CN106066398A - 一种a型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接elisa检测方法 - Google Patents

一种a型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接elisa检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物细菌学领域，提供了A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法，该方法以制备的A型产气荚膜梭菌外毒素为抗原，一是用来免疫家兔制备高免血清，二是浓缩、纯化后作为间接ELISA的包被抗原；检测方法包括以下步骤：(1)包被(2)封闭(3)加待检样品(4)加入二抗(5)显色(6)终止(7)结果判定。此方法具有特异性高、灵敏度强、可重复性好、成本低等优点，另外此方法可以大批量检测样品，为该病的检测和研究提供了有效，简便的血清学诊断方法。

Description

一种A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法
技术领域
本发明涉及动物细菌学领域，本发明提供了一种A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法。
背景技术
产气荚膜梭菌(C.perfringens)又称魏氏梭菌(C.welchii)，是一种正常情况下人和动物胃肠道中寄生的条件致病菌。产气荚膜梭菌根据其分泌的四种主要外毒素(α、β、ε、ι)分为A、B、C、D、E五个亚型。A型产气荚膜梭菌分泌的主要致病外毒素是α毒素。α毒素是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶，能破坏宿主细胞细胞膜表面的磷脂，从而破坏细胞膜的功能。该菌能够感染多种动物，导致坏死性肠炎和肠毒血症等疾病，给养殖业带来严重的经济损失。
产气荚膜梭菌毒素抗体水平是评价动物对产气荚膜梭菌病抵抗力的指标，小白鼠毒素中和试验是检测A型产气荚膜梭菌毒素抗体的经典方法,虽然准确可靠,但费时、费工,需要血清样品和动物的量也比较大，而且可能因为动物的个体差异造成结果不准确；在快速诊断上也难以适应实践需要。而卵磷脂水解抑制试验欠敏感,且重复性差,操作繁琐,难于推广应用。间接血凝实验，需要制备血凝抗原，较为复杂,难以在生产实践中普及。这些方法受到很多条件的限制，难以适应当前控制产气荚膜梭菌病的流行以及对该病的研究检测的需要。
发明内容
针对现有技术的上述情况，本发明提供了提供了一种A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法，该方法以制备的A型产气荚膜梭菌外毒素为抗原，一是用来免疫家兔制备高免血清，二是浓缩、纯化后作为间接ELISA的包被抗原；检测方法包括以下步骤：(1)包被(2)封闭(3)加待检样品(4)加入二抗(5)显色(6)终止(7)结果判定。此方法具有特异性强、灵敏度高、可重复性好、成本低等优点，另外此方法可以大批量检测样品，为该病的检测和研究提供了有效，简便的血清学诊断方法。
发明人在本发明中所采用的A型产气荚膜梭菌采用现有菌种，特别选自菌种NCTC528(保藏于National Collection of Type Cultures英国国家典型培养物保藏中心，保藏号:NCTC528)，可通过现有渠道直接获得，故而该生物材料属于现有技术中可直接获得的材料，不需进行单独的生物保藏。
本发明的具体技术方案中主要含有如下几个特殊之处：
1 A型产气荚膜梭菌毒素抗原的制备:
A型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落接种液体硫乙醇培养基增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于改良的Gordon汤中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；
获得上述外毒素之后，发明人利用LD50实验测定所产外毒素的活性。
除此之外利用其进行了如下的具体应用：
(1)甲醛灭活外毒素，得到类毒素，与弗氏佐剂乳化，作为免疫家兔的抗原；
(2)硫酸铵沉淀，再经透析袋除盐，Sephadex-G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩，作为间接ELISA的包被抗原；
(3)将粗提的毒素蛋白经SDS-PAGE电泳，分析鉴定毒素蛋白。
2 兔抗A型产气荚膜梭菌外毒素高免血清的制备
选取1.0-1.5Kg健康未接种过疫苗的家兔3只，将灭活的上述A型产气荚膜梭菌外毒素和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，背部皮肤多点注射；首免7天和15天后，将灭活的上述A型产气荚膜梭菌外毒素和弗氏不完全佐剂按照体积1:1混合乳化，对家兔进行二免和三免；三免后10天扑杀家兔，无菌采血，自然凝固，离心取上清，所得高免血清作为间接ELISA阳性对照血清；
在获得了上述两个重要技术要素之后，发明人进一步提供了间接ELISA检测方法如下：
(1)抗原包被：将浓缩纯化的产气荚膜梭菌毒素用抗原包被液稀释到4μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶标板中，密封4℃过夜；
(2)洗涤：将板中的液体垂直甩出，在干净的吸水纸上拍干，至孔内干燥无液体残留，每孔加入200μL PBST洗涤液，轻轻摇晃3min，再次甩出，拍干，加液时避免出现气泡，重复3次；
(3)封闭：洗涤完成后，加入5％脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；
(4)洗涤：重复步骤2，洗涤好的板子放入4℃待用；
(5)加样：用PBS将待检样品按照稀释度1:100进行稀释，每孔100μL，并设置阴性对照，37℃孵育1h；
(6)加二抗：重复步骤2后，用PBS稀释HRP标记的羊抗兔二抗，每孔100μL加到酶标板中，密封置于37℃孵育1h；
(7)显色：洗涤酶标板，每孔加入100μL TMB显色液，于37℃温箱内避光放置15min；
(8)终止，读数：每孔加入100μL 2M硫酸终止液，终止反应，用酶标仪读取450nm处的OD值；
结果判定标准的确定
计算阴性样品的平均值与标准差(SD)，计算为阳性临界值，运用建立的间接ELISA方法测定OD450nm，OD450nm大于为阳性，小于为阴性。
在上述间接ELISA检测方法中，所述的血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤绵羊血；
所述改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g，糊精1g，酵母提取物2g，L-精氨酸1.2g,葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌即得；
所述的抗原包被液成分为：称取Na2CO3 0.795g、NaHCO3 1.465g，加入400ml去离子水中，定容至500ml，PH调至9.5；
所述的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g、氯化钠(NaCl)：8g、氯化钾(KCl)0.2g；
所述PBST洗涤液成分为：500μL Tween-20溶解于1L的PBS中；
所述封闭液成分为：5g脱脂奶粉溶于100mlPBST中；
所述终止液(2M H2SO4)成分为：量取浓H2SO4 27.6ml加入到450ml去离子水中，混匀后定容至1L。
采用本发明上述公开的检测方法，具有如下有益效果：
(1)特异性强：本方法可检测到A型产气荚膜梭菌毒素抗体，对于抗β、ε毒素血清及巴氏杆菌病、沙门氏菌的血清抗体检测结果均为阴性，表明该方法特异性强。
(2)敏感性高：检测结果显示，当阳性血清稀释至1:12800时仍为阳性，表明该方法敏感性很高。
(3)重复性好:本方法对阳性血清进行多次重复检测，结果均相一致。
附图说明：
图1 A型产气荚膜梭菌粗提外毒素蛋白SDS-PAGE电泳分析图；
图中1、2、3泳道样品在43KD处有产气荚膜梭菌主要的外毒素(α毒素)的明显条带。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学等技术手段为本领域技术人员所熟知。实施例中所用的试剂及其来源：液体硫乙醇酸盐培养基购自青岛海博生物；弗氏佐剂购自sigma试剂公司；脱脂奶粉，TMB显色液购自索莱宝公司；HRP标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥；其他试剂所用化学试剂均为分析纯。
实施例1 A型产气荚膜梭菌外毒素的制备:
A型产气荚膜梭菌菌种(National Collection of Type Cultures-英国微生物菌种保藏中心保藏保藏号:NCTC528)接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，挑取单个的菌落到硫乙醇酸盐营养肉汤增菌培养基中，在气体浓度为88％N2、7％H2、5％CO2的厌氧环境条件下38℃厌氧培养12h。将5mL A型产气荚膜梭菌增菌液接种到100ml pH7.5的产毒培养基中(每100mL PBS缓冲液溶解2g蛋白胨、1g糊精、2g酵母提取物和1.2gL-精氨酸，1g葡萄糖)中，在厌氧环境下振荡培养，43℃培养5h高效产毒，然后在4℃8000r/min离心15min，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌，即得到除菌后的A型产气荚膜梭菌的外毒素。最终测得外毒素的LD50＝24.25，即将外毒素稀释19.03倍，腹腔注射1ml，能够使半数小鼠死亡。
实施例2 浓缩、纯化包被抗原及其浓度的测定
将除菌后的毒素溶液缓慢加入饱和硫酸铵溶液，最终使混合溶液中硫酸铵的体积浓度达到50％，4℃静置过夜；次日，将溶液8000r/min离心20min，弃掉上清，沉淀用适量0.05M Tris-HCL缓冲液溶解，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终浓度达到40％，重复上述操作，最后将沉淀溶解于Tris-HCL中；接着用Sephadex-G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩；将纯化后的毒素蛋白经SDS-PAGE电泳，分析蛋白纯度,结果显示分子量43KD处有明显条带(如图1所示)，为主要致病外毒素α毒素；用分光光度计测定260nm和280nm下的吸光度值，确定毒素蛋白浓度为：(1.45×A280－0.74×A260)×稀释倍数。
实施例3 免疫家兔，制备阳性血清
将外毒素溶液中加入0.3％的甲醛，充分混匀后，37℃灭活96h，期间每隔5-6h振荡摇晃一次。
选取1.0-1.5Kg健康未接种过疫苗的家兔3只，将灭活的上述A型产气荚膜梭菌外毒素和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，背部皮肤多点注射；首免7天和15天后，将灭活的上述A型产气荚膜梭菌外毒素和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，对家兔进行二免和三免；三免后10天扑杀家兔，无菌采血，自然凝固，离心取上清，所得高免血清作为间接ELISA阳性对照血清。
实施例4 间接ELISA方法的建立
通过方阵滴定实验确定包被抗原的最佳浓度，确定检测样品、二抗的最佳的孵育条件，及其他间接ELISA的条件进行摸索和优化，最终确定如下体系：
(1)抗原及样品最佳浓度、样品最佳稀释度确定
采用棋盘滴定法，用包被液将纯化的毒素蛋白按照1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml 7μg/ml 8μg/ml的浓度进行稀释，加入到96孔酶标板横排，每孔100μL包被,4℃静置过夜；洗涤后，脱脂奶粉封闭4℃过夜；次日洗涤，将制备的阳性血清用PBS稀释至1:20 1：40 1：80 1：100 1：200 1：400，加入到酶标板的前6列，后六列按照同样稀释度加入阴性血清，每孔100μL，密封后37℃孵育1h；加二抗，显色，终止反应；在450nm处用酶标仪读取每孔的OD值，以阳性OD450nm/阴性OD450nm(P/N)值最大作为选择抗原的最佳包被浓度和样品最佳稀释度的依据。
最终确定抗原蛋白最佳包被浓度为4μg/ml，样品最佳稀释度为1：100。
(2)最佳封闭条件的选择
封闭液选择5％胎牛血清、5％脱脂奶粉、1％BSA，抗原包被浓度以4μg/ml包被，按上述方法进行ELISA检测，比较使用不同封闭液后的P/N值，P/N值最大选择最佳封闭条件。
实验结果显示5％胎牛血清与1％BSA封闭效果不如脱脂奶粉，因此选用效果较好，价格适宜的5％脱脂奶粉。
(3)抗体最佳反应时间的确定
加入血清之后，分别在37℃孵育30min、45min、60min，90min按上述方法经行检测，选择最佳反应时间
实验结果显示抗体在37℃下孵育60min检测效果最好，P/N值最大，为最佳反应时间。
(4)酶标二抗孵育时间的确定
根据试剂说明书，将酶标二抗稀释至1:10000，分别在37℃孵育30min、45min和60min，90min比较出酶标二抗最佳孵育时间。
多次实验结果显示二抗孵育条件为37℃作用60min。
(5)显色底物作用时间的选择
加入底物后，分别在37℃避光显色5min、10min和15min，20min比较出显色时间。
多次重复实验显示最佳显色时间为15min。
(6)通过以上对间接ELISA各重要影响条件的优化，最终确定反应体系如下：
①用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将纯化的抗原稀释至4μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；
②用PBST溶液(含0.05％Tween-20的PBS溶液：NacL 8g/L、KCL 0.2g/L、Na2HPO4·12H2O 3.58g/L、KH2PO4 0.27g/L，pH 7.4)洗涤3次，加入含5％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液200μL/孔，4℃封闭过夜；
③用PBST洗涤液洗涤3次以后，将待检样品用PBS稀释至1:100，每孔100μL，密封后37℃孵育1h；
④用PBST洗涤液洗涤3次以后，用PBS稀释HRP标记的羊抗兔二抗，稀释至1:10000，每孔100μL加到酶标板中，密封置于37℃孵育1h；
⑤洗涤酶标板，每孔加入100μL TMB显色液，于37℃温箱内避光放置15min；
⑥每孔加入100μL 2M的硫酸终止液，终止反应；
⑦酶标仪测定450nm处每孔的OD值；
(7)判定标准的确定
运用该方法检测30份阴性血清，求取平均值为0.236，标准差(SD)为0.015，,可求出为0.281，为0.266，即当检测数值大于0.281时，判定结果为阳性；当检测数值小于0.266时，判定结果为阴性。
实施例5 间接ELISA检测方法的性能评价
(1)特异性实验：运用建立好的间接ELISA方法，检测免疫家兔制备的血清，同时检测阴性对照、替代试验组及感染巴氏杆菌、沙门氏菌和球虫等其他病原致死兔的血清。结果显示除了制备的血清为阳性外，其他检测结果均为阴性，表明该检测方法无交叉反应，特异性强。
(2)敏感性实验：将制备的标准阳性血清倍比稀释(1：100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600)用间接ELISA方法检测，结果表明，当血清稀释至1:25600时仍为阳性，表明该方法的敏感性高。
(3)重复性实验:本方法对标准阳性血清、阴性对照进行3次重复检测，其重复结果显示相一致。
实施例6 运用间接ELISA法对临床样品进行检测
运用建立好的间接ELISA方法对来自山东泰安某兔场内100份血清进行检测，用间接血凝试验作对照。该兔场已经对家兔免疫过A型魏氏梭菌类毒素疫苗，免后一个月，进行随机取样，采集100只家兔的血液，分离血清后，按照间接ELISA的方法对血清样品进行检测。检测结果显示：间接血凝试验检测92只家兔的血清样品检测为阳性，8只为阴性，阳性率为92％；间接ELISA法检测到100只家兔的血清样品为阳性，阳性率为100％；说明该方法的相较与其他方法的检测阳性率高，具有良好的敏感性，为临床易感动物A型产气荚膜梭菌病免疫预防提供了敏感、简便的抗体检测的方法。

Claims (3)

1.一种A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于：含有步骤如下：
(1)A型产气荚膜梭菌抗原的制备:
A型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落接种液体硫乙醇培养基增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于改良的Gordon汤中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；
(2)兔抗A型产气荚膜梭菌外毒素高免血清的制备
选取1.0-1.5Kg健康未接种过疫苗的家兔3只，将灭活的上述A型产气荚膜梭菌外毒素和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，背部皮肤多点注射；首免7天和15天后，将灭活的上述A型产气荚膜梭菌外毒素和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，对家兔进行二免和三免；三免后10天扑杀家兔，无菌采血，自然凝固，离心取上清，所得高免血清作为间接ELISA阳性对照血清。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法，具体步骤为：
(1)抗原包被：将浓缩的产气荚膜梭菌外毒素用抗原包被液稀释到4μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶标板中，密封4℃过夜；
(2)洗涤：将板中的液体垂直甩出，在干净的吸水纸上拍干，至孔内干燥无液体残留，每孔加入200μL PBST洗涤液，轻轻摇晃3min，再次甩出，拍干，加液时避免出现气泡，重复3次；
(3)封闭：洗涤完成后加入5％脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；
(4)洗涤：重复步骤2，洗涤好的板子放入4℃待用；
(5)加样：用PBS将待检样品按照稀释度1:100进行稀释，每孔100μL，37℃孵育1h；
(6)加二抗：重复步骤(2),用PBS稀释HRP标记的二抗，每孔100μL加到酶标板中，密封置于37℃1h；
(7)显色：洗涤酶标板，每孔加入100μL TMB显色液，于37℃温箱内避光放置15min；
(8)终止，读数：每孔加入100μL 2M硫酸终止液，终止反应，用酶标仪读取450nm处的OD值。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述改良的Gordon汤配方为：蛋白胨2g，糊精1g，酵母提取物2g，l-精氨酸1.2,葡萄糖1g，最后用PBS定容至100ml，用浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌即得。
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