CN102180953B

CN102180953B - 流产嗜性衣原体外膜重组蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102180953B
Application number: CN 201110048567
Authority: CN
Inventors: 何诚; 杨君敬; 凌勇; 潘青; 欧长波
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2031-02-28
Also published as: CN102180953A

Abstract

本发明涉及流产嗜性衣原体外膜重组蛋白及其编码基因与应用。本发明的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白，是如下a)或b)：a)由序列表中SEQ ID No.2自氨基末端第173-611位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白具有良好的抗原性，特异性强。以流产嗜性衣原体外膜重组蛋白为抗原，以间接ELISA方法可以检测流产嗜性衣原体，该方法操作简便，检测快速，成本低。

Description

流产嗜性衣原体外膜重组蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白及其编码基因与应用，尤其涉及一种流产嗜性衣原体外膜蛋白的重组蛋白及其编码基因，以及在检测高敏感性流产嗜性衣原体方面的应用。

背景技术

衣原体(Chlamydia)是一大群与革兰氏阴性菌有密切关系的专性真核细胞内寄生的原核生物。流产嗜性衣原体是比较常见的导致母猪流产的病原体，同时其致病动物种类也非常广泛，能够引起公猪和其它动物包括长期与患畜有接触的人群的各种疾病。流产嗜性衣原体所引起的各种动物和人的感染已使许多国家的畜牧业生产和公共卫生影响遭受了巨大的经济损失。

进入九十年代，猪衣原体在国内外感染总体均呈上升趋势，规模化猪场的不断发展也伴随着猪衣原体病感染的不断上升，给集约化养猪业造成严重的经济损失。为保障畜禽与人类健康，最根本的解决办法就是能够找到衣原体的相关致病因子，模拟相关致病因子在衣原体感染过程中的递呈过程，研究该致病因子与其重组蛋白免疫在抵抗流产衣原体感染方面的作用，从而探索预防猪流产嗜性衣原体性感染的新途径，并在此基础上研究新的衣原体相关诊断方法。

在衣原体诊断方面，目前应用最多的仍然是主要外膜蛋白(MOMP)和脂多糖(LPS)。他们主要用作ELISA方法中的包被抗原，进行衣原体抗体检测，如法国IDVET公司的流产衣原体检测试剂盒。有时也作为荧光抗体进行衣原体抗原检测，如英国OXOID公司的衣原体荧光检测试剂盒。基于流产衣原体和沙眼衣原体全基因序列测序工作的顺利完成，给相关研究者提供了更好的衣原体研究基因平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗原性好，特异性强、敏感性高的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白及其编码基因。

本发明所提供的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白，命名为PompD-N，是如下a)或b)：

a)由序列表中SEQ ID No.2自氨基末端第173-611位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

为了使a)的PompD-N蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ IDNo.2自氨基末端第173-611位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的PompD-N蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N的编码基因是如下a)或b)或c)：

a)其核苷酸残基序列如序列表中SEQ ID No.1自5′末端第517-1825位所示；

b)其核苷酸残基序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA片段杂交且编码与流产嗜性衣原体外膜重组蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明的再一个目的是提供一种重组表达载体。

本发明所提供的重组表达载体，含有以流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N的编码基因为目的基因的表达盒。

本发明的再一个目的是提供一种含有上述重组表达载体的转基因细胞系及重组菌。

本发明的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N具有衣原体相关毒力因子的特征，且具有良好的免疫原性，特异性，可用于检测流产嗜性衣原体。

针对流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N的上述特点，本发明还提供了一种流产嗜性衣原体的检测方法。

本发明所述的流产嗜性衣原体的检测方法，是以流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N为抗原，以间接ELISA方法检待测样本中的流产嗜性衣原体抗体。

为了使上述方法操作更简便，本发明还提供了一种流产嗜性衣原体酶联免疫吸附试剂盒。

本发明的流产嗜性衣原体酶联免疫吸附试剂盒，以上述的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N为包被抗原。

该试剂盒还含有酶结合物工作液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、10×浓缩洗涤液、显色液A、显色液B和终止液。酶结合物工作液可以用HRP标记兔抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照可以用猪C.abortus标准阳性血清，阴性对照可以用猪标准阴性血清。

本发明的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N为非全菌抗原，与流产衣原体猪、羊标准阳性血清反应，不与猪流产相关病原包括布鲁氏菌、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、日本乙型脑炎病毒以及呼吸与繁殖综合征病毒等阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，特异性强。以流产嗜性衣原体外膜重组蛋白PompD-N为抗原，以间接ELISA方法可以检测流产嗜性衣原体，该方法操作简便，检测快速，成本低。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1猪流产嗜性衣原体POMPD-N重组蛋白的制备

将猪嗜流产衣原体CP16菌株(购自中国兽医药品监察所)冻干粉用1毫升灭菌生理盐水稀释，接种于6日龄的SPF鸡胚，每枚鸡胚接种0.2mL。收集3-6天死亡的鸡胚的卵黄囊膜；将收获的鸡胚卵黄囊膜加PBS(pH7.4)洗涤，眼科剪取1小块膜组织，放置载玻片上，冷丙酮固定10分钟，使用荧光染色试剂(IMAGENTMCHLAMYDIA，Oxoid Ltd.UK)(Faming Zhang，et al.Avian Disease2008，52：74-78)进行染色，在荧光显微镜下检测是否具有绿色椭圆形的颗粒；阳性膜组织于冰浴中研磨成20％的悬液；取出100μL，4℃，3000rpm离心10min，弃沉淀保留上清，上清即为衣原体菌液，将上清于4℃，14000rpm离心20min，弃上清留沉淀，之后按细菌DNA提取试剂盒步骤进行基因组提取(Qiagen GmbH，GeneCompany Limited)。参照NCBI登录的嗜流产衣原体S26/3菌株的POMPD基因序列，设计相关片段引物，所用引物序列如下：

F：TCT TGGGAAAATCTAGATACC；

R：GGGCAGTGTAACCACCTCAT。

以上述提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，回收目的片段，与克隆载体连接。以含有第一次PCR扩增片段的重组载体为模板，用含有Sal I和Not I酶切位点引物进行第二次PCR扩增，PCR产物经Sal I和Not I酶切，与同样酶切的pET-32a(+)表达载体进行连接获得重组表达载体pET-POMPD-1。该重组表达载体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1长1884bp，编码序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白，SEQ ID No.1自5′末端第517-1825位所示为pompD基因N端序列，编码SEQ ID No.2自氨基末端第173-611位所示的蛋白。重组表达载体转入BL21(DE3)；菌株，在IPTG诱导下表达重组蛋白PompD-N。

结果表明，在诱导温度为37℃，诱导剂IPTG终浓度为1.0mmol/L时，重组蛋白PompD-N大量表达，并在诱导5小时时表达量最大，重组蛋白PompD-N大小为65.3kD(含载体pET-32a(+)标签蛋白)，与理论值相当。之后将重组蛋白PompD-N经Ni-NTA纯化柱(Invitrogen)在变性条件下纯化，然后经透析复性，再经过超滤浓缩后测定浓度，根据蛋白浓度计算公式：

蛋白浓度(mg/mL)＝1.45OD₂₈₀-0.74OD₂₆₀

得到蛋白浓度后，分装，并进行低温冻干，制成冻干粉，-80℃保存备用。

实施例2猪流产嗜性衣原体重组蛋白PompD-N的鉴定

重组蛋白PompD-N成功表达后，进行SDS-PAGE和Western-Blot试验，以确定是否获得目的重组蛋白。

SDS-PAGE检测：分别取重组蛋白PompD-N表达菌液的上清、沉淀、细胞裂解液的上清和沉淀各50微升，与相同体积的2×上样缓冲液混合均匀后，沸水中煮5～10min，使蛋白充分变性后，10，000rpm离心1min。将配好的凝胶按说明装入垂直电泳槽中，倒入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液；按顺序将蛋白Marker、样品小心加入SDS-PAGE胶孔中，10微升/孔，蛋白Marker为Prestained ProteinLadder(#SM0671，Fermentas，USA)。80V电压电泳约30min直至样品中的蓝色BPB带走过浓缩胶，然后将电压调至120V，直至样品带移动到凝胶底部，结束电泳，取出凝胶板。将凝胶取出后去掉上部的浓缩胶，其中一块胶直接用考马斯亮蓝R-250染色液染色2h后观察；

Western-Blot试验：另一块在转印缓冲液中浸泡5～10min后，进行Western-Blot试验。所用转印膜为PVDF膜(0.45μm)，转印方式为湿法转印，时间2～4h。转膜结束后，先用去离子水将PVDF膜洗涤2次，然后用丽春红S染液于脱色摇床上缓慢摇动，染色10min后，于室温用去离子水漂洗膜数次，每次换水，直至出现清晰的蛋白带，后继续漂洗至所有蛋白带均脱色；将漂洗后的膜放入平皿中，加入适量封闭液(一般20～25mL，5％脱脂奶粉，TBS配制)，盖上后于37℃温育1h，后取出膜，于Wash Buffer中漂洗3次，每次约10min；分别将嗜流产衣原体猪、羊标准阳性血清及鹦鹉热嗜性衣原体SPF鸡标准阳性血清用抗体稀释液(5％脱脂奶粉，TBST配制，一般20～25mL)1∶100稀释后加入到平皿中，37℃温育1h后，4℃过夜，同时设阴性对照，后取出膜，于Wash Buffer中漂洗3次，每次约10min；分别将HRP标记兔抗猪、兔抗羊、兔抗鸡抗体用抗体稀释液(同上)以1∶1000稀释后加入平皿中，37℃温育2h后再洗涤3次；将PVDF膜浸入显色液(中杉金桥DAB显色试剂盒)中，不断晃动，直至出现清晰的条带后，立刻浸入去离子水中终止反应，并拍照记录。

结果显示，重组蛋白PompD-N与嗜流产衣原体猪、羊标准阳性血清反应为阳性，与鹦鹉热嗜性衣原体SPF鸡标准阳性血清反应为阴性。说明该蛋白具有免疫原性。

实施例3流产嗜性衣原体间接抗体ELISA诊断试剂盒的制备

该诊断试剂盒包含抗体检测板、酶结合工作物、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、10×浓缩洗涤液、显色液A、显色液B和终止液。

抗体检测板的制备：用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将实施例1制备的重组蛋白PompD-N稀释为0.1～10μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，使每孔所含的重组蛋白为0.1μg，用封口膜封闭后37℃孵育2h，再4℃包被过夜；pH9.6的碳酸盐缓冲液为10mMNa₂CO₃和NaHCO₃溶液，pH9.6；甩干，按100μL/孔5％脱脂奶粉封闭(PBS配制)，37℃温箱中放置1h，洗涤，甩干；PBS为80mMNa₂HPO₄，20mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，20mM KCl的混合液，pH7.2～7.5；再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，将酶标板真空无菌、干燥包装。

酶结合物工作液的制备：采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记抗体，步骤如下：将5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新配置的0.06mol/L NaIO₄水溶液0.5mL，混匀置冰箱30min；待溶液呈绿色时取出加入0.16mol/L乙二醇溶液0.5mL，室温放置30min；加入含5mg兔抗猪IgG多克隆抗体的PBS溶液1mL，混匀并装入透析袋内，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌于4℃透析过夜；吸出透析袋内的液体，加5mg/mL的硼氢化钠溶液0.2mL，置冰箱2h；加入等体积饱和硫酸铵，置冰箱30min，离心，将所得沉淀物溶于0.02mol/L pH7.4PBS中，装入透析袋，充分透析；离心除去沉淀，上清中加入等量甘油，-20℃或冻干保存。

以含0.1％(质量百分含量)BSA，0.05％(质量百分含量)吐温-20，0.01％(质量百分含量)硫柳汞钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液按1∶200～5000稀释冻存的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体作为酶结合物工作液。

样品稀释液、洗涤液、终止液的配制：样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M的磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，NaCl 8g，KCl 0.2g，定容至1000mL，再加0.5mL Tween-20，pH7.2～7.4)；10×浓缩洗涤液为含0.05％吐温-20的0.1M的磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，NaCl 80g，KCl 2g，定容至1000mL，再加5mL Tween-20，pH7.2～7.4)；显色液A为0.1mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含0.05％过氧化氢的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；终止液为2M硫酸溶液，即取22.2mL浓硫酸缓慢加入177.8mL去离子水中制备获得。

显色液的制备：称取100mg四甲基联苯胺(TMB)，用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，定容至1000mL，配制显色液A；称取35.8gNa₂HPO₄·12H₂O，21g一水柠檬酸，6.4mL 0.75％的过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调pH值到4.5～5.0，配制显色液B。

阴、阳性对照的制备：将经筛选获得的猪流产嗜性衣原体标准阳性血清(OD₄₅₀≥1.00)加入少量红色颜料并按1000U/mL加入庆大霉素，无菌过滤，作为阳性对照；将筛选获得的猪流产嗜性衣原体标准阴性血清(OD₄₅₀≤0.30)，按1000U/mL加入庆大霉素，无菌过滤，作为阴性对照。

诊断试剂盒具体检测程序为：(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μL/孔加入反应板中，同时设阳性对照(C.abortus标准阳性血清)、阴性对照(C.abortus标准阴性血清)和空白对照(只加100μL样品稀释液)37℃反应1小时；(3)将酶标板甩干后，各孔加入300μL洗涤液，放置5min，甩干并于吸水纸上用力拍干，重复3次；(4)每孔加入100μL酶结合物工作液(空白不加)，37℃温箱中放置30min；(5)将酶标板甩干后，各孔加入300μL洗涤液，放置5min，甩干并于吸水纸上用力拍干，重复3次；(6)依次加入底物显色液A、B各50μL，室温下避光反应15min；(7)每孔加入50μL终止液，混合均匀，于酶标仪中450nm波长下读取其OD值。

检测样本的判定标准为：以阳性样品血清OD₄₅₀(P)/阴性样品血清OD₄₅₀(N)平均值≥2，且待检样品血清的吸收值除以阴性样品血清的吸收值也≥2，则判为阳性；以阳性样品血清OD₄₅₀(P)/阴性样品血清OD₄₅₀(N)平均值≥2，且待检样品血清的吸收值除以阴性样品血清的吸收值≤1.5，则判为阴性；介于1.5～2之间则为可疑。实施例4流产嗜性衣原体间接抗体ELISA诊断试剂盒的敏感性和特异性

用建立好的方法对猪流产嗜性衣原体血清样品进行敏感性试验，结果如下表2。

用建立好的方法对猪瘟病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、猪传染性乙型脑炎病毒阳性血清、猪布鲁氏菌病阳性血清进行检测，每个样品重复3次，结果如下表3所示。

表2.敏感性试验

从以上表格可以看出，即使将样品稀释到1∶200甚至1∶400，阴阳性样品OD值比例仍大于2，说明利用该目的蛋白建立的ELISA诊断方法具有良好的敏感性。

表3.特异性试验

从以上表格可以看出，除了猪流产嗜性衣原体阳性样品血清OD₄₅₀(P)/阴性样品血清OD₄₅₀(N)平均值≥2，其他待检样品血清的吸收值/阴性样品血清的吸收值也≤1.5，判为阴性，说明本方法的特异性良好。

Claims

1.流产嗜性衣原体外膜重组蛋白，所述重组蛋白是由序列表中SEQ ID No.2自氨基末端第173-611位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述流产嗜性衣原体外膜重组蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1自5′末端第517-1825位所示。

4.一种重组表达载体，含有以权利要求1所述重组蛋白的编码基因为目的基因的表达盒。

5.含有权利要求4所述重组表达载体的细胞系或重组菌。

6.权利要求1所述流产嗜性衣原体外膜重组蛋白、权利要求2或3所述基因在制备检测流产嗜性衣原体试剂中的应用。

7.以权利要求1所述的流产嗜性衣原体外膜重组蛋白为包被抗原的流产嗜性衣原体酶联免疫吸附试剂盒。

8.根据权利要求7所述的流产嗜性衣原体酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于还含有酶结合物工作液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、10×浓缩洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，

其中，所述显色液A由四甲基联苯胺100mg，用无水乙醇或DMSO100ml溶解，定容至1000mL制备得到；所述显色液B由Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g，一水柠檬酸21g，0.75%过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至1000mL，调pH值4.5～5.0制备得到。

9.根据权利要求8所述的流产嗜性衣原体酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述酶结合物工作液为HRP标记兔抗猪IgG多克隆抗体，所述阳性对照为猪C.abortus标准阳性血清，所述阴性对照为猪C.abortus标准阴性血清。