CN102174539A

CN102174539A - 杀粉蝶菌素a1生物合成基因簇

Info

Publication number: CN102174539A
Application number: CN2011100639242A
Authority: CN
Inventors: 由德林; 刘倩; 孙东昌; 吴吉安; 施跃峰; 邓子新
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2011-09-07

Abstract

一种生物技术领域的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，包括12个基因的核苷酸序列或由序列1形成的互补序列，其中：负责合成碳骨架共六个基因：pieA1，pieA2，pieA3，pieA4，pieA5，pieA6；负责吡啶环形成共两个基因：pieC，pieD；负责对生物合成进行调控一个基因：pieR；负责后修饰过程共三个基因：pieB1，pieB2，pieE。本发明提供了杀粉蝶菌素A1生物合成相关的基因信息，为杀粉蝶菌素A1生物合成的研究及其遗传改造提供了基础；本发明的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇可广泛用于农业、工业和医药领域。

Description

杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的基因簇，具体涉及的是一种具有抗真菌，杀粉蝶等农业害虫及抗肿瘤的活性的抗生素-杀粉蝶菌素A1(Piericidin A1)生物合成基因簇。

背景技术

PiericidinA1由票霉素链霉菌杭州湾变种(Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis)发酵产生的一种吡啶环(pyridone)类抗生素。吡啶环类抗生素是一类具有特定结构的微生物天然产物，此类抗生素由于与辅酶Q结构相似，故可以竞争性阻断电子从NADH到辅酶Q的传递，抑制线粒体呼吸作用，从而影响生物体正常代谢过程。

研究证实杀粉蝶菌素A1对微生物、植物致病菌显示较弱的抗菌活性，但是对致病真菌显示较强的生物活性，例如对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的最低抑菌浓度仅为2μg/ml，对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的最低抑菌浓度为10μg/ml。对粉蝶、蚕、菜青虫有很显著的杀虫效果，其中当浓度为4.8μg/ml时就可以使二龄家蚕幼虫死亡率达到100％，曾经作为杀虫剂进行开发研究，但由于其具有生物毒性，存在不可忽视的残留问题，故影响广泛推广使用。此外，它还是白介素2(interleukin-2)的抑制剂，而白介素2是一种广泛存在的免疫反应调控者，白介素2过量表达与一些肿瘤，自身免疫类疾病，器官移植排斥反应等相关，从而可作为治疗这些病症的潜力药物。另一方面，杀粉蝶菌素A1对脊椎动物也有很强的毒性，实验证明，它对老鼠的口服急性毒性为3.3mg/kg，按照我国相关规定属于高毒药品。

关于杀粉蝶菌素A1的生物合成途径至今尚未阐明，根据结构推测其由典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由一个丙二酰辅酶A的起始单元，三个丙二酰辅酶A的延伸单元和五个甲基丙二酰辅酶A的延伸单元进行组装形成碳骨架，然后经过天冬酰氨合酶，环化酶完成转氨成环反应形成吡啶环，最后经过氧化还原酶，甲基转移酶对其进行后修饰，形成了最终产物。杀粉蝶菌素A1的生物活性与其结构密切相关，随着杀粉蝶菌素A1整个生物合成基因簇的克隆与功能分析，可以从分子水平上阐明杀粉蝶菌素A1独特的生物合成机理，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰杀粉蝶菌素A1的生物合成途径，探索生物利用度高，生物毒性更小的非天然的天然产物。

经对现有技术的文献检索发现，尚未见到有关于杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，公开杀粉蝶菌素A1的生物合成基因簇，本发明包括由链霉菌Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis产生的具有良好生物活性的抗生素杀粉蝶菌素A1的生物合成基因簇的克隆、测序、分析，为生物合成杀粉蝶菌素A1及其遗传改造提供了基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，其序列如序列1所示。

包括12个基因的核苷酸序列或由序列1形成的互补序列，其中：负责合成碳骨架共六个基因：pieA1，pieA2，pieA3，pieA4，pieA5，pieA6，；负责吡啶环形成共两个基因：pieC，pieD；负责对生物合成进行调控一个基因：pieR；负责后修饰过程共三个基因：pieB1，pieB2，pieE。

所述基因pieA1，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列3中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第1152～8837位；

所述基因pieA2，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列4中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第8883～19019位；

所述基因pieA3，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列5中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第19078～24250位；

所述基因pieA4，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列6中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第24374～30808位；

所述基因pieA5，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列7中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第30858～36479位；

所述基因pieA6，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列8中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第36391～43626位；

所述基因pieC，编码环化酶，由序列10中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第44470～44982位；

所述基因pieD，编码天冬酰氨合酶，由序列11中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第45109～46869位；

所述基因pieR，编码转录调节蛋白，由序列2中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第1～600位；

所述基因pieB1，编码甲基转移酶，由序列9中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第43672～44358位；

所述基因pieB2，编码甲基转移酶，由序列12中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第46881～47654位；

所述基因pieE，编码黄素单加氧酶，由序列13中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第47657～49417位。

所述的序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列通过聚合酶链式反应或用限制性内切酶酶切DNA得到。

所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，利用聚合酶链式反应的方法或以上序列的DNA作为探针进行Southern杂交或者碱基序列合成的方法得到杀粉蝶菌素A1生物合成基因的同源基因。

所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断杀粉蝶菌素A1生物合成的一个或几个结构基因而得到杀粉蝶菌素A1衍生物。

所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断杀粉蝶菌素A1生物合成的一个或几个修饰基因而得到新的杀粉蝶菌素A1衍生物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：利用本发明的基因簇可实现以下目的：

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从其他微生物中得到杀粉蝶菌素A1生物合成基因的同源基因。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有基因组中以前临近区域未克隆的DNA。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断杀粉蝶菌素A1生物合成的一个或几个步骤或者引入其他同源基因而得到新的杀粉蝶菌素A1的前体或衍生物。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以用来提高杀粉蝶菌素A1或其衍生物的产量。例如，转入更多拷贝的正调节基因或增强其表达。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

本发明所提供的序列或部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系统在外源宿主中表达以得到修饰的酶或更高的生物活性或更高的产量。这些外源宿主包括链霉菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物和动物细胞等。

本发明所提供的序列或部分序列可以通过转化、转导、接合转移等方式转入到其他与核苷类抗生素产生菌中，从而产生该抗生素的衍生物。

本发明所提供的核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，或与其它来源的同源序列进行直接进化(DNAshuffling)，或提供紫外线或化学试剂诱变等。

本发明所提供的氨基酸序列或部分序列可以用来分离所需要的蛋白质并可用于抗体的制备。

本发明所提供的氨基酸序列或部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。

本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。

本发明提供的杀粉蝶菌素A1生物合成相关的所有基因和蛋白信息，有助于阐明与理解杀粉蝶菌素A1及相关吡啶环类抗生素家族生物合成的分子机理，从而为进一步利用基因工程手段改造提供理论基础与材料。本发明提供的基因及其所编码的蛋白质，也可以用来查找和发展可用于医药，工业，农业的化合物或蛋白。

附图说明

图1杀粉蝶菌素A1的化学结构。

图2杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇的结构组成与限制性内切酶谱。

其中：(A)8个重叠的粘粒代表了Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis基因组150kb的DNA区域；

(B)杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇的结构组成。

图330kb片段缺失突变株的构建与检测。

其中：(A)构建30kb片段缺失突变株的过程示意图；

(B)大片段缺失突变株的HPLC(高效液相色谱)检测，Wild type：Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis野生型，LQ1、LQ2：30kb片段缺失突变株。

图4Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis发酵产物的MS(质谱)检测。

图5推导的杀粉蝶菌素A1生物合成途径示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中所涉及的菌种保藏信息如下：

票霉素链霉菌杭州湾变种(Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis：分离于杭州天目山竹林土壤中，于2010年7月20号提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为：CGMCC NO：4029；该单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编，100101。

大肠杆菌DH10B：购买自美国马里兰州盖色斯堡生物制剂公司Gibco-BRL。

1.杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇的克隆、验证：

前期喂养试验表明，杀粉蝶菌素A1属于典型I型聚酮合酶合成的抗生素，而且其核心结构吡啶环的氮原子可能来源于转氨反应，故以I型聚酮合酶和转氨酶为主要线索克隆杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇。

首先，通过454全基因组扫描计划，得到917个基因组序列重叠群(contig)，相加有近187M bp。参考链霉菌常规基因组大小均在8M bp左右，故该扫描序列以约20倍覆盖率涵盖全基因组信息。接下来，使用生物信息学软件对187M bp序列进行功能分析，主要过程为先用软件Glimmer将核酸序列翻译为氨基酸序列，再通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的Blast比对，找到同源蛋白，从而实现对这段核酸编码蛋白的功能预测。

通过以上生物信息学手段，找到一个26kb大小的重叠群A，其序列编码包含有典型I型聚酮合酶及转氨酶。为了证实该段序列与杀粉蝶菌素A1生物合成相关，设计大片段缺失突变株进行30kb基因中断试验。

首先，以重叠群A的5’和3’端设计两对PCR引物，从基因组文库中调取含有重叠群A序列信息的粘粒。两对引物分别命名为，探针1(Forward：5’CGGCAGCTCATTCCGACGAT 3’；Reverse：5’GCAGTTCCTGACGCCCTACACC 3’)及探针2(Forward：5’TCCGCATCGCCTTCAGCA 3’；Reverse：5’CTCTACCGCCCGACCATCAA 3’)。

得到的6个阳性粘粒中选取19F9，包含pieA4到pieB2约40kb片段的载体，通过将其外源片段两端的BamHI片段克隆到穿梭载体上，导入到Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis野生型菌株，对pieA4到pieB2近35kb片段进行缺失，结果证实此35kb片段缺失突变株丧失了产生杀粉蝶菌素A1的能力。HPLC检测说明，杀粉蝶菌素A1标准品和野生型能在保留时间16.2分钟左右出现杀粉蝶菌素A1的特征性峰，而LQ1，LQ2大片段缺失突变株则没有该特征峰(图3B)，从而确凿证实pieA4到pieB2与杀粉蝶菌素A1的生物合成直接相关。

2.杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇边界的确定

通过对重叠群A序列的详细分析，只包含三个半模块的典型I型聚酮合酶，不足以承载一个起始单位和八个延伸单位的组装，即表明重叠群A只包含部分杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇。为了获得全部的生物合成基因簇，接下来设计引物探针3(Forward：5’CCGGATCTCGTTGGTGATGTTCT 3’；Reverse：5’TCCTGTTCGCCGTGATGGTCT 3’)，通过染色体步移(chromosome walking)得到了另外两个粘粒，包含另外三个全基因组测序重叠群(重叠群B，C，D)的序列信息，加上重叠群A，共涵盖约130kb的序列。进一步详细分析显示，这130kb的序列包含从pieR到pieE的基因，编码蛋白可以完成对杀粉蝶菌素A1的生物含成。

根据基因编码蛋白的功能分析，杀粉蝶菌素A1的生物合成基因簇被确定为从基因pieR到pieE，涵盖了染色体上49kb的区域，包含12个开放读码框。根据生物信息学分析，pieR上游有近4kb的非编码区，此非编码区上游的基因多编码一些后修饰酶，如羟化酶和氧化还原酶，这些酶没有显示明显的杀粉蝶菌素A1生物合成相关性，而pieR编码调节蛋白，且pieR下游是典型I型聚酮合酶，这种结构基因上有普遍存在的调节基因常被认为负责途径特异调控抗生素生物合成，因此pieR被确定为杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇的左边界。同时根据生物信息学分析pieE是负责杀粉蝶菌素A1生物合成的羟化反应基因，且其下游有近8kb的非编码区，此非编码区下游的基因编码的蛋白多出现在初级代谢中，如胍丁胺脱亚氨酶和DNA解旋蛋白，所以pieE被确定为pieE生物合成的右边界。

3.推测杀粉蝶菌素A1的生物合成途径

一个丙二酰辅酶A的起始单元，三个丙二酰辅酶A的延伸单元和五个甲基丙二酰辅酶A的延伸单元由pieA1，pieA2，pieA3，pieA4，pieA5，pieA6进行组装形成碳骨架，后经过pieD编码的天冬酰氨合酶的催化下完成转氨反应，NH2基团进攻酮基并取代，pieC编码的环化酶催化氮原子进攻羰基碳，完成成环反应形成吡啶环，最后经过三步后修饰反应，pieB1和pieB1编码的甲基转移酶催化C2’，C3’的甲基化修饰，pieE编码的黄素单加氧酶催化C3’的羟基化修饰，最终形成了产物。

实施例1

杀粉蝶菌素A1产生菌Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis基因组DNA的提取：

接种Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis至TSBY(10.3％蔗糖)培养基于含有弹簧的三角瓶中30℃培养48h。离心收集菌体，重悬于5ml SET缓冲液中(75mM NaCl，25mM EDTA pH8.0，20mM Tris-HCl pH7.5)。加入100μl溶菌酶溶液(50mg/ml)，置37℃约60分钟。溶菌后然后加入140μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)混均匀，再加600μl 10％SDS，通过颠倒混匀，置55℃温浴2h，期间偶尔颠倒几次。再加入2ml 5M NaCl，彻底混匀，冷却置37℃后，加入5ml氯仿，于室温轻轻混匀。20℃、4500g离心15分钟。转移上清至新管中，加入0.6倍体积的异丙醇颠倒混匀，约3分钟后用玻棒挑取至含70％(v/v)乙醇的新管中洗涤，重复2次，空气中干燥，溶解在TE中。

实施例2

杀粉蝶菌素A1产生菌Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis基因组文库的构建

(1)链轮丝菌总DNA的部分酶解和大片段DNA的回收

将提取的链轮丝菌总DNA用Sau3AI部分酶解，用1％低熔点琼脂糖凝胶，在装有0.5倍TBE电泳缓冲液的脉冲场电泳(Pulse Field Gel Electrophoresis，PFGE，Bio-Rad)中分离。回收约40kb大小的DNA片段。用热敏的碱性磷酸酶(APexTM Heat-Labile Alkaline Phosphatase，EPICENTRE Biotechnologies公司)处理是末端去磷酸化，供载体的连接及包装转染用。

(2)柯斯质粒载体的构建和处理

为了方便在链霉菌中做异源表达，从pOJ446质粒出发，构建了新的可整合在链霉菌染色体的穿梭柯斯质粒载体，pOJ446被BamHI酶切后，用CIAP(NEB公司)酶处理末端使其去磷酸化。

(3)连接和包装

将处理好的链轮丝菌基因组DNA(大小约40kb)和柯斯质粒载体按照1∶1分子数比例用T4连接酶(NEB公司)连接。将在冰上溶解的噬菌体包装蛋白(MaxPlax Lambda Packing Extracts，EPICENTREBiotechnologies公司)加入连接产物中，混匀，避免产生气泡，短暂离心，在30℃中温浴90分钟，再加入另一份包装蛋白，继续温浴90分钟后加入噬菌体稀释缓冲液(Phage Dilution Buffer，100mM NaCl，10mM MgCl，10mM Tris-HCl pH8.3)至1ml，并加入25μl氯仿，4℃保存。

(4)转染与保存

将大肠杆菌EPI300培养至OD600＝0.8～1.0作为感受态菌，可在4℃保存72h。将包装产物与感受态菌混合，37℃温浴20分钟后涂含阿伯拉抗生素的LB平板。37℃培养过夜。挑取单克隆至含抗生素的LB培养基96孔板中继续培养18小时，加入灭菌的甘油至终浓度20％，于-70℃中保存。

实施例3

杀粉蝶菌素A1产生菌Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis基因组文库的筛选：

采用PCR的方法从基因组文库中筛选所需要的柯斯质粒。为筛选基因组文库，从每个板的96孔孔中取出等量菌液混合，接种培养，提取质粒为一个模板进行PCR筛选，在得到的阳性平板中，从每排的12个孔中取出等量菌液混合，接种培养，提取质粒为一个模板进行PCR筛选。然后在那些阳性的排中进行单个的PCR筛选，直至筛出所有阳性克隆。

实施例4

杀粉蝶菌素A1产生菌Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis接合转移系统的建立：

收集生长于YMS培养基Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis的新鲜孢子备用。含有oriT的目标质粒必须在辅助质粒pUZ8002的协助下，才能通过接合转移导入到受体链霉菌细胞中。先将待转移到Streptomyees piomogeues var.hangzhouwanensis中的质粒转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后培养含目标质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，12h后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体2次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子重新悬浮于5ml 0.05M pH8.0的TES缓冲液中，在55℃水浴中热激10min，冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基(Oxide酵母膏10％，Oxide酪蛋白氨基酸1％，CaCl₂ 0.01M)(需配制5M的原液，分开灭菌后加到酵母膏酪蛋白氨基酸溶液中)预萌发2-3h，离心收集孢子并重新悬浮于适量的LB中，在混合器上振荡打散孢子，按108∶10⁸与大肠杆菌细胞等量混合，26-30h后用1ml无菌水含适量抗生素和萘啶酮酸(用来抑制大肠杆菌的生长)来覆盖，置30℃培养数天后即可看到接合子。

实施例5

基因中断突变株的构建：

将构建的中断载体通过接合转移的方式转至Streptomyces piomogeues var.hangzhouwanensis中，将生长出来的接合子在添加阿泊拉霉素(apramycin)的SFM平板上抗性验证，验证正确后，在未添加阿泊拉霉素的SFM平板上扩大松弛培养，待孢子生长丰满后(约7天)，收集孢子，然后在添加相应抗生素的SFM平板上梯度稀释每平板约50-100个单菌落，挑选菌落分别在含阿泊拉抗生素的SFM平板和含硫链丝菌素的SFM平板上扩大培养，选择在硫链丝菌素平板上未长但在阿泊拉平板上生长良好的菌落，转接到种子培养基中提取总DNA，进行PCR验证正确后，突变株进行发酵培养。

实施例6

杀粉蝶菌素A1的发酵、分离纯化及LC-MS分析鉴定：

发酵流程：

冻干管中菌种用种子培养基传一代后涂于YMS培养基，7天后收孢子于甘油管中保存。甘油管中取适量孢子(约50ul)接种至80ml TSBY(10.3％蔗糖)种子培养基(500ml三角瓶)，30℃，220rpm培养2天。以5％的接种量将种子接种至80ml发酵培养基中(500ml三角瓶)(玉米淀粉3.5％，黄豆饼粉1.5％，细麦麸1.5％，硝酸钾0.6％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.5％蒸馏水定容至1000ml，灭菌前将PH调至7.2)，30℃，220rpm培养3天。

分离纯化：

将80ml发酵液用等体积的丙酮浸泡，室温过夜。然后离心，弃菌体，取上清，45℃旋转蒸掉丙酮，剩余水相用约80ml乙酸乙酯萃取，然后将乙酸乙酯45℃旋转蒸干，用约1ml甲醇溶解，-70℃保存。

LC-MS分离检测：

将粗品溶于甲醇后，离心取上清，过0.22μm的有机相滤膜，用于HPLC分析或LC/MS分析。LC-MS的分离条件为：流动相A：0.1％三氟乙酸超纯水，流动相B：HPLC级乙腈，检测波长238nm，0-40min，流动相B维持在85％，流速为0.3ml/min。色谱柱为采用AgilentTC-C18(5μm，4.6×250mm)反向柱。所用仪器为安捷伦公司的Agilent 1100series LC/MSDTrap system。质谱检测是在离子阱的正离子模式下进行。干燥气流为8l/min，喷雾器压力为40psi。干燥气温为325℃。多级质谱断裂分析轰击电压在1.0～1.8V之间。

Claims

1.一种杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，其特征在于，包括12个基因的核苷酸序列或由序列1形成的互补序列，其中：负责合成碳骨架共六个基因：pieA1，pieA2，pieA3，pieA4，pieA5，pieA6，；负责吡啶环形成共两个基因：pieC，pieD；负责对生物合成进行调控一个基因：pieR负责后修饰过程共三个基因：pieB1，pieB2，pieE。

2.根据权利要求1所述的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，其特征是：

3.根据权利要求1或者2所述的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，其特征是，所述的序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列，通过聚合酶链式反应或用限制性内切酶酶切DNA得到。

4.根据权利要求1或者2所述的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，利用聚合酶链式反应的方法或以上序列的DNA作为探针进行Southern杂交或者碱基序列合成的方法得到杀粉蝶菌素A1生物合成基因的同源基因。

5.根据权利要求1或者2所述的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断杀粉蝶菌素A1生物合成的一个或几个结构基因而得到杀粉蝶菌素A1衍生物。

6.根据权利要求1或者2所述的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断杀粉蝶菌素A1生物合成的一个或几个修饰基因而得到新的杀粉蝶菌素A1衍生物。