CN105543266A - 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法 - Google Patents

一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105543266A
CN105543266A CN201511002817.3A CN201511002817A CN105543266A CN 105543266 A CN105543266 A CN 105543266A CN 201511002817 A CN201511002817 A CN 201511002817A CN 105543266 A CN105543266 A CN 105543266A
Authority
CN
China
Prior art keywords
crispr
gene editing
gene
ibl14
cas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201511002817.3A
Other languages
English (en)
Inventor
童望宇
雍德祥
李雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui University
Original Assignee
Anhui University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui University filed Critical Anhui University
Priority to CN201511002817.3A priority Critical patent/CN105543266A/zh
Publication of CN105543266A publication Critical patent/CN105543266A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

本发明公开了一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及基因编辑操作方法，包括它的CRISPR-Cas？I-B型基因编辑系统特征、靶向基因与基因编辑模版的设计与质粒构建及靶向基因与基因编辑模版重组质粒在链霉菌中的基因编辑操作全过程。应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas？I-B型基因编辑系统对遗传基因进行敲除、插入、无痕点突变及RNA水平调控可方便地改变生物体的遗传特征，该发明为实现提高医药、食品及其它工业产品的生产水平和改善产品品质提供了新的技术和方法。

Description

一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域中的基因编辑技术，确切地说是一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法。
背景技术
CRISPR(clusteredregμlarlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences)称为成簇规则间隔的短回文重复序列，1987年最早发现于大肠杆菌中(Nakata,A.,Amemura,M.andMakino,K.(1989)UnusualnucleotidearrangementwithrepeatedsequencesintheEscherichiacoliK-12chromosome.JBacteriol.171,3553-3556)，随后陆续发现存在于许多真细菌和古细菌的基因组中。2002年R.Jansen等详细分析比较了原核基因组中的这种重复序列，更重要的发现此重复序列的旁侧经常伴随出现保守的基因序列(Jansen,R.,Embden,J.D.,Gaastra,W.andSchouls,L.M.(2002)IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes.MolMicrobiol.43,1565-1575)，根据重复序列的排列特征，他们将这种独特的重复序列命名为CRISPR，保守基因序列编码的蛋白质称为Cas附属蛋白(CRISPR-associatedproteins)。由于这种序列在细菌和古细菌中分布广泛，因此推测CRISPR-Cas系统可能具有某种细胞生理功能。
2007年R.Barrangou等首次在乳酸菌Streptococcusthermophilus中实验证实了CRISPR-Cas系统的生物学功能-原核细胞抵御噬菌体侵染的一种免疫新机制(Barrangou,R.,Fremaux,C.,Deveau,H.,Richards,M.,Boyaval,P.,Moineau,S.,Romero,D.A.andHorvath,P.(2007)CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes.Science.315,1709-1712)。L.AMarraffini等于2008年在Staphylococci中证明CRISPR-Cas系统同样也能够干扰质粒的结合转移(Marraffini,L.A.andSontheimer,E.J.(2008)CRISPRinterferencelimitshorizontalgenetransferinstaphylococcibytargetingDNA.Science.322,1843-1845)。近年来，CRISPR-Cas系统的免疫机制以及Cas蛋白质结构功能等方面的研究取得了重大的进展，而且基于CRISPR-Cas系统发展的DNA编辑新技术，在原核和真核细胞中成功地应用于基因组编辑改造，在医药、食品、农业等领域中显示出了巨大的潜力。但到目前为止，广泛应用的CRISPR-Cas系统均为CRISPR-CasII型系统。
基因编辑技术是遗传功能研究的重要手段，传统的基因编辑方法主要包括锌指核酸酶(ZFN：zinc-fingernucleases)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN：transcriptionactivator-likeeffectornuclease)技术。不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成，这一步骤非常繁琐费时，常需要数周以上时间；且基因打靶效率低。CRISPR/Cas技术摆脱了合成组装具有特异性DNA识别能力的蛋白模块的繁琐操作，其gRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN技术中的DNA识别模块的构建过程，且打靶效率高。可是，在CRISPR-CasI型系统中，目前的基因编辑操作研究多采用接合转移，因而操作周期常达2个星期以上。
CRISPR-CasI型系统虽有发现，但少有应用报道。维吉尼亚链霉菌IBL-14(StreptomycesvirginiaeIBL14)是本实验室从甾体制药厂附近的活性泥污中分离得到的一株能降解多种甾体化合物的放线菌。对菌株IBL-14全基因组测序和数据库分析发现，菌株IBL-14中存在CRISPR-CasI-SV14B型系统。同时，该系统可通过原生质体转化进行维吉尼亚链霉菌基因编辑，该原生质体转化操作比接合转移操作缩短操作时间约4-5天。特别是：维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及基因编辑操作方法未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及基因编辑操作方法，通过靶向基因与基因编辑模版的设计与质粒构建及靶向基因与基因编辑模版重组质粒在链霉菌中的转化操作，对染色体基因进行敲除、插入、点突变及RNA水平调控可方便地改变维吉尼亚链霉菌的遗传特征，从而实现改造链霉菌基因组之目的。
采用如下技术方案：
一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统,其特征在于：所述的维吉尼亚链霉菌IBL14包括18个CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统。
所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统,其特征在于：所述的18个CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统包括：18个CRISPR核酸序列SV01-18和7个CasI-SV14B型基因Cas1-6，DevR。
所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统，其特征在于：所述的18个CRISPRSV01-18具有附表1中所描述的核酸序列，其CRISPR核酸序列数可多于或少于18个。
所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统，其特征在于：7个CasI-SV14B型基因顺序为Cas6,DevR,Cas5,Cas3,Cas4,Cas1,Cas2，两侧分别与CRISPRIC01和CRISPRIC02相比邻，且DevR与Cas5，Cas3与Cas4有碱基重叠，且基因编辑过程中所需Cas基因数可包含全部7个基因或只含其中的Cas3,Cas5,Cas6和DevR。(如图1所示)
所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)基于所述的基因编辑系统进行靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建；
(2)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的验证。
所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于，
所述的靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤包括：
(1)根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因组测序的数据和信息，得到靶向基因DNA序列信息；
(2)使用PfuDNA聚合酶通过聚合链式反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别和切割位点以及overlapPCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段；
(3)利用overlapPCR将上下同源臂结合起来构建编辑基因模版；
(4)直接合成靶向基因片段，首尾分别包含启动子J23119和RNA终止子；
(5)根据限制性酶切位点上的粘性末端将步骤(3)、步骤(4)获得的DNA片段连接到pKC1139上得到基因编辑质粒pKCSV14，即可。
所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于，
所述的维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的验证步骤包括：
(1)在含链霉菌的高渗溶液中添加溶菌酶制备链霉菌原生质体；
(2)将靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤中得到基因编辑质粒pKCSV14转化到维吉尼亚链霉菌原生质体中得到基因编辑后的重组子；
(3)对重组子染色体进行PCR和基因测序分析确证基因编辑后的目的重组菌株。
所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于：所述的基因编辑指的是应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统对维吉尼亚链霉菌的遗传物质进行基因敲除、插入、无痕点突变及任意组合。
有益效果为；
本发明丰富了CRISPRS技术的类型；提供了CRISPR-CASI-SV14B型系统在链霉菌基因功能研究中的应用；为CRISPR-CASI-SV14B型系统在其它生物体基因编辑研究中提供了新的方法和技术选择。应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-CasI-SV14B型基因编辑系统对链霉菌遗传基因进行敲除、插入、点突变及RNA水平调控可方便、快速、高效地改变生物体的遗传特征。
应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-CasI-B型基因编辑系统对遗传基因进行敲除、插入、无痕点突变及RNA水平调控可方便地改变生物体的遗传特征，该发明为实现提高医药、食品及其它工业产品的生产水平和改善产品品质提供了新的技术和方法。
附图说明
图1维吉尼亚链霉菌IBL14中的CasI-B系统；该CasI-SV14B系统包含7个Cas基因(顺序为Cas6,DevR,Cas5,Cas3,Cas4,Cas1,Cas2)，两侧分别与CRISPRIC01和CRISPRIC02相比邻，且DevR与Cas5，Cas3与Cas4有碱基重叠。
图2pKCSV14-16k质粒构建过程图；
图3svu016基因编辑转化株PCR检测电泳图；svu016基因编辑转化株PCR检测电泳图；
泳道1-8为转化株基因组PCR产物，泳道9为空白菌基因组扩增产物，M为GM347Marker；
图4敲除菌扩增出的svu016基因测序结果。
具体实施方式
本发明所说的是一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及基因编辑操作方法，下面结合具体施例进一步的作说明，旨在更好的解释本发明的内容，以下施例不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明匀采用如下材料：
1)菌种
宿主为StreptomycesvirginiaeIBL14，敲除辅助质粒pKC1139。
2)培养基
种子培养基(FM培养基)
NH4Cl3.0g，K2HPO4·3H2O1.55g，NaH2PO4·2H2O0.85g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O10.0mg，FeSO4·7H2O1.0mg，ZnSO40.1mg；加自来水至1000ml，灭菌前pH调为7.0，然后加葡萄糖3.0g,酵母粉3.0g玉米浆3.0g,β-环糊精3.0g。
转化培养基(R2YE培养基)
蔗糖103g/L，K2SO40.25g/L，MgCl2·6H2O10.12g/L，葡萄糖10g/L，酪蛋白0.1g/L，酵母粉5g/L，TES5.73g/L，微量元素(Fe2(SO4)·6H2O0.01g，CuSO4·5H2O0.001，ZnSO4·5H2O0.001,MnSO4·H2O0.001；加蒸馏水至1000ml)2ml，琼脂22g/L，pH7.0(使用前融化并加入0.54％KH2PO410ml/L，2.5MCaCl2·2H2O8ml/L，20％L-脯氨酸15ml/L)。
P缓冲液(原生质体转化用)
蔗糖103g，K2SO40.25g,MgCl2·6H2O2.02g,微量元素溶液2ml，蒸馏水800ml灭菌后每80ml上述溶液中加入：0.5％KH2PO41ml,3.68％CaCl2·2H2O10ml,5.73％TES缓冲液(pH7.2)10ml。
所用试剂均为市售品。
实施例1(svu016基因敲除)
(1)基因svu016引物设计与DNA扩增
根据全基因组测序信息，设计基因svu016特异性引物016-F和016-R(表3)。提取维吉尼亚链霉菌IBL-14基因组DNA，使用上海生工生物工程股份有限公司生产的PfuDNAPolymerase进行svu016基因PCR扩增，反应条件：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃2min，2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(50μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的svu016全长基因片段备用。
(2)制备上、下游同源臂
根据svu016基因全序列(表2)设计svu016基因上游同源臂引物016-UF和016-UR、以及下游同源臂引物016-DF和016-DR(表3)(黑体加粗为overlapPCR互补序列)，且上同源臂上游引物含BamHI限制性内切酶酶切位点，下同源臂下游引物含EcoRI限制性内切酶酶切位点(下划线为酶切位点)。
以纯化的svu016基因DNA为模板，先分别扩增上、下游同源臂，反应条件为：95℃5min，94℃30s，66℃30s，72℃30s，2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(50μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化后的上、下游同源臂DNA片段备用。
(3)制备编辑模版片段
取上同源臂纯化产物与下同源臂纯化产物0.4μl混合作为模板，30μl反应体系进行overlapPCR，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性lmin，55℃退火1min，72℃延伸30s，一个循环后加人引物016-UF与016-DR各1μl，继续PCR，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化备用。
(4)制备靶向基因片段
含启动子J23119的guideDNA-SVU016gk01连接产物的靶向基因片段(表3)由滁州通用生物公司直接合成，首尾分别加上HindIII及XbaI酶切位点，中间依次是启动子J23119，spacer，repeat以及终止子(小写字母为酶切位点，单下划线为启动子J23119，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator)。
(5)构建基因编辑质粒pKCSV14-16k
将实施例1步骤(3)中获得的编辑模版片段通过BamHI限制性内切酶酶、EcoRI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过全式金T4连接酶将其连接到pKC1139质粒上，得编辑模版载体；将实施例1步骤(4)中的靶向基因片段通过HindIII限制性内切酶酶、XbaI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过全式金T4连接酶将其连接到得编辑模版载体上得到基因编辑质粒pKCSV14-16k。
(6)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备
在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入30ml的FM培养基(加0.15gGlycine)，接种100μl的孢子悬液，于30℃摇床中培养24-36h。将培养物倒入50ml已灭菌的离心管中中，用无菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一离心管中，然后3000rpm离心10min。弃上清，将菌丝体悬浮于15ml的10.3％的蔗糖溶液中，3000rpm离心10min，弃上清。同此法洗两次。取1ml菌丝体，加入4ml的溶菌酶(上海生工生物工程股份有限公司生产)溶液(溶菌酶母液为50mg/mlPBuffer，终浓度为2mg/ml，用PBuffer稀释)，于30℃水浴30-60min(间隔七八分种轻轻摇动)至上清呈乳状。加入5ml的PBuffer并用5ml的吸管吹吸几次，继续温浴10min(使大量的原生质体释放出来)。用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的离心管中，3000rpm离心7min。原生质体沉淀呈黄色。弃上清，轻柔打散原生质体，用PBuffer洗两次(洗去溶菌酶)。每次仍使用3000rpm离心7min。弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于-70度保存备用。
(7)基因编辑质粒pKCSV14-16k转化
将基因编辑质粒pKCSV14-16k转化到维吉尼亚链霉菌IBL-14原生质体中，在R2YE固体培养基中30℃培养，待平板呈雾状后涂布1ml(含50mg/ml的安普霉素溶液30μl)无菌水溶液、覆盖，超净台吹干后30℃培养约30min得到svu016基因敲除重组子。
(8)重组子染色体PCR和基因测序分析
挑取8株转化株基因组作为模板，再以步骤(1)svu016基因引物016-F/016-R进行PCR扩增反应，反应条件：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃2min，2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(25μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，8株重组子染色体DNA扩增条带均减少预期的400bp(图4)，经通用生物系统(安徽)有限公司测序证明svu016基因已成功敲除掉，所得目的重组子为svu016基因敲除重组子。
实施例2(氯霉素抗性基因插入)
(1)基因svu016引物设计与DNA扩增
同实施例1步骤(3)。
(2)制备上、下游同源臂以及氯霉素基因
上下游同源臂扩增同实施例1步骤(2)。氯霉素基因引物cm-F和cm-R(表3)。以纯化的氯霉素基因DNA为模板，扩增氯霉素基因，反应条件为：95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(50μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化后氯霉素DNA片段备用。
(3)制备编辑模版片段
取上同源臂纯化产物和氯霉素基因纯化产物0.4μl混合作为模板，30μl反应体系进行overlapPCR，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性lmin，55℃退火1min，72℃延伸1min，一个循环后加人引物016-UF与cm-R各1μl，继续PCR，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸90s，进行30个循环，72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化备用。接着取上同源臂纯化产物和氯霉素基因结合后纯化产物及下同源臂纯化产物0.4μl混合作为模板，30μl反应体系进行overlapPCR，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性lmin，55℃退火1min，72℃延伸90s，一个循环后加人引物016-UF与016-R各1μl，继续PCR，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环，72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化备用。
(4)制备靶向基因片段
同实施例1步骤(4)
(5)构建基因编辑质粒pKCSV14-16cm
同实施例1步骤(5)。
(6)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备
同实施例1步骤(6)。
(7)基因编辑质粒pKCSV14-16cm转化
同实施例1步骤(7)。
(8)重组子筛选
挑去板上长出的单菌落到FM培养基中，42℃培养2h待质粒自杀后，取10μl菌液分别涂布到含有安普霉素和氯霉素的FM培养基上，24h后含有安普霉素的培养基中没有菌落长出而含有氯霉素的培养基中有菌体长出，挑取单菌落进行菌落PCR，重组子染色体DNA扩增条带均增加预期的300bp，同时测序正确。
实施例3(svu016基因无痕点突变)
(1)基因svu016引物设计与DNA扩增
同实施例1步骤(3)。
(2)制备点突变编辑模版片段
点突变编辑模版片段SVU016C352T由滁州通用生物公司直接合成，首尾分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，在此编辑模板片段上将蛋白活性位点352位半胱氨酸密码子序列突变成苏氨酸密码子序列，同时为了保证打靶正确，将活性位点附近的氨基酸密码子序列修改成其简并序列(表3)。
(3)制备靶向基因片段
同实施例1步骤(4)制备靶向基因guideDNA-SVU016C352T。(表3)
(4)构建基因编辑质粒pKCSV14-SVU016C352T
同实施例1步骤(5)。
(5)维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备
同实施例1步骤(6)。
(6)基因编辑质粒pKCSV14-SVU016C352T转化
同实施例1步骤(7)。
(7)重组子筛选
挑去板上长出的单菌落到含有安普霉素的FM培养基中，30℃培养24h后，取10ul菌液涂布到含有安普霉素的FM培养基上，待长出单菌落后挑取单菌落进行菌落PCR，以实施例1步骤(1)中svu016基因引物016-F/016-R进行PCR扩增反应，反应条件：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃2min，2.5U生工公司生产的PfuDNAPolymerase(25μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测后送至通用生物系统(安徽)有限公司测序，测序结果证明svu016活性位点半胱氨酸被突变成苏氨酸。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (8)

1.一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统,其特征在于：所述的维吉尼亚链霉菌IBL14包括18个CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统。
2.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统,其特征在于：所述的18个CRISPR与一个含有7个蛋白基因的CasI-SV14B型基因编辑系统包括：18个CRISPR核酸序列SV01-18和7个CasI-SV14B型基因Cas1-6，DevR。
3.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统，其特征在于：所述的18个CRISPRSV01-18具有附表1中所描述的核酸序列，其CRISPR核酸序列数可多于或少于18个。
4.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统，其特征在于：7个CasI-SV14B型基因顺序为Cas6,DevR,Cas5,Cas3,Cas4,Cas1,Cas2，两侧分别与CRISPRIC01和CRISPRIC02相比邻，且DevR与Cas5，Cas3与Cas4有碱基重叠，且基因编辑过程中所需Cas基因数可包含全部7个基因或只含其中的Cas3,Cas5,Cas6和DevR。
5.一种应用如权利要求1所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）基于所述的基因编辑系统进行靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建；
（2）维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的验证。
6.根据权利要求5所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于，
所述的靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤包括：
（1）根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因组测序的数据和信息，得到靶向基因DNA序列信息；
（2）使用PfuDNA聚合酶通过聚合链式反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别和切割位点以及overlapPCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段；
（3）利用overlapPCR将上下同源臂结合起来构建编辑基因模版；
（4）直接合成靶向基因片段，首尾分别包含启动子J23119和RNA终止子；（5）根据限制性酶切位点上的粘性末端将步骤（3）、步骤（4）获得的DNA片段连接到pKC1139上得到基因编辑质粒pKCSV14，即可。
7.根据权利要求5所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于，
所述的维吉尼亚链霉菌IBL14原生质体制备及基因编辑载体的转化与重组菌株的验证步骤包括：
（1）在含链霉菌的高渗溶液中添加溶菌酶制备链霉菌原生质体；
（2）将靶向基因片段与编辑模版片段的设计及载体的构建步骤中得到基因编辑质粒pKCSV14转化到维吉尼亚链霉菌原生质体中得到基因编辑后的重组子；
（3）对重组子染色体进行PCR和基因测序分析确证基因编辑后的目的重组菌株。
8.根据权利要求5所述的一种应用所述的维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统进行基因编辑的方法，其特征在于：所述的基因编辑指的是应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统对维吉尼亚链霉菌的遗传物质进行基因敲除、插入、无痕点突变及任意组合。
CN201511002817.3A 2015-12-25 2015-12-25 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法 Pending CN105543266A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511002817.3A CN105543266A (zh) 2015-12-25 2015-12-25 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511002817.3A CN105543266A (zh) 2015-12-25 2015-12-25 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105543266A true CN105543266A (zh) 2016-05-04

Family

ID=55822824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511002817.3A Pending CN105543266A (zh) 2015-12-25 2015-12-25 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105543266A (zh)

Cited By (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
CN106755037A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I‑B‑sv14型CAS基因编辑系统
CN106834323A (zh) * 2016-12-01 2017-06-13 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
CN107475169A (zh) * 2017-09-19 2017-12-15 安徽大学 一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法
CN107523583A (zh) * 2017-09-19 2017-12-29 安徽大学 一种源于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas5‑3的原核基因编辑方法
CN107557378A (zh) * 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法
CN107630041A (zh) * 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14 I‑B型Cas系统的真核基因编辑方法
CN107630042A (zh) * 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10227581B2 (en) 2013-08-22 2019-03-12 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
WO2019056848A1 (zh) * 2017-09-19 2019-03-28 安徽大学 一种基于I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3的基因编辑方法
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
CN110438141A (zh) * 2019-05-13 2019-11-12 安徽大学 一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法
CN110438142A (zh) * 2019-05-13 2019-11-12 安徽大学 一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN117025651A (zh) * 2023-10-08 2023-11-10 西北农林科技大学深圳研究院 一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014186435A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for reducing neointima formation
CN106755037A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I‑B‑sv14型CAS基因编辑系统

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014186435A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for reducing neointima formation
CN106755037A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I‑B‑sv14型CAS基因编辑系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IBTISSEM GRISSA等: "The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats", 《BMC BIOINFORMATICS》 *
狄慧玲等: "食源性单核细胞增生李斯特菌CRISPR结构的研究", 《现代食品科技》 *

Cited By (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10227581B2 (en) 2013-08-22 2019-03-12 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
CN106834323A (zh) * 2016-12-01 2017-06-13 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法
CN106755037A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I‑B‑sv14型CAS基因编辑系统
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN107630042A (zh) * 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法
EP3556860A4 (en) * 2017-09-19 2020-09-02 Anhui University GENEDITATION PROCESS BASED ON GEN CAS3 FROM THE TYPE I-B CRISPR CAS SYSTEM
CN107475169A (zh) * 2017-09-19 2017-12-15 安徽大学 一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法
CN107523583A (zh) * 2017-09-19 2017-12-29 安徽大学 一种源于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas5‑3的原核基因编辑方法
WO2019056848A1 (zh) * 2017-09-19 2019-03-28 安徽大学 一种基于I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3的基因编辑方法
CN107557378A (zh) * 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法
CN107630041A (zh) * 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14 I‑B型Cas系统的真核基因编辑方法
US11286506B2 (en) 2017-09-19 2022-03-29 Anhui University Type I-B CRISPR-Cas system gene Cas3-based gene editing method
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
CN110438141A (zh) * 2019-05-13 2019-11-12 安徽大学 一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法
CN110438142A (zh) * 2019-05-13 2019-11-12 安徽大学 一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN117025651A (zh) * 2023-10-08 2023-11-10 西北农林科技大学深圳研究院 一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法
CN117025651B (zh) * 2023-10-08 2023-12-19 西北农林科技大学深圳研究院 一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105543266A (zh) 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法
CN105505976A (zh) 一种维吉尼亚链霉菌ibl14产青霉素重组菌株的构建方法
CN108546716A (zh) 一种基因组编辑方法
CN106906240A (zh) 运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法
CN105358694B (zh) 来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子
CN107557373A (zh) 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法
CN107365793A (zh) 一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法
CN111057654B (zh) 一种适用于巴戟天内生真菌A761的Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用
CN104726478A (zh) 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用
CN104673814B (zh) 一种来自于阴沟肠杆菌的l‑苏氨酸醛缩酶及其应用
CN101413006B (zh) 一种干旱诱导的水稻花特异性启动子及其应用
CN107475169A (zh) 一种基于Ｉ型Cas系统中Cas7和Cas3的原核生物基因编辑方法
CN112920984A (zh) 一种构建基于甲酸和co2生长的重组菌株的方法与应用
CN107488639A (zh) 甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用
JPS6152279A (ja) リゾビウム・ジヤポニカムのｎｉｆプロモ−タ−
CN115927425A (zh) 一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用
CN111139207B (zh) 一种短短芽孢杆菌基因重组菌株及其制备方法和应用
CN101659960A (zh) 甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法
CN102174553A (zh) 一种松鼠葡萄球菌脱皮毒素c蛋白的制备方法
CN107810269A (zh) 新颖的启动子及其用途
CN102174539A (zh) 杀粉蝶菌素a1生物合成基因簇
CN110468091A (zh) 微生物及其用途
CN112852697B (zh) 一种重组菌株及制备天麻苷元的方法
CN111349649B (zh) 一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用
CN113337537B (zh) OsCDKB1；1蛋白及其编码基因在水稻耐盐中的功能与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160504

RJ01 Rejection of invention patent application after publication