CN102175862A - 一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的elisa方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法。该ELISA方法是将一种猪葡萄球菌脱落毒素包被在基材上，用封闭液进行封闭，然后加入被检样品进行反应；再加入标记物标记的二抗反应，然后加入底物显色，最后根据P/N值来判定抗体的高低。本发明所述的ELISA方法敏感性好、重复性好、特异性高、操作方便。

Description

一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法

技术领域

本发明涉及一种ELISA方法，特别涉及一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法。

背景技术

葡萄球菌产生的脱落毒素可以引起人和动物发生严重的皮肤性疾病。例如金黄色葡萄球菌可引起人的烫伤样皮肤综合症，猪葡萄球菌可引起仔猪发生渗出性皮炎。目前发现的脱落毒素有8种，包括金黄色葡萄球菌产生的ETA、ETB和ETD，以及猪葡萄球菌产生的EXHA、EXHB、EXHC和EXHD、SHETA、SHETB。

猪葡萄球菌S.hyicus可以引起猪群发生大规模的渗出性皮炎病(Exudative Epidermitis，EE)，它是一种急性、高度接触性的猪传染病，患猪以急性全身性渗出性皮炎为主要特征，该病又称溢脂性皮炎或煤烟病。本病主要感染5-6日龄的初生哺乳仔猪、刚断奶的仔猪以及母猪乳房上。该病原可通过各种途径感染，主要以破裂和损伤的皮肤黏膜引起动物的感染。据国内外的研究结果表明它的发病率为80％；死亡率5％～90％不等；少数存活的病猪常导致生长发育障碍形成“僵猪”。猪葡萄球菌首先在丹麦被研究人员发现，到目前为止已经波及到欧洲和亚洲的各个国家，并且有上升的趋势。据泰国对规模化猪场保育猪的10种主要疾病统计，渗出性皮炎发生率为25.3％，仅次于链球菌病(31.6％)，名列第2位。在美国最常见的保育猪疾病是链球菌病、渗出性皮炎。据相关报道，邓朝阳，甘海霞等于2001年报道了广西某猪场发生的渗出性皮炎的流行状况及治疗情况；殷凤斌，米瑞娟等在2002年报道了发生在东北的猪渗出性皮炎的病原鉴定；郑金燥于2005年报道了福建省德化县两例猪渗出性皮炎中西医结合的诊治情况；睢艳平，徐镔蕊等在2006年报道该病在北京的发病情况；包小华、操传斌等于2008年报道了猪葡萄球菌引起人的多器官功能衰竭的病例；杨先富^[10]等于2009年报道了猪葡萄球菌病的诊断与治疗情况，所有报道均显示该病已成为一种新的影响人类健康和养猪业发展的重要疫病之一。

猪葡萄球菌所产生的这些脱落毒素是造成猪渗出性皮炎的主要致病因子之一，它是一种细胞外分泌的蛋白质，分子量大约30KD。丹麦研究者首先通过PCR和Western-blot对产生的脱落毒素进行了分析和研究，将脱落毒素分为4种类型，并分别命名为EXHA、EXHB、EXHC、EXHD，其中EXHD的抗原性不同于其他3种毒素的抗原性。研究结果还表明EXHA、EXHB这两种毒素蛋白是一种金属蛋白，他们的分泌和一些二价金属离子有密切的关系，在培养基中加入二价金属离子比未加入二价金属离子产生的EXHA、EXHB毒素蛋白的量高一倍。这4种脱落毒素的基因大小约为816bp～834bp，这些基因携带一些质粒，并受这些质粒的调控。在日本，研究人员在对猪葡萄球菌的研究中发现了另外两种毒素蛋白，分别命名为SHETA、SHETB。另外，猪葡萄球菌引起的渗出性皮炎主要与DSG1(桥粒核心蛋白)有关，DSG1是一种钙依赖性蛋白，EXHA、EXHB、EXHC和EXHD可以将这种靶蛋白裂解，从而导致真皮表面的角化细胞发生脱落，引起猪群发生渗出性皮炎。猪葡萄球菌的这些复杂结构可能在不久的将来成为我们关注的一个热点。虽然，在丹麦和日本已经有了一些相关的研究，大多都是研究其致病机理，对该病在临床上的诊断研究还较少，特别是在鉴别诊断上还难以将其他的皮肤病区分开。临床上缺少一种快速高效、简便易操作的诊断方法。因此，本研究通过对这六种脱落毒素基因的克隆表达，纯化出纯度在90％以上的重组蛋白质，以此为抗原来包被具有高吸附性的材料上，建立一种检测ExhA、ExhB、ExhC、ExhD、ShetA、ShetB等毒素抗体的诊断试剂盒，从而解决该病在临床上诊断的不便之处。

目前，采用的诊断方法有临床症状、病理变化、细菌学的分离鉴定、生化试验、冰冻组织切片、PCR、免疫印迹分析和ELISA等。

根据症状和病理变化的诊断是临床诊断中最基本的方法。通常发病猪的表现为不发热，全身皮肤粘胶样渗出，恶臭，形成黑色痂皮，肥厚干裂等，其外观和在同一窝小猪中严重程度不同，这些都是该病的特征。

细菌学方法如下：通常是采取化脓的皮肤、组织或脓性渗出物等做涂片和分离培养，经革兰氏染色后，用显微镜观察，并依据细菌的形态、排列和染色特性等进行诊断；另外，猪葡萄球菌具有一个独特的生物学特性，在血平板上不发生溶血现象，在麦康凯培养基上不生长。

生化试验过程如下：猪葡萄球菌可以发酵大多数糖类，产酸产气，为兼性厌氧菌。取1mL 3％的过氧化氢倾注于含有大量菌落的普通琼脂平板上，有气泡产生；凝血酶阴性，DNA酶、酯酶、透明质酸酶阳性，甘露醇和羟基丁酮阴性；在有条件的情况下可以采用选择性指示培养基(Devriese，1977)或者Staph-Zyum试验(LammLer，1989)来确定分离的葡萄球菌是否为猪葡萄球菌。

RT-PCR扩增方法如下：国外有很多研究者对猪葡萄球菌产生的脱落毒素设计了6对特异性引物，对疑似发生猪渗出性皮炎的病猪分离细菌，抽提全基因组DNA，以此为模板，进行扩增；然后克隆测序在NCBI上进行比对，从而来对6种毒素基因进行检测。但它也有一定的局限性，那就是对样本DNA的纯度要求很高，为了提高多重PCR方法的敏感性必须用专用的DNA提取试剂盒。

免疫印迹试验过程如下：通过PCR鉴定出的含有毒素的菌株，利用这些有毒菌株制备单克隆抗体和多克隆抗体，分析各种毒素蛋白的免疫学特性。

现有的ELISA方法如下所述：在丹麦，研究人员通过PCR鉴定出含有毒素基因的菌株后，经分离培养后进行灭活，以灭活的全菌作为抗原来建立一种ELISA鉴定方法，虽取得了一定效果，但是该方法可靠性差。

另外，由于猪葡萄球菌在嗜菌型、血清型和DNA指纹型方面具有多型性(Andresene tal，1993)，发病猪中同时存在不同型的S.hyicus，从而使诊断变得复杂。Wegener发现从每个病猪的皮肤上任选分离出的10株S.hyicus中，平均包含1.9种不同的噬菌体型和2.3种不同的抗生素型。从动物肝、脾中分离到的菌株的多样性则稍低一些。目前，在实验室诊断中缺少简易方法来区分毒力型和非毒力型菌株，所以各型S.hicus都应被看做潜在的毒力型菌株。但是，由于引起该病的病因很复杂，而且易与其它皮肤病变混淆，如脂痘，疥癣，癣，玫瑰糖疹，缺锌，增生性皮肤病等。因此，在诊断过程中要选择特异性强、灵敏度高的检测方法进行鉴别诊断。

总之，以上这些方法虽然已经得到了推广应用，但是都存在一定的缺陷，对实际生产的指导意义不大。因此，建立一种快速、有效、简便的抗体诊断方法已迫在眉睫。为预防和控制该病在我国的蔓延以及对人类健康和养猪生产造成的威胁奠定基础。同时为制定合理的免疫程序提供有力保证。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，包括以下步骤：将一种猪葡萄球菌脱落毒素包被在基材上，用封闭液进行封闭，然后加入被检样品进行反应；再加入标记物标记的二抗，然后加入底物显色，最后根据P/N值来判定抗体的高低。

所述的猪葡萄球菌脱落毒素为EXHA、EXHB、EXHC和EXHD、SHETA或SHETB；

所述的基材包括96孔ELISA酶标板、洗板槽、封口膜、吸水材料等；

所述包被的条件优选为于0.05mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液中4℃包被12～16h，然后再于37℃包被2h；

所述的封闭液优选为质量体积比3％的牛血清白蛋白；

所述封闭的条件优选为4℃封闭过夜；

所述的被检样品优选按体积1∶80稀释后再加入基材中；

所述的标记物优选为辣根过氧化物酶；

所述标记物标记的二抗优选为HR标记物标记的IgG；

所述的底物为能与标记物发生反应显色的化学药品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明敏感性好、重复性好、特异性高、操作方便。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)基因工程方法制备脱落毒素EXHB，具体步骤如下：

猪葡萄球菌ExhB基因的构建和转化见参考文献(杨彩娟等.猪葡萄球菌ExhB基因在E.coli中的表达及生物学活性分析.中国兽医学报，2009，29(4)：399～402)。

融合蛋白的大量诱导表达：挑单个E.coli BL21转化体接入3mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养过夜进行活化，按体积百分比1％的量接种500mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中进行扩大培养，37℃200rpm培养至其OD₆₀₀值为0.6左右，加入1PTG使其终浓度为1mmol/L。然后再在37℃恒温振荡器上以200rpm继续诱导培养4h后，12000rpm离心10min，收集菌体，弃上清，尽量去除培养基，再用预冷的PBS洗涤一次，12000rpm离心10min，收集菌体并称量菌体湿重克(g)数。

重组蛋白的纯化：将收集的湿菌按每100mL培养基所得菌体加入40mL平衡缓冲液(Buffer A：0.1M NaH₂PO₄、0.01M Tris-Cl，pH 8.0)比例重悬菌体。细胞悬液中加入溶菌酶(终浓度为100mg/mL)，上下吹打混匀，37℃孵育15min。将重悬菌液至于合适容器中，超声波破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或者盐冰浴中。超声条件：每次超声4s，间隔10s，共25min(裂解次数根据菌体浓度和体积来确定)，功率300W。裂解后的菌液于4℃10000rpm离心20min，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。移去上清，按每100mL培养基加5mL缓冲液比例，加入Buffer B缓冲液重悬沉淀(Buffer B：8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.01MTris-Cl，pH 8.0)，然后用0.45μM滤膜过滤上清，得到细菌粗提物。将细菌粗提物和树脂(Ni-NTA Agarose，506428A，invitrogen)按1∶1的体积比混合，孵育10分钟。分别用Buffer C(Buffer C：8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.01M Tris-Cl pH6.3)、Bufer D(Buffer D：8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.01M Tris-Cl pH 5.9)洗脱杂蛋白，改用Buffer E(Buffer E：8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.01M Tris-Cl pH4.5)洗脱目的蛋白。取少量的洗涤上清和重悬的沉淀，加入等量的2×SDS电泳上样缓冲液进行SDS-PAGE分析检查包涵体的洗涤情况。

包涵体的复性：纯化后的蛋白用PBS缓冲液(0.01mol/L)透析去除尿素，蛋白质重新形成包涵体，离心，去上清，收集沉淀。用适量的Buffer E重新溶解蛋白，以浓缩蛋白。

A、将浓缩蛋白溶于包涵体复性缓冲液(0.01mol/L PBS、1mmol/L EDTA，pH 8.0)中，加入3-环已胺-1-丙磺酸(CAPS Merker protein Refolding kit)，使其质量体积比为1％，加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度1mmol/L；

B、将蛋白转移到透析袋中，加入1×透析液(1M Tris-Cl，pH 8.0)和DTT(0.1mmol/L)4℃透析，透析6h以上；

C、倒掉透析液，重新加入1×透析液进行透析；

D、按照步骤C重复一次

E、12000rpm离心5min，去沉淀，测定上清中的蛋白浓度。

分别取少量的上清和重悬的沉淀，加入等量的2×SDS电泳上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳检查包涵体的复性，经Western blot检测表明，复性后的重组蛋白能被猪葡萄球菌多克隆阳性血清所识别具有良好的反应原性。

蛋白质浓度、纯度的测定及保存：

蛋白质浓度的测定：用紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm波长的光吸收值，按下式计算样品中的蛋白质含量：蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀)×稀释倍数。蛋白质纯度的测定：SDS-PAGE电泳检查纯化的蛋白。复性后蛋白的保存：将复性后的脱落毒素EXHB蛋白溶液过滤除菌，小量分装冻存于-70℃冰箱。

得到纯度为85％，浓度为0.375mg/ml脱落毒素EXHB蛋白。

(2)测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，步骤如下：

①ELISA试剂和溶液

I、包被液：(0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃                  1.59g

NaHCO₃                  2.93g

准确称量后，调pH值为9.6，定容到1000mL。

II、PBST洗涤缓冲液：(0.01mol/L PBS-T，含0.05％Tween-20，pH7.4)

Na₂HPO₄.12H₂O           2.91g

NaH₂PO₄.2H₂O            0.30g

NaCl                    8.50g

Tween-20                0.5mL

加蒸馏水至1000mL

III、封闭液液

质量体积比3％牛血清白蛋白(BSA)

准确量取后，分别溶于PBS-T洗涤缓冲液中。

IV、底物缓冲液(PH5.0磷酸柠檬酸)：

0.2M Na₂HPO₄(28.4g/L)25.7ml

0.1M柠檬酸(19.2g/L)  24.3ml

加蒸馏水50ml。

V、TMB(四甲基联苯胺)使用液：

TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml

底物缓冲液(PH5.5)    10ml

0.75％H₂O₂           32μl

VI、终止液(2mol/L H₂SO₄)

蒸馏水               177.8mL

浓硫酸(浓度为98％)   22.2mL。

②ELISA操作步骤：

I、将步骤(1)得到的重组纯化的脱落毒素EXHB蛋白包被在96孔酶标板上每孔100μL的脱落毒素EXHB，4℃过夜+37℃2h；

II、次日甩去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液在振荡器上振荡洗涤96孔酶标板3-5次，每次3min，每洗完一次在吸水材料上拍干，加入200μL的质量体积比为3％BSA封闭液4℃封闭过夜；

III、甩去孔内的液体，用PBST洗涤缓冲液在振荡器上洗涤96孔酶标板3～5次，每次3min，每洗完一次在吸水材料上拍干；

IV、加入稀释好的标准阴性血清(健康猪免疫前抽的血清)和阳性血清(用纯化后的脱落毒素EXHB蛋白免疫猪后的血清)，用含有体积比为3％的BSA和10％的胎牛血清的PBS-T作为血清稀释液，按1∶80倍稀释后每孔100μL作对照，取上述血清稀释液以1∶80倍稀释后的被检血清每孔加入100微升，37℃反应1h；

V、洗去未反应的抗体，洗涤步骤同步骤II；

VI、加入HRP标记的羊抗猪源IgG抗体(纯度＞90％，浓度大于2mg/ml此，二抗浓度是1∶10000稀释，每孔的用量是100μL)，37℃孵育30min，用PBST洗涤缓冲液振荡洗涤96孔酶标板3～5次，每洗完一次在吸水材料上拍干。同时加入底物显色液，A液(A液是pH5.0的磷酸柠檬酸)50微升，B液(B液是TMB使用液50微升，37℃反应15min。

显色后加入50微升体积的终止液终止反应，在酶标仪上用OD450读数，计算P/N值。应用该ELISA方法对送检的5个猪场的30份血清进行检测，结果显示10份血清呈阳性，血清的阳性率为33.3％。同时，进行批内重复性试验，试验结果(表1)显示本发明的重复性良好。

表1批内ELISA重复性试验

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于包括以下步骤：将一种猪葡萄球菌脱落毒素包被在基材上，用封闭液进行封闭，然后加入被检样品进行反应；再加入标记物标记的二抗反应，然后加入底物显色，最后根据P/N值来判定抗体的高低。

2.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述猪葡萄球菌脱落毒素为EXHA、EXHB、EXHC和EXHD、SHETA或SHETB。

3.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述的基材为96孔ELISA酶标板、洗板槽、封口膜或吸水材料。

4.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述包被的条件为于0.05mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液中4℃包被12～16h，然后再于37℃包被2h。

5.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述的封闭液为质量体积比3％的牛血清白蛋白。

6.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述封闭的条件为4℃封闭过夜。

7.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述的被检样品按体积1∶80稀释后再加入基材中。

8.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述的标记物为辣根过氧化物酶。

9.根据权利要求1所述的所述的检测猪葡萄球菌脱落毒素抗体的ELISA方法，其特征在于：所述标记物标记的二抗为HRP标记物标记的IgG。