CN110423790A - 一种抗真菌四霉素b定向高产的代谢工程方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法；采用对菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中制霉菌素生物合成基因簇聚酮合酶基因nysI的同框缺失技术，获得的基因突变菌株不仅实现了四霉素组分的定向生产，而且使四霉素B产量提高至167％。在此基础之上，通过对基因突变株进行加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，进一步使四霉素B的产量提高了9％，最终使四霉素B的产量提高至176％，为四霉素B的工业化定向高产奠定了基础。

Description

一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法
技术领域
本发明涉及一种生物工程与技术领域的方法，具体涉及一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法。
背景技术
多烯聚酮抗生素是链霉菌次级代谢产物中的一大类，因其具有较好的抑菌、抗真菌和杀虫等活性而日益被人们重视。该家族的化合物是在I型聚酮合酶作用下，通过线性的组装方式形成的化合物，该类型化合物具有很强的抗真菌活性，在农业和医药等研究领域具有重要的应用和研究价值。
刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123的次级代谢产物中含有四霉素和制霉菌素两种多烯类抗生素。四霉素是一种广谱、高效的抗真菌剂，主要用于植物病害防治，对多种植物病原菌具有较强的抑制和杀死作用。四霉素与制霉菌素在生物合成过程中均利用如乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A等作为聚酮链延伸单元的前体物质，由于制霉菌素对四霉素在生物合成过程中对底物造成的竞争性结合，导致野生型菌株中四霉素产量低下，采用传统的发酵工程手段无法满足四霉素工业化的应用与生产。四霉素包含四霉素A与四霉素B两种组分，四霉素B相比四霉素A具有更好的生物活性，在生物合成过程中四霉素A可以在P450单加氧酶tetrK的催化作用下转化成四霉素B，但野生型菌株中tetrK不能完全将四霉素A转化成四霉素B，导致生物效价低下，使其应用局限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过基因遗传工程的手段使得刺孢吸水链霉菌北京变种能够定向高产具有抗真菌活性的四霉素B的代谢工程方法。具体是通过基因遗传工程的手段在刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中，在对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失的基础上，加强表达四霉素生物合成基因簇后修饰基因tetrK，从而实现定向生产抗真菌四霉素B。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，所述方法包括如下步骤：
S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；
S2、在所述同框缺失突变菌株上加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，获得基因tetrK加强表达突变菌株；
S3、发酵培养所述基因nysI同框缺失突变菌株或基因tetrK加强表达突变菌株，实现定向生产抗真菌四霉素B。
上述方法最终使该菌能够定向生产单一组分的多烯类抗生素四霉素，并且使四霉素A能够更多地转化成抗真菌活性更佳的四霉素B。
步骤S1具体包括步骤如下：
A1、构建用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒pJQK503；
A2、将所述质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；
A3、通过对步骤A2获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失突变菌株SY02。
所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII双酶切位点间，分别插入经测序正确的左右同源臂片段ΔNys-L与ΔNys-R；且同源臂片段ΔNys-L是插入XbaI/BspTI酶切位点之间，同源臂片段ΔNys-R是插入BspTI/HindIII酶切位点之间。
上述同源臂片段ΔNys-L的序列如SEQ ID NO.5所示；同源臂片段ΔNys-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
步骤S2具体包括步骤如下：
B1、构建用于加强基因tetrK表达的整合型质粒pJQK509；
B2、将所述质粒pJQK509通过大肠杆菌与链霉菌间属间接合转移导入受体菌基因nysI同框缺失突变菌株中；
B3、通过对步骤B2获得的突变菌株进行阿伯拉霉素抗性验证及PCR验证筛选得到基因tetrK加强表达突变菌株SY03。
所述质粒pJQK509的构建是在质粒pSET152-KasOp*的BglII/NotI双酶切位点间插入经测序正确的基因tetrK。
所述基因tetrK序列如SEQ ID NO.11所示。
步骤S3中，所述发酵培养是将菌株的菌丝体在种子培养基中以30℃，220rpm转速下，培养24h后，按5％接种量转接于发酵培养基中，然后以220rpm转速在30℃培养箱中发酵培养5天。
所述种子培养基配方为Oxoid胰胨豆汤粉30g、蔗糖103g、Difco酵母膏5g、加蒸馏水定容至1L；所述发酵培养基配方为玉米粉10g、可溶性淀粉20g、黄豆饼粉10g、KH2PO40.2g、NaCl 3g、NH4Cl 3g、CaCO3 4g、加蒸馏水定容至1L，并用1M氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
本发明还涉及一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，所述突变菌株为：在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得的基因nysI同框缺失突变菌株。获得的基因nysI同框缺失突变菌株SY02，经发酵验证SY02中不再产生制霉菌素，只定向生产四霉素，且四霉素B含量提高至167％。
本发明还涉及一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，所述突变菌株为：在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；在所述同框缺失突变菌株上加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，获得的基因tetrK加强表达突变菌株。获得的基因tetrK加强表达突变菌株SY03，经发酵验证SY03中四霉素B产量进一步提高至176％。
为使四霉素B产生菌能够定向生产四霉素B，进一步提高农抗120的生物效价，本发明采用基因遗传工程的方法，在刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中，首先对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行了同框缺失，获得突变菌株SY02；再在突变菌株SY02的基础上，加强表达四霉素生物合成基因簇后修饰基因tetrK，获得突变菌株SY03，最终实现了四霉素B的定向高效生产。
本发明中的突变菌株SY02是刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinosus var.beijingnsis)，已经于2019年7月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNO.18241。
本发明中的突变菌株SY03是刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinosus var.beijingnsis)，已经于2019年7月17保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.18242。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明可以使菌株SY02不再产生制霉菌素而定向生产四霉素，且在菌株SY02中四霉素B的产量提高至167％，从而使得刺孢吸水链霉菌北京变种突变菌株SY02可以生产出特定的单一组分的多烯类抗生素四霉素；
2)本发明可以使基因工程菌株刺孢吸水链霉菌北京变种SY02中四霉素A进一步转化为抗真菌活性更佳的四霉素B，并使四霉素B的产量进一步提高了9％，最终实现在菌株SY03中四霉素B的产量提高至176％，为四霉素B的工业化定向高产奠定了基础。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为用于nysI基因同框缺失重组质粒pJQK503构建示意图；
图2为同框缺失突变菌株SY02PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；
图3为用于加强tetrK基因表达的整合型质粒pJQK509构建示意图；
图4为整合型质粒pJQK509PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；
图5为野生型刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123发酵产物HPLC检测示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
实施例
本实施例涉及一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，具体包括如下步骤：
步骤1：用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒pJQK503的构建；
如图1所示，以刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)基因组总DNA为模板，分别以ΔNys-L-F/R与ΔNys-R-F/R为引物，利用高保真DNA聚合酶扩增得到用于基因缺失的左右同源臂片段，并标记为ΔNys-L与ΔNys-R(序列如SEQ ID NO.5、6所示)，其中同源臂片段ΔNys-L两端分别引入XbaI与BspTI酶切位点，同源臂ΔNys-R两端分别引入BspTI与HindIII酶切位点，以便于质粒pJQK503的构建。经胶回收后的左右同源臂PCR产物连接于EcoRV处理的pBluescriptSK(+)载体，经过蓝白斑筛选及测序正确后，分别经XbaI/BspTI与BspT1/HindIII双酶切，回收目标片段。回收的左右同源臂片段同时连接于经XbaI与HindIII双酶切处理的载体pJTU1278，获得质粒pJQK503。为了验证质粒pJQK503构建的正确性，则采用XbaI/HindIII双酶切质粒，可获得大小为3.2kbp的酶切片段，说明质粒pJQK503构建正确。
步骤1中所用到的引物序列如下表1所示：
表1
引物名称 碱基序列
ΔNys-L-F 5′-<u>TCTAGA</u>GGGTGGTGGCGAGGGAGT-3′(XbaI酶切位点)SEQ ID NO.1
ΔNys-L-R 5′-<u>CTTAAG</u>GCGGCGGGTCAGCGAGCTG-3′(BspTI酶切位点)SEQ ID NO.2
ΔNys-R-F 5′-<u>CTTAAG</u>GTCGGCGTATTGGTTTTC-3′(BspTI酶切位点)SEQ ID NO.3
ΔNys-R-R 5′-<u>AAGCTT</u>ACCTGTTGCACGTCGTTC-3′(HindIII酶切位点)SEQ ID NO.4
步骤2：将第一步构建的质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；
将步骤1已构建完成的质粒pJQK503通过钙转化法将其导入宿主ET12567/pUZ8002中。取该转化子于含有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素的LB培养基中37℃过夜培养，将过夜培养物按10％的比例转接至含有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素的LB培养液培养3小时，然后用新鲜不含抗生素的LB培养液洗涤菌体2次以充分除去培养物中的抗生素。同时制备刺孢吸水链霉菌北京变种的新鲜孢子约108个，用TES溶液漂洗2～3次后再用0.5mL TES溶液悬浮孢子，在50℃水浴中热激10min，快速冷却至室温后，加入等体积2×孢子预萌发培养液(配方为：Difco酵母膏1％，Difco酪蛋白氨基酸1％，CaCl2 0.1M(需配制5M的原液，分开高温灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)及0.5uM氯化钙溶液，然后在37℃培养2.5小时进行孢子的预萌发过程。离心收集孢子，并用新鲜的LB培养液漂洗孢子2次，然后将孢子重悬于适量的不含抗生素的LB培养液中，在混合器上充分震荡并打散孢子，按照107∶108的供受体比与大肠杆菌细胞混合后均匀涂布于不含有抗生素的MS平板上，待平板吹干后转移至30℃培养箱中培养17小时后取出平板，并用含有硫链丝菌素(0.5mg)与萘啶酮酸(1mg)的1.5mL无菌水覆盖于MS平板上，将平板吹干后转移至30℃培养箱中培养。一般4～5天后可见平板上有单菌落结合子长出。经无抗松弛2-3轮后，收集孢子在不含有任何抗生素的MS平板上以10-4、10-5、10-6进行梯度稀释涂板，最后采用V-ΔNys-F/R为PCR引物验证结合子正确性，即得到突变菌株SY02。
步骤2中所用到的引物序列如表2所示：
表2
引物名称 碱基序列
V-ΔNys-F 5′-CGTTCGAACGCCTCCCAG-3′SEQ ID NO.7
V-ΔNys-R 5′-CGATTTCCCCGCCCTCAT-3′SEQ ID NO.8
步骤3：用于加强表达四霉素生物合成基因簇后修饰基因tetrK整合型质粒pJQK509的构建；
如图3所示，以刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123基因组总DNA为模板，分别以tetrK-F/R为引物，利用高保真DNA聚合酶扩增得到用于加强表达基因tetrK的PCR片段(两端分别为BglII与NotI酶切位点)，经纯化后的PCR片段连接于EcoRV处理的pBluescript SK(+)载体，经过蓝白斑筛选及测序正确后，经BglII/NotI双酶切后回收目标片段，再将酶切后的目的片段连接于经BglII与NotI双酶切处理的载体pSET152-KasOp*，(将强启动子KasOp*(经BamHI/BglII双酶切)片段插入至整合型质粒pSET152(经BamHI/BglII双酶切)，获得质粒pSET152-KasOp*，其中pSET152质粒序列与KasOp*启动子序列为公知常识，已有文献报道)获得质粒pJQK509。tetrK基因序列如SEQ ID NO.11所示。为了验证质粒pJQK509构建的正确性，则采用BglII/NotI双酶切质粒，如图4，获得大小为1198bp的酶切片段，则说明质粒pJQK509构建正确。
步骤3中所用到的引物序列如下表3所示：
表3
引物名称 碱基序列
tetrK-F 5′-<u>AGATCT</u>ATGACCTCCCCCCACCGTGA-3′(BglII酶切位点)SEQ ID NO.9
tetrK-R 5′-<u>GCGGCCGC</u>CTACCAGGTCACCGGCAGCT-3′(NotI酶切位点)SEQ ID NO.10
tetrK基因是p450单加氧酶基因，负责编码催化四霉素B中C-4位羟基的形成，其基因序列为：
ATGACCTCCCCCCACCGTGATCTGCCGTCCCTCGACCTCGAAACGCCCGCCCTACTGCGCGTCAGCCCGCTCCTGCGGGACCTCCAGGAACGGGGGCCGGTCTGCCTGGTGCGCACCCCCGCCGGGGACGAGGGCTGGCTGGTGACCCGCCACTCCGTGCTCAAGCAGCTGCTGAACGACGAACGCATCGGCCATTCGCATCCGGACCCGGCGAACGCGGCGCAGTACGTGCGCAACCCGTTCCTGGACCTGATGATCGCCGACACCGACGCCGAGACCGCCCGTCGCACGCACACCGAGTCCCGCCGGCTCCTGGCCCCGATGTTCTCCGCCCGGCGGGTGCGCGAGATGGAGCCGCGGGTAGCGGCGGTCGTGGACGCCGTGCTGGACGACTTCACCGCCCAGGAGCCGCCCGGCGACCTGCACGGCGGCGTGTCCGTGCCGGTGGCGAGGACGGTGCTCTGCGACATCATCGGCGTGCCGCCGCAGAACCGCGAACACCTCACGGCGCTGCTGTCCCAGACGGCCGTGCTCGGGGACCGCGAGGGGGTGCAGCGCACGCAGCGCGACCTGTACGCCTTCGTCGGGGGGTTGGTCGAGCACAAGCGGGCCGCACCGGGCCAGGACATCATCACCCGCCTGGCCGAGGGCGGGCTGTCCGACGAGCGCGTGACGCACCTGGCCGTGGGCCTGCTGTTCGCCGGGCTGGACAGCGTCGTGACCATCATGGACCACGGGGTGGTGCTGCTGGCGACCCACCCCGAGCAGCGGGCGGCGGCACTGGCGGACCCGGACGTGATGACGCACGCCGTCGAGGAAGTGCTGCGGGCCGCGAAAGCCGGCGGGTCGATCCTGCCGCGCTACGCCACCGAGGACCTGACGGTCGGCGGAGAGACGATCCGGGCCGGGGACCTGGTCCTGTTCGACTTCAGTCTCCCCAACTTCGACGAGCGGGCCTTCGACGAGCCGGAGCGGTTCGACGTCACCCGGAGTCCCAACCCGCATCTGACCTTCGCGCACGGGATGTGGCACTGCATCGGCGCACCCCTGGCGCGGATCGAGCTGAACACGGTCTTCACCCAGTTGTTCACGCGCCTGCCCGACCTGCGACTGGCGCTGCCGGCGGGCGAACTGGCGGAGAACGAAGGCCGGTTGTCCGGCGGGCTCAGTGAGCTGCCGGTGACCTGGTAG SEQ ID NO.11
步骤4：将步骤3构建的整合型质粒pJQK509通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123与SY02中；
将步骤3已构建完成的质粒pJQK509通过化学转化法将其导入E.coli ET12567/pUZ8002中。取该转化子于含有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素的LB培养基中37℃过夜培养，将过夜培养物按10％的比例转接至含有氯霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素的LB培养液培养3小时，然后用新鲜不含抗生素的LB培养液洗涤菌体2次以充分除去培养物中的抗生素。同时制备刺孢吸水链霉菌北京变种的新鲜孢子约108个，用TES溶液漂洗2～3次后再用0.5mLTES溶液悬浮孢子，在50℃水浴中热激10min，用循环水冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养液及0.5uM氯化钙溶液在37℃培养2.5小时进行孢子的预萌发过程。离心收集孢子，并用新鲜的LB培养液漂洗孢子2次，然后将孢子重悬于适量的不含抗生素的LB培养液中，在混合器上充分震荡并打散孢子，按照107∶108的供受体比与大肠杆菌细胞混合后均匀涂布于不含有抗生素的MS平板上，待平板吹干后转移至30℃培养箱中培养17小时后取出平板，并用含有安普霉素(0.5mg)与萘啶酮酸(1mg)的1.5mL无菌水覆盖于MS平板上，将平板吹干后转移至30℃培养箱中培养。一般4～5天后可见平板上有单菌落结合子长出，最后采用V-Tetrk-F/R为PCR引物验证结合子正确性，即得到突变菌株CGMCC4.1123：：pJQK509与SY03(SY02：：pJQK509)。
步骤4中所用到的引物序列如下表4所示：
表4
引物名称 碱基序列
V-Tetrk-F 5′-TGCTGTGCGGTGTTGTAAAGTC-3′SEQ ID NO.12
V-Tetrk-R 5′-CGTGAGGTGTTCGCGGTTCT-3′SEQ ID NO.13
步骤5：出发菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123及其突变株的发酵培养；
种子培养基(TSBY)配方为Oxoid胰胨豆汤粉30g，蔗糖103g，Difco酵母膏5g，加蒸馏水定容至1L；发酵培养基配方为玉米粉10g，可溶性淀粉20g，黄豆饼粉10g，KH2PO4 0.2g，NaCl 3g，NH4Cl 3g，CaCO3 4g，加蒸馏水定容至1L，并用1M氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
将按照配方配置的种子培养基与发酵培养基分装于500mL带有弹簧的三角瓶中，每瓶分装100mL培养基，121℃高压灭菌20min。首先将菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123及其突变菌株转接至种子培养基中，以220rpm转速在30℃摇床培养24h后得发酵种子液，最后将发酵种子液按照5％的接种比例转接于发酵培养基中，以220rpm转速在30℃摇床培养5天后收取发酵培养液，并按照以下方法进行检测、分析。
获得发酵培养产物后，首先往里面添加两倍体积(210mL)的甲醇溶液，混匀并超声处理15min，获得发酵萃取液。取1mL发酵萃取液于1.5mL离心管中，12000rpm离心5～8min，所得上清液经0.22μm有机滤膜过滤后，即可获得用于HPLC及LC-MS分析的发酵产物样品。
四霉素及制霉菌素HPLC检测所用仪器为美国安捷伦1260系列高效液相色谱，所用分析液相色谱柱为Agilent Eclipse TC-C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，粒径为5μm。流动相为67％含0.1％甲酸的水与33％乙腈，流速为0.4mL/min，检测波长为304nm，柱温为30℃。
图5为野生型刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123发酵产物HPLC检测图，由图5可得野生型菌株的次级代谢产物中不仅含有四霉素A/B，还有制霉菌素这一多烯类化合物，这使得发酵产物组分比较复杂，不利于单一组分多烯类化合物的定向生产。
表5为刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123、CGMCC4.1123：：pSET152、CGMCC4.1123：：pJQK509、SY02、SY02：：pSET152与SY03(SY02：：pJQK509)发酵产量数据。
表5
结果表明，菌株SY02不再产生制霉菌素而定向生产四霉素，且在菌株SY02中四霉素B的产量提高至167％；菌株SY02与带有空载体的菌株SY02：：pSET152中四霉素A/B产量均无明显变化，进一步说明了菌株SY03中四霉素B产量的进一步提高是加强基因tetrK表达所致。由发酵数据进一步可得出，如果只简单地在野生型菌株CGMCC4.1123中加强基因tetrK的表达，四霉素B的产量仅提高6％。而通过在制霉菌素生物合成基因簇中对聚酮合酶基因nysI进行同框缺失的基础上，加强基因tetrK表达可使四霉素B产量提高至176％，这一代谢工程策略为四霉素B的工业化定向高产奠定了基础。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法
<130> DAG41287
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 △Nys-L-F(Artificial Sequence)
<400> 1
tctagagggt ggtggcgagg gagt 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 △Nys-L-R(Artificial Sequence)
<400> 2
cttaaggcgg cgggtcagcg agctg 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 △Nys-R-F(Artificial Sequence)
<400> 3
cttaaggtcg gcgtattggt tttc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 △Nys-R-R(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcttacct gttgcacgtc gttc 24
<210> 5
<211> 1511
<212> DNA
<213> 人工序列 △Nys-L (Artificial Sequence)
<400> 5
tctagagggt ggtggcgagg gagtgggcga cgtcgagcag gtcggcgtgc ggggcgtcgt 60
cgagggcggc gcgcagggcc gcggcctggc cgcgcagggc gtcgggggtg cggccggaga 120
gcaggaccgg gacggtgccc ggcgtcacgg gggcggtggt cggcgtggtg tcggtgccgg 180
ccggggcgtg gggcgtcccg ggctcctcgg gcggtgcctc gggggcctgc tcgatgatgg 240
tgtgggcgtt ggtgccgctg atgccgaagg aggagacggc ggcgcggcgc ggggcgccgg 300
tggcgggcca gtcggtgggg tcggtgagca ggcgcaccgc gccctgcgac cagtcgacgt 360
gccgggtggg ttcctcggcg tgcagggtgc ggggcagcac gccgtgccgc atcgccagca 420
ccatcttgat gacgccggcg acgccggcgg cggcctgggt gtggctgagg ttggacttga 480
ccgagccgag cagcagcggc cggtccgcgg ggcggttctg gccgtaggtg gcgagcagtg 540
cctgggcctc gacggggtcg cccagggtgg tgccggtgcc gtgtgcctcg acgacgtcga 600
cgtccccggc ggtcagtcgg gcgttgacca gggcctgttg gatgacctgc tgctgggagg 660
ggccgttggg ggcggtcagg ccgttggagg cgccgtcctg gttgacggcg gtgccgcgga 720
cgacggcgag gacctcgtgg ccgttgcgga cggcgtcgga gaggcgttcc aggacgagga 780
tgccgacgcc ctcggcccag ccggtgccgt cggcggtgtc gccgaaggag cggcagcgac 840
cgtccgcgga cagtccgccc tggcggccca tctcgatgaa ggtgccgggg ccggacatga 900
tggtgacgcc gccggccagg gcgagggtgc actcgccggc ccgcagtgcc tgggtggcca 960
ggtggacggc gacgagcgag gaggagcagg cggtgtcgac ggtgacggcg gggccgaccg 1020
tgccgaaggt gtaggagatg cggccggaca gcacgctgcc ggtgttgccg gtgagttgga 1080
agccctcggc gccgtcggcg gggccgaccc ggtagtcctg cgccatggcg ccgatgaaga 1140
cgccggtgcg gctgcccttc acggacgtcg ggtcgatgcc ggcgcgttcg aacgcctccc 1200
aggcggattc caggacgacg cgctgctgcg ggtccatggc gaccgcctcg cgcggcgaga 1260
tgccgaagaa ctccgcgtcg aagtcggggg cgtcgtgcag gaatccgccg gctgcggtcg 1320
gtgcggtggc gagtgcctcc aggtcccagc cgcggtcggt ggggaacggg ctgacgccgt 1380
gttcgccggc cgcgaccagt cgccagaggt cttcggggct gcggacgcct ccggggtagc 1440
ggcaggtcat gccgatgatg gccaccggtt cctgggccgc cgattccagc tcgctgaccc 1500
gccgccttaa g 1511
<210> 6
<211> 1698
<212> DNA
<213> 人工序列 △Nys-R (Artificial Sequence)
<400> 6
cttaaggtcg gcgtattggt tttcgcggga aacctgcgcc aggtcggaat cgaccatcat 60
gcgcatgagg gcggggaaat cgacgtccgg tttccagccg aggcggtcgc gggccttggc 120
gctgtcggcg cacagcacct cgacctcggc gggccgcacc aggtcggggt cgatgacgac 180
gtggtcctgc cagttcaggc cgacgtgttc gaaggcgagc cggaccgcgt cgcgcaccga 240
gtgcatctgg ccggtgccga tgacgtagtc gtcgccggcg tcctgctgga gcatcaggtg 300
catggcgcgg acgtagtcgc cggcgtagcc ccagtcgcgg accgcgtcga ggttgcccag 360
ggagagcttg tcctggaggc cgtgcttgat gcgggcgacc gcgagggaga tcttgcgggt 420
gacgaactcc tggccgcggc gcggggactc gtggttgaag agcatcccgg agaccgcgta 480
catgccgaag gactcgcggt agttgcgggt gatgtagtgg ccgtacgcct tggccgcgcc 540
gtacgggctg cgcggatgga agagcgtggt ctcgcgctgc ggggtctccg ccgccttgcc 600
gaacatctcc gaggaggacg cctggtagaa gcggatctga ccgcgcgggt tggcggtgcg 660
ggaggtggac aggccgctga ccatgcggat ggcctccagc atccgcagca cgcccatgcc 720
gttgacctcg gtgacgagtt ccgcctgctg ccaggacatc gggacgaacg agatcgcgcc 780
gaggttgtag acctcgtcgg gctgcacgcc gtcgaccgcg gagaccaggc tcccctggtc 840
catcaggtcg ccgtcgatga agttcagttc ggtggcgagc cggctgacgc gggacttgcg 900
ggggttcgcc tggccgcgga tcagacccca cacctggtag ccccgcgaca gcaggtgctc 960
cgcgagatag gagccgtcct ggccggtgat tccggtgatc agcgctcgtt tggacatggc 1020
caacccttct cgatcacgaa agagaccgtc caaaccctgg agctcggcca cgacctggcg 1080
tcgaatacgc agtccggacg atagataccg gcacgctcgc aagccgcgga agacgctgtc 1140
aacgcatccc ggagttttta gggaattccc gagttccgga ccgtcaggag tgcgccgtcg 1200
tcgccaacac tagtgagatt tcggtgcgga atgcggtgca atgacgtggg tcggcggaac 1260
ggccgaccgc gtccaccacc gagcggcccg gcgccgccgt caaccggggt gttcctccgt 1320
gctgctgaga ctcctgcggg cgcagttgcg cccctacgcg ggggccacct ccgccctcgt 1380
cgccctccaa ctcgtccaga tcctcggcac gttgctgctg ccgacgctgg gtgccgcgct 1440
catcgaccag ggcgtggtgc gcgccgaccg cgatcgggtg gccgagctgg gggcggtgat 1500
ggtggcggtg gccgtggtgc agatcgcggc ggcgctcggg gcggcggcgt tggcggcgcg 1560
gacctcgacg gcgatgggcc gcgacctgcg gtccgcggtg ttccgccgca tcctggactt 1620
ctccgcccgc gaggtcgggc ggttcggcac gccgtcgctg ctcacccgtg ccgtgaacga 1680
cgtgcaacag gtaagctt 1698
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 V-△Nys-F(Artificial Sequence)
<400> 7
cgttcgaacg cctcccag 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 V-△Nys-R(Artificial Sequence)
<400> 8
cgatttcccc gccctcat 18
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 tetrK-F(Artificial Sequence)
<400> 9
agatctatga cctcccccca ccgtga 26
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列 tetrK-R(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggccgcct accaggtcac cggcagct 28
<210> 11
<211> 1191
<212> DNA
<213> 菌株刺孢吸水链霉菌北京变种tetrK基因(Streptomyces hygrospinosusvar.beijingensis tetrK)
<400> 11
atgacctccc cccaccgtga tctgccgtcc ctcgacctcg aaacgcccgc cctactgcgc 60
gtcagcccgc tcctgcggga cctccaggaa cgggggccgg tctgcctggt gcgcaccccc 120
gccggggacg agggctggct ggtgacccgc cactccgtgc tcaagcagct gctgaacgac 180
gaacgcatcg gccattcgca tccggacccg gcgaacgcgg cgcagtacgt gcgcaacccg 240
ttcctggacc tgatgatcgc cgacaccgac gccgagaccg cccgtcgcac gcacaccgag 300
tcccgccggc tcctggcccc gatgttctcc gcccggcggg tgcgcgagat ggagccgcgg 360
gtagcggcgg tcgtggacgc cgtgctggac gacttcaccg cccaggagcc gcccggcgac 420
ctgcacggcg gcgtgtccgt gccggtggcg aggacggtgc tctgcgacat catcggcgtg 480
ccgccgcaga accgcgaaca cctcacggcg ctgctgtccc agacggccgt gctcggggac 540
cgcgaggggg tgcagcgcac gcagcgcgac ctgtacgcct tcgtcggggg gttggtcgag 600
cacaagcggg ccgcaccggg ccaggacatc atcacccgcc tggccgaggg cgggctgtcc 660
gacgagcgcg tgacgcacct ggccgtgggc ctgctgttcg ccgggctgga cagcgtcgtg 720
accatcatgg accacggggt ggtgctgctg gcgacccacc ccgagcagcg ggcggcggca 780
ctggcggacc cggacgtgat gacgcacgcc gtcgaggaag tgctgcgggc cgcgaaagcc 840
ggcgggtcga tcctgccgcg ctacgccacc gaggacctga cggtcggcgg agagacgatc 900
cgggccgggg acctggtcct gttcgacttc agtctcccca acttcgacga gcgggccttc 960
gacgagccgg agcggttcga cgtcacccgg agtcccaacc cgcatctgac cttcgcgcac 1020
gggatgtggc actgcatcgg cgcacccctg gcgcggatcg agctgaacac ggtcttcacc 1080
cagttgttca cgcgcctgcc cgacctgcga ctggcgctgc cggcgggcga actggcggag 1140
aacgaaggcc ggttgtccgg cgggctcagt gagctgccgg tgacctggta g 1191
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 V- Tetrk-F(Artificial Sequence)
<400> 12
tgctgtgcgg tgttgtaaag tc 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 V- Tetrk-R(Artificial Sequence)
<400> 13
cgtgaggtgt tcgcggttct 20

Claims (10)

1.一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；
S2、在所述同框缺失突变菌株上加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，获得基因tetrK加强表达突变菌株；
S3、发酵培养所述基因nysI同框缺失突变菌株或基因tetrK加强表达突变菌株，实现定向生产抗真菌四霉素B。
2.根据权利要求1所述的抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，步骤S1具体包括步骤如下：
A1、构建用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒pJQK503；
A2、将所述质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；
A3、通过对步骤A2获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失突变菌株。
3.根据权利要求2所述的抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII双酶切位点间，分别插入经测序正确的左右同源臂片段△Nys-L与△Nys-R；且同源臂片段△Nys-L是插入XbaI/BspTI酶切位点之间，同源臂片段△Nys-R是插入BspTI/HindIII酶切位点之间。
4.根据权利要求3所述的抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，同源臂片段△Nys-L的序列如SEQ ID NO.5所示；同源臂片段△Nys-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1所述的抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，步骤S2具体包括步骤如下：
B1、构建用于加强基因tetrK表达的整合型质粒pJQK509；
B2、将所述质粒pJQK509通过大肠杆菌与链霉菌间属间接合转移导入受体菌基因nysI同框缺失突变菌株中；
B3、通过对步骤B2获得的突变菌株进行阿伯拉霉素抗性验证及PCR验证筛选得到基因tetrK加强表达突变菌株。
6.根据权利要求5所述的抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，所述质粒pJQK509的构建是在质粒pSET152-KasOp*的BglII/NotI双酶切位点间插入经测序正确的基因tetrK。
7.根据权利要求6所述的抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，所述基因tetrK序列如SEQ ID NO.11所示。
8.一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，其特征在于，所述突变菌株为：
在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得的基因nysI同框缺失突变菌株；
或是在所述同框缺失突变菌株上加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，获得的基因tetrK加强表达突变菌株。
9.一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，所述突变菌株为刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingnsis)，保藏编号为CGMCC NO.18241。
10.一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，所述突变菌株为刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingnsis)，保藏编号为CGMCC NO.18242。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142589A (zh) * 2018-10-25 2019-01-04 湖南农业大学 一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001059126A2 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Norges Teknisk Naturvitenskapelige Universitet Gene cluster encoding a nystatin polyketide synthase and its manipulation and utility
CN102516374A (zh) * 2011-11-17 2012-06-27 上海交通大学 用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇
CN105602950A (zh) * 2016-03-07 2016-05-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种链霉菌中聚酮生物合成基因簇及其扩增引物与试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001059126A2 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Norges Teknisk Naturvitenskapelige Universitet Gene cluster encoding a nystatin polyketide synthase and its manipulation and utility
US20040115762A1 (en) * 2000-02-08 2004-06-17 Zotchev Sergey Borisovich Novel genes encoding a nystatin polyketide synthase and their manipulation and utility
CN102516374A (zh) * 2011-11-17 2012-06-27 上海交通大学 用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇
CN105602950A (zh) * 2016-03-07 2016-05-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种链霉菌中聚酮生物合成基因簇及其扩增引物与试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BO CAO等: "Genome Mining of the Biosynthetic Gene Cluster of the Polyene Macrolide Antibiotic Tetramycin and Characterization of a P450 Monooxygenase Involved in the Hydroxylation of the Tetramycin B Polyol Segment", 《CHEMBIOCHEM》 *
姚芬: "农用抗生素120的生物合成和细菌中DNA磷硫酰化基因功能的研究", 《万方学位》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142589A (zh) * 2018-10-25 2019-01-04 湖南农业大学 一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法
CN109142589B (zh) * 2018-10-25 2022-03-01 湖南农业大学 一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法

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