deriváty ortho-para:
    Β, E a D znamenají atom vodíku a A a C znamenají methylovou skupinu.
  2. 2. Sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce I zvolená z množiny zahrnující
    4ζ-ωβϋιγ1±ίο-<ΐ63(4ζ-<ϋπιείΗγΐΗπιΐηο) pristinamycin Ιχ.
    4ζ-π^ϋψ1ύύο^β3 ^-dimethylamino) pristinamycin Ih, όγ-hydroxy 4ζ-πιβΛγ1ύύο-ύβ5(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· Ih,
    4ζ-methyl-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin
    4ζ-πιβ±γΜβ3(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· Ih.
    1 30
    4ζ-Γηβ thoxy-děs ^-dimethylamino) pristinamycin· 1^,.
    4ζ^6±οχγ!«Γϋοη7ΐ-<1έ5(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^,
    4ζ-chlor -dimethylamino) pristinamycin 1^,
    4ζ-1θΓθΓη des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· I/v 4£-brom< -des ^-dimethylamino) pristinamycin Ijj.
    4ζ·^ -des^-dimethylamino) pristinamycin· Iy\,
    4ζ-3οά -des ^-dimethylamino) pristinamycin Ih.
    4ζ-ττϊΠηθΓ methyl-des ^-dimethylamino) pristinamycin 4ζ-ίτΐίΐΗ0Γ methy 1-des ^-dimethylamino) pristinamycin Ih , 4ζ-ίβΛ-1)ΐ^Ι-0ε8 ^-dimethylamino) pristinamycin I^> 4ζ-ΐ5ορΓθργΜβ3(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· 1^, 4ζ-ϊ30ρπ^1-άε3(4ζ-dimethylamino) pristinamycin- Ig. 4e-methylamino-des^-dimethylamino) pristinamycin·
    4e-methoxy-dés^-dimethylamino) pristinamycin· I \ 4e-methoxy-des^-diméthylamino) pristinamycin I h.
    4e-fluor 4ζ-ιηβ±ν1-θβ3(4ζ^ΐπη:^ΐ3πιϊηο) pristinamycin· I 4ζ-amino-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· I 4ζ-β±γΙιπιηκΗίβ5{4ζ-4ΐιηβΰιγΐ3πιίηο) pristinamycin I^_ 4ζ-<1ιβύψ^ίηο-3β5(4ξ-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4ξ-ι1^ΐ8πύηο^έ3(4ζ-dimethylamino) pristinamycini 1^ 4ζ-<^11νΐ3πιίηο^63(4ζ-dimethylamino) pristinamycin· 1^
    4ζ-3ΐ1γΙ ethylamino-des ^-dimethylamino) pristinamycin· 1^
    4ξ-ethyl propylamino-des(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^
    4ζ-ethyl isopropylamino-des^-dimethylamino) pristinamycin· 1^
    4ζ-έ±γΙ methy Icyclopropy lamino-des ^-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4ζ-(1-pyrrolidinyl) -des (4ζ-dimethylamino). pristinamycin 1^
    4ζ-Επί1ιΐ0Γ methoxy-děs^-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4ζ-Η^Κ^-4β3(4ζ<Ιίπ,.εύ^Ιαπιίηο) pristinamycin· 4ζ-ethoxy-des(4ζ-dimeώ.yiamino) pristinamycin 4ζ-ε±ν1ΐίύο-άέ5(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4ζ-πΐ6ώ^Ίύύοπΐ€ύιγΜ65(4ζ^ΰηβύιγ1ατηϊηο) pristinamycin- 1^
    4ξ-(2-οΜοΓ ethoxy)-des^-diméthylamino) pristinamycin· 1^ 4ζ-3οεΓνΙ-αε3(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^
    4ζ-€±νΜβ3(4ζ-dimethylamino) pristinamycin 1^ 4ζ-εύ^Ι-ύε3(4ζ<ϋπΐ6Λνΐ3πιίηο) pristinamycin Ih
    131
    4€-dimethylammo-des^-dimethylamino) pristinamycin 1^
    4€-methylthio-des ^-dimethylamino) pristinamycin 1^ a
    4£-ethoxy-des^-dimethylamino) pristinamycin·
  3. 3. Způsob přípravy streptograminů, vyznačený tím, že se použije kmen mikroorganismu produkující streptograminy, mající alespoň jednu genetickou modifikaci ovlivňující biosyntézu prekurzorů streptograminů skupiny B, že se uvedený mutantní kmen kultivuje na adekvátním kultivačním prostředí komplementovaném alespoň jedním původním prekurzorem, odlišným od prekurzorů, jehož biosyntéza je modifikována a že se izolují uvedené streptograminy.
  4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačený tím, že mutantní kmen má alespoň jednu genetickou modifikaci lokalizovanou v úrovni genů uplatňujících se při biosyntéze prekurzorů streptograminů skupiny B.
  5. 5. Způsob podle nároku 4,vyznačený tím, že gen nebo geny, jejichž exprese je modifikována, jsou zvoleny z množiny genů uplatňujících se při biosyntéze kyseliny L--2aminomáselné, 4-dimethylamino-L-fenylalaninu (DMPAPA), kyseliny L-pipekolové, L-fenylglycinu nebo/a kyseliny 3-hydroxypikolinové.
  6. 6. Způsob podle nároku 4 nebo 5,vyznačený tím, že se jedná o alespoň jeden gen zvolený z množiny zahrnující geny papA, papM, oapC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pipA (Seq ID č.5), snb? (SEQ ID č.6) a hpaA (SEQ ID č.8).
  7. 7. Způsob podle některého z nároků 3 až 6, vyznačený t í m , že uvedená genetická modifikace činí alespoň jeden z genů uplatňujících se při biosyntéze prekurzorů streptograminů skupiny B částečně nebo zcela neschopným kódovat přírodní enzym.
    Způsob podle některého z nároků 3 až 7, v y znače
  8. 8.
    1 32 n ý t ί m , že genetická modifikace spočívá v přerušení jednoho z genů uplatňujících se při biosyntěze prekurzorů streptograminů skupiny B.
  9. 9. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že použitý mutantní kmen je odvozen od kmene S. pristinaespiralis a výhodně od kmene S. pristinaespiralis SP92.
  10. 10. Způsob podle nároku 9,vyznačený tím, že se výhodně jedná o kmen SP92:pVRC508.
  11. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že se výhodně jedná o kmen SP212.
  12. 12. Způsob podle nároku 9,vyznačený tím, že se výhodně jedná o kmen S?92pipA:: j? am .
  13. 13. Způsob podle nároku 9,vyznačený tím, že £
    se výhodně jedná o kmen SP92hpaA: :Qam .
  14. 14. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že původní prekurzor, zavedený do kultivačního prostředí, je zvolen z množiny zahrnující deriváty nebo analogy aminokyselin a alfa-ketokarboxylových kyselin.
  15. 15. Způsob podle některého značený tím, že původní že je příbuzný s prekurzorem, z předcházejících nároků, v y prekurzor se výhodně zvolí tak, jehož biosyntéza se modifikována.
  16. 16. Způsob podle nároku 14 nebo 15, vyznačený tím že původním prekurzorem je výhodně derivát fenylalaninu v případě, že se gen, jehož exprese je modifikována, týká biosyntézy DMPAPA.
  17. 17.
    Způsob podle některého z předcházejících nároků, v y
    133 značený tím, že je použitelný pro přípravu pristinamycinu IB.
  18. 18. Nukleotidová sekvence, vyznačená tím, že je zvolena z množiny zahrnující:
    a) celek něho část genů papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.6) a hpaA (SEQ ID č. 8) ,
    b) sekvence hybridizující s celkem nebo částí genů a) a
    c) sekvence odvozené od sekvencí a) a b) v důsledku degenerace genetického kódu.
  19. 19. Nukleotidová sekvence podle nároku 18, vyznačená t í m , že je zvolena z množiny zahrnující geny papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.6) a hpaA (SEQ ID č.8).
  20. 20. Rekombinantní DNA obsahující gen zvolený z množiny zahrnující geny papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.) a hpaA (SEQ ID č.8).
  21. 21. Vektor, vyznačený tím, že zahrnuje nukleotidovou sekvenci podle nároku 18 nebo 19 nebo rekombinantní DNA podle nároku 20.
  22. 22. Použití sekvence podle nároku 18 nebo 19 nebo/a vektoru podle nároku 21 pro přípravu metabolitů.
  23. 23. Polypeptid rezultující z exprese sekvence podle nároku 18 nebo 19.
  24. 24. Mutantní kmen S. pristinaespiralis, vyznačený tím, že má alespoň jednu genetickou modifikaci v úrovni jednoho z jeho genů papC (SEQ ID č.2), papB (SEQ ID č.3), pipA (SEQ ID č.5), snbF (SEQ ID č.6) nebo/a hpaA (SEQ ID č.8).
  25. 25.
    Mutantní kmen podle nároku 24, v y z n a č e n ý tím,
    1 34 že se jedná o kmen SP92pipA::2am .
  26. 26. Mutantní kmen podle nároku 24, vyznačený tím
    R že se jedná o kmen SP92hpaA: am .
  27. 27. Mutantní kmen S. pristinaespiralis, vyznačený tím, že má genetickou modifikaci spočívající v přerušení genu papA dvojitou homologovou rekombinací, jako je SP212.
  28. 28. Sloučenina z množiny zahrnující 4-trifluormethoxyfenylalanin, 3-methylaminofenylalanin, 3-methylthiofenylalanin,
    3- fluor-4-methylfenylalanin, kyselinu 4-methylaminofenylpyrohroznovou, 3-etnoxyfenylalanin, 4-allylaminofenylalanin, 4diallylaminofenylalanin, 4-allylethylaminofenylalanin, 4ethylpropylaminofenylalanin, 4-ethylisopropylaminofenylalanin,
    4- ethylmethylcyklopropylaminofenylalanin, 4-(1-pyrrolidinyl)fenylalanin, 4-ethylthiomethylfenylalanin, 4-0-(2-chlorethyl)tyrosin, 3-dimethylaminofenylalanin a 3-ethylaminofenylalanin.
  29. 29. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle nároku 1 nebo 2 v případné kombinaci se streptograminem skupiny A.
CZ9752A 1994-07-08 1995-07-04 Novel streptogramins and process for preparing streptogramins by mutasynthesis CZ5297A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9408478A FR2722210B1 (fr) 1994-07-08 1994-07-08 Nouvelles streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ5297A3 true CZ5297A3 (en) 1997-05-14

Family

ID=9465182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ9752A CZ5297A3 (en) 1994-07-08 1995-07-04 Novel streptogramins and process for preparing streptogramins by mutasynthesis

Country Status (33)

Country Link
US (2) US6352839B1 (cs)
EP (2) EP0770132B1 (cs)
JP (1) JPH10502532A (cs)
KR (2) KR100379100B1 (cs)
CN (1) CN1152338A (cs)
AP (1) AP562A (cs)
AT (1) ATE480626T1 (cs)
AU (1) AU712397B2 (cs)
BR (1) BR9508714A (cs)
CA (1) CA2193130C (cs)
CO (1) CO4410252A1 (cs)
CZ (1) CZ5297A3 (cs)
DE (1) DE69536102D1 (cs)
DK (1) DK0770132T3 (cs)
DZ (1) DZ1910A1 (cs)
ES (1) ES2352324T3 (cs)
FR (1) FR2722210B1 (cs)
HU (1) HU220964B1 (cs)
IL (1) IL114489A0 (cs)
MA (1) MA23610A1 (cs)
MX (1) MX9700257A (cs)
NO (1) NO970047L (cs)
NZ (1) NZ289153A (cs)
PE (1) PE28596A1 (cs)
PL (1) PL318193A1 (cs)
PT (1) PT770132E (cs)
RU (1) RU2205183C2 (cs)
SK (1) SK597A3 (cs)
TN (1) TNSN95077A1 (cs)
TR (1) TR199500830A2 (cs)
UY (1) UY23996A1 (cs)
WO (1) WO1996001901A1 (cs)
ZA (1) ZA955688B (cs)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6495348B1 (en) 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
EP0870053A4 (en) 1995-12-19 2002-09-11 Univ Minnesota METABOLIC PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF POLYHYDROXYALCANOATE MONOMER SYNTHASES
FR2775288B1 (fr) * 1998-02-26 2000-03-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Derives de streptogramines, leur preparation et les compositons qui les contiennent
CN101293920B (zh) 1998-05-01 2012-07-18 诺华疫苗和诊断公司 脑膜炎奈瑟球菌抗原和组合物
FR2796950B1 (fr) * 1999-07-27 2001-09-21 Aventis Pharma Sa Derives de streptogramines, leur preparation et les compositions qui les contiennent
DE60006130D1 (de) * 1999-07-27 2003-11-27 Aventis Pharma Sa Streptograminderivate, ihre herstellung und sie enthaltende zubereitungen
FR2796949B1 (fr) * 1999-07-27 2001-09-21 Aventis Pharma Sa Derives de streptogramines, leur preparation et les compositions qui les contiennent
CN100489095C (zh) 1999-09-29 2009-05-20 明治制果株式会社 生产被官能团修饰的次级代谢产物的转化体和新的生物合成基因
DE60126993D1 (de) * 2001-03-22 2007-04-12 Gakkou Houjin Kitasato Gakuen Selektionsmedia für beauveriolid i oder iii und verfahren zur selektiven herstellung dieser substanzen
FR2825717B1 (fr) * 2001-06-08 2005-02-18 Rhodia Chimie Sa Preparation stereoselective de l-acides amines cycliques
FR2841563B1 (fr) * 2002-06-28 2006-09-01 Aventis Pharma Sa Nouveaux variants du polypeptide papm de bacteries du genre streptomyces
EP1880004A1 (en) * 2005-05-04 2008-01-23 TMO Renewables Limited Thermophilic microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (ldh) for ethanol production
TWI387603B (zh) * 2005-07-20 2013-03-01 Merck Sharp & Dohme Ｈｃｖ ｎｓ３蛋白酶抑制劑
SG10201405661QA (en) * 2005-12-14 2014-10-30 Ambrx Inc Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
US7776535B2 (en) 2006-02-06 2010-08-17 Franklin And Marshall College Site-specific incorporation of fluorinated amino acids into proteins
US7548705B2 (en) * 2007-04-03 2009-06-16 Xerox Corporation Systems and methods for marking test patches for calibrating and/or visually confirming color accuracy of a marking device
JP6539212B2 (ja) * 2013-12-26 2019-07-03 株式会社カネカ 光学活性環状イミノ酸の製造方法
CN112442507B (zh) * 2019-09-05 2022-09-30 武汉合生科技有限公司 马度米星化合物的生物合成基因簇及其应用
CN112970782A (zh) * 2019-12-16 2021-06-18 德强生物股份有限公司 一种劳意德链霉菌发酵得到的农药制剂及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4156734A (en) 1976-02-13 1979-05-29 Merck & Co., Inc. Antihypertensive compositions containing an aryl-substituted alanine azo and an arylhydrazino-propionic acid
US4082736A (en) * 1976-04-26 1978-04-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Novel immunological adjuvant compounds and methods of preparation thereof
DE3322402A1 (de) 1983-06-22 1985-01-03 Jagenberg Ag Vorrichtung zum falten und verschliessen des kopfes einer von einer innenseitig mit einer thermoplastischen kunststoffschicht ueberzogenen kartonbahn bzw. einer aus einem zuschnitt gebildeten faltschachtel in einer falt- und schweissstation
FR2549062B1 (fr) * 1983-07-13 1985-10-25 Rhone Poulenc Sante Nouveaux derives de synergistines, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR2689518B1 (fr) * 1992-04-01 1995-04-07 Rhone Poulenc Rorer Sa Microorganismes, procédé de préparation et utilisation.
FR2696189B1 (fr) * 1992-09-25 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Polypeptides impliqués dans la biosynthèse des streptogramines, séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides et leur utilisation.

Also Published As

Publication number Publication date
FR2722210A1 (fr) 1996-01-12
EP2248901A1 (fr) 2010-11-10
EP0770132A1 (fr) 1997-05-02
PT770132E (pt) 2010-12-09
US6833382B2 (en) 2004-12-21
TR199500830A2 (tr) 1996-06-21
AU712397B2 (en) 1999-11-04
DE69536102D1 (de) 2010-10-21
US6352839B1 (en) 2002-03-05
TNSN95077A1 (fr) 1996-02-06
ZA955688B (en) 1996-02-26
RU2205183C2 (ru) 2003-05-27
PL318193A1 (en) 1997-05-26
DZ1910A1 (fr) 2002-02-17
ES2352324T3 (es) 2011-02-17
BR9508714A (pt) 1998-06-02
CN1152338A (zh) 1997-06-18
NZ289153A (en) 1999-02-25
HU220964B1 (hu) 2002-07-29
ATE480626T1 (de) 2010-09-15
SK597A3 (en) 1997-08-06
MX9700257A (es) 1997-05-31
CA2193130A1 (fr) 1996-01-25
KR100379100B1 (ko) 2003-10-08
CA2193130C (fr) 2010-10-19
PE28596A1 (es) 1996-07-06
US20020142947A1 (en) 2002-10-03
JPH10502532A (ja) 1998-03-10
KR100420238B1 (ko) 2004-02-26
DK0770132T3 (da) 2011-01-10
WO1996001901A1 (fr) 1996-01-25
UY23996A1 (es) 1995-09-08
FR2722210B1 (fr) 1996-08-14
EP0770132B1 (fr) 2010-09-08
MA23610A1 (fr) 1996-04-01
AU2891295A (en) 1996-02-09
CO4410252A1 (es) 1997-01-09
NO970047D0 (no) 1997-01-07
IL114489A0 (en) 1995-11-27
AP562A (en) 1996-11-20
AP9500752A0 (en) 1995-07-31
HUT77341A (hu) 1998-03-30
NO970047L (no) 1997-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ5297A3 (en) Novel streptogramins and process for preparing streptogramins by mutasynthesis
Delmas et al. A mammalian DNA-binding protein that contains a chromodomain and an SNF2/SWI2-like helicase domain.
Rosteck Jr et al. Homology between proteins controlling Streptomyces fradiae tylosin resistance and ATP-binding transport
Retzlaff et al. The regulator of streptomycin gene expression, StrR, of Streptomyces griseus is a DNA binding activator protein with multiple recognition sites
EP1537137A2 (en) Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
US20040101963A1 (en) Production of the lantibiotic cinnamycin with genes isolated from streptomyces cinnamoneus
US9115358B2 (en) Moenomycin biosynthesis-related compositions and methods of use thereof
US9452976B2 (en) Pactamycin analogs and methods of making thereof
AU652766B2 (en) Cloning of the biosynthetic pathway genes for chlortetracycline production from streptomyces aureofaciens and their expression in streptomyces lividans
EP0929681B1 (en) Rifamycin biosynthesis gene cluster
US5589385A (en) Cloning of the biosynthetic pathway for chlortetracycline and tetracycline formation and cosmids useful therein
Buggy et al. Nucleotide sequence and characterization of the Rhodobacter capsulatus hvrB gene: HvrB is an activator of S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase expression and is a member of the LysR family
Haggård-Ljungquist et al. DNA sequences of bacteriophage P2 early genes cox and B and their regulatory sites
Merchant et al. In vitro inhibition of 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced activity by α-naphthoflavone and 6-methyl-1, 3, 8-trichlorodibenzofuran using an aryl hydrocarbon (Ah)-responsive construct
JP2003518387A (ja) 遺伝子発現に関する方法および材料
US5360742A (en) Eukaryotic plasmid vector encoding enzymes for cysteine production
Murata The trpF nucleotide sequence and its promoter analysis in Pseudomonas aeruginosa
Stock et al. Inhibition of neomycin phosphorotransferase expression in Entamoeba histolytica with antisense peptide nucleic acid (PNA) oligomers
Gottelt Regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolor: a bacterial hormone receptor variant and the awakening of a cryptic antibiotic biosynthesis gene cluster
Cohen Regulation of Amino Acids Biosynthesis in Prokaryotes
Kim Mapping of long-range protein-protein and protein-DNA interactions in the higher order nucleoprotein complexes involved in lambda site-specific recombination
Bell Analysis and manipulation of “actagardine” gene clusters from Actinoplanes
Day Characterization and expression of the chicken 5-Aminolevulinate synthase gene
Cheng In vitro reconstitution of the entire enterocin biosynthetic pathway: New insights into type II PKS enzymology
Hsieh Cloning, characterization and disruption of malonyl-CoA decarboxylase gene from Saccharopolyspora erythraea and heterologous expression in Escherichia coli

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic