CN103215281A - 一种格瑞克霉素和p-1894b的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents
一种格瑞克霉素和p-1894b的生物合成基因簇及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇及其应用。格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3722~40612位的碱基序列所示。本发明所提供的包含格瑞克霉素和P-1894B生物合成相关的所有基因和蛋白信息,可以帮助人们理解角环素类天然产物的生物合成机制,为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
Description
技术领域:
本发明属于微生物基因工程领域,具体涉及一组角环素(angucycline)抗生素,格瑞克霉素(grincamycin)和P-1894B(vineomycin A1)的生物合成基因簇及其应用。
背景技术:
格瑞克霉素和P-1894B是一类由角环素为骨架连接5个糖配基所组成的抗生素,具有很好的抗各种肿瘤细胞和革兰氏阳性细菌的活性,其结构式如图1所示。角环素是指通过聚酮生物合成途径形成十聚酮链而产生的具有角四环即苯并蒽环(Benz[a]anthracene)结构并不含糖配基的化合物。角环素类化合物分别于1965及1966年被Dann和Kunstmann and Mitscher等人首次报道过。微生物次级代谢产物生物合成是由多酶体系参与的,这些多酶体系中的各个酶系按照一定的组织结构协调起作用。聚酮化合物均是由多酶体系PKS催化酰基-CoA活化的底物之间的重复脱梭缩合而合成的。所有角环素类化合物都是由II型PKS形成的具有广泛生物活性及化学多样性的芳香多聚酮类化合物,其生物活性主要包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、酶抑制、血小板凝集抑制以及免疫调节等。由于角环素结构骨架及其糖配基数量和种类上的多样性,目前已发现天然的角环素类化合物总数超过170多个。目前有许多典型的角环素类型化合物的生物合成被报道,如:urdamycins,landomycins,gaudimycins,simocyclinone,oviedomycin。
角环素类天然产物在过去十几年里由于其显著的生物活性及多样的糖基团而引起了许多科学家的关注。除了从自然界中获得典型的天然角环素类化合物,通过组合生物合成的手段对角环素类化合物生物合成基因簇进行改造也已经获得一些新的具有显著生物活性的角环素类衍生化合物。另外,可以通过对化合物生物合成途径的了解,对一些化合物结构进行修饰,得到目标的化合物,或者通过对一些调控基因进行改造,可以达到提高目标化合物产量的目的。由于存在角环素化合物的毒性及可溶性问题,目前并没有该类化合物进入临床试验药物的报道,所以可以通过组合生物合成的手段,对该类化合物进行定向修饰,从而能够得到具有用药前景的角环素类化合物。
组合生物合成是近20年发展起来的一种合成天然产物结构多样性,用以发现和发展药物的新方法。它尤其适合于化学方法难以合成的那些复杂的生物大分子化合物。由于分子遗传工程、基因工程的发展,以及基因组学和蛋白质组学等学科研究的不断深入,诸多与微生物代谢相关的生物合成基因和蛋白功能被认知与掌握。通过生物信息学和微生物遗传学手段可确定基因簇中的各模块或结构域的功能,如将这些模块或结构域进行多种“自由”组合就可能产生核心环合成和功能基团各异的新型“非天然”天然产物。组合生物合成和代谢工程在筛选和发展新型药物方面日益成为生物、化学和医药界关注的重点。基于聚酮和聚肽类天然产物的独特化学结构和良好生物活性,研究它们的生物合成机制,将为合理化遗传修饰生物合成途径获得结构类似物提供遗传和生物化学的基础,实现利用现代生物学和化学的技术手段在微生物体内进行药物开发的目的。
发明内容:
本发明的第一个目的是提供一种格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇。
本发明的格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇来源于链霉菌Streptomyces lusitanusSCSIO LR32,其特征在于,该生物合成基因簇是从包含有整个格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇的cosmid179F中测序获得的,该格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3722~40612位的碱基序列所示,包含30个基因,具体为:
(1)负责格瑞克霉素和P-1894B的角环素骨架合成的基因,即gcnH、gcnI、gcnJ共3个基因:
gcnH位于基因簇核苷酸序列(SEQ ID NO.1,下同)第11220-12500个碱基处,长度为1281个碱基对,编码酮基合成酶,426个氨基酸;
gcnI位于基因簇核苷酸序列第12497-13717个碱基处,长度为1221个碱基对,编码II型PKS链延伸因子模块,406个氨基酸;
gcnJ位于基因簇核苷酸序列第13794-14063个碱基处,长度为270个碱基对,编码酰基载体蛋白,89个氨基酸;
(2)负责格瑞克霉素和P-1894B的角环素骨架后修饰的基因,即gcnA、gcnC、gcnF、gcnK、gcnL、gcnM、gcnP、gcnT、gcnU共9个基因:
gcnA位于基因簇核苷酸序列第3722-4840个碱基处,长度为1119个碱基对,编码氧化还原酶,372个氨基酸;
gcnC位于基因簇核苷酸序列第6612-7211个碱基处,长度为600个碱基对,编码NADPH-依赖型黄素单核苷酸还原酶,199个氨基酸;
gcnF位于基因簇核苷酸序列第9396-10883个碱基处,长度为1488个碱基对,编码氧化还原酶,495个氨基酸;
gcnK位于基因簇核苷酸序列第14192-14977个碱基处,长度为786个碱基对,编码酮基还原酶,261个氨基酸;
gcnL位于基因簇核苷酸序列第14998-15933个碱基处,长度为936个碱基对,编码环化酶,311个氨基酸;
gcnM位于基因簇核苷酸序列第15935-17923个碱基处,长度为1989个碱基对,编码氧化还原酶,662个氨基酸;
gcnP位于基因簇核苷酸序列第32089-33624个碱基处,长度为1536个碱基对,编码羧基转移酶,511个氨基酸;
gcnT位于基因簇核苷酸序列第37801-39597个碱基处,长度为1797个碱基对,编码氧化还原酶,598个氨基酸;
gcnU位于基因簇核苷酸序列第39587-40612个碱基处,长度为1026个碱基对,编码氧化还原酶,341个氨基酸;
(3)负责格瑞克霉素和P-1894B的脱氧糖合成的基因,即gcnS1、gcnS2、gcnS3、gcnS4、gcnS5、gcnS6、gcnS7、gcnS8共8个基因:
gcnS1位于基因簇核苷酸序列第21799-22293个碱基处,长度为495个碱基对,编码NDP-己糖3,5-异构酶,164个氨基酸;
gcnS2位于基因簇核苷酸序列第23455-24522个碱基处,长度为1068个碱基对,编码dNDP-葡糖合成酶,355个氨基酸;
gcnS3位于基因簇核苷酸序列第24519-25502个碱基处,长度为984个碱基对,编码dNDP-葡糖4,6脱水酶,327个氨基酸;
gcnS4位于基因簇核苷酸序列第25537-26547个碱基处,长度为1011个碱基对,编码NDP-己糖4-酮基还原酶,336个氨基酸;
gcnS5位于基因簇核苷酸序列第26550-27854个碱基处,长度为1305个碱基对,编码NDP-己糖3,4-脱水酶,434个氨基酸;
gcnS6位于基因簇核苷酸序列第27907-28671个碱基处,长度为765个碱基对,编码NDP-己糖4-酮基还原酶,254个氨基酸;
gcnS7位于基因簇核苷酸序列第29709-31112个碱基处,长度为1404个碱基对,编码NDP-己糖2,3-脱水酶,467个氨基酸;
gcnS8位于基因簇核苷酸序列第31109-32068个碱基处,长度为960个碱基对,编码NDP-己糖3-酮基还原酶,319个氨基酸;
(4)负责格瑞克霉素和P-1894B的脱氧糖转移的基因,即gcnG1、gcnG2、gcnG3共3个基因:
gcnG1位于基因簇核苷酸序列第19194-20486个碱基处,长度为1293个碱基对,编码O-糖基转移酶,430个氨基酸;
gcnG2位于基因簇核苷酸序列第20516-21730个碱基处,长度为1215个碱基对,编码O-糖基转移酶,404个氨基酸;
gcnG3位于基因簇核苷酸序列第22296-23426个碱基处,长度为1131个碱基对,编码C-糖基转移酶,376个氨基酸;
(5)负责格瑞克霉素和P-1894B调控子蛋白和转运子的基因,即gcnB、gcnD、gcnN、gcnR共4个基因:
gcnB位于基因簇核苷酸序列第5064-6581个碱基处,长度为1518个碱基对,编码转运蛋白,505个氨基酸;
gcnD位于基因簇核苷酸序列第7242-8081个碱基处,长度为840个碱基对,编码TetR家族的转录调控蛋白,279个氨基酸;
gcnN位于基因簇核苷酸序列第17936-19153个碱基处,长度为1218个碱基对,编码转运蛋白,405个氨基酸;
gcnR位于基因簇核苷酸序列第36424-37134个碱基处,长度为711个碱基对,编码正调控调节子,236个氨基酸;
(6)负责格瑞克霉素和P-1894B脱氧糖脱氢修饰的基因,即gcnQ1个基因:
gcnQ位于基因簇核苷酸序列第34148-35737个碱基处,长度为1590个碱基对,编码FAD/FMN依赖型脱氢酶,529个氨基酸;
(7)其它功能尚未明确的蛋白,gcnE、gcnO共2个基因:
gcnE位于基因簇核苷酸序列第8228-9070个碱基处,长度为843个碱基对,编码未知功能蛋白,280个氨基酸;
gcnO位于基因簇核苷酸序列第28700-29653个碱基处,长度为954个碱基对,编码未知功能蛋白,317个氨基酸;
(8)格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇的上下游基因,即orf(-3)、orf(-2)、orf(-1)和orf(+1)共4个基因:
orf(-3)位于基因簇核苷酸序列第1-600个碱基处,长度为600个碱基对,编码推测的保守蛋白,199个氨基酸;
orf(-2)位于基因簇核苷酸序列第763-2388碱基处,长度为1626个碱基对,编码苹果酸合成酶,541个氨基酸;
orf(-1)位于基因簇核苷酸序列第2682-3605个碱基处,长度为924个碱基对,编码推测的保守蛋白,307个氨基酸;
orf(+1)位于基因簇核苷酸序列第40952-41908个碱基处,长度为957个碱基对,编码膜输出蛋白,编码318个氨基酸;
SEQ ID NO.1(序列表)所示序列的第3722~40612位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。且第3722~40612位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第3722~40612位中DNA序列的重组DNA载体的途径。
本发明还提供了产生格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因被中断或其他基因改造的途径,至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO.1所示序列的第3722~40612位中的核苷酸序列。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明SEQ ID NO.1所示序列的第3722~40612位的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇相似的基因。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列,也包含有Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因组中邻近区域未克隆的DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内、体外修饰或进行突变,包括插入、置换或缺失,聚合酶链式反应,错误介导聚合酶链式反应,位点特异性突变,不同序列的重新连接,序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化,或通过紫外线或化学试剂诱变等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径,也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。
包含DNA片段或基因可以用来提高格瑞克霉素和P-1894B或其衍生物的产量,本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。
本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性,或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。
本发明还提供了格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇在制备格瑞克霉素或/和P-1894B及其类似物中的应用。
本发明还提供了如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在制备化合物P-1894B中的应用。
所述的应用是将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转入链霉菌S.coelicolor中异源表达产生化合物P-1894B。
本发明还提供了FAD/FMN依赖型脱氢酶的编码基因gcnQ,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第34148-35737位碱基所示。
一种上述编码基因gcnQ编码的FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ。
FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ在催化脱氧糖L-玫红糖(L-rhodinose)末端糖基脱氢氧化成L-aculose中的应用。
FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ在催化化合物1a产生化合物1c和/或化合物1b中的应用,所述的化合物1a其结构如式1a所示,所述的化合物1c其结构如式1c所示,所示的化合物1b即为P-1894B;
FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ在催化化合物2a产生化合物2c和/或化合物2b中的应用,所述的化合物2a其结构如式2a所示,所述的2c其结构如式2c所示,所述的化合物2b其结构如式2b所示;
FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ在催化化合物3a产生化合物3c中的应用,所述的化合物3a其结构如式3a所示,所述的化合物3c其结构如式3c所示;
总之,本发明所提供的包含格瑞克霉素和P-1894B生物合成相关的所有基因和蛋白信息,可以帮助人们理解角环素类天然产物的生物合成机制,为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
本发明的链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32菌株现保存于中国广东省广州市中国科学院南海海洋研究所的中国科学院海洋微生物研究中心(RNAM Center for MarineMicrobiology,CAS),保藏编号为:SCSIO LR32,该菌株是对外销售的,任何人都可以从该保藏中心购买到。
附图说明:
图1是格瑞克霉素(grincamycin,1)和P-1894B(vineomycin A1,1b)的化学结构式。
图2是Streptomyces lusitanus SCSIO LR32中格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇:MinimalPKS角环素骨架合成基因;Aglycon tailoring角环素骨架后修饰基因;Sugar biosynthesis脱氧糖合成基因;Glycosyltransferase脱氧糖转移酶;Sugar tailoring脱氧糖后修饰基因;Regulator调节基因;Boundary gene边界基因;Unknown function未知功能基因。
图3是包含有整个格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇的cosmid179F整合到异源宿主链霉菌S.coelicolor得到的重组菌株S.coelicolor/179F-pSET152AB在发酵培养基中发酵的发酵产物的HPLC分析图:I重组菌株S.coelicolor/179F-pSET152AB;II野生型S.coelicolor;▲表示P-1894B。
图4是gcnQ基因遗传改造后链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32中格瑞克霉素生物合成基因簇得到的突变株在发酵培养基中发酵的发酵产物的HPLC分析图:I野生型Streptomyceslusitanus SCSIO LR32;II突变株△gcnQ;▲表示格瑞克霉素。
图5是gcnQ基因遗传改造后得到的突变株△gcnQ发酵所产生的新结构中间体1a、2a、3a的化学结构式。
图6是GcnQ蛋白的SDS-PAGE分析图谱。
图7是1a、2a、3a作为底物在FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ的催化作用下生成相应的格瑞克霉素类似物的HPLC分析图。I底物;II-V是随着酶催化反应时间的变化底物的生成情况。A:1a在酶GcnQ催化反应下得到中间产物1c以及终产物1b(P-1894B);B:2a在酶GcnQ催化反应下得到中间产物2c以及终产物2b(vineomycin B2);C:3a在酶GcnQ催化反应下得到中间产物3c。
图8是化合物1a、1c、2a、2c和3a的1H,13C的核磁共振谱的结果。
图9是化合物1a、1c、1b、2a、2c、2b、3a、3c的高分辨质谱结果。I化合物1a,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z941.4168,MF:C49H65O18;II化合物1c,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z937.3860,MF:C49H61O18;III化合物1b,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z933.3558,MF:C49H57O18;IV化合物2a,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z941.4174,MF:C49H65O18;V化合物2c,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z937.3873,MF:C49H61O18;VI化合物2b,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z933.3561,MF:C49H57O18;VII化合物3a,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z923.4078,MF:C49H63O17;VIII化合物3c,HR-ESI-MS[M-H]-:m/z919.3743,MF:C49H59O17;
图10是化合物1a、2a、1c、2c、2b、3a和3c的化学结构式。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
1.格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇测序以及序列生物信息学分析:
通过对包含有grincamycin生物合成基因簇的cosmid进行测序,得到插入片段大约53Kb的基因组序列,通过生物信息学软件及数据库比对分析,所测序cosmid包含了整个grincamycin生物合成基因簇,该基因簇全长大约37Kb,分析该基因簇包含有30个开放阅读框(open reading frames,ORFs),包括3个II型PKS合成基因(KS,酮基合成酶;ACP,酰基载体蛋白和CLF,蛋白链长度决定因子,即角环素骨架合成的基因gcnH、gcnI、gcnJ),9个角环素骨架后修饰基因gcnA、gcnC、gcnF、gcnK、gcnL、gcnM、gcnP、gcnT、gcnU,8个脱氧糖合成基因gcnS1、gcnS2、gcnS3、gcnS4、gcnS5、gcnS6、gcnS7、gcnS8,3个糖基转移酶基因gcnG1、gcnG2、gcnG3,4个调节基因即gcnB、gcnD、gcnN、gcnR,1个糖修饰基因gcnQ(如表1),2个未知功能基因gcnE、gcnO。利用数据库比对的方法,分析这30个开放阅读框的基因信息,并找到与其相类似的基因序列,从而推测各开放阅读框的生物功能。具体的cosmid179F及其包含的格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的分析如图2所示。
表1:gcnQ基因的功能分析
2.包含整个格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇的cosmid179F的异源表达
通过构建的重组质粒pSET152AB与包含有完整的格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的SuperCos1质粒cosmid179F利用同源重组的方法进行PCR-targeting实验获得重组质粒179F-pSET152AB,然后通过与异源宿主链霉菌S.coelicolor进行接合转移实验得到了重组菌株S.coelicolor/179F-pSET152AB,通过在发酵培养基中培养,表达出了化合物P-1894B。
3.格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇中gcnQ基因的功能分析
基于生物信息学分析,gcnQ基因是一个与FAD共价结合的脱氢酶,推测它的功能是催化末端糖基的脱氢化作用,将脱氧糖L-rhodinose氧化成L-aculose。通过对gcnQ基因进行体内阻断实验,从△gcnQ突变株的发酵产物中分离得到了三个新活性中间体,角四环结构的化合物1a,三环结构的化合物2a以及四环结构的化合物3a。这三个化合物的结构如图5所示。
4.GcnQ的体外酶反应和产物的鉴定。
在获取以上信息的基础上,将gcnQ基因克隆到pET28a(+)的NdeI和HindIII位点并转化至E.coli BL21(DE3)以表达获得GcnQ粗酶液,通过亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳、含量测定、体外酶反应及产物鉴定证明,gcnQ基因的功能是催化末端糖基的脱氢化作用,所有产物均通过核磁共振谱(图8)和高分辨质谱鉴定(图9)鉴定。
以下进一步提供实施例,这些实施实例有助于理解本发明,仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
实施例1
格瑞克霉素和P-1894B产生菌链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32大量基因组DNA提取:
将新鲜链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32的孢子按照5%的接种量接种于50mL的TSB培养基(胰蛋白胨17g,植物蛋白胨3g,氯化钠5g,磷酸氢二钾2.5g,葡萄糖2.5g,加水至1L,pH7.2-7.4)中,28-30℃,振荡培养约2天,4000rpm离心10分钟收集菌丝体。菌丝体用STE溶液(NaCl75mM,EDTA25mM,Tris-Cl20mM,余量为水)洗涤两次,向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液和终浓度3mg/mL的溶菌酶,涡旋均匀,37℃温浴3小时,加入至终浓度0.1-0.2mg/mL的蛋白酶K,混匀,37℃温浴10分钟,加入至终浓度1-2%的SDS,混匀,放入55℃水浴约1小时,期间颠倒数次。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(V/V/V=25:24:1),混合均匀,置于冰上冷却30分钟。12000rpm,4℃离心10分钟,然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离心管中,用同样的方法反复处理3次,然后用等体积的氯仿洗涤两次,12000rpm,4℃离心10分钟。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管,加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2),混匀后再加入等体积的异丙醇,混匀后冰上放置,沉淀DNA。小心地用玻璃棒将DNA纤维团转移至新的离心管中,用70%乙醇洗涤两次,将液体倾出,在37℃下略微烘干,加5mL TE溶解,并加入3-5U的RNA酶,由此得到链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因组DNA。
实施例2
格瑞克霉素和P-1894B产生菌链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因组文库的建立:
首先通过一系列的稀释实验确定了限制性核酸内切酶Sau3A I的用量,在50μL体系中,含有5μL的链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因组DNA,5μL的10×反应缓冲液和7.5μL稀释度为10-3的Sau3A I,其终止反应为2.5μL15mM EDTA和合适的上样缓冲液。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于40kb的基因组DNA片段,用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。
用于构建文库的载体SuperCos l质粒先用限制性核酸内切酶Xba I从两个cos序列中间切开,然后进行去磷酸化处理,再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶Bam HI切开,获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的约40kb的基因组DNA片段连接过夜,连接体系为20μL,含有2.8μg制备的基因组DNA片段和0.56μg处理后的SuperCos1质粒,2μL的10×Buffer,0.3U的连接酶。连接产物于65℃处理15分钟,使连接酶失活。从-80℃冰箱中取出一管包装混合物(50μL)置于冰上,将包装混合物在指间迅速融化,小心吸取一半包装混合物(25μL)至一个新的离心管中,加入10μL热处理后的连接产物,其余包装混合物于-80℃保存。小心混匀,30℃温浴90分钟,加入另外一半包装混合物(25μL),30℃温浴继续90分钟。加入500μL噬菌体稀释缓冲液(100mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl2,10mmol/L pH8.3Tris-HCl,余量为水),再加入25μL氯仿,轻轻混匀,得包装液,于4℃保存。
将冻存于-80℃的菌株E.coli LM392涂布在LB培养基上复苏。包装反应前一天,挑取单克隆接种于LB培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mM MgSO4),37℃振荡培养过夜,包装反应当天,取5mL过夜培养的菌液加入到50mL新鲜的LB培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mM MgSO4),37℃,200rpm振荡至培养物OD600达到0.8-1时,4℃保存备用,得宿主菌液。取100μL如上处理的宿主菌液和100μL适度稀释的包装液轻轻混匀,于37℃温浴15分钟,然后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上,37℃培养过夜。将长出来的单个克隆子,用无菌牙签点种于23块含以上上述抗生素的LB培养基的96孔板上,37℃培养过夜,加入终浓度为20%的甘油,混合均匀,置于-80℃保存。
实施例3
从格瑞克霉素和P-1894B产生菌链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因组文库中筛选含有格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因的阳性克隆子:
通过分析格瑞克霉素和P-1894B的结构以及相关文献的报道,用2,3-脱水酶基因做筛选引物(表2)进行PCR来筛选,从2300个克隆子中得到10个阳性克隆子,确定包含格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的阳性克隆,并进行测序,其中的一个包含有整个格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的阳性克隆—cosmid179F,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第3722~40612位的碱基序列所示。
表2:文库筛选引物
实施例4
将包含有整个格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的cosmid179F在异源宿主链霉菌S.coelicolor中进行表达:
利用同源重组的原理,选取了包全了格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的质粒cosmid179F,首先将这个cosmid179F转化到大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coliBW25113/pIJ790/179F,再制备感受态细胞E.coli BW25113/pIJ790/179F。同时将BamH I/EcoRI完全酶切质粒pSET152AB后,回收5.5kb左右片段,溶解于ddH2O中。从中取大约100ng片段加到E.coli BW25113/pIJ790/179F感受态细胞中,转入电击杯中,1.4kv电压进行电转化。电击完成后迅速加入预冷的0.5mL的LB培养基,37℃复苏1h后涂布于LB+100μg/mL Amp+50μg/mL Ap r平板。12h后待转化子长出后,通过2,3-脱水酶基因筛选引物(表2)PCR验证阳性的重组质粒,阳性重组质粒命名为179F-pSET152AB。将构建好的重组质粒电转到E.coli ET12567/pUZ8002中,构建成E.coli ET12567/pUZ8002/179F-pSET152AB作为接合转移的供体菌。
将含有cosmid179F-pSET152AB的转化菌株E.coli ET12567/pUZ8002/179F-pSET152AB接种于3mL的LB+100μg/mL Amp+50μg/mL Apr+25μg/mL Cm+50μg/mL Kan液体培养基中,37℃培养12h后,取40μL菌液转接于4mL相同培养基中培养至OD为0.6,离心收集菌体,用不含任何抗生素的LB液体培养基洗涤2次,洗去抗生素,离心浓缩菌体,备用。与此同时,10%甘油收集S.coelicolor孢子,经过滤器过滤后,3600rpm离心8min,弃上清,加入适量LB培养基悬浮孢子,置于50℃水浴中热激10分钟。将转化菌株E.coli ET12567/pUZ8002/179F-pSET152AB与S.coelicolor孢子按照体积比2:1比例混合,涂布于M-ISP4+MgCl2(终浓度为10mmol/L)固体平板上(M-ISP4:可溶性淀粉10g,K2HPO41.0g,MgSO4·7H2O1.0g,NaCl1.0g,蛋白胨1.0g,酵母粉0.5g,(NH4)2SO42.0g,CaCO32.0g,Trace salt0.1mL,海盐30g,H2O1000mL,pH7.2~7.4)。20~24h后,用1mLH2O+30μL100μg/mL Tmp+20μL50μg/mL Apr进行药物覆盖。大约在30℃培养2~3天后即可看到接合转移子,该接合转移子即为转入cosmid179F的链霉菌S.coelicolor,命名为重组菌株S.coelicolor/179F-pSET152AB。
接合转移子—重组菌株S.coelicolor/179F-pSET152AB在M-ISP4+50μg/mL Apr平板上培养4~6d后,挑取适量菌丝体分别接种入50mL Am2种子培养基(豆粉0.5%,酵母粉0.5%,可溶性淀粉2%,细菌学蛋白胨0.2%,海盐3%,碳酸钙0.2%,余量为水,pH7.2~7.4),在温度为28℃,转速为200rpm的摇床上摇瓶1.5天后分别取5ml菌液转接到50ml RA发酵培养基(葡萄糖10g、麦芽粉10g、玉米粉5g、淀粉20g、麦芽糖10g、微量盐100ul、30g海盐,余量为水,PH7.2-7.4)中继续发酵培养2-3天,得到发酵产物。发酵产物加入等体积的丁酮,超声15min破碎细胞,然后静置分层。将丁酮萃取液与水相分离,用旋转蒸发仪将丁酮蒸干,残留物溶解于甲醇形成样品,进行HPLC检测。HPLC分析条件为:使用Prodigy ODS(2)(150×4.6mm,5μ)分析柱;A相组成为15%乙腈-85%水-0.1%甲酸,B相组成为85%乙腈-15%水-0.1%甲酸。流速为1ml/min,HPLC分析的检测波长为440nm。HPLC走样程序:0-20min,20%-100%B相;20-28min,100%B相;28-28.01min,100%-20%B相;28.01-32min,20%-20%B相。结果如图3所示,从图3可以看出,野生型的S.coelicolor(其发酵程序同重组菌株S.coelicolor/179F-pSET152AB)不能产生化合物P-1894B,而重组菌株S.coelicolor/179F-pSET152AB能够产生化合物P-1894B。
实施例5
格瑞克霉素和P-1894B产生菌链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32遗传转移系统的建立及gcnQ基因中断突变菌株的获得,以敲除FAD/FMN依赖型脱氢酶基因gcnQ而获得的突变菌株△gcnQ为例:
首先根据获得的gcnQ基因的序列,设计一对灭活引物(表3)。引物的5’端39bp大写字母部分序列与gcnQ基因相匹配,而3’端小写字母部分的序列分别与pIJ773中包含转移起始序列oriT和阿泊拉抗性基因aac(3)IV的DNA片段两侧的序列相匹配。然后参照PCR-targeting系统的要求准备接合转移体系的大肠杆菌供体菌,步骤如下:(1)将阳性克隆cosmid179F转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/179F,于28℃添加终浓度为10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统,并将该菌制备成为电转感受态细胞。(2)用EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773,回收1.4kb含有转移原点oriT和阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV的DNA片段,以此DNA片段作为PCR模板,用表3所示的gcnQdel F和R作为引物扩增出1.4kb的PCR产物,50uL反应体系:5×Buffer10uL,高保真DNA聚合酶fast pfu3U,dNTPs0.5mmol/L,DMSO3u L,引物gcnQdel F和R各0.5umol/L,DNA模板约1ng,加水至50uL。PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性50s,59℃退火1min,72℃延伸90s,30个循环;72℃延伸10min。最后将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将纯化后的1.4kb的PCR产物电转入E.coli BW25113/pIJ790/179F的感受态细胞使其发生重组,在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素,50mg/L卡那霉素,50mg/L阿泊拉霉素)上于37℃过夜培养,从平板上挑出阳性单菌落,抽提质粒,并命名为pJu4007,这个质粒中的gcnQ基因的部分片段被oriT和aac(3)IV取代。(4)将构建好的重组载体pJu4007电转到E.coli ET12567/pUZ8002中,构建成E.coliET12567/pUZ8002/pJu4007作为接合转移的供体菌。
用竹签蘸取Streptomyces lusitanus SCSIO LR32孢子液,在M-ISP4平板上划线28℃培养孢子6-8d,待孢子长出来后,用棉签将孢子和菌丝体刮到10%甘油里,涡旋2-4分钟,让孢子和菌丝体分开;用孢子过滤器过滤得到孢子悬液,离心去上清甘油;用1ml TSB培养液将孢子悬浮起来,在50℃水浴锅中热激10min,然后接入50mL TSB中,放入28℃摇床培养4-5小时,让孢子萌发,离心收集孢子,加入1-2ml LB将孢子悬浮起来,作为接合转移的受体菌。将供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/pJu4007接种在50mL含100mg/L氨苄青霉素,25mg/L卡那霉素,25mg/L氯霉素和50mg/L阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.6时,离心收集菌体,用LB洗涤菌体两次,加入1-2mL LB将菌株悬浮起来,作为接合转移的供体菌。将上述受体菌和供体菌各取250uL混合均匀涂布于不含任何抗生素但添加了10mmol/L MgSO4的M-ISP4固体培养基上,吹干后,置于30℃培养20-24h。将平板取出后,使用终浓度为50mg/L阿泊拉霉素和50mg/L甲氧苄氨嘧啶的无菌水覆盖平板,吹干后置于30℃培养箱中,培养3d后观察。
当接合转移平板上长出小菌落后,用无菌牙签将其转接到含有35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的M-ISP4平板上,28℃培养2-3天后,抽取突变株△gcnQ的基因组DNA,利用检测引物(引物序列见于表4中的gcnQ的检测引物序列)通过PCR检测获得阳性克隆,即获得FAD/FMN依赖型脱氢酶基因gcnQ敲除双交换突变菌株(△gcnQ)。
表3:构建突变株所需的灭活引物名称和序列
表4:构建突变株所需的检测引物名称和序列
实施例6
格瑞克霉素和P-1894B的生物发酵与检测:
将链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32野生菌或突变株△gcnQ活化后,按5%的接种量分别接入到250mL三角瓶的50mL Am2液体培养基(豆粉0.5%,酵母粉0.5%,可溶性淀粉2%,细菌学蛋白胨0.2%,海盐3%,碳酸钙0.2%,余量为水,pH7.2~7.4),在温度为28℃,转速为200rpm的摇床上摇瓶1.5天后转接到50ml RA液体培养基(葡萄糖10g、麦芽粉10g、玉米粉5g、淀粉20g、麦芽糖10g、微量盐100ul、30g海盐,余量为水,PH7.2-7.4)中继续发酵培养5天后,加入等体积的丁酮,超声15min破碎细胞,然后静置分层。将丁酮萃取液与水相分离,用旋转蒸发仪将丁酮蒸干,残留物溶解于甲醇形成样品,进行HPLC检测,检测条件为:Phenomex C184.6×150mm反相柱,流动相A相为15%乙腈,含0.1%乙酸,流动相B相为85%乙腈,含0.1%乙酸;流速为1mL/min,检测波长为440nm。HPLC程序:0-20min,20%-100%B相;20-28min,100%B相;28-28.01min,100%-20%B相;28.01-32min,20%-20%B相。
检测结果如图4所示,从图4可以看出gcnQ基因失活的突变株△gcnQ不能产生格瑞克霉素,而野生型Streptomyces lusitanus SCSIO LR32能够产生格瑞克霉素。
在突变株△gcnQ的发酵培养物中分离纯化到新的结构中间体1a、2a、3a,其具体结构如图5所示,新的化合物1a、2a、3a的核磁共振谱和高分辨质谱如图8和图9所示。
实施例7
gcnQ在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化:
将gcnQ基因按照常规方法克隆至载体pET28a(+)的NdeI和HindIII位点之间以得到pET28a(+)/gcnQ,然后转化至E.coli BL21(DE3)以表达。将得到的转化菌株挑取单克隆过夜培养后按1%的接种量接入到250mL三角瓶的50mL LB培养液体,于28℃摇床180r/min培养至OD600约为0.6时,往培养液中加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。于28℃诱导表达7-8h。离心收集菌体,用50mL binding buffer洗涤菌体2遍后,重悬于30mL1×binding buffer中,进行超声波破碎以释放蛋白,然后高速冷冻低温离心除去不溶部分。取稍许上清100℃煮沸,离心后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测GcnQ蛋白的表达,分离胶浓度为12%,从DSS-PAGE图谱可以看出GcnQ蛋白可溶,大小是58.7KDa(如图6)。
将可溶性上清部分上样到镍柱HisTrap HT column(1mL,GE Healthcare)上,待滤液全部过滤完后,用wash buffer冲洗两次,每次3mL。然后用2.5ml elution buffer洗脱。用Vivaspin(20mL,10kD)浓缩至2.5mL,经PD-10脱盐柱(GE Healthcare)脱盐后,溶解于含10%甘油的Tris-HCl缓冲液(50mM,pH8.0),采用Bradford方法测定蛋白浓度为36.4μM,分装保存于-80℃备用,由此得到纯化的FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ。
实施例8
FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ体外生化反应及产物鉴定:
采用Tris-HCl缓冲液(50mM,pH7.5),1mmol/L底物和0.15μmol/L FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ进行50μL酶促反应,三种底物(1a,2a,3a)在30℃条件下反应,由于有的底物得到的反应产物不只一个,所以通过不同的反应时间,做反应时间曲线来观察反应的动态变化。反应后用乙酸乙酯进行萃取,蒸干后用甲醇溶解,然后利用HPLC进行分析。检测酶促反应情况,分析条件为:使用Prodigy ODS(2)(150×4.6mm,5μ)分析柱;A相组成为15%乙腈-85%水-0.1%甲酸,B相组成为85%乙腈-15%水-0.1%甲酸。流速为1ml/min,HPLC分析的检测波长为390nm。对于底物1a和2a,HPLC走样程序:0-15min,20%-100%B相;15-20min,100%B相;20-21min,100%B相;21.1-27min,20%-20%B相。对于底物3a,HPLC走样程序:0-20min,20%-100%B相;20-28min,100%B相;28-28.01min,100%-20%B相;28.01-32min,20%-20%B相。
获得的酶催化反应中间体及终产物利用核磁共振及高分辨质谱等手段来对产物进行结构鉴定。其结果如图7、8、9、10所示,化合物1a在FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ的催化反应下先得到中间产物1c,然后得到终产物1b。化合物2a在FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ的催化反应下,先得到中间产物2c,然后得到终产物2b。化合物3a在FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ催化反应下得到中间产物3c。由此可见gcnQ基因的功能是催化末端糖基的脱氢化作用。
Claims (10)
1.一种格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇,其特征在于,该格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3722~40612位的碱基序列所示。
2.权利要求1所述的格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇在制备格瑞克霉素或/和P-1894B及其类似物中的应用。
3.如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在制备化合物P-1894B中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,是将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转入链霉菌S.coelicolor中异源表达产生化合物P-1894B。
5.一种FAD/FMN依赖型脱氢酶的编码基因gcnQ,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ IDNO.1的第34148-35737位碱基所示。
6.一种权利要求5所述的FAD/FMN依赖型脱氢酶的编码基因gcnQ编码的FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ。
7.权利要求6所述的FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ在催化脱氧糖L-玫红糖末端糖基脱氢氧化成L-aculose中的应用。
8.权利要求6所述的FAD/FMN依赖型脱氢酶GcnQ在催化化合物1a产生化合物1c和/或化合物1b中的应用,所述的化合物1a其结构如式1a所示,所述的化合物1c其结构如式1c所示,所示的化合物1b即为P-1894B;
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