CN102174553A

CN102174553A - 一种松鼠葡萄球菌脱皮毒素c蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN102174553A
Application number: CN2010106239380A
Authority: CN
Inventors: 郑世军; 李海花
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明涉及一种松鼠葡萄球菌脱皮毒素C蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)以松鼠葡萄球菌基因组DNA为模板，扩增松鼠葡萄球菌脱皮毒素C基因全长，克隆到原核表达载体中，获得重组质粒；(2)将重组质粒进行大肠杆菌转化，用IPTG诱导蛋白表达；(3)提取蛋白粗提液并进行ExhC蛋白纯化。该方法利用基因工程技术成功实现ExhC在大肠杆菌中的高效表达，获得具有生物学活性的高纯度高浓度的ExhC，并且操作简单、成本低廉。

Description

一种松鼠葡萄球菌脱皮毒素C蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种松鼠葡萄球菌脱皮毒素C蛋白的制备。

背景技术

松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)是引起人心内膜炎、腹膜炎、败血病性休克、尿路感染、盆腔炎和伤口感染的病原。2006年本实验室从患有渗出性皮炎的猪心包液中分离到一株高致病性松鼠葡萄球菌(Chen et al.，2007)。猪渗出性皮炎又称“猪油皮病”，是一种以皮肤油脂样渗出、表皮脱落、小水泡形成以及体表痂皮结壳为特征的高度接触性急性传染病，除了松鼠葡萄球菌外，常见引起本病的病原还有某些致病性猪葡萄球菌(S.hyicus)。据报道，目前已发现了6种脱皮毒素，ExhA、ExhB、ExhC、ExhD、ShetA和ShetB(Devriese et al.，1977；Wegener et al.，1993)，但针对具体的某一株病原，可能只有一种或几种脱皮毒素存在。

目前制备脱皮毒素的方法有三种：

1)、利用脱皮毒素是一种分泌型外毒素这一特点，早期研究者通过培养产生脱皮毒素的猪葡萄球菌，收集含有脱皮毒素的培养液上清(Amesberg，1979；Sato et al.，1991；Wegener et al.，1993)。此法获得的脱皮毒素混有大量的杂蛋白，并且毒素浓度低不利于后续的研究。

2)、在上述方法的基础上，研究者又采用饱和硫酸铵沉淀和层析法分离纯化猪葡萄球菌培养液上清中的脱皮毒素SHETA和SHETB(Tanabe et al.，1993；Sato et al.，1999)。该方法步骤繁琐，首先需要摸索合适的饱和硫酸铵浓度，该浓度既要使脱皮毒素沉淀，又要保护脱皮毒素的活性，然后沉淀下来的蛋白还需要经Sephadex G-75凝胶层析分段收集洗脱的各个洗脱峰，最后再分析各个洗脱峰中蛋白的脱皮活性。此方法与第一种方法相比，可以获得较高纯度的脱皮毒素，但利用野生型菌株来制备毒素，其生产率低，培养条件苛刻、获取蛋白的过程繁杂，生产成本高。

3)、利用基因工程技术表达脱皮毒素。该方法操作简单、成本低廉、可以快速大规模生产目的蛋白，而且蛋白的纯度较高。但目前此方法主要应用于猪葡萄球菌脱皮毒素的制备(Ahrens & Andresen，2004；Fudaba et al.，2005)，对松鼠葡萄球菌脱皮毒素的详细制备过程却未见报道。

目前已经证实松鼠葡萄球菌在基因水平存在ExhC部分序列(Chen et al.，2007)，但该菌是否产生脱皮毒素、该毒素的致病机制以及我国渗出性皮炎的发生与脱皮毒素的关系目前还未见报道，因此需要制备高纯度的松鼠葡萄球菌脱皮毒素C蛋白，一方面可以进行ExhC基础和临床的相关研究，另一方面可以作为优良的抗原，通过动物免疫获得抗ExhC单克隆抗体，有助于ExhC致病机制的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有生物活性的松鼠葡萄球菌脱皮毒素C蛋白的制备方法。本发明的目的是这样实现的：

(1)ExhC基因重组质粒的构建

按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取松鼠葡萄球菌基因组(李海花等，2009)。根据GenBank已发表的ExhC全基因核苷酸序列(登陆号：AF515455)设计引物如下：上游引物(ExhC-F)5′-CCGCCATGGCTATGCATTCAAAACTATTAAGTAAAT-3′，下游引物(ExhC-R)5′ATAGCGGCCGCTTTAATTAATTGTTTGAGATCTCTAATGAG-3′，上下游引物分别引入NcoⅠ和NotⅠ酶切位点(下划线)及相应的保护性碱基。采用PCR的方法扩增ExhC基因全长，经NcoⅠ和NotⅠ酶切后，克隆到pET-28a(+)载体中，同时在ExhC的羧基端引入载体中的6×His标签，获得重组质粒pET-28a(+)-ExhC。NcoⅠ和NotⅠ双酶切初步鉴定阳性克隆，基因测序由诺赛基因公司完成。

(2)ExhC蛋白的获得

挑单菌落接种于LB液体培养基中(含50μg/ml卡那霉素)，37℃过夜振荡培养，按1％接种于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，加入IPTG至终浓度为1mM，30℃诱导培养6h后收集菌体，菌裂解产物经SDS-PAGE分离后得到大小约32KD的融合蛋白，用His标签单抗和抗松鼠葡萄球菌多克隆抗体经Western blot可以检测到特异条带的表达，证明为松鼠葡萄球菌ExhC特异蛋白。

(3)ExhC蛋白的纯化

诱导重组菌，收集并进行破碎，离心收集沉淀，即为蛋白包涵体，清洗包涵体后进行重悬破碎，离心收集上清，过滤上清收集滤液得到蛋白粗提物，用金属离子亲和层析柱纯化ExhC蛋白，收集各段洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯度。

所述金属离子为镍离子。

(4)ExhC蛋白的变性和重折叠

采用尿素变性、梯度透析复性方法对纯化的ExhC蛋白进行变性和重折叠以获得具有天然结构的ExhC。

(5)ExhC蛋白的生物学活性检测

用重折叠的ExhC蛋白刺激BHK-21和L-929细胞，显微镜下观察和用流式检测细胞变化，证明ExhC蛋白能够引起细胞死亡。

所述的松鼠葡萄球菌分离自患有渗出性皮炎的猪心包液，并具高致病性。

本发明利用基因工程技术成功实现ExhC在大肠杆菌中的高效表达，获得具有生物学活性的高纯度高浓度的ExhC，并且操作简单、成本低廉，为进一步研究脱皮毒素的致病机理以及我国渗出性皮炎的发生与脱皮毒素的关系奠定了基础。

附图说明

图1所示为ExhC基因扩增产物电泳图，图中M：Marker，1：ExhC，2：阴性对照；Marker片段大小自上到下依次为：4500bp，2000bp，1200bp，800bp，500bp，200bp。

图2所示为重组质粒pET-28a(+)-ExhC酶切鉴定电泳图，图中M：Marker；1：Not I和Nco I双酶切产物；Marker片段大小自上到下依次为：4500bp，2000bp，1200bp，800bp，500bp。

图3所示为ExhC表达的SDS-PAGE图，图中M：Marker；1：pET-28a(+)空载体；2：pET-28a(+)-ExhC；Marker片段自上到下依次为：116kD，66kD，45kD，35kD，25kD。

图4所示为抗His单抗鉴定ExhC表达的Western blot图，图中1：pET-28a(+)空载体；2：pET-28a(+)-ExhC；3：纯化后的ExhC。

图5所示为抗松鼠葡萄球菌多克隆抗体鉴定ExhC表达的Western blot图，1：pET-28a(+)空载体；2：pET-28a(+)-ExhC；3：纯化后的ExhC。

图6所示为纯化后的重组蛋白ExhC的SDS-PAGE图，图中M：Marker；1：pET-28a(+)空载体；2：ExhC蛋白粗提液；3：穿透液；4：5mM咪唑洗脱液；5：10mM咪唑洗脱液；6：纯化的ExhC；Marker片段大小自上到下依次为：116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD。

图7所示为重组蛋白ExhC生物学活性检测图，A：Tris缓冲液对照，B：ExhC。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 ExhC原核表达载体的构建

按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取松鼠葡萄球菌基因组。根据GenBank已发表的ExhC全基因核苷酸序列(登陆号：AF515455)设计引物如下：上游引物(ExhC-F)5′-CCGCCATGGCTATGCATTCAAAACTATTAAGTAAAT-3′，下游引物(ExhC-R)5′-ATAGCGGCCGCTTTAATTAATTGTTTGAGATCTCTAATGAG-3′，上下游引物分别引入NcoⅠ和NotⅠ酶切位点(下划线)及相应的保护性碱基。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应程序：94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，循环30次，72℃终延伸10min，扩增得到ExhC的全长(图1)。PCR产物切胶回收，经NcoⅠ和NotⅠ酶切后，克隆到pET-28a(+)、pET-20b(+)和pET-32a(+)载体中，同时在ExhC的羧基端引入载体中的6×His标签，获得重组质粒pET-28a(+)-ExhC、pET-20b(+)-ExhC和pET-32a(+)-ExhC。NcoⅠ和NotⅠ双酶切初步鉴定阳性克隆(图2)，基因测序由诺赛基因公司完成。

实施例2重组质粒pET-28a(+)-ExhC在大肠杆菌中的表达

将鉴定正确的重组质粒pET-28a(+)-ExhC转化E.coli BL 21。挑单菌落接种于LB液体培养基中(含50μg/ml卡那霉素)，37℃过夜振荡培养。按1％接种于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.7。加入IPTG至终浓度为1mM，30℃诱导培养6h后收集菌体，同时设只含表达载体pET-28a(+)的E.coli BL 21对照。菌裂解产物经12％SDS-PAGE分离，考马斯亮兰染色，脱色，得到大小约32kD的融合蛋白(图3)。蛋白经SDS-PAGE分离后，电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。5％脱脂奶粉4℃过夜封闭，小鼠抗6×His单克隆抗体(1∶1000)室温孵育2h，TBST洗涤10min×3次，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶8000)室温孵育1h。TBST洗涤10min×3次，按Western发光检测试剂盒使用说明配制发光检测液，并将其转移到蛋白膜上，室温孵育5min，通过X光片曝光检测6×His蛋白的存在(图4)。兔抗松鼠葡萄球菌多克隆抗体(1∶500)室温孵育2h，TBST洗涤10min×3次，HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶8000)室温孵育1h。以下操作同6×His蛋白的检测方法，进行ExhC蛋白的鉴定，也检测到了ExhC蛋白的存在(图5)。而重组质粒pET-20b(+)-ExhC和pET-32a(+)-ExhC通过上述的Western杂交的方法鉴定，既没有检测到6×His蛋白的信号，也没有检测到ExhC的信号。

实施例3ExhC蛋白的纯化

蛋白纯化之前应分析重组6×His融合蛋白的可溶性，方法参考Bio-Scale Mini IMAC Cartridge使用说明。蛋白纯化简述如下：诱导重组菌200ml，8000rpm，4℃离心10min收集菌体，用10ml工程菌裂解液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10％甘油，10mM DTT，100μg/ml溶菌酶，pH 8.0)重悬菌沉淀，4℃作用1h后冰浴超声破碎细胞，10000rpm，4℃离心20min，沉淀即为包涵体。用10ml工程菌洗涤液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10％甘油，0.1mMDTT，1％Triton X-100，pH 8.0)洗涤包涵体，10000rpm，4℃离心20min，收集沉淀，重复洗涤一次。用6ml变性洗涤缓冲液Ⅰ(50mMTris-HCl，50mM NaCl，0.1％Tween 20，8M尿素，5mM咪唑，pH8.0)重悬包涵体，冰浴超声破碎包涵体。12000rpm，4℃离心30min，收集上清，0.2μM滤器过滤上清，滤液即为蛋白粗提物。用1ml镍离子亲和层析柱纯化蛋白，即依次加入5ml变性洗涤缓冲液Ⅰ平衡柱子；加入蛋白粗提物，流速为0.2ml/min；加入6ml变性洗涤缓冲液Ⅰ洗脱柱子；加入6ml变性洗涤缓冲液Ⅱ(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.1％Tween 20，8M尿素，10mM咪唑，pH 8.0)洗脱柱子；加入4ml洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.1％Tween 20，8M尿素，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱6×His融合蛋白，流速为0.2ml/min。收集各段洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化。利用紫外吸收法测定ExhC蛋白浓度，-80℃保存备用。

实施例4ExhC蛋白的变性和重折叠

方法参考文献(Warner et al.，2007)并进行改进。简述如下：先用蛋白变性溶液(50mM Tris-HCl，100mM KCl，10％甘油，20mMDTT，0.1mM PMSF，8M尿素，pH8.0)将纯化的ExhC稀释到40μg/ml，于250rpm摇床中室温作用2h，再将变性的ExhC蛋白液逐步在预冷的溶液1(50mM Tris-HCl，100mM KCl，10％甘油，0.75ML-精氨酸，5mM DTT，0.1mM PMSF，6M尿素，pH8.0)、溶液2(50mM Tris-HCl，100mM KCl，10％甘油，1.1M L-精氨酸，2mMDTT，0.1mM PMSF，4M尿素，pH8.0)和溶液3(50mM Tris-HCl，100mM KCl，10％甘油，0.55M L-精氨酸，1mM DTT，0.1mM PMSF，2M尿素，pH8.0)中4℃透析12h，然后将重折叠蛋白液在预冷的Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM KCl，10％甘油，pH7.5)中连续4℃透析3次，10h/次，最后用10Kd超滤管将重折叠蛋白液浓缩到10mg/ml，-80℃保存备用。

实施例5ExhC蛋白生物学活性检测

将BHK-21和L-929细胞分别接种于96孔培养板，37℃，5％CO₂培养，待细胞生长至30％～40％融合度时，用含2％血清的DMEM将重折叠的ExhC稀释成500μg/ml，刺激6h后在显微镜下观察细胞生长情况。ExhC刺激BHK-21和L-929细胞后，能够引起这2种细胞死亡，流式检测进一步证实ExhC能够引起细胞死亡。图7所示是ExhC为500μg/ml刺激6h的结果。图7A为细胞在Tris缓冲液对照里的生长情况。在Tris缓冲液里，细胞生长良好，细胞轮廓清晰。图7B为细胞在含ExhC的溶液里的生长情况。ExhC刺激后的细胞，出现部分细胞崩解(如箭头处所示)，细胞轮廓模糊。

利用流式细胞术分析细胞死亡时发现，100μg/ml ExhC能够显著引起BHK-21细胞死亡。另外，在研究ExhC对巨噬细胞功能的影响时发现，25μg/ml ExhC能够诱导很强的免疫反应。这些试验结果说明，本研究制备的ExhC具有很高的生物学活性。

序列说明：

SEQ ID No.1和2分别为松鼠葡萄球菌脱皮毒素C基因(ExhC)的核苷酸序列和ExhC蛋白的氨基酸序列，SEQ ID No.3和4分别是引物ExhC-F和ExhC-R。

Claims

1.一种松鼠葡萄球菌脱皮毒素C蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)以松鼠葡萄球菌基因组DNA为模板，用SEQ ID No.3和SEQID No.4所示的引物进行PCR反应，扩增松鼠葡萄球菌脱皮毒素C基因全长，经NcoⅠ和NotⅠ酶切后，克隆到原核表达载体中，获得重组质粒；

(2)将重组质粒进行大肠杆菌转化，经NcoⅠ和NotⅠ双酶切鉴定阳性克隆，用IPTG诱导蛋白表达，蛋白经SDS-PAGE检测和Western杂交检测，证明为松鼠葡萄球菌ExhC特异蛋白，并且筛选能够稳定高效表达ExhC的克隆株；

(3)提取蛋白粗提液，利用金属离子亲和层析柱纯化ExhC蛋白，经SDS-PAGE检测证明获得高纯度的ExhC蛋白；

(4)采用尿素变性、梯度透析复性方法对纯化的ExhC蛋白进行变性和重折叠获得具有天然结构的ExhC。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述原核表达载体为pET-28a(+)。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述大肠杆菌的菌株为BL21。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述IPTG的终浓度为1mM。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述金属离子亲和层析柱为镍离子亲和层析柱。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述筛选能够稳定高效表达ExhC的克隆株按如下步骤进行：挑取多株克隆并进行连续传代5次后，采用SDS-PAGE方法分析各个克隆的表达量，最后筛选出能够稳定高效表达ExhC的克隆株。