CN108841769A - 一种非达霉素基因工程菌及构建方法和应用 - Google Patents
一种非达霉素基因工程菌及构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产非达霉素的基因工程菌德干高原游动放线菌YP‑2(Actinoplanes deccanensis YP‑2)及构建方法，通过将非达霉素生物合成正调控基因导入出发菌德干高原游动放线菌YP‑1中，筛选得到高产非达霉素的基因工程菌德干高原游动放线菌YP‑2，产量比出发菌提高了400％～500％，高达130mg/L，具有很好的应用前景。本发明方法高效、准确、操作方便，为放线菌药物高效生物合成途径的构建提供了一种新的研究手段。所述的非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP‑2可在制备治疗艰难梭菌感染引起的腹泻药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药领域，涉及一种高产非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌 YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)及其构建方法与应用。
背景技术
临床上抗生素的大量使用，导致病原菌产生耐药性，更为严重的是细菌还能有效扩散耐药性基因信息，多种类别抗生素耐药的病原菌比例不断增加，对临床治疗产生了较大负面影响。艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)是由一种革兰氏阳性芽孢杆菌难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)过度生长并释放毒素引起的，可导致结肠炎症、严重腹泻甚至死亡。以往资料显示，CDI主要影响老年人、长期住院和重症监护室的患者，近年来健康人群及儿童感染的病例报道逐渐增多。治疗CDI的首选药物是万古霉素和甲硝唑，但随着耐药菌株逐渐出现，寻找更加有效的治疗药物成为近年来的主要研究目标。
非达霉素(fidaxomicin)，又称为台勾霉素(Tiacumicin又称Lipiarmycin A3，OPT-80， PAR-101)，是一种可口服给药的新型大环内酯类抗生素，原研厂Optimer公司于2011年5月获FDA批准上市，但中国至今未有该药品获CFDA批准上市。临床研究表明：与口服万古霉素相比，非达霉素的疗效优于万古霉素，用药后对艰难梭菌有很强的抑制作用，并能有效降低艰难梭菌感染的复发率。
发明内容
本发明的目的是提供一种非达霉素工程菌德干高原游动放线菌YP-2，分类命名为： Actinoplanes deccanensis YP-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCC No.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的另一个目的是提供所述非达霉素工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)的构建方法，包括将非达霉素生物合成正调控基因导入出发菌，筛选得到高产非达霉素的德干高原游动放线菌基因工程菌株(Actinoplanesdeccanensis YP-2)。
本发明构建方法具体步骤如下：
(1)设计特异性引物扩增SEQ ID NO.1序列并回收，
上游引物SEQ ID NO.3：aagatctgcccagcatatgaactgttgaaagttgttta
下游引物SEQ ID NO.4：ccaagatctgcccagcatatgtcaggcggaatccgccatg；
(2)步骤1中回收的片段酶切插入表达载体pIJ8630上得到质粒pIJ8630-ermE*-fadR1，并验证；
(3)步骤2中获得的质粒通过化转导入大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002中；
(4)通过双亲本接合转导将步骤2中的质粒转入出发菌德干高原游动放线菌(Actinoplanes deccanensis)YP-1中；德干高原游动放线菌YP-1购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏号为：CGMCC No.4.2098，分类命名：德干高原游动放线菌(Actinoplanes deccanensis)，保藏日期：2001年8月16日；
(5)通过发酵获筛选得到高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)，产量高达130mg/L，比出发菌高400％～500％，所述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：Actinoplanesdeccanensis YP-2，保藏号：CGMCC No.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述方法中，步骤2-4将SEQ ID NO.1的序列插入质粒pIJ8630导入到出发菌德干高原游动放线菌YP-1。
其中，步骤1中SEQ ID NO.1由3063个核苷酸组成，第1-19位为NdeI识别位点和保护碱基，第20-297位为红霉素抗性基因启动子，第297-3042为非达霉素生物合成正调控基因的编码序列，第3043-3063位为NdeI识别位点和保护碱基，SEQ ID NO.2为非达霉素生物合成正调控基因的氨基酸序列。
上述方法中，步骤2将所述的SEQ ID NO.1序列片段经过NdeI酶切后插入表达载体上pIJ8630上，启动子为含红霉素抗性基因启动子；步骤3-4将表达载体利用大肠杆菌进行双亲接合获得所述的高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanesdeccanensis YP-2)。
上述方法中，步骤4所述作为出发菌为德干高原游动放线菌(Actinoplanesdeccanensis) YP-1，步骤3所述大肠杆菌为E.coil ET12567(pUZ8002)。
上述方法中，经筛选得到的高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)产量比出发出发菌高400％～500％，高达130mg/L。
本发明的再一个目的是提供所述非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)在制备治疗艰难梭菌感染引起的腹泻药物中的应用。
本发明人从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)购买了一株产非达霉素的出发菌游动放线菌，但该菌株产非达霉素低，不适合工业应用。本发明所述的高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensisYP-2)，经过发酵可大量生产治疗艰难梭菌感染引起腹泻的药物非达霉素，其产量比出发菌提高了400％～500％，高达130mg/L，具有很好的应用前景，可推进非达霉素产业化开发。
本发明的优点是：
(1)本发明通过体内过表达非达霉素生物合成正调控基因，获得了高产非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)，不需进行体外表达，从而克服了有些蛋白在体外难以表达，表达后无活性或活性较低等问题，操作快捷方便；不需准备体外反应底物，避免了有些底物难以制备或购买的问题；不需摸索体外反应条件，简化流程。
(2)本发明所构建的高产非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)产量比出发菌提高了400％～500％，高达130mg/L，大大降低了非达霉素的生成成本，为工业生产提高非达霉素发酵产量提供技术支持。
本发明通过体内基因工程改造，理性优化非达霉素的生物合成，获得了高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)，该方法高效、准确、操作方便，为放线菌药物高效生物合成途径的构建提供了一种新的研究手段。所述的非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)可在制备治疗艰难梭菌感染引起的腹泻药物中的应用。
附图说明
图1是高表达质粒构建图。
图2是德干高原游动放线菌YP-1和德干高原游动放线菌YP-2在发酵过程中生物量曲线。
图3是德干高原游动放线菌YP-1和德干高原游动放线菌YP-2在发酵过程中非达霉素产量。
图4是德干高原游动放线菌YP-2的生长表型。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中所使用的培养基：
(1)ISP4固体培养基：可溶性淀粉1％、MgSO4.7H2O 0.1％ K2HPO4 0.1％、NaCl 0.1％、(NH4)2SO4 0.2％、CaCO3 0.2％、FeSO4.7H2O 0.0001％、MnCl 0.0001％琼脂2％，pH7.0。
(2)2×YT液体培养基：蛋白胨1.6％，酵母提取物1％，NaCl 0.5％。
(3)种子培养基：葡萄糖1.75％，蛋白胨1.5％，NaCl 1.0％，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，pH自然。
(4)发酵培养基B：酵母提取物0.3％，蛋白胨0.5％，麦芽提取物0.3％，葡萄糖1％，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，pH自然。
(5)MS固体培养基：甘露醇2％，黄豆粉2％，琼脂糖2％，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，10mM MgCl2，pH自然。
实施例1构建高产非达霉素的基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)
一、途径特异性基因表达载体pIJ8630-ermE*-fadR1的构建
本实施例构建的非达霉素生物合成正调控基因的表达载体名称为pIJ8630-ermE*-fadR1，该载体含有非达霉素生物合成的正调控基因fadR1.非达霉素生物合成正调控基因fadR1的序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1由3063个核苷酸组成，第1-19位为NdeI识别位点和保护碱基，第20-297位为红霉素抗性基因启动子，第297-3042为非达霉素生物合成正调控基因的编码序列，第3043-3063位为NdeI识别位点和保护碱基，SEQ ID NO.2为非达霉素生物合成正调控基因的氨基酸序列。
pIJ8630-ermE*-fadR1的构建方法如下：
(1)设计特异性引物扩增SEQ ID NO.1序列并回收；
上游引物SEQ ID NO.3：aagatctgcccagcatatgaactgttgaaagttgttta
下游引物SEQ ID NO.4：ccaagatctgcccagcatatgtcaggcggaatccgccatg。
(2)将步骤(1)中回收的两端带有NdeI酶切位点的SEQ ID NO.1片段经过NdeI单酶切后与经过相同酶切的表达载体pIJ8630连接，得到重组表达载体pIJ8630-ermE*-fadR1(酶切验证图1)。
二、将pIJ8630-ermE*-fadR1表达载体导入出发菌德干高原游动放线菌(Actinoplanes deccanensis)YP-1得到高产非达霉素的基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)，具体方法如下。
(1)通过热激法将pIJ8630-ermE*-fadR1载体转化进入去甲基化的出发大肠杆菌E.coil ET1256/(pUZ8002中，得到重组菌E.coil ET12567/pUZ8002/pIJ8630-ermE*-fadR1。
(2)将E.coil ET1256/(pUZ8002/pIJ8630-ermE*-fadR1接种到5ml LB液体培养基(含氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素)中，37℃培养至OD600为0.6，离心收集菌体，用10ml LB液体培养基洗涤两次，用0.5ml的2×YT液体培养基重悬；将德干高原游动放线菌YP-1(Actinoplanes deccanensis YP-1)在2×YT液体培养中培养36h，取200μl菌丝体用10mlLB 液体培养基洗涤两次，用0.5ml的2×YT液体培养基重悬；将上述的大肠杆菌和游动放线菌菌丝体混合后均匀涂在MS固体培养基上，30℃培养16小时后，加入20μg/ml的萘啶酸和阿泊拉霉素，30℃继续培养4-5天；将上述得到的转化子在含有阿泊拉霉素的斜面培养基上培养4-5天，通过PCR方法确证目标DNA序列已经融合在德干高原游动放线菌(Actinoplanesdeccanensis)YP-1中，并通过发酵筛选得到高产非达霉素的基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)。
(3)本发明所提供的德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，分类命名：Actinoplanes deccanensis YP-2，保藏号：CGMCC No.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2出发菌和基因工程菌株合成非达霉素发酵验证。
(1)将出发菌德干高原游动放线菌(Actinoplanes deccanensis)YP-1和基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)在ISP4固体培养基上培养10天。
(2)在德干高原游动放线菌YP-1和德干高原游动放线菌YP-2培养的ISP4固体培养基上，各取1cm×1cm左右的菌块，接种到种子培养基中，30℃培养16小时，转速200rpm；将种子培养基中的菌丝体接种至发酵培养基B中至OD600为0.15，30℃培养168小时，在培养12、24、48、72、96、120小时后分别取样测定菌体生物量、非达霉素产量。实验重复三次。
实施例3基因工程菌株和出发菌生物量、非达霉素产量对比验证
(1)菌体生物量：取1ml通过发酵培养基B发酵的菌液，离心后收集菌体，用1ml无菌水洗涤后再次离心后收集菌体，50℃烘干3天后称重，图2为游动放线菌YP-1和游动放线菌YP-2生物量曲线。
(2)非达霉素标准曲线：将非达霉素标准品用甲醇配成一定浓度梯度的溶液，通过HPLC 进行测定。HPLC条件：色谱柱：C18柱子(Aglient，Eclipse Plus XDB，5um，4.6mm*250mm)；检测波长：254nm；流速：1.00mL/min；进样量：10ul；实验流动相：流动相A相为10％乙腈，含0.08％三氟乙酸(TFA)，流动相B相为90％乙腈；HPLC走样程序：0-20min，30％-100％ B相；20-25min，100％B相；25-30min，100％-30％B相。
(3)非达霉素产量分析：将通过发酵获得的1ml发酵液加入9mL甲醇，充分振荡后，12000rpm/min离心10min沉降菌丝体及固形物，上清液稀释10倍后用0.45um的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液，所得的样品用于HPLC检测。检测条件同上述测定非达霉素标准曲线条件。图3为德干高原游动放线菌YP-1和德干高原游动放线菌YP-2非达霉素产量曲线。
(4)发酵结果显示，基因工程菌株和出发菌的生长曲线没有太大差异，但基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis YP-2)在发酵中的非达霉素产量比出发菌提高了400％～500％，高达130mg/L，而非达霉素能够很好地治疗艰难梭菌感染引起的腹泻，因此本发明所述的基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanesdeccanensis YP-2) 具有很好的应用前景。
实施例4基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2菌体形态特征
菌株德干高原游动放线菌YP-2在ISP4琼脂培养基培养10天，基内菌丝和气生菌丝发育良好(图4)。在各种不同的培养基中的表观特征，结果见表1；德干高原游动放线菌YP-2 的生理生化特性见表2。
表1：德干高原游动放线菌YP-2的培养特性：
| 培养基 | 生长情况 | 基内菌丝 | 气生菌丝 | 可溶性色素 |
| 酵母精麦芽精琼脂 | 极丰富 | 浅橙色 | 无 | 无 |
| 燕麦粉琼脂 | 稀疏 | 浅琥珀色 | 无 | 无 |
| 无机盐淀粉琼脂 | 丰富 | 橙色 | 无 | 无 |
| 苹果酸钙琼脂 | 稀疏 | 浅橙色 | 无 | 无 |
| 甘油天冬素琼脂 | 丰富 | 橙色 | 无 | 无 |
| 葡糖天冬素琼脂 | 稀疏 | 浅橙色 | 无 | 无 |
| 酪氨酸琼脂 | 浅橙色 | 无 | 无 | 褐色 |
表2：德干高原游动放线菌YP-2的生理生化特性：
| 特性 | 结果 | 特性 | 结果 |
| 生长pH范围 | 碳源利用 | ||
| pH＜4 | － | D-葡萄糖 | + |
| pH＝5～11 | + | D-果糖 | — |
| pH＝12 | W | 甘露糖 | + |
| NaCl耐受性 | 蔗糖 | + | |
| 3％NaCl | + | 乳糖 | + |
| 5％NaCl | W | 肌醇 | — |
| 7％NaCl | － | D-甘露醇 | — |
| 生长温度 | 阿拉伯糖 | + | |
| 37℃ | + | 木糖 | + |
| 45℃ | － | 鼠李糖 | + |
| 黑色素产生 | － | 醋酸钠 | － |
| 硝酸盐还原 | + | 棉子糖 | － |
| 淀粉水解 | + | － | |
| 明胶液化 | + | ||
| 纤维素分解 | — |
注：“W”表示弱阳性结果，“+”表示阳性结果，“－”表示阴性结果。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种非达霉素基因工程菌及构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3063
<212> DNA
<213> 德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis )
<400> 1
aagatctgcc cagcatatga actgttgaaa gttgtttagc aaaacctcat acagaaaatt 60
catttactaa cgtctggaaa gacgacaaaa ctttagatcc tcgagatccg gcggcttgcg 120
cccgatgcta gtcgcggttg atcggcgatc gcaggtgcac gcggtcgatc ttgacggctg 180
gcgagaggtg cggggaggat ctgaccgacg cggtccacac gtggcaccgc gatgctgttg 240
tgggcacaat cgtgccggtt ggtaggatct gactgagtga ccaaaggagg cggacatatg 300
tccatggcgc tgacggagcg aacgaacgaa ctgtttgtcc tcgacgaaat gctgtcggca 360
tgcagaagcg gagtgggtca actggctctg atcagcgggc cggtcggctg tggaaagacg 420
gaagtgctgg acgcgttcgc ggatcgggcg gtgcgggccg gcgcgcttct tttcagcgcc 480
accgcgaaaa gatccggtgc cgaggtgccg tacgacgttc tggtgcagct gttcggcgcc 540
ggcacggcac ccgggcggct ccgggcgcag atggacaagt tcgtggacgc ggacctggcc 600
gacccctccg gtacgcaggc gttgcgcatc ctctacgccg agttgctggc ctggaccgct 660
gaccgccccg tggtgatcct ggtcgacgac gtccagtgcg ccgatcacga gtccctgcgg 720
gagctgctcg acctggtctc gcggttgcgg cgggcctcgg cgctgctcgt cttcacccag 780
tccgacgacg agaacgcggc gaccgcgctg gtgcgggccg agttgctgag gcaccaccac 840
tggcggcgca tcgacctcac cctgctgtcg gtcgagggcg tcgcggcgct ggtgcgcgca 900
cagacggacc cggcccgcct gccgctgtcc gccgcggaga tccatcggct cagcggaggc 960
aacccgttgc tggtgcgtgc tctgctcgac gacgtgcgca cggcggatcc gcgccggccc 1020
gacagtgcgt tcgggcaggc tctgcttgcc tgtttgcacc gaagctcgcc ggagacgctg 1080
gcagtcgcgc gcggtatcgc ggtcctgggc cggcccaccg gcgtcccgct cctggccgat 1140
ctcgtcgagc tcggccagga gcagacccgg accgcgctgc gccggcttga gtcggccggt 1200
ctggtgaccg gcggagactt ccgcaacccg gcgggcgggg ccgccgtcct ggcggagctg 1260
cgccccgagg agcggagccg gctgcaccag cgcgccgccg agctgctgta cctccagggc 1320
gcctcggcct cgacggtggc ccggcacctc ctccagacgg gggagacgcg gcagcggtgg 1380
acccagcggc tgctgcgcga ggccgccgag gtcgccaccg cgtccgacga cctcgacttc 1440
gccagcgact gcctcggcct ggcgctcgag agcagcccgg acgatcacga gcgcgcgacc 1500
gcgctcgccc ggttggccgg ggtcgtgtgg cggcgcaacc cggtcgccgc cgtacgccac 1560
gtctccctgc tgatcgagcc gtcgcgccgc gggctgctct ccgaccggca ggtcaccgcg 1620
gtggccaggt cgctggtatg gcacggcatg accggcgagg ccaaggaggt catcgaggcg 1680
acgggccgca tcggcgaggc gggcggcgag cggcgcgacg ccgagctcgg catgatccgg 1740
cggtggctgc ggtcgtggca tccgccgctg gccaagatgg tgaccggggc gccgcggcag 1800
ccggagacgc tggacgctgc ggatctcgcc gacgagcgcc tcctcggtgc ggcgctgctg 1860
tcggaggtgc tgacgcgtgg cgccgaggac gtcgtgcgcc gcgcggagga catcctgcgc 1920
ggctgtggga ccgaggtcga cgagtccacg ctggagcccg ccgagtcggc gctgctggcc 1980
ctgctctact ccgatcacgc ggaacgggcg ctcacctggt gcgatccgct gctcgcggcg 2040
gcgtcggaac gatacgcgcc gacgtggaac gcccggctcg aggccgtacg cggagagatc 2100
gcgctgtacc agggcgacct gcccaacgcc gagcgatact cccgcgccgc cctcgaccgg 2160
atcgccccgc gtggctgggg cgtggccgtg ggggcgccgc tggccacgta catccaggcg 2220
accacgatga tgggcgacct ggacgcggcg ggcgcctacg ccaaggcgcc ggtgccgcag 2280
gagatgttca agactcggtt cggcctgcgc tacctctacg cgcggggtct ctacctctcc 2340
gcgtgcgacc gctggcatgc cgccctgagc gacctgctca cctgtggcga gctggcctcg 2400
gaatgggaga tggacgtccc ctcgttcgtc ccgtggcgcg gcgccgccgc acggctgtac 2460
ctgaagctcg gggaccggga ccgcgcccag aagctcgccg gggcgcaatt gatacgtgcc 2520
aagcaagggc tgacccgtac ggccggcatc tcgctgcgtg cggtggccgc ctgcggtggc 2580
acgcgcgggc gcctgcaact gctgcgcgag gccgtcgatg tgctgcatgc ctccggcgac 2640
cgcttcgagc tggcctgcgc gctggccgac ctgcaccggg cgcatcaggc gacgggcgag 2700
cggcagcggg cgaacgcggt gttccagcag gctctccgcc tggccaccga gtgccgggcc 2760
gagccgctgc gccgggccct gttgcaccag tcctccgacg agcacgccga atcgatcgtg 2820
acgaaacagc ccaacggcgg gctggtgaag ctgagccggg ccgaacggcg ggtcaccgcc 2880
ctggcggcca ccgggcacac caaccgggag atcgcgcaga agctctacat caccgtgagc 2940
acggtcgagc agcacctcac gaaggcctac cgcaaactca atgtgaccaa tcgggccgac 3000
ctggcggcgg cctgcatgcc gaccatggcg gattccgcct gacatatgct gggcagatct 3060
tgg 3063
<210> 2
<211> 914
<212> PRT
<213> 德干高原游动放线菌YP-2(Actinoplanes deccanensis )
<400> 2
Met Ser Met Ala Leu Thr Glu Arg Thr Asn Glu Leu Phe Val Leu Asp
1 5 10 15
Glu Met Leu Ser Ala Cys Arg Ser Gly Val Gly Gln Leu Ala Leu Ile
20 25 30
Ser Gly Pro Val Gly Cys Gly Lys Thr Glu Val Leu Asp Ala Phe Ala
35 40 45
Asp Arg Ala Val Arg Ala Gly Ala Leu Leu Phe Ser Ala Thr Ala Lys
50 55 60
Arg Ser Gly Ala Glu Val Pro Tyr Asp Val Leu Val Gln Leu Phe Gly
65 70 75 80
Ala Gly Thr Ala Pro Gly Arg Leu Arg Ala Gln Met Asp Lys Phe Val
85 90 95
Asp Ala Asp Leu Ala Asp Pro Ser Gly Thr Gln Ala Leu Arg Ile Leu
100 105 110
Tyr Ala Glu Leu Leu Ala Trp Thr Ala Asp Arg Pro Val Val Ile Leu
115 120 125
Val Asp Asp Val Gln Cys Ala Asp His Glu Ser Leu Arg Glu Leu Leu
130 135 140
Asp Leu Val Ser Arg Leu Arg Arg Ala Ser Ala Leu Leu Val Phe Thr
145 150 155 160
Gln Ser Asp Asp Glu Asn Ala Ala Thr Ala Leu Val Arg Ala Glu Leu
165 170 175
Leu Arg His His His Trp Arg Arg Ile Asp Leu Thr Leu Leu Ser Val
180 185 190
Glu Gly Val Ala Ala Leu Val Arg Ala Gln Thr Asp Pro Ala Arg Leu
195 200 205
Pro Leu Ser Ala Ala Glu Ile His Arg Leu Ser Gly Gly Asn Pro Leu
210 215 220
Leu Val Arg Ala Leu Leu Asp Asp Val Arg Thr Ala Asp Pro Arg Arg
225 230 235 240
Pro Asp Ser Ala Phe Gly Gln Ala Leu Leu Ala Cys Leu His Arg Ser
245 250 255
Ser Pro Glu Thr Leu Ala Val Ala Arg Gly Ile Ala Val Leu Gly Arg
260 265 270
Pro Thr Gly Val Pro Leu Leu Ala Asp Leu Val Glu Leu Gly Gln Glu
275 280 285
Gln Thr Arg Thr Ala Leu Arg Arg Leu Glu Ser Ala Gly Leu Val Thr
290 295 300
Gly Gly Asp Phe Arg Asn Pro Ala Gly Gly Ala Ala Val Leu Ala Glu
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Glu Arg Ser Arg Leu His Gln Arg Ala Ala Glu Leu
325 330 335
Leu Tyr Leu Gln Gly Ala Ser Ala Ser Thr Val Ala Arg His Leu Leu
340 345 350
Gln Thr Gly Glu Thr Arg Gln Arg Trp Thr Gln Arg Leu Leu Arg Glu
355 360 365
Ala Ala Glu Val Ala Thr Ala Ser Asp Asp Leu Asp Phe Ala Ser Asp
370 375 380
Cys Leu Gly Leu Ala Leu Glu Ser Ser Pro Asp Asp His Glu Arg Ala
385 390 395 400
Thr Ala Leu Ala Arg Leu Ala Gly Val Val Trp Arg Arg Asn Pro Val
405 410 415
Ala Ala Val Arg His Val Ser Leu Leu Ile Glu Pro Ser Arg Arg Gly
420 425 430
Leu Leu Ser Asp Arg Gln Val Thr Ala Val Ala Arg Ser Leu Val Trp
435 440 445
His Gly Met Thr Gly Glu Ala Lys Glu Val Ile Glu Ala Thr Gly Arg
450 455 460
Ile Gly Glu Ala Gly Gly Glu Arg Arg Asp Ala Glu Leu Gly Met Ile
465 470 475 480
Arg Arg Trp Leu Arg Ser Trp His Pro Pro Leu Ala Lys Met Val Thr
485 490 495
Gly Ala Pro Arg Gln Pro Glu Thr Leu Asp Ala Ala Asp Leu Ala Asp
500 505 510
Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ser Glu Val Leu Thr Arg Gly
515 520 525
Ala Glu Asp Val Val Arg Arg Ala Glu Asp Ile Leu Arg Gly Cys Gly
530 535 540
Thr Glu Val Asp Glu Ser Thr Leu Glu Pro Ala Glu Ser Ala Leu Leu
545 550 555 560
Ala Leu Leu Tyr Ser Asp His Ala Glu Arg Ala Leu Thr Trp Cys Asp
565 570 575
Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ser Glu Arg Tyr Ala Pro Thr Trp Asn Ala
580 585 590
Arg Leu Glu Ala Val Arg Gly Glu Ile Ala Leu Tyr Gln Gly Asp Leu
595 600 605
Pro Asn Ala Glu Arg Tyr Ser Arg Ala Ala Leu Asp Arg Ile Ala Pro
610 615 620
Arg Gly Trp Gly Val Ala Val Gly Ala Pro Leu Ala Thr Tyr Ile Gln
625 630 635 640
Ala Thr Thr Met Met Gly Asp Leu Asp Ala Ala Gly Ala Tyr Ala Lys
645 650 655
Ala Pro Val Pro Gln Glu Met Phe Lys Thr Arg Phe Gly Leu Arg Tyr
660 665 670
Leu Tyr Ala Arg Gly Leu Tyr Leu Ser Ala Cys Asp Arg Trp His Ala
675 680 685
Ala Leu Ser Asp Leu Leu Thr Cys Gly Glu Leu Ala Ser Glu Trp Glu
690 695 700
Met Asp Val Pro Ser Phe Val Pro Trp Arg Gly Ala Ala Ala Arg Leu
705 710 715 720
Tyr Leu Lys Leu Gly Asp Arg Asp Arg Ala Gln Lys Leu Ala Gly Ala
725 730 735
Gln Leu Ile Arg Ala Lys Gln Gly Leu Thr Arg Thr Ala Gly Ile Ser
740 745 750
Leu Arg Ala Val Ala Ala Cys Gly Gly Thr Arg Gly Arg Leu Gln Leu
755 760 765
Leu Arg Glu Ala Val Asp Val Leu His Ala Ser Gly Asp Arg Phe Glu
770 775 780
Leu Ala Cys Ala Leu Ala Asp Leu His Arg Ala His Gln Ala Thr Gly
785 790 795 800
Glu Arg Gln Arg Ala Asn Ala Val Phe Gln Gln Ala Leu Arg Leu Ala
805 810 815
Thr Glu Cys Arg Ala Glu Pro Leu Arg Arg Ala Leu Leu His Gln Ser
820 825 830
Ser Asp Glu His Ala Glu Ser Ile Val Thr Lys Gln Pro Asn Gly Gly
835 840 845
Leu Val Lys Leu Ser Arg Ala Glu Arg Arg Val Thr Ala Leu Ala Ala
850 855 860
Thr Gly His Thr Asn Arg Glu Ile Ala Gln Lys Leu Tyr Ile Thr Val
865 870 875 880
Ser Thr Val Glu Gln His Leu Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Asn Val
885 890 895
Thr Asn Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ala Cys Met Pro Thr Met Ala Asp
900 905 910
Ser Ala
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
aagatctgcc cagcatatga actgttgaaa gttgttta 38
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
ccaagatctg cccagcatat gtcaggcgga atccgccatg 40
Claims (7)
1.一种非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌，分类命名为：德干高原游动放线菌YP-2（Actinoplanes deccanensis YP-2），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.15743，保藏日：2018年5月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种构建高产非达霉素基因工程菌的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将非达霉素生物合成的正调控基因导入出发菌德干高原游动放线菌YP-1中，筛选得到非达霉素产量高于出发菌的基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2（Actinoplanes deccanensis YP-2）；德干高原游动放线菌YP-1购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.4.2098，分类命名：德干高原游动放线菌（Actinoplanes deccanensis），保藏日期：2001年8月16日。
3.根据权利要求2所述的构建高产非达霉素基因工程菌的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）设计特异性引物扩增SEQ ID NO.1序列并回收；
上游引物SEQ ID NO.3：aagatctgcccagcatatgaactgttgaaagttgttta
下游引物SEQ ID NO.4：ccaagatctgcccagcatatgtcaggcggaatccgccatg
（2）步骤（1）中回收的片段酶切插入表达载体pIJ8630上得到质粒pIJ8630-ermE*-fadR1，并验证；
（3）步骤（2）中获得的质粒通过化转导入大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002中；
（4）通过双亲本接合转导将步骤（2）中的质粒转入出发菌德干高原游动放线菌YP-1中；
（5）通过发酵筛选得到高产非达霉素基因工程菌株德干高原游动放线菌YP-2，产量达130 mg/L。
4.根据权利要求3所述的构建高产非达霉素基因工程菌的方法，其特征在于，步骤（2）中将SEQ ID NO.1的序列插入质粒pIJ8630后导入到出发菌德干高原游动放线菌YP-1。
5.根据权利要求4所述的构建高产非达霉素基因工程菌的方法，其特征在于，SEQ IDNO.1由3063个核苷酸组成，第1-19位为NdeI识别位点和保护碱基，第20-297位为红霉素抗性基因启动子，第297-3042为非达霉素生物合成正调控基因的编码序列，第3043-3063位为NdeI识别位点和保护碱基，SEQ ID NO.2 为非达霉素生物合成正调控基因的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的构建高产非达霉素基因工程菌的方法，其特征在于，将所述的SEQ ID NO.1序列片段经过NdeI酶切后插入表达载体上pIJ8630上，启动子为含红霉素抗性基因启动子；将表达载体利用大肠杆菌进行双亲接合获得所述的高产非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2（Actinoplanes deccanensis YP-2）。
7.根据权利要求1所述的非达霉素基因工程菌德干高原游动放线菌YP-2（Actinoplanes deccanensis YP-2）在制备治疗艰难梭菌感染引起的腹泻药物中的应用。
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