CN110244043A - B型诺维氏梭菌的间接elisa检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒，所述间接ELISA检测试剂盒以B型诺维氏梭菌菌悬液为包被抗原；所述B型诺维氏梭菌菌悬液由如下方法制备而成：将B型诺维氏梭菌接种于培养基中进行増菌培养；将培养得到的B型诺维氏梭菌培养物离心，收集菌体，洗涤，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成B型诺维氏梭菌菌悬液。本发明的试剂盒以完整诺维氏梭菌菌体作为包被抗原，能够高敏感及高特异性的检测羊血清中是否含有诺维氏梭菌的抗体，并依此判断羊是否感染羊黑疫。本发明的检测结果特异性强，且重复性好，能够实现在羊发病后快速做出诊断并采取紧急治疗措施。

Description

B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及诺维氏梭菌检测的技术领域，具体涉及一种羊B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒。
背景技术
羊黑疫又称“传染性坏死性肝炎”，是由B型诺维氏梭菌引起的一种急性高度致死性传染病。诺维氏梭菌能引起人的气性坏疽、动物的恶性水肿、绵羊的大头病和绵羊、山羊、牛、马等的黑疫等疾病，发病急、死亡率高，是人畜共患病中危害较大的一类生物因素，是严重危害养殖业的重要疾病，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。对于羊黑疫的分析检测一直不被重视，但是临床和科研过程中都需要建立针对羊黑疫的快速检测方法，目前还未出现针对羊黑疫的快速检测方法，不利于科研工作和健康养殖工作的开展。
目前，对于该病的病原学诊断方法主要为病原菌的PCR、临床剖检观察其病理变化等方法，但这些方法基本不适用于患羊的活体诊断。患病羊血清中必然存在抗诺维氏梭菌抗体，因此，ELISA检测方法检测其抗体水平可有效反映羊只的感染情况。
目前，间接ELISA方法检测羊黑疫抗体的方法少之又少。在常见的间接ELISA方法检测抗体的方法中，所用的包被抗原包括原核表达蛋白、超声裂解的菌体蛋白。以原核表达的蛋白做包被抗原时，特异性较差，会与其他疫病阳性血清发生交叉反应。以超声裂解的菌体作为包被抗原时，不同批次裂解菌体所得结果差异较大，不能保证批次间的稳定性；且菌体裂解，释放内部蛋白，易出现假阳性检测结果。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒。本发明的试剂盒以完整诺维氏梭菌菌体作为包被抗原，能够高敏感及高特异性的检测羊血清中是否含有诺维氏梭菌的抗体，并依此判断羊是否感染羊黑疫。本发明的检测结果特异性强，且重复性好，能够实现在羊发病后快速做出诊断并采取紧急治疗措施。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒，所述间接ELISA检测试剂盒以B型诺维氏梭菌菌悬液为包被抗原。
优选的，所述B型诺维氏梭菌菌悬液由如下方法制备而成：
将B型诺维氏梭菌接种于増菌培养基中进行培养；将培养得到的B型诺维氏梭菌培养物离心，收集菌体，洗涤，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成B型诺维氏梭菌菌悬液。
更优选的，所述増菌培养基由如下方法制备而成：
将胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g、牛肉粒12g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；
将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；
将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；
向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液5mL、血红素溶液10mL，调节pH至7.8-8.4，即制备得到増菌培养基。
更优选的，所述培养条件为：在37℃厌氧环境下培养3d；所述厌氧环境的气体组成为：80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳(均为体积百分比)。
进一步的，所述间接ELISA检测试剂盒还包括：酶标板、封闭液、B型诺维氏梭菌阳性血清、B型诺维氏梭菌阴性血清、酶标二抗、底物显色液和终止液。
优选的，所述封闭液为5％脱脂奶粉。
优选的，所述酶标二抗为HRP标记的羊抗兔抗体(阳性血清用)、HRP标记的兔抗羊抗体(待检羊血清用)。
本发明的第二方面，提供利用上述间接ELISA检测试剂盒检测B型诺维氏梭菌抗体的方法，包括以下步骤：
(1)用抗原包被液将B型诺维氏梭菌菌悬液稀释40倍，包被酶标板，4℃包被过夜；
所述抗原包被液由如下方法制备而成：
将1.465g NaHCO3和0.795g Na2CO3，溶于400mL去离子水并定容至500mL，用NaOH调pH值至9.5。
(2)取出酶标板，用PBST溶液洗涤，加入封闭液，37℃封闭2h；
(3)分别加入稀释后的B型诺维氏梭菌阳性血清、B型诺维氏梭菌阴性血清和待检血清；37℃孵育1h；
(4)加入按1:10000稀释的酶标二抗，37℃孵育1h；
(5)加入底物显色液，37℃避光反应15min；
(6)加入终止液终止反应，在450nm处读取吸光值，对检测结果进行判定。
优选的，步骤(3)中，B型诺维氏梭菌阳性血清、B型诺维氏梭菌阴性血清和待检血清均按1:100进行稀释。
优选的，步骤(6)中，检测结果的判定标准为：若待测样品的OD值大于0.531，则判定为阳性；若待测样品的OD值小于0.531，则判定为阴性。
需要说明的是，上述方法除了用于羊黑疫病的快速诊断外，还可以用于B型诺维氏梭菌病治疗药物和疫苗的开发。
本发明的有益效果：
本发明的B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简单等优点，能够用于B型诺维氏梭菌抗体的检测，可以对羊黑疫病进行快速、有效的检测。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，目前国内外对于羊黑疫快速检测的研究较少，现有的间接ELISA检测抗体的方法普遍存在特异性差、稳定性差、易出现假阳性检测结果等问题。
基于此，本发明的目的是提供一种B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒，并建立了特异性强、灵敏度高、可重复性好、经济、简便、快速的检测B型诺维氏梭菌ELISA检测方法，为羊黑疫病的快速诊断和这类疾病的防控提供了技术支持。
由于诺维氏梭菌増菌培养困难，利用已经报道的诺维氏梭菌序列，现代生物合成技术，对诺维氏梭菌进行原核表达，获取所需重组蛋白，诺维氏梭菌重组蛋白的制备可以打破现在对诺维氏梭菌研究困难的瓶颈，加快对诺维氏梭菌病及其相关技术的研究。但是诺维氏梭菌重组蛋白是否与天然蛋白具有相同的生物活性无法验证，虽然原核表达技术成熟，但是表达的蛋白不能使用的情况屡见不鲜，以原核表达的蛋白做包被抗原时，特异性较差，会与其他疫病阳性血清发生交叉反应；以超声裂解的菌体作为包被抗原时，不同批次裂解菌体所得结果差异较大，不能保证批次间的稳定性；且菌体裂解，释放内部蛋白，易出现假阳性检测结果。因此，本发明仍选择对诺维氏梭菌进行増菌培养，并直接使用増菌培养后的诺维氏梭菌菌体作为包被抗原以消除这些因素，而且重组蛋白只针对一种菌体蛋白，或外毒素蛋白或菌体结构蛋白，不能保证检测结果的可靠性。羊只发病时往往是菌体先被检测到，而后大量增殖产生外毒素，因此以菌体作为包被抗原构建ELISA检测方法准确性更高。
但以直接菌体作为包被抗原的难度在于菌体的增殖培养、菌悬液浓度的确定，本发明的间接ELISA检测试剂盒是以B型诺维氏梭菌菌体作为包被抗原，确定包被抗原浓度、待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装B型诺维氏梭菌ELISA检测试剂盒，实现了对B型诺维氏梭菌的快速、准确检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
本发明实施例中的増菌培养基由如下方法制备而成：
将胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g、牛肉粒12g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；
将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；
将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；
向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液5mL、血红素溶液10mL，调节pH至7.8-8.4，即制备得到増菌培养基。
实施例1：
1.间接ELISA检测方法的建立：
步骤一、包被抗原的制备
将诺维氏梭菌接种于实验室自制针对诺维氏梭菌的增菌培养基进行増菌培养，所述培养条件为：在37℃厌氧环境下培养3d；所述厌氧环境的气体组成为：80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳(均为体积百分比)；10000～12000r/min离心3～5min，收集菌体，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液，此即为包被抗原。
步骤二、酶标板的包被
取菌悬液100μL/孔加至酶标板，置于4℃过夜。包被结束后，将PBST加至酶标板，200μL/孔，轻微震荡3-5min后，弃掉酶标板中的PBST，重复洗涤3次，最后一次洗涤结束后拍干孔中残留PBST。
步骤三、封闭
取5％脱脂奶粉，100μL/孔添加至酶标板，37℃封闭2h。封闭结束后洗涤，洗涤操作同步骤二。
步骤四、一抗血清的孵育
将待检血清做1﹕100稀释后，100μL/孔添加至酶标板中，37℃孵育1h。孵育结束后，洗涤操作同步骤二。
步骤五、酶标二抗的孵育
用PBST对酶标二抗做1﹕10000稀释，100μL/孔添加至酶标板中，37℃孵育1h。孵育结束后，洗涤操作同步骤二。
步骤六、显色
取4℃避光保存的TMB显色液，100μL/孔添加至酶标板，37℃孵育15min。
步骤七、反应终止及结果测定
取室温保存的2mmol/L的浓H2SO4，100μL/孔添加至酶标板，于酶标仪450nm读取结果。
2.包被抗原浓度的确定
将纯化培养的诺维氏梭菌菌体作为包被抗原，自制的阳性血清为阳性对照，在酶标板上进行方阵滴定试验。用碳酸盐缓冲液将诺维氏梭菌菌体重悬，按照倍比稀释的方法，将诺维氏梭菌菌体按照100μL/孔纵向包被酶标板，各浓度分别包被一列，置于4℃，包被过夜。按照上述间接ELISA检测方法操作，以P/N值最大确定抗原的最佳包被浓度，根据试验结果得，当诺维氏梭菌菌体悬液稀释到40倍时，所对应的菌液浓度为抗原的最佳包被浓度。具体检测结果如表1。
表1：抗原包被浓度检测结果
由于菌液成分复杂，含有牛肉粒等物质难以除去，OD值不准确，在相同培养条件下菌液的初始浓度相差不大，可以视为浓度一致，在不能洗涤菌体干净的情况下，本发明按照稀释比来限定菌悬液的浓度。
3.临界值的确定
按照1中ELISA操作步骤，将39份标准阴性血清做1∶100稀释后作为一抗血清，测定其OD450nm，计算器平均值和标准差(SD)，临界值即为和3SD之和，本研究所确定的临界值为0.531。具体测定结果如表2。
表2：临界值的检测结果
4.特异性试验
按照1中ELISA操作步骤，检测本实验室保存的大肠杆菌，沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌分别免疫兔子所得血清。血清做1:100稀释，测定其OD450nm，同时设置羊黑疫标准阳性血清、阴性血清做阳性、阴性对照，检测结果显示大肠杆菌，沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌阳性血清的测定结果均小于阳性临界值0.531，说明本研究所确定的试验方法特异性良好。具体试验结果如表3。
表3：特异性试验检测结果
5.重复性试验
(1)批内重复性试验：在同一块酶标板上，取羊黑疫阳性血清、阴性血清各5份，按照1中ELISA操作步骤，测定OD450nm，每份血清做三个重复，计算批内变异系数(CV)，批内CV＝(SD/OD450nm平均值)×100％。结果显示，批内变异系数均小于10％。具体试验结果如表4。
表4：批内重复性试验的检测结果
(2)批间重复性试验：在不同批次包被的酶标板上，取伪结核标准阳性血清、阴性血清各5份，按照1中ELISA操作步骤，测定OD450nm，每份血清做三个重复，计算批间变异系数(CV)，批间CV＝(SD/OD450nm)×100％。结果显示，批间变异系数均小于10％。具体试验结果如表5。
表5：批间重复性试验的检测结果
6.ELISA试剂盒的组装
羊黑疫间接ELISA检测试剂盒具体组成如下：
(1)空白96孔酶标板一块；
(2)诺维氏梭菌纯品一支，置于-20℃保存，使用前，用包被稀释液40倍；
(3)诺维氏梭菌阳性血清，诺维氏梭菌阴性血清各一支；
(4)辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体，使用前，用样品稀释液1:10000稀释；
(5)TMB底物显色液，终止液，封闭液，样品稀释液，洗涤液各一支。
实施例5：临床样本的检测
从发病羊场采集临床血样15份，5份健康羊只血。分离血清，测定其OD450nm。检测结果显示发病羊血清均大于阳性临界值，健康羊只的OD450nm均小于阳性临界值，与实际患病状况一致(准确率为100％)，说明本研究建立检测方法可靠。具体检测结果如表6。
表6：临床样品的检测结果
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种B型诺维氏梭菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒以B型诺维氏梭菌菌悬液为包被抗原。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述B型诺维氏梭菌菌悬液由如下方法制备而成：
将B型诺维氏梭菌接种于増菌培养基中进行培养；将培养得到的B型诺维氏梭菌培养物离心，收集菌体，洗涤，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成B型诺维氏梭菌菌悬液。
3.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述増菌培养基由如下方法制备而成：
将胰蛋白胨10g、酵母浸粉10g、磷酸钾5g、葡萄糖10g、牛肉粒12g溶解于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌15min，配制成基础培养基；
将1g维生素K1溶于99ml无水乙醇中，过滤除菌，制备得到维生素K1溶液；
将0.5g血红素溶于1mol/L的氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌，制备得到血红素溶液，4℃保存备用；
向冷却至室温的基础培养基中无菌加入维生素K1溶液5mL、血红素溶液10mL，调节pH至7.8-8.4，即制备得到増菌培养基。
4.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述培养条件为：在37℃厌氧环境下培养3d；所述厌氧环境的气体组成为：80％氮气、10％氢气、10％二氧化碳。
5.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒还包括：酶标板、封闭液、B型诺维氏梭菌阳性血清、B型诺维氏梭菌阴性血清、酶标二抗、底物显色液和终止液。
6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5％脱脂奶粉。
7.根据权利要求5所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的羊抗兔抗体和HRP标记的兔抗羊抗体。
8.利用权利要求1-7任一项所述的间接ELISA检测试剂盒检测腐败梭菌抗体的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用抗原包被液将B型诺维氏梭菌菌悬液稀释40倍，包被酶标板，4℃包被过夜；
(2)取出酶标板，用PBST溶液洗涤，加入封闭液，37℃封闭2h；
(3)分别加入稀释后的B型诺维氏梭菌阳性血清、B型诺维氏梭菌阴性血清和待检血清；37℃孵育1h；
(4)加入按1:10000稀释的酶标二抗，37℃孵育1h；
(5)加入底物显色液，37℃避光反应15min；
(6)加入终止液终止反应，在450nm处读取吸光值，对检测结果进行判定。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，B型诺维氏梭菌阳性血清、B型诺维氏梭菌阴性血清和待检血清均按1:100进行稀释。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，检测结果的判定标准为：若待测样品的OD值大于0.531，则判定为阳性；若待测样品的OD值小于0.531，则判定为阴性。
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