CN105606826B

CN105606826B - 一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒

Info

Publication number: CN105606826B
Application number: CN201610082031.5A
Authority: CN
Inventors: 何诚; 吴宗学; 张强
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2036-02-05
Also published as: CN105606826A

Abstract

本发明涉及检测试剂盒，具体公开了酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。本发明通过基因工程表达重组蛋白MOMP，并以此为抗原包被固相载体进行酶联免疫吸附检测。本发明试剂盒使用基因工程表达的高纯度的重组抗原作为包被抗原，特异性高，灵敏性好。且在抗原包被固相载体后用抗原保护剂对包被好的抗原进行保护，延长了抗原的保存时间。此外，本发明使用的酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG，可广泛针对禽类，如鸡、鸭、鹅等进行通用性的检测。

Description

一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒

技术领域

本发明涉及检测试剂盒，具体地说，涉及酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。

背景技术

禽衣原体病(Avian Chlamydiosis)是由鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，Cp)引起的一类家禽、鸟类及哺乳动物等人畜共患传染性疾病。常常表现为禽类呼吸道和消化道疾病症状，感染家禽嗜睡、发烧、体重下降、鼻腔和眼睛异样分泌物、气囊炎、腹膜炎、心包炎、肝周炎以及产蛋禽产蛋量下降，病死率可达30％；观赏鸟类感染后表现为食欲减退、体重减轻、腹泻、黄色粪便、窦炎、呼吸道炎症以及肝脾肿大、气囊炎、心包炎、腹膜炎等症状。该病偶尔也会感染牛、羊和其它哺乳动物，引起动物生殖道炎性病变、孕畜流产等症状。人类在自然条件下可感染该病，主要引起呼吸道感染、肺炎和菌血症，所以临床上又称之为鹦鹉热(psittacosis)或鸟疫(Ornithosis)。

公开号为CN103981252A的中国专利申请公开了一种特异快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR的方法。根据GenBank中牛鹦鹉热衣原体主要外膜A蛋白的基因序列，利用Primer 5.0软件设计引物，包括上游引物和下游引物序列，同时针对引物之间的基因片段设计TaqMAN探针，5’端标记FAM，3’端标记NFQ-MGB，扩增目标片段的长度为180bp。但该方法由于采集样本过程繁琐复杂不适于大量样本的检测，且所需设备价格昂贵，不能作为基层养禽业的衣原体常规检测手段。此外，该方法中扩增目标片段只有180bp，很容易造成假阳性结果从而降低试验准确率。

目前国内外对鹦鹉热衣原体的主要检测手段包括两大类即抗原检测和血清学检测。抗原检测方法有直接染色，免疫组织化学染色，病原分离和鉴定，免疫荧光技术，聚合酶链反应，双抗夹心酶联免疫吸附试验。血清学检测方法有补体结合试验，间接血凝试验，胶体金试纸条法等。

直接染色病原法方法操作简单、检测快，但是灵敏性和特异性一般，结果判定需要有丰富的专业技术经验，判定结果受主观影响较大，尤其辨认衣原体的EB和RB时候相当困难。

病原分离鉴定方法病原分离需要禽胚或细胞，分离过程比较复杂并对试验操作要求较高一般基层试验室难以进行。免疫荧光抗体技术特异性强、敏感性高，是衣原体抗原鉴定比较理想的方法，但荧光显微镜价格昂贵不适合作为常规检测方法。聚合酶链反应虽然有较高的特异性和敏感性制备模板比较复杂所需样本量大，且需要PCR仪等贵重仪器，检测试剂昂贵。

双抗夹心酶联免疫吸附试验方法具有简便，灵敏，高效等特点但目前国内没有能够检测禽衣原抗原的ELISA试剂盒。补体结合试验操作繁琐、敏感性低、检测时间长、需要较高的专业知识，因此在临床应用中受到较多限制。

间接血凝试验方法操作程序简单、不需要特殊设备，但是结果判定受主观因素影响较大，而且耦合抗原多为全菌体，可能与部分革兰氏阴性菌存在交叉反应，结果易产生假阳性。胶体金试纸条法操作简单易行但检测敏感性较低。

酶联免疫吸附试验是用于血清抗体检测的常用方法，若能选择并制备适宜的包被抗原及通用性好的酶联二抗用于禽衣原体病ELISA抗体检测，则可达到通用性好、操作简便、所需时间短、降低操作人员主观因素影响的目标，从而弥补上述对鹦鹉热衣原体检测方法的不足。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的固相载体，酶标抗体，禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清，禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清；所述鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述固相载体包被鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP后，经抗原保护剂处理，所述抗原保护剂含有2％的β-1，3/1,6葡聚糖，20％的甘油和0.01％的明胶，余量为PBS。

作为优选，本发明为了提供一种酶联免疫反应试剂盒，所述固相载体为采用酶标板，如96孔酶标板。

进一步地，本发明提供了包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板的制备方法为：

1)以鹦鹉热衣原体6BC株总DNA为模板，使用特异性引物MOMP-F和MOMP-R进行扩增，得到1143bp的目的片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

MOMP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；

MOMP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；

2)将扩增所得片段回收纯化后用EcoRlI和SalI双酶切回收纯化目的片段；

3)将酶切好的目的片段与用相同酶切的PET28a(+)载体连接获得重组表达质粒；

4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，37℃培养，IPTG诱导表达；

5)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于适量体积的pH7.2的PBS溶液中，经过超声裂解处理后离心取沉淀；

6)重复第5)步，获得的沉淀为重组蛋白包涵体；

7)将步骤6)的沉淀经尿素溶解、透析复性后，与Ni-NTA琼脂糖凝胶混匀，低温结合；

8)将结合完毕后的蛋白与Ni-NTA琼脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪唑溶液洗涤，除去杂蛋白；

9)以250mmol/L的咪唑溶液洗脱Ni-NTA柱，收集经SDS-PAGE分析达到95％以上纯化程度的重组蛋白MOMP洗脱液；

10)将收集的蛋白洗脱液体装入透析袋中，在20倍体积的PBS溶液中透析去除咪唑，冷冻抽干获得干粉重组蛋白MOMP；

11)将重组蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓度0.5μg/mL，加入酶标板各孔，4℃孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST溶液)封闭，以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干倒掉封闭液，洗涤，甩干；

12)封闭好的微孔板每孔加入200微升的抗原保护剂，37℃孵育4小时后，倒掉抗原保护剂，洗涤，甩干，晾干，即获得包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板。

进一步地，为了使检测试剂盒具有更好的通用性，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG。

进一步地，本发明还提供了所述禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清的制备方法，具体如下：

1)取鹦鹉热衣原体6BC株灭活抗原，将抗原以2SP溶液稀释至蛋白浓度为2mg/mL；

2)选择8周龄，衣原体抗体为阴性SPF鸡，进行免疫；

3)首免：将氟氏完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取1mL颈部皮下多点注射；

4)二免：首免后第14天，取氟氏不完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取1mL颈部皮下多点注射；

5)三免：二免后第7天，同二免方法加强免疫一次；

6)四免：三免后第7天，肌肉和颈部皮下各注射衣原体抗原1mL；

7)1周后采血，经衣原体IHA试剂盒测定血清抗体效价，选取效价≥1:256的SPF鸡，进行心脏采血，无菌分离血清，水浴灭活，即获得禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清。

进一步地，所述禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清的制备方法为：

选取2～4只SPF鸡，优选2只，分别采血、分离血清，水浴灭活，经过衣原体间接血凝(IHA)试剂盒检测，收集结果为阴性的禽血清，混合，即为禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清。

进一步地，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液、酶标抗体稀释溶液、样本稀释缓冲液、显色液和终止液。

其中，所述洗涤缓冲液为含0.5‰吐温-20、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBST)；

所述酶标抗体稀释溶液为含有1.0％牛血清白蛋白、0.1‰硫柳汞钠、5％甘油、5％海藻糖的pH7.2的磷酸盐缓冲液；

所述样本稀释缓冲液为含有1％小牛血清、0.3％Triton-100、0.1‰硫柳汞钠的pH7.2的磷酸盐缓冲液；

所述终止液为强酸，优选为蒸馏水配制的H₂SO₄。

进一步地，所述显色液包括显色剂A和显色剂B：显色剂A为含1.46％磷酸氢二钠，0.93％柠檬酸，0.045％过氧化氢的水溶液；显色剂B为含0.03％四甲基联苯胺，0.096％柠檬酸，0.019％乙二胺四乙二酸钠盐，2％DMSO，4％甘油的水溶液。

本发明还提供了所述试剂盒的操作步骤：

用样本稀释液将阳性对照血清，阴性对照血清和样本以1∶100倍稀释，以100μL/孔加入到重组蛋白包被板内(其中阳性和阴性对照设复孔)，37℃温育30min，倒掉反应板内液体，用洗涤缓冲液洗涤5次排干；然后以100μL/孔加入以酶标抗体1∶40000倍稀释的酶标抗体置37℃温育30min；取出反应板倒掉酶标抗体有洗涤缓冲液洗涤5次；显色液A、B等体积混匀后，以100μL/孔加入，37℃温育10min；加入终止液100μL/孔，置酶标仪上450nm和630nms双波段测量各孔OD值，根据待测样本(S)，阳性对照(P)和阴性对照(N)的OD450＝OD450-OD630和PI值＝(样品OD450/阳性对照OD450)x100％，如果P≥0.6,N≤0.1的基础上PI≥0.2则判定为阳性。

应用本发明所述试剂盒进行鹦鹉热衣原体检测时采用抗原检测抗体的酶联免疫吸附方法。应用在禽群是否感染鹦鹉热衣原体病原的分析中，待测样本为采自禽的血清。

本发明的有益效果在于：

本发明通过基因工程表达重组蛋白MOMP，并以此为抗原包被固相载体进行酶联免疫吸附检测。本发明试剂盒使用基因工程表达的高纯度的重组抗原作为包被抗原，特异性高，灵敏性好。且在抗原包被固相载体后用抗原保护剂对包被好的抗原进行保护，延长了抗原的保存时间。此外，本发明使用的酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG，可广泛针对禽类，如鸡、鸭、鹅等进行通用性的检测。

本发明提供的试剂盒能够弥补现有技术中对鹦鹉热衣原体检测的不足，且ELISA方法便于操作、所需时间短、降低操作人员的主观因素影响。且经济实用，对仪器要求不高，仅需要普通恒温水浴箱、酶标仪等。本发明适于作为大规模商业检测方法推广，具有良好的市场前景。所述试剂盒也可为禽类鹦鹉热衣原体病的流行病学调查与诊断奠定了新的技术基础，满足了临床检验的需求。

附图说明

图1为本发明pET-28a-MOMP重组蛋白诱导表达和纯化的SDS-PAGE电泳鉴定结果。其中：M，蛋白Marker；1，转化pET-28a-MOMP表达质粒的BL21(DE3)诱导后全菌蛋白；2，纯化后的pET-28a-MOMP重组蛋白。

图2为本发明重组pET-28a-MOMP蛋白的Western-blot鉴定结果。其中：M，蛋白Marker；1，纯化的pET-28a-MOMP重组蛋白。

图3为本发明阳性和阴性血清ROC曲线图。

图4为本发明ROC曲线的坐标点及相应的敏感性和1-特异性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 重组蛋白MOMP的制备

1、提取鹦鹉热衣原体6BC株总DNA(DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)

1)取100μL鹦鹉热衣原体6BC株纯化产物，加入200μL缓冲液GA，振荡混匀。

2)加入20μL Proteinase K溶液，振荡混匀，再加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。

3)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时出现絮状沉淀，简短离心。

4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)重复操作步骤6)。

8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附柱膜的中央部位悬空滴加100μL去离子水(预热60℃)，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。

2、引物设计：

根据Genbank上收录鹦鹉热衣原体6BC株MOMP基因序列(Accession：CP002549)，利用Primer Premier 5.0软件设计合成1对MOMP基因(全长1143bp)特异引物MOMP-F和MOMP-R，在上下引物的5’端分别引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点。引物序列如下：

MOMP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；

MOMP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；

3、PCR扩增：以提取的6BC基因组总DNA为模版，用DNA聚合酶扩增MOMP序列。扩增的条件参数：预变性94℃4min后，进入扩增循环，依次为变性94℃30s，退火60℃45s，延伸72℃1.20min。共计35个循环，末次循环后补延伸72℃7min，终止反应。PCR产物用1.5％琼脂糖胶电泳检测，并用胶回收试剂盒(TRANSGEN公司)回收纯化。

4、重组质粒构建：

回收纯化的PCR产物MOMP与pEASY-T1连接，转化DH5α感受态细胞，经酶切鉴定获得重组质粒pEASY-T1-MOMP。用和EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-T1-MOMP并回收MOMP片段，连接到相同酶切处理的pET-28a(+)载体，转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定获得重组质粒pET-28a-MOMP，构建了pET-28a-MOMP重组表达质粒。

5、重组质粒诱导表达和纯化：

1)将构建的pET-28a-MOMP重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，37℃摇床培养至0D0.8，用0.5mM IPTG于37℃诱导4小时。然后离心收集菌体，悬浮于PBS溶液中，超声裂解，离心收集沉淀，次步骤重复2次。

2)将超声、离心后收集的沉淀重新悬浮于10mL 8mol/L尿素溶液中，时，随后将以细胞破碎仪破碎菌体，功率为300W，超声时间5s，间隔时间10S，共超声80次。裂解后的菌液于4℃10000rpm离心10min，将上清转移至透析袋中，依次放入2mol/L尿素溶液中，置于4℃透析复性48小时。最后将透析袋放入1L pH8.020mmol/L的Tris-HCL溶液中继续透析48小时，期间换3次液，收集透析袋中的蛋白液，为粗纯蛋白。按着Invitrogen Ni-NTA琼脂糖树脂说明书进行纯化优化纯化条件。优化后的条件为：

3)1mL纯化柱用20mL含有5mM咪唑的PBS进行平衡，控制流速1mL/s；

4)将10mL粗纯的重组蛋白与1mL平衡好的NI-NTA琼脂糖树脂混合置于4℃结合1小时；

5)将粗纯蛋白和Ni-NTA树脂的混合物倒入直径1cm的空柱子内，控制流速1mL/s；

6)用三分之二柱体积的含20mM咪唑的PBS洗涤柱子2遍，每次流速控制在1mL/s；

7)用6mL含有250mM咪唑的PBS洗脱与NI-NTA树脂结合的目的蛋白，每1mL收集到1个EP管中；

8)收集好的洗脱液每管取10μL，进行15％SDS-PAGE电泳分析纯度，并把蛋白条带比较粗纯度较高的收集管内蛋白溶液收集在一起；

9)收集在一起的纯化蛋白溶液装入透析袋内，在20倍体积的pH7.2的PBS溶液中透析72小时，期间换3次透析缓冲液，透析完成的蛋白和纯化前的蛋白进行15％SDS-PAGE电泳分析纯化效果如图1所示，纯化后的重组蛋白大小为43kDa，即得到纯化好的重组MOMP蛋白；

10)纯化蛋白以禽鹦鹉热衣原体阳性血清进行Western-blot检测,结果只有一条43Kda大小的条带如图2所示这与重组MOMP蛋白理论大小相符，从此结果可以确定纯化获得的蛋白为禽鹦鹉热衣原体重组MOMP蛋白。

11)定蛋白含量分装，冷冻抽干后-80℃保存备用。

实施例2 抗原保护剂的选择

选择-蔗糖、海藻糖、β-1，3/1,6葡聚糖、聚乙二醇6000、甘油、明胶按照表1的组方配制成抗原保护剂，以最佳优化条件包被衣原体MOMP蛋白酶标板，封闭、洗涤后分别加入200μL/孔的抗原稳定剂(处方1、处方2、处方3、处方4、PBS对照组)，4℃过夜，次日取出弃去孔内液体，加入PBST溶液300μL/孔，洗涤3次，每次3min，并用吸水纸拍干，紫外线照射2h，晾干后装入避光袋中，置于37℃环境连续保存7d，每天取出4孔置于4℃环境。第12天取出所有酶标板，并取出-20℃保存的酶标板(-20℃对照组)，按照确定的ELISA程序检测阳性对照品，重复4孔，计算其平均值，比较其OD450’的下降情况。选择与-20℃保存PBS组为对照组。

表1包被稳定剂的组方

蔗糖

葡聚糖

海藻糖

PEG

甘油

明胶

PBS

处方1

2％

2.2％

4％

20％

0.01％

至100％

处方2

2％

-

2.2％

4％

20％

0.01％

至100％

处方3

-

2％

2.2％

4％

20％

0.01％

至100％

处方4

2％

-

20％

0.01％

至100％

PBS组

-

4％

20％

0.01％

至100％

表2不同包被稳定剂在37℃下的测定OD值

	0天	2天	4天	6天	8天	10天	12天
								处方1	1.20	1.18	1.19	1.18	1.15	0.98	0.85
处方2	1.19	1.11	1.02	0.98	0.95	0.70	0.52
								处方3	1.19	1.17	1.18	1.17	1.18	1.05	0.98
处方4	1.21	1.19	1.20	1.19	1.20	1.15	1.12
								PBS组	1.14	1.10	1.0	0.9	0.7	0.54	0.43
-20°保存	1.20	1.20	1.19	1.20	1.19	1.18	1.19

结果显示包被抗原保护液组-处方4组的OD450值几乎没有下降，与-20℃对照组相一致，而处方2组稳定剂和PBS组保存第4天后OD＇450值在开始明显下降，下降趋势比较显著。处方3抗体测定的OD值下降比较缓慢，第12天其OD值低于1.0。因此选择包被处方4为抗原保护剂，筛选的抗原保护处方组成为100ml中含：2％β-1，3/1,6葡聚糖、20％甘油、0.01％明胶。

实施例3 包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板的制备

1、以鹦鹉热衣原体6BC株总DNA为模板，使用特异性引物MOMP-F和MOMP-R进行扩增，得到1143bp的目的片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

MOMP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；

MOMP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；

2、将扩增所得片段回收纯化后用EcoRlI和SalI双酶切回收纯化目的片段；

3、将酶切好的目的片段与用相同酶切的PET28a(+)载体连接获得重组表达质粒；

4、将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，37℃培养，IPTG诱导表达；

5、将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于PBS，pH7.2溶液中经过超声裂解处理后离心取沉淀；

6、重复第5步，获得的沉淀为重组蛋白包涵体；

7、将步骤6的沉淀经尿素溶解、透析复性后，与Ni-NTA琼脂糖凝胶混匀，低温结合；

8、将结合完毕后的蛋白与Ni-NTA琼脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪唑溶液洗涤，除去杂蛋白；

9、以250mmol/L的咪唑溶液洗脱Ni-NTA柱，收集经SDS-PAGE分析达到95％以上纯化程度的重组蛋白MOMP洗脱液；

10、将收集的蛋白洗脱液体装入透析袋中，在20倍体积的PBS溶液中透析去除咪唑，冷冻抽干获得干粉重组蛋白MOMP；

11、将重组蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓度0.5μg/mL，加入酶标板各孔，4℃孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST溶液)封闭，以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干倒掉封闭液，洗涤，甩干；

12、封闭好的微孔板每孔加入200微升的抗原保护剂，pH7.2溶液37度孵育4小时后，倒掉抗原保护溶液，洗涤，甩干，晾干，即获得包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板。

实施例4 禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清的制备

1、取鹦鹉热衣原体6BC株种子液，以2SP溶液作1:200稀释，经卵黄膜接种方式接种7日龄SPF鸡胚，每个胚接种200μL衣原体种子稀释液，置于孵化器中继续孵化。弃去3日内死亡的禽胚，挑选接种后3～8日死亡的禽胚，无菌收获胚体和卵黄膜，以0.01mol/L pH7.2预冷PBS溶液充分洗涤胚体和卵黄膜，取少量卵黄膜以MOMP特异引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的剩余组织加入适量2SP溶液充分匀浆，置于离心管中，4℃3000rpm离心15min,收集上清，加入4％甲醛4℃灭活16h。取灭活前、后的菌液接种细胞，培养36h，以衣原体荧光抗体试剂盒鉴定是否有衣原体生长。收集灭活成功的菌体，小量分装，-80℃保存备用，即为鹦鹉热衣原体抗原。

2、将衣原体抗原以2SP溶液1:10稀释后，应用分光光度法测定衣原体抗原浓度并用2SP溶液稀释至蛋白浓度为2mg/mL。选择8周龄SPF鸡，采血、分离血清，经衣原体IHA试剂盒检测，选择衣原体抗体为阴性禽2只，进行免疫。

3、首免：将氟氏完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取1mL颈部皮下多点注射。

4、二免：首免后第14天，取氟氏不完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取1mL颈部皮下多点注射。

5、三免：二免后第7天，同二免方法加强免疫一次。

6、加强免疫：三免后第7天，肌肉和颈部皮下各注射衣原体抗原1mL。

7、血清抗体效价检测：加强免疫7天后翅静脉各采血300μL，至无菌微量离心管中，于37℃静置2小时，然后4℃过夜。次日8000g离心2分钟，分离血清。经衣原体IHA试剂盒测定血清抗体效价，选取效价≥1:256的SPF鸡，进行心脏采血，无菌分离血清，56℃水浴灭活30min，即获得禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清。

实施例5 禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清的制备

1、取2只SPF鸡，分别采血、分离血清，56℃水浴灭活30min，

2、经过衣原体间接血凝(IHA)试剂盒检测，选取效价≤1:4的SPF鸡，进行心脏采血，无菌分离血清，56℃水浴灭活30min混合，小量分装，即为衣原体阴性血清，-20℃保存备用。

实施例6 禽鹦鹉热衣原体病酶联免疫检测试剂盒

1、各种试剂溶液的配制：

1)包被缓冲液为pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液(CB)；

2)封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST溶液；

3)洗涤缓冲液为含0.5‰吐温-20、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBST)；

4)样本稀释缓冲溶液为含有1％小牛血清、0.3％Triton-100、0.1‰硫柳汞钠的pH7.2的磷酸盐缓冲液

5)酶标抗体稀释溶液为含有1.0％牛血清白蛋白、0.1‰硫柳汞钠、5％甘油、5％海藻糖的pH7.2的磷酸盐缓冲液；

6)显色剂A为含1.46％磷酸氢二钠，0.93％柠檬酸，0.045％过氧化氢的水溶液。

7)显色剂B为含0.03％四甲基联苯胺，0.096％柠檬酸，0.019％乙二胺四乙二酸钠盐，2％DMSO，4％甘油的水溶液。

实施例7 禽鹦鹉热衣原体病酶联免疫检测试剂盒的应用

禽鹦鹉热衣原体病酶联免疫抗体检测法的具体实施步骤如下：

1)包被：用包被缓冲液将鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP稀释成终浓度0.5μg/mL，100μL/孔包被于NUNC公司生产的96孔酶标板上，4℃温育16小时。倒掉酶标板内液体，PBST洗涤3次，甩干。

2)封闭：以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干。

3)保护：加入抗原保护剂，pH7.2溶液37℃孵育4小时后，倒掉抗原保护剂，洗涤，甩干，晾干，即获得包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板。

4)样品稀释：用样本稀释缓冲溶液将待测血清、阴性和阳性对照血清1∶100稀释。

5)加样：以100μL/孔待测样品加入封闭后的酶标板孔中，同时以100μL/孔设复孔阴性对照和阳性对照，37℃温育30分钟。PBST冲洗5次，甩干。

6)加酶标抗体：用酶表抗体缓冲液将酶标抗体稀释成1∶40000的酶工作液，每孔加入100μL，37℃温育30分钟。PBST冲洗5次，甩干。

7)显色：每孔先后加入显色剂A、B 50μL，37℃避光温育10分钟。

8)终止：每孔加入100μL终止液。

9)检测：于酶标仪上双波长检测450nm/630nm吸收值。

实施例8 禽鹦鹉热衣原体病酶联免疫检测试剂盒的灵敏性和特异性

1、灵敏性检测：用该试剂盒检测了经实施例1中的引物对MOMP-F/MOMP-R做了PCR鉴定证明均为阳性的92份感染鹦鹉热衣原体的SPF鸡喉头拭子，判断。灵敏度以真阳性率表示，即灵敏度(％)＝[阳性数/(真阳性数+假阴性数)]x 100％。

2、特异性检测：用该试剂盒检测了经实施例1中的引物对MOMP-F/MOMP-R做了PCR鉴定证明均为阴性的92份SPF鸡血清，判断。特异性以真阴性率表示，即特异性(％)＝[阴性数/(真阴性数+假阳性数)]x 100％。检测结果如下：

注“+”代表阳性；“-”代表阴性。

3、92份由PCR检测阳性的样品，ELISA试剂盒检出88份阳性，4份阴性；92份由PCR检测阴性的样品，ELISA试剂盒检出0份阳性，92份阴性。用SPSS软件对两种方法的做X2检验(McNemar Test)，P＞0.05，表明两种方法没有显著差别，同时初步得出本试剂盒的灵敏度为95.7.3％，特异性为100％。

实施例9 重复性检测

按照ELISA操作方法，以同一试剂盒对8份禽血清(4份阴性，4份阳性)各重复测定3次；同时，用同一批不同试剂盒和不同批次的试剂盒分别对8份禽血清进行重复检测各3次，计算其各自OD450的平均值，按照CV(％)＝(SD/AV OD450)x100％计算该ELISA试剂盒的板内、批内和批间变异系数CV值，验证该ELISA试剂盒的重复性。检测结果如下：

ELISA试剂盒板内和批内变异系数均小于10％，批间变异系数均小于15％。

实施例10 禽衣原体病酶联免疫抗体检测试剂盒标准体系的建立

1、临界值的建立：根据优化确立的ELISA试验条件，检测146份人工感染的鹦鹉热衣原体阳性血清和108份SPF鸡阴性血清进行检测，计算各血清的OD450与阳性对照OD450的比值PI，以1-特异性为横坐标，敏感度为纵坐标，运用SPSS 20.0软件绘制ROC曲线，统计尤登指数(Youden’s Index，YI)，YI＝敏感性+特异性-1，选择尤登指数最大处为最佳临界点，此点对应的敏感性和特异性最高，确定该处的PI值为试剂盒临界值(CUT-OFF值)。如图3和图4所示，经SPSS20.0软件绘制得到ROC曲线，曲线下面积＝0.975，尤登指数最大值＝0.837，此点对应的灵敏性为0.911，特异性为0.926，对应坐标点为PI＝16.975。该方法变异系数约为15％，故确定该试剂盒的CUT-OFF值PI＝20％。

2、检测结果判定标准：待测样本(S)，阳性对照(P)和阴性对照(N)的OD450＝OD450-OD630和PI值＝(样品OD450/阳性对照OD450)x100％，如果P≥0.6,N≤0.1则试剂盒有效。在此基础上PI≥20％则判定为衣原体阳性。PI＜20％则判定为衣原体阴性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的固相载体，酶标抗体，禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清，禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清；

所述鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述固相载体包被鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP后，经抗原保护剂处理，所述抗原保护剂含有2％的β-1，3/1,6葡聚糖，20％的甘油和0.01％的明胶，余量为PBS。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板，包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板的制备方法为：

1)以鹦鹉热衣原体6BC株总DNA为模板，使用特异性引物MOMP-F和MOMP-R进行扩增；

MOMP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；

MOMP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；

5)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于pH7.2的PBS溶液中，经过超声裂解处理后离心取沉淀；

6)重复第5)步，获得的沉淀即为重组蛋白包涵体；

11)将重组蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓度0.5μg/mL，加入酶标板各孔，4℃孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液封闭，倒掉封闭液，洗涤，甩干；其中，所述封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST溶液；

12)封闭好的酶标板每孔加入200微升的抗原保护剂，pH7.2溶液37℃孵育4小时后，倒掉抗原保护剂，洗涤，甩干，晾干，即获得包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清的制备方法为：

取鹦鹉热衣原体6BC株灭活抗原，将抗原以2SP溶液稀释至蛋白浓度为2mg/mL；

选择8周龄，衣原体抗体为阴性SPF鸡，进行免疫；

首免：将氟氏完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取1mL颈部皮下多点注射；

二免：首免后第14天，取氟氏不完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取1mL颈部皮下多点注射；

三免：二免后第7天，同二免方法加强免疫一次；

四免：三免后第7天，肌肉和颈部皮下各注射衣原体抗原1mL；

1周后采血，经衣原体IHA试剂盒测定血清抗体效价，选取效价 ≥1:256的SPF鸡，进行心脏采血，无菌分离血清，水浴灭活，即获得禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清的制备方法为：

选取2～4只SPF鸡，分别采血、分离血清，水浴灭活，经过衣原体间接血凝(IHA)试剂盒检测，收集结果为阴性的禽血清，混合，即为禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液、酶标抗体稀释溶液、样本稀释缓冲液、显色液和终止液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为含0.5‰吐温-20、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBST)；

所述终止液为强酸。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为蒸馏水配制的H₂SO₄。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液包括显色剂A和显色剂B：显色剂A为含1.46％磷酸氢二钠，0.93％柠檬酸，0.045％过氧化氢的水溶液；显色剂B为含0.03％四甲基联苯胺，0.096％柠檬酸，0.019％乙二胺四乙二酸钠盐，2％DMSO，4％甘油的水溶液。