CN100489095C - 生产被官能团修饰的次级代谢产物的转化体和新的生物合成基因 - Google Patents

生产被官能团修饰的次级代谢产物的转化体和新的生物合成基因 Download PDF

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Abstract

一种经过修饰的能生产苯环对位被含有氮原子的官能团修饰的次级代谢产物的转化体。该转化体是生产含有对位没有被含氮原子官能团置换的苯环骨架的次级代谢产物的生物的转化体，其特征在于，通过导入参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因而被转化，被转化后能够生产含有对位被含氮原子官能团置换的苯环骨架的次级代谢产物。另外，本发明还提供参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的新基因。这些新基因编码序列号2、4、6记载的氨基酸序列或者其改变序列。

Description

生产被官能团修饰的次级代谢产物的转化体和新的生物合成基因
发明背景
发明领域
本发明涉及生产被官能团修饰的次级代谢产物的转化体，更详细地讲是涉及生产苯环的对位被含有氮原子的官能团修饰的次级代谢产物的转化体。本发明也涉及到参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的新基因。
有关技术的说明
由于生物可以生产具有生物活性的各种各样的次级代谢产物，所以想将次级代谢产物用于医药、兽药、农药等的研究非常盛行。然而，来自生物的次级代谢产物直接应用于实际还很少，一般都是为了使其生物活性最适化而要用各种各样的官能团进行修饰。其中，用含有氮原子的官能团，例如硝基或氨基进行修饰是最重要的修饰之一。
在用硝基对某物质进行修饰时可以利用化学方法。然而，由于用化学方法在苯环的对位特异地导入硝基比较难，所以其收率非常低。而想要用硝基修饰的物质是来自生物的次级代谢产物那样的复杂物质时，用硝基对其中所含苯环的对位特异地进行修饰就更难了。
而导入氨基的方法大致分为酶法和化学方法的两种方法。在酶法中是使用称之为转氨酶(EC 2.6.1类)的酶来进行。然而，可作为转氨酶底物的物质有限，能够直接将氨基转移到苯环上的酶到目前为止还没有被发现。因此，想用氨基修饰苯环时只有使用化学方法。
然而，在利用化学方法时，需要首先用硝基修饰苯环，然后将其还原为氨基的反应。由于第一阶段的硝基化反应非常困难，所以使得用化学方法将氨基导入苯环变得非常困难。因此，急切希望用硝基或氨基特异修饰苯环对位的方法的开发。
发明概要
本发明的目的在于提供改造的转化体，该转化体能够生产次级代谢产物的苯环对位被含氮原子的官能团修饰的次级代谢产物，以及提供简便而且造价低地制造被修饰的次级代谢产物的方法。
本发明人在用含有参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因的DNA转化生产含有苯环骨架的PF1022物质的微生物，得到了生产苯环对位被氨基修饰的PF1022物质的转化体方面获得了成功。
本发明提供的转化体是特征如下的转化体：它是生产含有对位没有被含氮原子官能团置换的苯环骨架的次级代谢产物的微生物的转化体，通过导入参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因(以下有时简称为「生物合成基因」)而被转化，被转化后能够生产含有对位被含氮原子官能团置换的苯环骨架的次级代谢产物。
本发明提供的制造方法是含有对位被含氮原子置换的苯环骨架的次级代谢产物的制造方法，该方法包括培养上述转化体，提取含有经含氮原子官能团置换的苯环骨架的次级代谢产物。
本发明的另一目的是提供参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的新基因。
按照本发明提供的新基因是
编码序列号2中记载的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的其改变序列的基因，
编码序列号4中记载的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性的其改变序列的基因，以及
编码序列号6中记载的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧前苯(プレフエン)酸脱氢酶活性的其改变序列的基因。
附图的简单说明
图1给出了从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)分离出的DNA片段的限制酶图谱以及开放读框的位置。
图2表示质粒pTrc-papA的构建。
图3给出了用于papA基因产物的酶活性检测的氨基酸分析仪的色谱图。
图4表示质粒pTrc-papB的构建。
图5给出了用于papB基因产物的酶活性检测的氨基酸分析仪的色谱图。
图6表示质粒pET-papC1的构建。
图7给出了用于papC基因产物的酶活性检测的氨基酸分析仪的色谱图。
图8表示质粒pPF260-A2以及pPF260-A3的构建。
图9给出了含有Abp1基因的6kb的HindIII片段的限制酶图谱。
图10表示pABPd的限制酶图谱。
图11表示质粒pPF260-B3的构建。
图12表示质粒pPF260-C3的构建。
图13给出了在检测苯环对位被硝基或氨基修饰的PF1022衍生物的检测中使用的HPLC的色谱图。
发明的具体说明
微生物的保藏
实施例5记载的PF1022菌株于1989年1月24日保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁1-3)，保藏号为FERM BP-2671(Mycelia Sterilia)。
无孢菌丝菌(Mycelia Sterilia)的转化体55-65于1999年9月17日保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁1-3)，保藏号为FERM BP-7255。
用质粒pUC118-papA转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1999年9月17日保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁1-3)，保藏号为FERM BP-7256。
用质粒pTrc-papB转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1999年9月17日保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁1-3)，保藏号为FERM BP-7257。
用质粒pET-papC转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1999年9月17日保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁1-3)，保藏号为FERM BP-7258。
可被转化的生物
作为在本发明中可使用的生物，可以使用的是生产含有苯环骨架的次级代谢产物的生物。作为理想的生物是诸如生产经分支酸生物合成的次级代谢产物，特别是生产由选自苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、苯丙氨酸、酪氨酸和苯乳酸中的至少一个标准构件合成的次级代谢产物的生物。
作为理想的生物还有例如将肽或缩肽，特别是由选自苯丙氨酸、酪氨酸和苯乳酸中的至少一个标准构件合成的肽或缩肽作为次级代谢产物生产的生物。
这样的次级代谢产物以及生产它们的微生物如下所示。
化合物和微生物名称
 
奥尔苏丹(オルスタチンD) 蜡状芽孢杆菌(Bacillus <u>cereus</u>)KY-21，<u>Nigrosabulum</u> sp.28Y1
纳克林(ナノケリン) 侵蚀侏囊菌(<u>Nannocvstis</u> <u>exedens</u>)Nae485
膦酸基苯丙氨酰精氨酸 利尻链霉菌(<u>Streptomvces</u> <u>rishiensis</u>)NK-122
I5B1 马杜拉放线菌(<u>Actinomadura</u> <u>spiculoosospora</u>)K-4
阿呋嗪(アフフアチニン)A 链霉菌属(Streptomyces)sp.WK-142
A-38533 链霉菌属(Streptomyces)sp.
麦拉斯塔秦(メラノスタチン) Streptomyces <u>clavus</u> N924-1，钉斑链霉菌(Streptomyces clavifer)N924-2
阿勒斯塔秦(アルドスタチン) Pseudoeurotium zonatum M4109
N-乙酰L-苯丙氨酰-L-苯丙氨醇 Emericellopsis <u>salmosynemata</u>
乌苯美司 橄榄轮丝链霉菌(Streptomyces <u>olivoverticuli</u>)
谷胱甘酞制剂(エスタチン)A Myceliophthora <u>thermophilia</u> M4323
N-(N-L-精氨酰-D-别苏氨酰)-L-苯丙氨酸 Keratinophyton <u>terreum</u> Tu 534
红网链霉素P1 田无链霉菌(<u>Streptomvces</u> <u>tanabeensis</u>)
WF-10129 Doratomyces <u>putredinis</u> F-214690
氯哌酰胺(クロバミド) Kobatiella <u>caulivora</u>
SP-抑凝乳蛋白酶素B 变黑链霉菌(<u>Streptomyces nigrescens</u>)WT-27，黎巴嫩链霉菌(<u>Streptomyces libani</u>)，链霉菌属(<u>Streptomvces</u>)sp.GE16457
安气班(アンチパイン) 链霉菌属(Streptomyces)sp.KC84-AG13
米洛里金(ミロリジン)K<sub>A</sub> Metarrhizium anisopliae U-47
奇洛斯塔秦(チロスタチン) Kitasatospora sp.55，链霉菌属(Streptomyces)sp.SAM-0986
 
泰特克星(デトキシン) 头状链霉菌(Streptomyces <u>caespitosus</u>)var.<u>detoxicus</u> 7072 GC<sub>1</sub>，茂原链霉菌(Streptomyces<u>mobaraensis</u>)
抑凝乳蛋白酶素(キモスタチン) 链霉菌属(Streptomyces)sp.
十三紫铆黄酮(トリデカプチン) 多粘芽胞杆菌(Bacillus <u>polymyxa</u>)
阿拉麦沙星(アラメサイシン) Trichoderma <u>viridis</u>
木霉素(トリコセリン) 绿色木霉(Trichoderma <u>viride</u>)
毛孢子菌(トリコスポリン)B Trichoderma <u>polysporum</u>
トリコジアニン Trichoderma <u>polysporum</u>，Trichoderma <u>harzianum</u>
舍玛隆斯孢林(サマロスポリン)I Emericellopsis <u>microspora</u>，<u>Samarospora</u> sp.，<u>Stibella</u> sp.
水杨酸钠锡合剂(スズカシリン)A Trichoderma <u>viride</u>
トリコロンギン Trichoderma <u>longibrachiatum</u>
札巴米星(ザ—バミシン) Emericellopsis <u>microspora</u>，Emericellopsis<u>salmosynnemata</u>
安气阿麦并(アンチアメビン) Emericellopsis <u>synnematicola</u>，Emericellopsis<u>poonesis</u>，<u>Cephalosporum</u> <u>pimprina</u>
短杆菌肽(グラミシジン)C 短芽孢杆菌(Bacillus <u>brevis</u>)
赭曲霉毒素(オクラトキシン) Aspergillus <u>ochraceus</u>，Aspergillus <u>melleus</u>，Aspergillus <u>sulDhureus</u>，<u>Penicillium</u><u>viridicatum</u>
FR-900261 Petriella sp.，Petriella <u>guttulata</u> 3161
3，4-二氯-α-苯氧基马尿(クラミドシン) Diheterospora <u>chlamydosporia</u>
特拉普克星(トラポキシン) Helicoma <u>ambiens</u> RF-1023
Cyl-1 Cylindrocladium <u>scoparium</u>
Cyl-2 Cylindrocladium <u>scoparium</u>
曲霉素(アスペルコリン) Aspergillus <u>versicolor</u>
牛角花素 Zizyphus <u>lotus</u>
里休伍米(リシユウミン) Lycium <u>chinense</u> Mill.
燕麦蛋白(アベラニン) Hamigera <u>avellanea</u>，<u>Penicillium</u> sp，PF1119
环阿斯布特(シクロアスプチド) Aspergillus sp.NE-45
孢巴勒星(ボバルジン) Bouvardia <u>ternifolia</u>，<u>Rubia</u> <u>cordifolia</u>
 
环阿玛尼特(シクロアマニド)A Amanitia <u>phalloides</u>
环阿玛尼特(シクロアマニド)B Amanitia <u>phalloides</u>
异非丽苷(ヘテロフイリン)A Pseudostellarea <u>heterophylla</u>
多粘菌素 多粒芽胞杆菌(Bacillus <u>polymyxa</u>)
オクタペプチン 环状芽孢杆菌(Bacillus <u>circulans</u>)G493-B6，芽孢杆菌属(Bacillus)sp.JP-301
Bu-2470A 环状芽孢杆菌(Bacillus <u>circulans</u>)
满克沙林(マイコサチリン) 枯草杆菌(Bacillus <u>subtilis</u>)
芽胞菌毒素D 枯草杆菌(Bacillus <u>subtilis</u>)I-164，枯草杆菌(Bacillus <u>subtilis</u>)Sc-3
伊枯草菌素A 枯草杆菌(Bacillus <u>subtilis</u>)
シアノギシン 铜绿微囊蓝细菌(<u>Microcystis</u> <u>aeruginosa</u>)
杆菌肽[素] 枯草杆菌(Bacillus <u>subtilis</u>)，地衣芽孢杆菌(Bacillus <u>licheniformis</u>)
短杆菌肽S 短芽孢杆菌(Bacillus <u>brevis</u>)
アンタマニド Amanitia <u>phalloides</u>
短杆菌酪肽 短芽孢杆菌(Bacillus <u>brevis</u>)
克气南林(コチナリン) Cortinarius <u>speciosissimus</u>
克拉气星(グラチシン) 短芽孢杆菌(Bacillus <u>brevis</u>)
满克巴星(マイコバシリン) 枯草杆菌(Bacillus <u>subtilis</u>)
TL119 枯草杆菌(Bacillus <u>subtilis</u>)
皮巴劳拉特(ビユウベロライド) Beauveria <u>bassiana</u>，<u>Isaria</u> sp.
新抗霉素 奥里诺科链霉菌(<u>Streptoverticillium</u> <u>orinoci</u>)
MK3990 Basidiobolus sp.MK 3990
劳可拉星(ロイアラシン) Hapsidospora <u>irregularis</u> SANK 17182
A54556 夏威夷链霉菌(Streptomyces <u>hawaiiensis</u>)
爱南百普秦(エノペプチン)B 链霉菌属(Streptomyces)sp.RK-1051
皮百里星(ビユウベリシン) Beauveria <u>bassiana</u>
克森特斯塔秦(キサントスタチン) 螺旋轮丝链霉菌(Streptomyces<u>spiroverticillatus</u>)
巴里阿百普秦(バリアペプチン) 柠檬链霉菌(<u>Streptomyces citrus</u>)K3619，微黄绿链霉菌(Streptomyces <u>flavidovirens</u>)
巴西尼阿玛星(バ—ジニアマイシン)S<sub>1</sub> 弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces <u>virginiae</u>)，白直丝链霉菌(Streptomyces <u>alborectus</u>)
环庚特马星(シクロヘプタマイシン) 链霉菌属(Streptomyces)sp.
WS-9326 紫黑链霉菌(<u>Streptomyces violaceusniger</u>)9326
普沙芬克环普西肽(フサリアフンギシクロプシペプチド) Fusarium <u>sporotrichoides</u>，<u>fusarium</u> <u>roseum</u>，Fusarium <u>tricinctum</u>
FR-900359 Ardisia <u>crenata</u>
百拉麦林(ベルラメリン) Verticillium <u>lamellicola</u> MF4683
西泰木尼(ジデムニン) Trididermnum <u>solidam</u>
里普百普秦(リポペプチン)A 链霉菌属(Streptomyces)sp.AC-69
20561 气单胞菌(<u>Aeromonas</u>)sp.
南奥百普秦(ネオペプチン) 链霉菌属(Streptomyces)sp.K-710
奥巴西金(オ—レオバシジン) Aureobasidium <u>pullulans</u> R106
丁香霉素 丁香假单胞菌丁香致病变种(<u>Pseudomonas</u> <u>syringae</u>pv.<u>Syringae</u>)
普里瓦斯塔秦(プリパスタチン) Bacillus <u>cereus</u> BMG302-fF67
巴麦秦(パ—メチン)A 环状芽孢杆菌(Bacillus <u>circulans</u>)H913-B4
BMY-28160 环状芽孢杆菌(Bacillus <u>circulans</u>)
圈杆菌素A 环状芽孢杆菌(Bacillus <u>circulans</u>)
 
布莱皮斯秦(ブレビスチン) 芽胞短杆菌(Bacillus <u>brevis</u>)
拉毛普拉尼(ラモプラニン) 游动放线菌(<u>Actinoplanes</u>)sp.ATCC33076
安克百尼(アンコベニン) 链霉菌属(Streptomyces)sp.A-647P
耐久霉素 八丈岛链霉菌浅褐变种(Streptomyces<u>hachijoensis</u> var.<u>Takahagiensis</u>)E-312，<u>Streptoverticillium</u> <u>griseoluteus</u> 2075，灰轮丝链轮丝菌(<u>Streptoverticillium</u><u>griseoverticillatum</u>)PA-48009
西南玛星(シナマイシン) 肉桂链霉菌(Streptomyces <u>cinnamoneus</u>)
阿克气南金(アクチノイジン) 似放线菌诺卡氏菌(<u>Nocardia</u> <u>actinoides</u>)SKF-AAJ-193，似放线菌诺卡氏菌(<u>Proactinomvcetes</u><u>actinoides</u>)
PF1022物质 Mycelia <u>sterilia</u>
这些物质在Dictionary of Natural Products(Chapman &Hall，1994)中都有记载。
作为本发明中可被转化的「生物」可列举的有诸如细菌、酵母以及霉菌那样的微生物和植物。植物中也包括植物细胞。
作为含有氮原子的官能团的例子可举出氨基和硝基。
可被转化的生物是生产用下式表示的PF1022物质：
的微生物时，由转化体生产的次级代谢产物可以是用下式表示的用氨基修饰的PF1022物质(以下称之为「PF1022物质衍生物」)：
Figure C00813681D00121
PF1022物质[环(D-乳酰-L-N-甲基亮氨酰-D-3-苯乳酰-L-N-甲基亮氨酰-D-乳酰-L-N-甲基亮氨酰-D-3-苯乳酰-L-N-甲基亮氨酰)]是由属于无孢菌科(Agonomycetales)的线状菌，由PF1022菌株(Mycelia sterilia、FERM BP-2671)生产的环状缩肽，对动物寄生性线虫类表现出极高的驱虫活性(特开平3-35796号、Sasaki，T.etal.J.Antibiotics.，45，692，(1992))。因此，PF1022物质除了用作动物的驱虫药外，用氨基修饰了的其衍生物可用作合成高活性的该物质的衍生物的原料。
PF1022物质是由4分子的L-亮氨酸、2分子的D-乳酸、以及2分子的D-苯乳酸在PF1022物质合成酶催化下合成的。虽然并不限制在以下机理，但人们认为合成过程如下：(1)通过将参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因导入PF1022物质生产菌中，在转化体中生产对氨基苯丙酮酸，(2)对氨基苯丙酮酸经D-苯乳酸脱氢酶(D-PLDH)作用后，在转化体中生产对氨基-D-苯乳酸，(3)PF1022物质合成酶作用于对氨基-D-苯乳酸，而不是D-苯乳酸，(4)生产出PF1022物质衍生物。
生物合成基因
作为参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径中的酶，可列举的有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶、4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶以及4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶(Blanc，V.，etal.Mol.Microbiol.23，191-202(1997))。可将由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径概述如下：分支酸经4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶催化生成4-氨基-4-脱氧分支酸，生成的4-氨基-4-脱氧分支酸在4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的催化下生成4-氨基-4-脱氧前苯酸，生成的4-氨基-4-脱氧前苯酸在4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶作用下生成对氨基苯丙酮酸。
4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶是指作用于分支酸，将它变换为4-氨基-4-脱氧分支酸的酶。
4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶作为由分支酸合成对氨基安息香酸的生物合成途径系统的一员广泛存在于生物界中。对氨基安息香酸可以通过两步反应由分支酸合成。4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶催化第一步反应，4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶催化第二步反应(Green，J.M.and　Nichols，B.P.，J.Biol.Chem.266，12971-12975(1991))。
据报道作为编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因有来自大肠杆菌(Kaplan，J.B.and Nichols，B.P.，J.Mol.Biol.168，451-468(1983)、Goncharoff，P.and Nichols，B.P.，J.Bacteriol.159，57-62(1984))、枯草杆菌(Slock，J.etal.，J.Bacteriol.172，7211-7226(1990))、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumomiae)(Kaplan，J.B.et al，J.Mol.Biol.183，327-340(1985)、Goncharoff，P.andNichols，B.P.，MOI.Biol.Evol.5，531-548(1988))、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)(Blanc，V.，etal.Mol.Microbiol.23，191-202(1997))、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)(Brown，M.P.et al.，Microbiology142，1345-1355(1996))、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Edman.J.C.et al.，Yeast 9，669-675(1993))的基因，可以使用这些基因。也可以使用按照常规方法从具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的生物中分离的其它编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因。
而4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶大致可分为象来自大肠杆菌、枯草杆菌、肺炎克雷伯杆菌那样的由两条多肽构成的和象来自一部分放线菌或啤酒酵母那样的由一条多肽链构成的两种酶。在本发明中，由于需要将多个基因导入宿主，最好利用编码由一条多肽链构成的4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因。
在本发明中，作为编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因的优选例子是编码序列号2的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的其改变序列的基因，更优选的是含有序列号1所示的DNA序列的基因。
本发明中，所谓「改变序列」是指含有通过置换、缺失、插入以及附加使得1个以上，例如1～数个氨基酸改变的序列。
在本发明中，改变的氨基酸序列是否「具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性」，可以通过使由该氨基酸序列构成的蛋白质作用于底物，然后检测反应产物来进行评价，例如可以按照实施例2记载的方法进行评价。
4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶是作用于4-氨基-4-脱氧分支酸后，使其变换为4-氨基-4-脱氧前苯酸的酶。
4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶是作用于4-氨基-4-脱氧前苯酸使其生成对氨基苯丙酮酸的酶。
编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因可以从能够生物合成对氨基苯丙酮酸的生物中得到。更具体地讲，可以从生产原始霉素I(pristinamycin I)的始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、生产春霉素B(vernamycin B)的劳意德链霉菌(Streptomyces loidens)、生产棒状杆菌素(corynesin)的噬蜡卡氏菌(Nocardia parafinnica)和解烃棒杆菌(Corynebacterium hydrocarboclastus)、生产氯霉素(chloramphenicol)的委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)等生物得到。其中已经从始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)分离出推定为编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶和4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因，其碱基序列已经阐明(V.Blancetal.，Mol.Microbiol.，23，191-202(1997))，可用于本发明。
分别编码分支酸变位酶和前苯酸脱氢酶的基因已经从细菌、酵母和植物等分离出很多，以它们作为基础利用蛋白质工程手法或进化工程上的手法，通过对适当的氨基酸进行置换、缺失或附加有可能使之改变为具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性和4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶活性，在本发明中也可以利用改变的基因。
在本发明中作为编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因的优选例子是编码序列号4的氨基酸序列或者是编码具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性的其改变序列的基因，更优选的是含有序列号3的DNA序列的基因。
在本发明中改变氨基酸序列是否「具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性」，可以通过使由该氨基酸序列构成的蛋白质作用于底物，然后检测反应产物来进行评价，例如可以按照实施例3记载的方法进行评价。
在本发明中作为编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因的优选例子是编码序列号6的氨基酸序列或者是编码具有4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶活性的其改变序列的基因，更优选的是含有序列号5的DNA序列的基因。
在本发明中改变氨基酸序列是否「具有4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶活性」，可以通过使由该氨基酸序列构成的蛋白质作用于底物，然后检测反应产物来进行评价，例如可以按照实施例4记载的方法进行评价。
如果给出了在本发明中参与生物合成的酶的氨基酸序列的话，编码该序列的核苷酸序列很容易确定，可以选择编码序列号2、4和6记载的氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此，所谓本发明提供的生物合成基因除了序列号1、3、5记载的DNA序列的一部分或全部以外，作为DNA序列也包括编码同一氨基酸的DNA序列存在简并关系的密码子的序列，另外与这些序列相对应的RNA序列也包括在内。
转化体
本发明的转化体可以通过将含有参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因构成的在宿主细胞内可复制且该基因可表达的DNA分子，特别是表达载体导入宿主来获得。
在本发明中将多个生物合成基因导入宿主时，各个基因可以包含在同一DNA分子中或者分别包含在不同的DNA分子中。另外宿主是细菌时，为了使各个基因以多顺反子mRNA表达对各个基因进行设计，将它们作成一个DNA分子也是有可能的。
本发明利用的表达载体要考虑所使用的宿主细胞的种类，可以从病毒、质粒、黏粒载体中选择合适的载体。例如，宿主细胞是大肠杆菌时，可以选择λ嗜菌体系列的嗜菌体、pBR、pUC系列的质粒，宿主细胞为枯草杆菌时，可选择pUB系列的质粒，宿主为酵母时选择YEp、YRp、YCp、YIp系列的质粒。
在使用的质粒载体中，优选至少含有一个用于筛选转化体的选择标记，作为选择标记可以使用耐药性基因、营养需求互补的基因。其优选的具体例子有：当使用的宿主是细菌时可以使用氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等，而使用酵母时可以使用色氨酸生物合成基因(TRP1)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等，使用霉菌时可以使用潮霉素抗性基因、ビアラホス抗性基因、博莱霉素抗性基因、金霉素(オ-レオバシジン)抗性基因等，使用植物时，可以使用卡那霉素抗性基因、ビアラホス抗性基因等。
另外在表达载体内可以连接各个基因表达所必需的调控序列，例如启动子、转录起始信号、核糖体结合部位、翻译终止信号、转录终止信号等转录调节信号、翻译调节信号等使得生物合成基因可以运转。调控序列的选择以及连接可以按照常规方法进行。
作为启动子，例如对于大肠杆菌可以选择乳糖操纵子、色氨酸操纵子等操纵子的启动子，对于酵母可以选择醇脱氢酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖型基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因等基因的启动子，对于霉菌可以选择α-淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因、纤维二糖羟化酶基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、Abp1基因等基因的启动子，对于植物可以选择CaMV 35SRNA启动子、CaMV 19SRNA启动子、正缬氨酸(ノパリン)合成酶基因启动子等。
在生物的转化中可以使用钙离子法、锂离子法、电穿孔法、PEG法、土壤杆菌法、粒子枪法等那样的常规方法，可以根据被转化的生物进行选择。
在本发明中，培养转化体，通过获得的培养物可以得到所希望的修饰的次级代谢产物。来自本发明的转化体的培养也按照常规方法，通过选择适合的培养基、培养条件来进行。
作为培养基可以添加本发明转化体可以同化的碳源、可以利用的氮源、无机盐类、各种维生素、谷氨酸或天冬酰胺等各种氨基酸、核苷酸等微量营养元素、抗生素等选择药物。另外可以适当添加有助于本发明的转化体的发育、促进目的次级代谢产物的生产那样的有机物和无机物。另外根据需要可以使用含有适量其它营养物的合成培养基或天然培养基。
作为在培养基中使用的碳源和氮源只要是本发明的转化体可以利用的，无论什么样的都可以。作为可以同化的碳源，例如可以利用蔗糖、葡萄糖、淀粉、甜精、甘油糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、半乳糖、核糖、糊精、动植物油等或其水解产物等各种碳水化合物。其浓度通常相对于培养基在0.1～5％范围内为优选。
作为可利用的氮源，例如可以使用胨、肉膏、玉米浸渍液、脱脂大豆粉等动植物体成分或浸渍液、琥珀酸铵盐类、酒石酸铵等有机酸铵类、除尿素之外的其它各种无机酸或有机酸的含氮化合物。
而作为无机盐类，例如可以适当使用可以生成钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸、硫酸以及其它离子的盐类。
不用说，作为其它成分，例如即使是含有酵母等微生物的菌体或浸出液和浸出提取物等，或含有植物体碎末的培养基，只要不妨碍本发明转化体的发育和目的次级代谢产物的生产蓄积，可以适当地使用任一种。另外在对表现出营养需求性的变异株进行培养时，将可满足其营养需求的物质加到培养基中，但在使用含有天然物的培养基时，有时不必特别添加该种营养素。
培养基的pH例如可以处于pH6～pH8左右范围。作为培养方法可以按照需氧条件下振荡培养法、通气搅拌培养法或深部需氧培养法进行。适于培养的温度处于15℃～40℃范围，但多数场合下都是在26℃～37℃附近发育。目的次级代谢产物的生产因培养基和培养条件、或者使用的宿主不同而有所差异，无论使用哪种方法，通常都是在2日～25日期间其积蓄量达到最高。在目的次级代谢产物量达到最高时，停止培养，从培养物中分离、纯化目的物质。
这些培养基组成、培养基的溶液特性、培养温度、搅拌速度、通气量等培养条件根据使用的转化体和外部的条件等适当调节、选择，使之获得理想的结果。在液体培养中，出现发泡时，可以适当使用硅油、植物油、矿物油、表面活性剂等消泡剂。由于如此培养得到的培养物中蓄积的目的次级代谢产物包含在本发明的转化体内以及培养滤液中，所以可将培养物离心分离，使得培养滤液和转化体分开，然后分别从这两部分提取目的次级代谢产物。
在从培养滤液提取目的次级代谢产物过程中，可以单独或任意组合或反复使用在按照常规方法从培养物中提取目的次级代谢产物中使用的手段。就是说，可以利用例如萃取过滤、离心分离、透析、浓缩、干燥、冻结、吸附、洗脱以及利用对各种溶剂的溶解度差的诸如沉淀、结晶、再结晶、转溶、对流分配法、色谱法等手段。
另外，从本发明转化体内的培养物可以获得目的次级代谢产物。按照常规方法，例如使用从培养物提取(磨碎处理、加压破碎等)、回收(过滤、离心分离等)和纯化(盐析法、溶剂沉淀法等)等手法。
得到的粗物质可以通过常规方法，例如通过使用硅胶、氧化铝等载体的柱色谱法或应用ODS载体的反相色谱法进行纯化。通过以上方法，或通过这些方法的适当组合可以从本发明转化体的培养物中获得纯的目的次级代谢产物。
生产PF1022物质衍生物的转化体
按照本发明的理想模式可以提供导入了参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因(生物合成基因)的PF1022物质生产菌的转化体。
该转化体可以生产PF1022物质衍生物。被转化的PF1022物质生产菌为Mycelia sterilia，理想的是委托号为FERM BP-2671的寄存于生命工学技术研究所的菌株。
生物合成基因可以由编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因以及编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因构成。编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因理想的是编码序列号2记载的氨基酸序列的或编码具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的其改变序列的基因。编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因理想的是编码序列号4中记载的氨基酸序列或者是编码具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性的其改变序列的基因。编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因理想的是编码序列号6的氨基酸序列或者是编码具有4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶活性的其改变序列的基因。
作为转化中使用的表达载体，理想的是在PF1022物质生产菌中起作用的调控序列(启动子、终止子等)中连接生物合成基因，并使之运转可能的表达载体，最优选将在PF1022菌株(Mycelia sterilia，FERM BP-2671)中发挥作用的调控序列与生物合成基因连接并使之运转的表达载体。
转化体可以是委托号为FERM BP-7255的寄存于生命工学技术研究所的转化体55-65菌株。
按照本发明的更好的模式可以提供包括对PF1022物质生产菌的转化体进行培养、提取PF1022物质衍生物的PF1022物质衍生物的制造方法。
实施例
以下通过实施例详细叙述本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1：从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)分离 编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支 酸变位酶的基因以及编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因
(1)探针用DNA片段的获得
在250ml容积的三角烧瓶中制备每份为50ml的液体培养基(2％可溶性淀粉、1％聚蛋白胨、0.3％肉膏、0.05％磷酸二氢钾、pH 7.0)。在该培养基中分别植入委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230菌株和140-5菌株，于28℃下培养24小时。培养结束后，通过离心从培养液中收集菌体，用Genetic Manipulation ofStreptomyces、A Laboratory Manual(D.A.Hopwood et al.、The JohnInnes Foundation、1985)记载的方法从这些菌体中制备染色体DNA。
然后，以上述的委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230菌株的染色体DNA作为模板，用序列号7和序列号8记载的寡核苷酸作为引物，进行PCR。PCR使用TaKaRa LA PCRTM kit Ver.2.1(宝酒造公司生产)，用GeneAmp PCR System 2400(Perkin-Elmer公司生产)进行。反应液中加1μl(相当于0.62μg的量)的染色体DNA，5μl试剂盒附带的10倍浓度反应用缓冲液、8μl 2.5mM dNTP溶液、调整到浓度为100pmol/μl的上述引物各0.5μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药公司生产)、0.5μl TaKaRa LA-Taq(2.5U)、29.5μl灭菌水，总体积为50μl。反应在94℃下进行10分钟预处理后进行25个循环，每一循环为94℃下温育1分钟、50℃下1分钟、72℃下3分钟。反应结束后，将反应液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳，结果可以确认大约2kbp的DNA片段被特异地扩增了。而剩下的反应液用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)萃取，进行乙醇沉淀。将沉淀再溶解于灭菌水，60μl左右的溶解液用限制霉BamHI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切出约2kbp的带，回收DNA片段。
将该DNA片段克隆到质粒pTrcHis B(Invitrogen公司生产)的BamHI位点。得到的质粒的插入片段的限制酶谱图与Brown等人(M.P.Brown.et al，Microbiology，142，1345-1355(1996))给出的pabAB基因(U21728)一致，由此可判断pabAB基因已被克隆，该质粒被命名为pTH-PAB。在后面叙述的染色体DNA文库的筛选中，从质粒pTH-PAB经限制霉BamHI消化后，用琼脂糖凝胶电泳分离，回收得到的插入片段作为探针。
(2)染色体DNA文库的筛选和基因的分离
用限制酶Sau3AI对委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)140-5菌株的染色体DNA(约10μg)进行部分消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，分离、回收约10kbp～20kbp的DNA片段。
用T4DNA连接酶将上述回收的约0.5μg的10kbp～20kbp的DNA片段与预先用限制酶BamHI和XhoI双重消化的λDASH II 1μg进行连接，用Gigapack III包装提取物(Stratagene公司生产)在体外进行包装，做成染色体DNA文库。然后使它感染大肠杆菌XLI-BlueMRA，使其形成噬斑。
用(1)分离的约2kbp的DNA片段作为探针，使用ECL直接DNA/RNA标记/检测系统(Amershampharmacia公司生产)进行噬斑杂交，对约24000个噬斑进行筛选。对得到的阳性克隆中的10个进行2次筛选，纯化阳性克隆，制备噬菌体DNA。
用限制酶BamHI消化这些噬菌体DNA，进行southern解析，结果表明探针与约1.8kbp和约3.4kbp的两种片段杂交。另外从噬菌体DNA的限制酶谱图的解析也可表明这两种DNA片段是染色体DNA上相邻的两个片段。
用荧光DNA测序仪ABI PRISM 377(Perkin-Elmer公司生产)确定这两种DNA片段的全碱基序列。然后检索开放读框，结果可以发现象图1表示的那样的ORF I～IV的ORF。就从各个ORF推定的氨基酸序列利用信息库检索与已知的氨基酸序列的同源性，结果表明ORF I与对氨基安息香酸合成酶，和ORFII与前苯酸脱氢酶，和ORF III与分支酸变位酶都显示出同源性。将ORF I、II、III的基因分别命名为papA、papC和papB。papA编码的氨基酸序列及其碱基序列分别如序列号2和序列号1所示，papB编码的氨基酸序列及其碱基序列分别如序列号4和序列号3所示，papC编码的氨基酸序列及其碱基序列分别如序列号6和序列号5所示。
实施例2：papA基因在大肠杆菌中的表达
为了获得papA基因的翻译区，以来自在实施例1中显示阳性克隆的噬菌体DNA为模板，用序列号9和序列号10记载的寡核苷酸作为引物，进行PCR。PCR使用KOD Dash(东洋纺织公司生产)作为DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer公司生产)进行。反应液中加1μl(相当于1μg的量)的噬菌体DNA，5μl酶附带的10倍浓度反应用缓冲液、5μl的2mM dNTP溶液、调整到浓度为100pmol/μl的上述引物各1μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药公司生产)、1μl KOD Dash、31μl灭菌水，总体积为50μl。反应在94℃下进行5分钟预处理后进行15个循环，每一循环为94℃下温育30秒、50℃下2秒、73℃下30秒。将得到的反应液用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)萃取，进行乙醇沉淀。将沉淀再溶解于灭菌水，使用DNAblunting kit(宝酒造社制)使DNA末端成为平末端。然后利用T4 DNA激酶(和光纯药公司生产)使5’末端磷酸化后，进行琼脂糖凝胶电泳，切出约2kbp的DNA片段，回收后克隆于pUC118的SmaI位点，获得质粒pUC118-papA。
就pUC118-papA的插入片段用荧光DNA测序仪ABI PRISM 310Genetic Analyzer(Perkin-Elmer公司生产)确定其碱基序列，结果表明序列号1记载的碱基序列中的第2043位的胞嘧啶被腺嘌呤置换了。这可能是通过PCR进行DNA片段扩增时出现的错误，但由于被编码的氨基酸序列没有变化，所以pUC118-papA的插入片段可以用于以下的实验中。
将pUC118-papA导入大肠杆菌JM110，按照常规方法从获得的转化体制备质粒。该质粒用限制酶BclI消化后进行琼脂糖凝胶电泳，分离、回收约2kbp的BclI DNA片段。
另外，用限制酶NcoI消化质粒pTrc99A(Amershampharmacia公司生产)，使用Mung Bean Nuclease(和光纯药公司生产)使DNA变成平末端。再用限制酶SmaI将其消化后，用T4 DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pTrc101。
用限制酶BamHI消化pTrc101，实施碱性磷酸酶(宝酒造公司生产)处理后，与上述的2kbp的BclI DNA片段连接。选择相对于包含在pTrc101内的启动子正向插入了papA基因的质粒，命名为pTrc-papA。到此为止的质粒的构建过程如图2所示。
将携带pTrc-papA的大肠杆菌JM109菌株于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(1％细菌培养用胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中，37℃下培养过夜。将得到的培养液1ml接种于100ml同样的培养基中，于30℃培养4小时后，添加1ml的100mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，再于30℃下培养3小时。培养后，通过离心从培养液中收集菌体，悬浮于4ml细胞破碎用缓冲液(50mMTris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、10％甘油)后，通过超声处理破碎细胞。破碎后，通过离心得到上清，将该上清作为细胞提取液。将携带pTrc101的大肠杆菌JM109菌株也进行同样的处理，制备细胞提取液。
用这样制备的细胞提取液测定酶活性。即，将100μl细胞提取液、400μl蒸馏水、500μl底物溶液(10mM分支酸钡盐(sigma公司生产)、10mM谷氨酰胺(和光纯药公司生产)、10mM氯化镁、100mM MOPS(和光纯药公司生产)、pH7.5)混合，于30℃下反应2小时。反应结束后，用全自动氨基酸分析仪JLC-500/V(日本电子株式会社生产)对反应液的一部分进行分析。
分析结果就象图3给出的那样，在使用从携带pTrc-papA的大肠杆菌中制备的细胞提取液时，在与按照Chia-Yu P.Teng等人(Chia-Yu P.Teng.et al.J.Am.Chem.Soc.，107，5008-5009(1985))方法合成的4-氨基-4-脱氧分支酸标准样品相同保留时间的位置可检测出峰。在使用煮沸处理的细胞提取液或使用从携带pTrc101的大肠杆菌中制备的细胞提取液时在该位置并没有检测到峰。以上结果表明papA基因是编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因。
实施例3：papB基因在大肠杆菌中的表达
为了获得papB基因的翻译区，以来自于实施例1中显示阳性克隆的噬菌体DNA为模板，用序列号11和序列号12记载的寡核苷酸作为引物，进行PCR。PCR使用KOD Dash(东洋纺织公司生产)作为DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer公司生产)进行。反应液中加1μl(相当于1μg的量)的噬菌体DNA，5μl酶附带的10倍浓度反应用缓冲液、5μl的2mM dNTP溶液、调整到浓度为100pmol/μl的上述引物各1μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药公司生产)、1μl KOD Dash、31μl灭菌水，总体积为50μl。反应在94℃下进行5分钟预处理后进行15个循环，每一循环为94℃下温育30秒、50℃下2秒、72℃下30秒。将得到的反应液用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)萃取，进行乙醇沉淀。将沉淀再溶解于灭菌水，用限制酶BamHI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切出约0.3kbp的带，回收DNA片段。
用限制酶BamHI消化pTrc101，实施碱性磷酸酶(宝酒造公司生产)处理后，用T4DNA连接酶与上述的0.3kbp的BamHI DNA片段连接。选择相对于包含在pTrc101内的启动子正向插入了papB基因的质粒，命名为pTrc-papB(图4)。就pTrc-papB的插入片段用荧光DNA测序仪ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin-Elmer公司生产)确定其碱基序列，确认其序列与序列3记载的碱基序列一致。
将携带pTrc-papB的大肠杆菌JM109菌株于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基(1％细菌培养用胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中，37℃下培养过夜。将得到的培养液1ml接种于100ml同样的培养基中，于37℃培养2小时后，添加1ml的100mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，再于37℃下培养5小时。培养后，通过离心从培养液中收集菌体，悬浮于4ml细胞破碎用缓冲液(50mMTris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、10％甘油)后，通过超声处理破碎细胞。破碎后，通过离心得到上清，将该上清作为细胞提取液。另外将携带pTrc101的大肠杆菌JM109菌株也进行同样的处理，制备细胞提取液。
用这样制备的细胞提取液测定酶活性。即，将50μl细胞提取液、200μl蒸馏水、250μl底物溶液(2mg/ml的4-氨基-4-脱氧分支酸、10mM氯化镁、100mM MOPS(和光纯药公司生产)、pH7.5)混合，于30℃下反应1小时。反应结束后，用全自动氨基酸分析仪JLC-500/V(日本电子株式会社生产)对反应液的一部分进行分析。
分析结果就象图5给出的那样，在使用从携带pTrc-papB的大肠杆菌中制备的细胞提取液时，4-氨基-4-脱氧分支酸峰减少，而新检测到4-氨基-4-脱氧前苯酸的峰。另外即使使用5分钟煮沸处理的细胞提取液得到的结果也一样。
另外使用从携带pTrc101的大肠杆菌中制备的细胞提取液时4-氨基-4-脱氧分支酸峰没有变化，也没有检测到4-氨基-4-脱氧前苯酸的峰。以上结果表明papB基因编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶，而papB基因编码的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶即使煮沸5分钟处理也没有失活，表现出耐热性。
实施例4：papC基因在大肠杆菌中的表达
为了获得papC基因的翻译区，以来自在实施例1中显示阳性克隆的噬菌体DNA为模板，用序列号13和序列号14记载的寡核苷酸作为引物，进行PCR。PCR使用KOD Dash(东洋纺织公司生产)作为DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer公司生产)进行。反应液中加1μl(相当于1μg的量)的噬菌体DNA、5μl酶附带的10倍浓度反应用缓冲液、5μl的2mM dNTP溶液、调整到浓度为100pmol/μl的上述引物各1μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药公司生产)、1μl KOD Dash、31μl灭菌水，总体积为50μl。反应在94℃下进行5分钟预处理后进行15个循环，每一循环为94℃下温育30秒、50℃下2秒、72℃下30秒。将得到的反应液用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)萃取，进行乙醇沉淀。将沉淀再溶解于灭菌水，用限制酶BamHI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切出约1kbp的带，回收DNA片段。
用限制酶BamHI消化pET-11c(Stratagene公司制)，实施碱性磷酸酶(宝酒造公司生产)处理后，用T4DNA连接酶与上述的1kbp的BamHI DNA片段连接。选择相对于包含在pET-11c内的启动子正向插入了papC基因的质粒，命名为pET-papC。
就pET-papC的插入片段用荧光DNA测序仪ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer(Perkin-Elmer公司生产)确定其碱基序列，确认其序列与序列号5记载的碱基序列一致。
另外，用pET-papC使papC基因表达时，由于来自载体的14个氨基酸构成的肽附加在papC基因产物的N末端一侧，所以可预料到不能正确评价papC基因产物的性质。在此用限制酶NdeI对pET-papC进行消化后，用T4 DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pET-papC1。通过利用pET-papC1，有可能使papC基因产物本身(而不是作为融合蛋白质)在大肠杆菌中生产。到此为止的质粒的构建过程如图6所示。
将携带pET-papC1的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基(1％细菌培养用胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中，37℃下培养过夜。将得到的培养液1ml接种于100ml同样的培养基中，于37℃下培养2小时后，添加1ml的100mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，再于37℃下培养5小时。培养后，通过离心从培养液中收集菌体，悬浮于4ml细胞破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、10％甘油)后，通过超声处理破碎细胞。破碎后，通过离心得到上清，将该上清作为细胞提取液。另外将携带质粒pET-11c的大肠杆菌BL21(DE3)菌株也进行同样的处理，制备细胞提取液。
用这样制备的细胞提取液测定酶活性。即，将40μl细胞提取液、从实施例3记载的携带pTrc-papB的大肠杆菌中制备的且经煮沸处理的细胞提取液10μl、190μl蒸馏水、10μl的10mM NAD溶液、250μl底物溶液(2mg/ml的4-氨基-4-脱氧分支酸、10mM氯化镁、100mMMOPS(和光纯药公司生产)、pH7.5)混合，于30℃下反应1小时。反应结束后，用全自动氨基酸分析仪JLC-500/V(日本电子株式会社生产)对反应液的一部分进行分析。
分析结果就象图7给出的那样，在使用从携带pET-papC1的大肠杆菌中制备的细胞提取液时，4-氨基-4-脱氧分支酸峰减少，而且由papB基因产物生成的4-氨基-4-脱氧前苯酸的峰也消失了。由于在全自动氨基酸分析仪JLC-500/V(日本电子株式会社生产)没有检测到对氨基苯丙酮酸，所以不能直接确认其生成。
但是，对氨基苯丙氨酸的峰被检测出，这可能是由papC基因产物生成的对氨基苯丙酮酸经大肠杆菌的氨基转移酶催化被氨基化而生成的峰。另外使用经煮沸处理的细胞提取液和从携带pET-11c的大肠杆菌中制备的细胞提取液时，由papB基因产物产生的4-氨基-4-脱氧前苯酸的峰没有变化。以上结果表明papC基因编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶。
实施例5：PF1022生产菌导入用质粒pPF260-A2和pPF260-A3的 构建
用于使papA在PF1022生产菌中表达的质粒pPF260-A2和pPF260-A3的构建如图8所示。
构建PF1022生产菌用表达载体pABPd，然后与从实施例2记载的质粒pUC118-papA中得到的DNA片段连接，作为表达载体。表达载体构建的具体过程如下。
PF1022物质生产菌基因组DNA的分离
PF1022物质生产菌(FERM BP-2671)的基因组DNA的分离根据(H.Horiuchi et.al.，J.Bacteriol.170，272-278，(1988))记载的方法进行。具体过程如下：首先将PF1022菌株(FERM BP-2671)在种子培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％右旋糖、0.5％多聚蛋白胨、0.6％小麦胚芽、0.3％酵母提取物、0.2％大豆饼和0.2％碳酸钙；灭菌前pH为7.0；WO97/00944号参照实施例1)中培养2天，离心分离(3500rpm、10分钟)、收集菌体。然后将得到的菌体冷冻干燥后，悬浮于TE中，在3％SDS溶液中于60℃下处理30分钟后，通过TE饱和酚萃取，除去菌体残渣。萃取液经乙醇沉淀后，用核糖核酸酶A(シグマ社制)和蛋白激酶K(和光纯药公司生产)处理，再通过12％聚乙二醇6000使核酸沉淀。用TE饱和酚对沉淀进行萃取，进行乙醇沉淀，将该沉淀溶解于TE中，将其作为基因组DNA。
PF1022物质生产菌的基因组文库的制作
用Sau3AI对上述制备的来自PF1022物质生产菌的基因组DNA进行部分消化。然后用T4连接酶(宝酒造生产的连接kit.Ver.2)将经消化的DNA与噬菌体载体、λ EMBL3克隆试剂盒(Stratagene公司生产)的BamHI arm连接。再用乙醇将其沉淀，沉淀溶解于TE中。使用Gigapack III plaspackaging kit(Stratagene公司生产)用全量的连接混和物感染大肠杆菌LE392菌株，使其形成噬菌体噬斑。用通过这种方法得到的1.3×104个(2.6×104PFU/ml)的噬菌体文库进行Abp1基因的克隆。
从来自PF1022物质生产菌的基因组DNA中克隆Abp1基因
利用PCR扩增Abp1基因的翻译区用作探针。象上述那样以从PF1022物质生产菌制备的基因组DNA为模板，使用由8-73U和8-73R构成的合成引物，按照レツツゴ-PCR试剂盒(サワデイ-テクノロジ-公司生产)进行PCR。PCR反应条件按照94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒步骤反复进行25个循环，进行扩增。下面给出的是8-73U和8-73R的DNA序列。
8-73U：CTCAAACCAGGAACTCTTTC(序列号15)
8-73R：GACATGTGGAAACCACATTTTG(序列号16)
上面得到的PCR产物用ECLdirect系统(AmershampharmaciaBiotech.公司生产)进行标记。将上面形成的噬菌体噬斑转移到HybondN+转移膜(Amershampharmacia Biotech.公司生产)上，经碱处理后，用5倍浓度SSC(SSC：15mM柠檬酸三钠盐、150mM氯化钠)洗涤，使其干燥，对DNA进行固定。按照试剂盒的记载的方法，进行1小时预杂交(42℃)后，添加先前标记的探针，进行16小时(42℃)杂交。探针的洗涤按照上述试剂盒记载的方法进行。探针洗涤后的尼龙膜在检测溶液中浸泡1分钟后，使メデイカルX光片(富士写真胶片公司生产)感光，得到1个阳性克隆。该克隆进行southern解析，结果至少6kb的HindIII片段与基因组DNA的限制酶片段长度一致。该HindIII片段的限制酶谱图如图9所示。将HindIII片段亚克隆于pUC119(pRQHin/119)供以下实验用。
表达载体的构建
以pRQHin/119为模板，利用PCR法扩增Abp1基因的启动子区和终止子区。扩增启动子使用ABP-Neco和ABP-Nbam组成的引物，而扩增终止子时用ABP-Cbam和ABP-Cxba组成的引物，使用PCRス-パ-ミツクスハイフイデリテイ(ライフテツクオリエンタル公司生产)实施PCR法。反应条件按照94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒步骤反复进行25个循环，进行扩增。下面给出的是ABP-Neco、ABP-Nbam、ABP-Cbam和ABP-Cxba的DNA序列。
ABP-Neco：GGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC(序列号17)
ABP-Nbam：GGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG(序列号18)
ABP-Cbam：GGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC(序列号19)
ABP-Cxba：GGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG(序列号20)
各个PCR产物用microspine S-400柱(AmershampharmaciaBiotech.公司生产)纯化，经乙醇沉淀后，启动子用EcoRI和BamHI消化，而终止子用BamHI和XbaI消化，然后依次与用同样的酶消化的pBluescriptII KS+连接。再用XbaI将其消化，插入来自pMKD01(WO98/03667号)的四环素抗性组件，构建pABPd(图10)。pABPd含有Abp1基因的启动子和终止子。
从实施例2记载的质粒pUC118-papA制备约2kbp的BclI DNA片段。然后将该片段插入PF1022生产菌用表达载体pABPd的BamHI位点，构建质粒pPF260-A。
然后用限制酶PstI和BamHI对pPF260-A进行双重消化，制备约1.7kbp的DNA片段。将该片段亚克隆于pUC119的PstI和BamHI位点，得到质粒pUC119-A。以pUC119-A为模板DNA，序列号21记载的寡核苷酸作为引物，使用Muta-Gene in vitro(突变产生kit)ミユ-タジエネシスキツト(Bio-Rad公司生产)实施位点特异突变，得到质粒pUC119-A1。
然后用限制酶PstI和BamHI对pPF119-A1和pPF260-A进行双重消化，制备约1.7kbp和约8.6kbp的DNA片段后，将它们连接起来得到质粒pPF260-A2。用限制酶XbaI消化后pPF260-A2，用T4 DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pPF260-A3。
实施例6：PF1022生产菌导入用质粒pPF260-B3的构建
用于使papB在PF1022生产菌中表达的质粒pPF260-B3的构建如图11所示。
从实施例3记载的质粒pTrc-papB制备约0.3kbp的BamHI DNA片段。然后将该片段插入表达载体pABPd(实施例5)的BamHI位点，得到质粒pPF260-B。pPF260-B用限制酶XbaI消化后，用T4 DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pPF260-B1。
然后用限制酶PstI消化pPF260-B1，制备约0.6kbp的DNA片段。将该片段亚克隆于pUC118的PstI位点，要使papB基因的方向与lacZ′基因方向相同，得到质粒pUC118-B。以pUC 118-B为模板DNA，以序列号22中记载的寡核苷酸为引物，应用Muta-Gene in vitro突变产生kit(Bio-Rad社制)进行位点特异性突变处理，得到质粒pUC118-B1。
用限制酶PstI消化pUC118-B1和pPF260-B1，分别制备约0.6kbp和约8.0kbp的DNA片段后，将它们连接起来得到质粒pPF260-B3。
实施例7：PF1022生产菌导入用质粒pPF260-C3的构建
用于使papC在PF1022生产菌中表达的质粒pPF260-C3的构建如图12所示。
从实施例4记载的质粒pET-papC制备约1kbp的BamHI DNA片段。然后将该片段插入表达载体pABPd(实施例5)的BamHI位点，得到质粒pPF260-C。pPF260-C用限制酶XbaI消化后，用T4 DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pPF260-C1。
然后用限制酶PstI和SphI对pPF260-C1进行双重消化，制备约1.7kbp的DNA片段。将该片段亚克隆于pUC118的PstI和SphI位点，得到质粒pUC118-C。以pUC118-C为模板DNA，以序列号23中记载的寡核苷酸作为引物，使用Mut-Gene in vitro突变产生kit(Bio-Rad公司生产)实施位点特异突变处理，得到质粒pUC118-C1。
然后用限制酶PstI和SphI对pUC118-C1和pPF260-C1进行双重消化，分别制备约1.7kbp和约7.6kbp的DNA片段后，将它们用T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒pPF260-C3。
实施例8：PF1022生产菌的转化
将pPF260-A2、pPF260-A3、pPF260-B3和pPF260-C3混合，它们的含量分别为1μg、3μg、3μg和3μg，用乙醇沉淀后再溶解于10μl的TE缓冲液(10mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA)中。使用这样制备的DNA溶液，通过WO97/00944号的实施例1记载的方法转化PF1022生产菌。具体来说就是将PF1022生产菌在实施例5记载的种子培养基中于26℃下培养48小时。然后通过离心分离(3000r.p.m.，10分钟)，收集菌丝体，用0.5M蔗糖溶液洗涤。将得到的菌丝体于含有β-葡糖醛酸酶(Sigma公司生产)3mg/ml、壳多糖酶(Sigma公司生产)1mg/ml和消解酶(生化工业公司生产)1mg/ml的0.5M蔗糖溶液中，通过于30℃下振荡2小时使其原生质体化。将得到的混合物进行过滤，除去残存菌体。用SUTC缓冲液(0.5M蔗糖、10mMTris-HCl(pH7.5)、10mM氯化钙)通过2次离心分离(2500r.p.m.、10分钟、4℃)将原生质体洗涤，然后用SUTC缓冲液制备1×107个/ml的原生质体悬浊液。
向100μl原生质体悬浊液加入先前制备的质粒DNA溶液，将得到的混合物于冰冷下放置5分钟。然后向该混合物中加入400μl的聚乙二醇溶液(60％聚乙二醇4000(和光制药)、10mMTris-HCl(pH7.5)、10mM氯化钙)，将得到的混合物于冰冷下放置20分钟。
将以上那样处理的原生质体用SUTC缓冲液洗涤后，再悬浮于同样缓冲液中。将得到的悬浊液与马铃薯葡糖软琼脂一起铺在含有100μg/ml氯霉素B和0.5M蔗糖的马铃薯葡糖琼脂培养基上。于26℃下培养5天，将出现的菌落作为转化体。
从得到的转化体中制备染色体DNA，以染色体DNA作为模板DNA，除了循环数为25个循环外，在实施例2、3和4记载的条件下进行PCR，进行papA、papB和papC基因的检测。结果选择出3种基因都导入的转化体55-65株(FERM BP-7255)。
实施例9：PF1022生产菌转化体的培养和PF1022衍生物的检测
按照WO97/20945号记载的条件对实施例8选择出的转化体55-65株(FERM BP-7255)和亲本株进行培养。即于实施例5记载的种子培养基中于26℃下培养2天。将得到的培养液2ml接种到50ml的生产培养基(0.6％小麦胚芽、フイ-マメデイア1.0％、可溶性淀粉2.6％、糖稀6.0％、MgSO4·7H2O 0.2％、NaCl 0.2％)中，再于26℃下培养6天。培养结束后，从每份为40ml的培养液中通过离心收集菌体，用30ml的乙酸乙酯萃取。将萃取液浓缩干燥后，再溶解于2ml的乙腈中，取其中的10μl进行HPLC分析。
HPLC分析的条件为：
HPLC系统：株式会社日立制作所655A-11
柱子：Inertsil ODS-24.6×250mm
流动相：乙腈:＝70:30
流速：1.0ml/min
柱子温度：40℃
检测器：日本分光工业株式会社870-UV
UV波长：245nm。
就象图13所表示的那样，在转化体55-65株可检测到与PF1022-268(WO97/11064号实施例1、Cyclo[MeLeu-Lac-MeLeu-(O2N)PhLac-MeLeu-Lac-MeLeu-PhLac])以及PF1022-269(WO97/11064号实施例2、Cyc l o[MeLeu-Lac-MeLeu-(H2N)PhLac-MeLeu-Lac-MeLeu-PhLac])保留时间一致的峰。而这些峰在亲本株中检测不到。在将来自转化体的萃取液和各个标准样品混合后进行HPLC分析实验中，结果表明这些峰与标准样品的峰完全重合。就这些峰中含有的物质通过LC-MS(带有aQaTM的四极型ベンチトツプLC/MS系统NAVIGATOR(サ-モクエスト株式会社生产))测定质谱，结果与标准样品一致。
以上结果表明导入了所有papA、papB和papC 3种基因的转化体55-65株生产苯环对位被硝基或氨基修饰的PF1022物质衍生物。
序列表
<110>明治制菓公司(Meiji Seika Kaisha，Ltd.)
<120>生产被官能团修饰的次级代谢产物的转化体和新的生物合成基因
<130>127185PX
<140>
<141>
<150>276314/1999
<151>1999-09-29
<160>23
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2061
<212>DNA
<213>委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2058)
<400>1
Figure C00813681D00331
Figure C00813681D00351
Figure C00813681D00361
<210>2
<211>686
<212>PRT
<213>委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)
<400>2
Figure C00813681D00391
Figure C00813681D00401
Figure C00813681D00411
Figure C00813681D00421
<210>3
<211>312
<212>DNA
<213>委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(309)
<400>3
Figure C00813681D00441
<210>4
<211>103
<212>PRT
<213>委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)
<400>4
Figure C00813681D00451
<210>5
<211>969
<212>DNA
<213>委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(966)
<400>5
Figure C00813681D00461
Figure C00813681D00481
Figure C00813681D00491
<210>6
<211>322
<212>PRT
<213>委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)
<400>6
Figure C00813681D00492
Figure C00813681D00511
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：pabAB基因的PCR引物
<400>7
Figure C00813681D00521
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：pabAB基因的PCR引物
<400>8
Figure C00813681D00522
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：papA基因的PCR引物
<400>9
Figure C00813681D00523
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：papA基因的PCR引物
<400>10
Figure C00813681D00531
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：papB基因的PCR引物
<400>11
Figure C00813681D00532
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：papB基因的PCR引物
<400>12
Figure C00813681D00541
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：papC基因的PCR引物
<400>13
Figure C00813681D00542
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：papC基因的PCR引物
<400>14
Figure C00813681D00543
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：Abpl基因的PCR引物
<400>15
Figure C00813681D00551
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：Abpl基因的PCR引物
<400>16
Figure C00813681D00552
<210>17
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：Abpl基因的PCR引物
<400>17
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：Abpl基因的PCR引物
<400>18
Figure C00813681D00562
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：Abpl基因的PCR引物
<400>19
Figure C00813681D00571
<210>20
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：Abpl基因的PCR引物
<400>20
Figure C00813681D00572
<210>21
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：定点诱变引物
<400>21
Figure C00813681D00573
<210>22
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：定点诱变引物
<400>22
Figure C00813681D00581
<210>23
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：定点诱变引物
<400>23
Figure C00813681D00582

Claims (14)

1.一种转化体，其特征在于，它是生产具有对位没有被含氮原子的官能团置换的苯环骨架的次级代谢产物的生物的转化体，通过导入参与由分支酸合成对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因，即生物合成基因，进行转化，使之生产具有对位被含氮原子的官能团置换的苯环骨架的次级代谢产物，其中的生物合成基因是由编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因以及编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因组成的，并且，被转化的生物是无孢菌类(Mycelia sterilia)，并且被转化的生物生产结构式如下的化合物，
Figure C00813681C00021
2.权利要求1记载的转化体，其特征在于，由转化体生产的次级代谢产物是结构式如下的化合物：
3.权利要求1记载的转化体，其中由编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因以及编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因组成的生物合成基因中，至少一个基因是来自链霉菌属、诺卡菌属或棒状杆菌属的基因.
4.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因是由编码序列号2中记载的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的序列号2的改变序列的多核苷酸构成的.
5.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因是由序列号1的DNA序列组成的.
6.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因是由编码序列号4中记载的氨基酸序列或者具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性的序列号4的改变序列的多核苷酸组成的.
7.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因是由序列号3的DNA序列组成的.
8.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因是由编码序列号6中记载的氨基酸序列或者具有4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶活性的序列号6的改变序列的多核苷酸组成的.
9.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因是由序列号5的DNA序列组成的.
10.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因以及编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因分别是由编码序列号2中记载的氨基酸序列或者具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的序列号2的改变序列的多核苷酸构成的；由编码序列号4中记载的氨基酸序列或者具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性的序列号4的改变序列的多核苷酸组成的；以及由编码序列号6中记载的氨基酸序列或者具有4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶活性的序列号6的改变序列的多核苷酸组成的.
11.权利要求1记载的转化体，其特征在于，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因以及编码4-氨基-4-脱氧前苯酸脱氢酶的基因分别是由序列号1的DNA序列、序列号3的DNA序列以及序列号5的DNA序列组成的.
12.权利要求1记载的转化体，其中无孢菌类(Mycelia sterilia)是保藏号为FERM BP-2671的保藏于生命工程工业技术研究所的PF1022菌株.
13.权利要求1记载的转化体，其中转化体是保藏号为FERM BP-7255的保藏于生命工程工业技术研究所的55-65菌株.
14.一种PF1022物质衍生物的制造方法，其中包括对权利要求1～13中的任一项记载的转化体进行培养，提取下式表示的PF1022物质衍生物.
Figure C00813681C00041
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