CN113087778B

CN113087778B - 鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白的制备方法和应用

Info

Publication number: CN113087778B
Application number: CN202110394222.6A
Authority: CN
Inventors: 何诚; 李强; 隋卓君; 王艺晖; 李小慧
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2021-04-13
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2041-04-13
Also published as: CN113087778A

Abstract

本发明提供了一种禽鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)多形外膜蛋白PmpG蛋白的制备方法及其应用。本发明提供：1)鹦鹉热衣原体PmpG蛋白包括17G、19G、20G和21G蛋白表达的引物、载体、表达条件、蛋白复性技术。2)利用制备的Pmp20G蛋白为包被抗原，制备ELISA诊断试剂盒，具有良好的特异性、敏感性和重复性，与国外商品化试剂盒相比符合率达到98.1％，且与其它相关呼吸道病原无交叉反应。3)以鹦鹉热衣原体Pmp17G、19G、20G、21G四种蛋白组合物为抗原，制备的疫苗具有使用剂量小，协同效应高，免疫保护效力高等特点。4)以鹦鹉热衣原体Pmp17G、19G、20G、21G四种蛋白组合物为抗原，以壳聚糖凝胶为佐剂可通过气雾免疫途径，产生良好的呼吸道粘膜免疫，防治鹦鹉热衣原体的感染，阻断鹦鹉热衣原体从畜禽向人群传播。

Description

鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白的制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白的制备方法和应用。

背景技术

禽衣原体病(Avian Chlamydiosis)是由鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，C.psittaci) 感染禽类而引起不同症候群的一种接触性人畜共患传染病，在临床上主要是以肺炎、心包炎、气囊炎、结膜炎为特征。感染的发病禽群，可以长期向外排出衣原体，严重威胁人类健康。由于缺少可靠的商业诊断试剂盒和疫苗，难以有效防控鹦鹉热衣原体的传播，该病的流行已经严重威胁到养殖业的发展和人类健康，因此急需探究禽鹦鹉热衣原体的反应性和免疫性抗原，用于开发新型的检测试剂盒和疫苗，防控鹦鹉热衣原体的感染。

针对疫苗的研究方面，有全菌疫苗和亚单位疫苗。全菌疫苗包括灭活疫苗和减毒活苗。减毒活苗虽然可以有效保护宿主，但是这种保护是短期的，存在突变的可能，引起致病力增强，造成人为的衣原体持续性感染。灭活疫苗具有安全简便的特点，能起到较好的保护效果，但是亚型较多且成本较高。随着蛋白质组学技术的发展，不断加深了对衣原体蛋白功能的了解。疫苗研究从全菌疫苗转向亚单位疫苗，亚单位疫苗候选者主要有：主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)、多形态膜蛋白(polymorphic membraneproteins，Pmps)和质粒糖蛋白(plasmid glycoprotein，Pgp)。天然的和重组的MOMP蛋白作为疫苗，都可以诱导鹦鹉热等衣原体的保护性免疫。但是由于重组蛋白无法模拟蛋白的天然结构，充分暴露T细胞和B细胞抗原表位，保护效力不稳定。

Pmps为衣原体外膜蛋白，由pmp基因编码，包含PmpA-I蛋白，Pmps可通过介导衣原体粘附，促进早期感染。蛋白组学分析表明Pmp蛋白具有免疫原性，富含T细胞和B细胞抗原表位，可用于疫苗研究。多个研究证明Pmps蛋白含有T细胞抗原表位，而清除早期衣原体的感染需要CD4+T细胞的参与，Pmps通过诱导T细胞免疫从而保护机体不受衣原体感染。大肠杆菌Nissle 1917菌影搭载鹦鹉热衣原体Pmp C蛋白可以诱发BALB/c小鼠保护性体液免疫和黏膜免疫，抵抗沙眼衣原体的感染。通过表达9种沙眼衣原体Pmps蛋白发现， Pmp C、PmpG和Pmp H具有最佳的保护效应。但C.psittaci PmpG蛋白在诊断及免疫保护中的作用目前尚不清楚。通过对C.psittaci不同基因型参考株的PmpG蛋白进行生物信息分析，根据氨基酸序列的相似度，将PmpG蛋白分为高相似组(High identity group，HIG) 和低相似组(Lowidentity group，LIG)。C.psittaci 6BC株HIG成员有Pmp12G、13G、14G、 15G、19G、20G和21G，相似度为75％-85％，LIG成员有Pmp7G、8G、9G、10G、11G、16G和17G，相似度为30％-49％。HIG蛋白四肽基序GGAI和FxxN的平均数量分别为2.7和 7.4个，LIG蛋白GGAI和FxxN的平均数量分别为3.7和7.1个。C.psittaci 6BC株的HIG蛋白和C.trachomatis PmpG蛋白具有33％的相似性，而LIG蛋白中Pmp7G和C.trachomatis PmpG 相似度最高(37％)，Pmp17G相似度最低(28％)，其中Pmp19G、Pmp20G和Pmp21G 为高相似度蛋白。但是PmpG族的哪些蛋白具有反应原性或免疫原性并不清楚。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供禽鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白，其具有免疫原性的蛋白包括Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G；其具有反应原性的蛋白包括 Pmp 17G和Pmp20G。

本发明的第二个目的在于提供上述蛋白表达为可溶性蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供Pmp17G、19G、20G、21G蛋白在免疫诊断和疫苗制备中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白，其具有免疫原性的蛋白包括Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G和Pmp21G，其具有反应原性的蛋白包括Pmp17G和Pmp19G，其中， Pmp17G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.1所示，Pmp19G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.2，所示Pmp20G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.3所示，Pmp21G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.4所示；

或与SEQ ID NO.1-4所示氨基酸序列中经取代、缺失、添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白质。

本方法表达的PmpG蛋白与衣原体内的PmpG蛋白具有相同的活力和活性。

本领域技术人员可根据本发明公开的Pmp17G、19G、20G、21G蛋白的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列，不影响其免疫原性。得到具有与Pmp17G、19G、20G、21G蛋白或同等活性的衍生蛋白质。

本发明提供编码如上所述Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白的基因序列如 SEQID NO.5-8所示。所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码Pmp17G、19G、 20G、21G蛋白的核苷酸序列。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明 Pmp17G、19G、20G、21G基因还包括所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码Pmp17G、19G、20G、21G蛋白的核苷酸序列。

含有如上所述基因的载体pKM32。

一种制备Pmp17G、19G、20G、21G蛋白的方法，包括如下步骤：

a)PCR方法扩增如SEQ ID NO.5-8所示的鹦鹉热衣原体Pmp17G、19G、20G、21G 基因；

b)将Pmp17G、19G、20G、21G基因导入酿酒酵母CEN.PK2株进行同源重组；

c)将构建成功的pKM32载体转入特定的感受态细胞；

d)筛选抗性菌株扩大培养，诱导蛋白表达；

e)分离后经镍柱纯化并用透析袋复性获得具有生物活性的可溶性形式的蛋白。如上所述的方法，优选地，选择pKM32穿梭质粒作为重组载体，该质粒可以在酿酒酵母和大肠杆菌中复制。酿酒酵母的质粒转化采用醋酸锂法，经PCR扩增鉴定的目的基因和线性化的pKM32载体同时在酵母内进行转化。扩增片段上与pKM32载体上的同源部分可以通过同源重组进行整合。在酵母中，可通过营养选择培养基(Ura^-)对阳性克隆进行筛选。经酵母同源重组后，提高了蛋白的生物活性和可溶性表达。本发明中的感受态细胞为Rosetta GM-48，有助于含二硫键蛋白的高效表达，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

如上所述的方法，优选地，PCR方法所用的引物如SEQ ID NO.9-16所示。

含如上所述Pmp20G蛋白的ELISA诊断试剂盒。

本发明提供了含有重组蛋白Pmp20G的禽鹦鹉热衣原体ELISA诊断方法，其最适条件为：抗原包被浓度4μg/mL，血清稀释比列1：200，孵育时间90min，二抗比例1：72500，孵育时间1h，封闭液含0.5％的明胶。

本发明提供了一种用于预防和控制禽类衣原体感染的联合疫苗，所述联合疫苗包括如上所述的Pmp17G、19G、20G和21G蛋白。

如上所述的联合疫苗，优选地，其制备方法为每羽份包含Pmp17G、19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白各50μg，加入壳聚糖凝胶至0.2mL，混合均匀。

如上所述的联合疫苗，优选地，其通过滴鼻和注射方式进行免疫。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的禽鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG，包括17G、19G、20G、21G蛋白与壳聚糖凝胶制备的温度敏感性疫苗，经呼吸道接种，产生良好的免疫效力，安全性高，且可以实现气雾免疫和用于集约化饲养动物的免疫，替代传统的注射免疫，节省劳动成本，最大限度有益于动物福利和动物保护。

本发明提供了一种将Pmp17G、19G、20G、21G基因导入酿酒酵母CEN.PK2株进行同源重组，再经过大肠杆菌表达高效可溶性蛋白成分。

本发明通过分析鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白的种间保守性，经Western blot验证， Pmp17G和Pmp20G具有良好的反应原性，建立ELISA检测方法，其中Pmp20G为包被抗原建立的ELISA抗体检测试剂盒，具有良好的特异性、敏感性和重复性，与国外商品化试剂盒相比符合率达到98.1％，且与其他相关呼吸道病原无交叉反应。可见，Pmp20G 蛋白具有较好的反应原性和临床诊断价值，可以开发其应用于禽鹦鹉热衣原体的诊断试剂盒或诊断试剂。

以鹦鹉热衣原体Pmp17G、19G、20G、21G四种蛋白组合物为抗原，以温度敏感性的壳聚糖凝胶为佐剂，制备的疫苗通过呼吸道粘附附着在粘膜表面，诱导粘膜免疫；多种组合抗原协同效应高，免疫效力高等特点。本发明疫苗可通过气雾免疫途径，替代注射免疫途径，有效减少了对家禽的免疫应激，实现了免疫过程中的动物福利和动物保护。

综上，本发明涉及的禽鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白Pmp17G、19G、20G、21G是有潜力的疫苗和诊断候选抗原，在预防和控制禽类衣原体感染方面有良好的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为Pmp17G基因PCR扩增结果，其中M：DNA marker；1：Pmp17G基因扩增条带；2：阴性对照。

图2为Pmp19G基因PCR扩增结果，其中M：DNA marker；1：Pmp19G基因扩增条带；2：阴性对照。

图3为Pmp20G、21G基因PCR扩增结果，其中M：DNA marker；1和3：阴性对照，2：Pmp20G基因扩增条带；4：Pmp21G基因扩增条带。

图4为构建的pKM32表达载体双酶切PCR扩增结果，其中M：DNA marker；1：原始pKM32质粒；2：pKM32质粒双酶切结果。

图5为Pmp17G、19G、20G、21G蛋白的SDS-PAGE结果，以及Western-blot对四种蛋白的鉴定。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明方法、步骤或条件所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1禽鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白Pmp17G、19G、20G、21G基因的克隆表达与重组蛋白的制备

1实验材料

1.1菌株、质粒载体、细胞株与血清

鹦鹉热衣原体6BC株由南华大学吴移谋教授惠赠，于中国农业大学动物医学院实验室保存。酿酒酵母CEN.PK 2-1C株，大肠杆菌Rosseta GM-48株：由德国海因里希·海涅大学惠赠。大肠杆菌RosettaGM48购自Nonages公司(美国)。Hela229细胞和鹦鹉热衣原体6BC阳性血清保存于中国农业大学动物医学院。pKM32载体：以pAC2为基础骨架，整合CEN6,ARS,URA3，在目的蛋白N端融合His标签，由德国海因里希·海涅大学惠赠。

1.2主要试剂及试剂盒

酵母含氮碱基(YNB)购自BD公司(美国)。对甲苯胺蓝(BCIP)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、牛胸腺载体-DNA(ss-DNA)购自Sigma公司(德国)。氯化钠、脲素和磷酸二氢钠购于上海国药(分析纯)。卡那霉素、姬姆萨染色液、琼脂粉、胰蛋白酶-EDTA 消化液(0.25％)、盐酸胍、Tris、咪唑、Triton X-100和50×TAE缓冲液购于北京索莱宝公司。放线菌酮购于北京鼎国昌盛生物技术公司。胎牛血清购于美国HyClone。DMEM (高糖)培养基购于美国Gibco公司。酵母浸粉、和胰蛋白胨购于美国OXOID公司。10 ×Loading Buffer、普通PCR酶、高保真PCR酶BamHI和XhoI酶均购于北京TAKARA 公司。T4连接酶购于北京NEB公司。琼脂糖购于西班牙Biowest公司。Trans2K DNA Marker和ECL发光底物溶液购于北京全式金公司。E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A. Gel Extraction Kit购于美国OMEGA公司。Qiagen DNA Mini kit购于QIAGEN公司。β- 巯基乙醇购于北京百奥莱博科技有限公司。兔抗His单抗和羊抗鸡IgY H&L(HRP)购于 abcam(上海)公司。羊抗兔IgG多抗西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。His蛋白纯化柱购于常州天地人和。PVDF膜购于Millipore公司。PageRuler Prestained Protein Ladder(10-180KDa)购于中国赛默飞世尔科技有限公司。Unstained Protein Marker (14.4-116KDa)购于上海翊圣生物科技有限公司。

1.3引物的设计及目的基因扩增

1.3.1引物序列

本发明提供的目的基因序列基于鹦鹉热衣原体pmp17G、pmp19G、pmp20G、pmp21G优化而来。现有序列的蛋白表达性差，表达量低，并且容易降解。经优化后本发明目的基因可高效、快捷的表达相应的蛋白，且具有相同的活力和活性。本发明基因序列，用SMART在线网站(https://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白结构域和信号肽分析，优化氨基酸序列，选取去除信号肽的PmpG蛋白N端进行表达，其中，Pmp17G蛋白的氨基酸序如SEQ IDNO.1所示，Pmp19G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.2所示，Pmp20G蛋白的氨基酸序如SEQ IDNO.3所示，Pmp21G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.4所示。本发明表达的蛋白具有较好的稳定性和可溶性，可应用于诊断试剂和疫苗的研发。本发明经试验验证编码Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白的基因序列如SEQ ID NO.5-8所示，扩增这些蛋白的基因所优化的引物序列如表1-1所示，由上海捷瑞生物工程有限公司进行引物合成。

表1-1 pmp17G、pmp19G、pmp20G和pmp21G基因克隆引物

上述引物序列根据目的基因进行针对性设计，为保证后续实验的开展，对不同引物序列进行优化，分别添加对应的酶切位点和His标签(具体见下划线部分)，用于目的片段的特异性剪切和鉴定。

1.3.2目的基因扩增

以鹦鹉热6BC基因组为模板，使用引物表1-1扩增目的基因pmp17G、pmp19G、pmp20G和pmp21G，扩增反应体系如表1-2所示，扩增反应程序为98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s，变性至延伸重复29个循环后，72℃继续延伸10min，反应结束。

表1-2 PCR扩增反应体系

1.3.3目的基因的鉴定及回收

(1)配制1％的琼脂糖凝胶电泳。

(2)PCR扩增结束后，取5μL PCR产物与0.5μL 10×Loading Buffer混匀，将样品加入1％琼脂糖凝胶中，进行电泳分析，电泳条件：125V恒压，25-30min。结果见图1、图2和图3，分别可见目的基因Pmp17G约1267bp，Pmp19G约1467bp，Pmp20G约1479bp， Pmp21G约1501bp，条带大小与预期相符。

(3)将鉴定为阳性的产物，用OMEGA E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行目的基因回收，具体操作按说明书进行。

(4)回收后，用NanoDrop分光光度计测定DNA纯度。DNA样本的A260/A280比值用于检查DNA的纯度。如果该比值为1.8到2.0之间，则认为DNA纯度足够用于下一步试验。

1.4酵母同源重组克隆目的基因

酿酒酵母的质粒转化采用醋酸锂法(LiAc)，经PCR扩增鉴定的目的基因和pKM32载体同时在酵母内进行转化。扩增片段与pKM32载体上的同源部分通过同源重组进行整合。

(1)单菌落的酿酒酵母CEN.PK2株接种入5m L YPD液体培养基，140rpm，30 ℃过夜培养。

(2)将过夜培养的酿酒酵母稀释到50ml YPD培养基(OD＝0.1)中，140rpm，30 ℃培养4-5小时，直到培养物OD600＝1.0，约2×10⁷细胞/m L。

(3)将50m L培养物室温3500rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用25m L无菌双蒸水重悬后，再次离心。

(4)弃上清，沉淀用1m L 100mM的醋酸锂重悬后转入1.5m L离心管。

(5)将离心管13000rpm离心15秒，弃上清并获得沉淀，用500μL 100mM的 LiAc重悬(约2×10⁹细胞/ml)。

(6)每个转化样品使用50μL感受态酿酒酵母，13000rpm离心15秒后，弃上清待用。

(7)载体ss-DNA(2mg/m L)在100℃下变性5分钟后迅速置于冰上。

(8)pKM32载体用SmaI内切酶30℃过夜孵育，使用前需琼脂糖凝胶电泳检查，确保载体完全线性化。转化体系包括(365μL)：感受态细胞、240μL无菌PEG(50％w/v)、 36μL 1M醋酸锂、50μL载体ss-DNA、2μL线性载体、3μL目的基因片段、34μL ddH₂O。

(9)上述转化体系溶液在30℃孵育30分钟后，转入42℃孵育30分钟。

(10)孵育后将离心管8000rpm离心15秒。用200μL ddH₂O重悬沉淀。

(11)将重悬物均匀的涂布在选择培养平板上，30℃孵育2-3天。

(12)挑出单个阳性克隆菌落，涂布在新的选择培养平板上，30℃过夜孵育后，4 ℃保存待用。

1.5酿酒酵母中质粒的抽提

(1)单个阳性克隆菌落接种入5m L选择SD培养基140rpm，30℃过夜培养。

(2)2m L过夜培养物转入2m L离心管中，13000rpm离心15秒。去上清后，用 1m LddH₂O重悬沉淀，再次离心。

(3)弃上清，细胞沉淀用600μL的P1溶液重悬。

(4)加入600μL的P2溶液，另外加入2/3体积的灭菌玻璃珠，用Precellys 24破碎机6500rpm进行两轮(每轮20秒)破碎。

(5)破碎后，悬液2000rpm离心5分钟，将1m L上清转入新的1.5m L离心管中，加入500μl的P3溶液，颠倒4-6次混匀后置于冰上15分钟。

(6)将悬液13000rpm离心15分钟，取1.2m L上清，至于新的2m L离心管中。

(7)加入600μL异丙醇，将悬液13000rpm离心30分钟。

(8)小心地去除上清，用500μL 70％乙醇清洗沉淀，然后再次13000rpm离心10分钟。

(9)小心地去除上清，DNA沉淀在Speed-vac中真空干燥15到20分钟。

(10)完全干燥后，DNA沉淀用30-100μL ddH₂O溶解，提取的质粒用于后续感受态细胞的转化。

1.6质粒pKM32和目的基因PCR产物双酶切

(1)将目的基因PCR产物以及载体pKM32按表1-3进行双酶切。

表1-3目的基因和载体双酶切反应体系

(2)酶切完成后，用OMEGA E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒回收酶切产物，具体按说明书进行操作，回收完成后用NanoDrop分光光度计测定回收产物的浓度。

1.7感受态细胞中的电转化

(1)灭菌的电极杯在使用前置于冰上冷却。

(2)10μL电转化感受态E.coli置于冰上消融。

(3)将5-10μL酿酒酵母中质粒抽提物(质粒DNA)加入电极杯底部。

(4)10μL E.coli感受态细胞加入电极杯底部。

(5)100μL灭菌水加入电极杯底部。

(6)使用Bio-Rad Gene Pulser(2.1KV,200Ohm and 25μF)进行电转化。

(7)电转后的细菌在1m L LB培养基中重悬，140rpm，37℃培养45分钟。

(8)细菌悬液在13000rpm下离心1分钟，弃除80％的上清，将沉淀用剩余的200μL上清重悬后，均与地涂布在含有选择抗性的LB培养板上，置于37℃过夜孵育培养。

1.8阳性克隆PCR鉴定

(1)从LB固体琼脂板上挑单菌落，接种于含5mL LB培养液、2.5μL卡那霉素的培养基中，于37℃摇床以180rpm过夜。

(2)取摇过夜的菌液进行PCR鉴定(所用引物与表1-1相一致)，扩增反应体系见表1-4，扩增反应程序：95℃预变性5min，95℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min40s，变性至延伸步骤重复29个循环后，72℃再延伸10min，反应结束。

表1-4 PCR反应体系

(3)PCR结束后，取5μL产物进行核酸电泳，进行凝胶成像，保存图片进行分析。结果如图4所示，可见原始pKM32质粒有超螺旋、线性、开环三种形态，双酶切后的载体已被酶切成为大小5300bp的片段。

1.9阳性克隆提取

(1)经菌液PCR鉴定后，用OMEGA Plasmid DNA Kit试剂盒提取质粒，按说明书进行操作。

(2)质粒提取结束后，用NanoDrop2000测定纯度。

(3)将质粒送往上海生工进行测序，余置于-20℃保存。

2重组蛋白小样表达、条件优化及大批量表达纯化

2.1重组蛋白小样表达

(1)将测序正确的质粒分别取1μL转化至E.coli Rossetta感受态细胞中。

(2)小样表达优化条件如下，见表1-5。

表1-5蛋白表达条件优化

(3)制备种子液：从LB固体琼脂板上挑单菌落，接种于5mL含2.5μL卡那霉素的 LB培养基中，于37℃摇床以180rpm过夜。

(4)按1％的比例(v/v)将种子液接种至5mL含2.5μL卡那霉素的LB培养基中，于37℃摇床以180rpm摇2h-2.5h至OD600达0.4-0.6，加入5μL IPTG诱导剂(终浓度为 1mmol/L)，按表1-5进行小样表达。

(5)处理样品：小样表达结束后，以5000rpm离心5min，收集表达菌沉淀。用500μLPBS重悬菌体沉淀，经冰浴超声(45％W，3s/3s)，进行离心，分离上清沉淀。

(6)用500μL PBS重悬沉淀，分别取20μL上清和沉淀，加入6μL 5×SDS-PAGERunning buffer和3μL 1mM DTT，混匀，金属浴100℃10min，使蛋白变性。

(7)配制12％SDS-PAGE凝胶，每孔加入10μL处理好的样品，以80V，电泳30min，后改为120V进行凝胶电泳。

(8)电泳结束后，取下蛋白胶，进行考马亮蓝染色，乙醇脱色后，进行凝胶成像，拍照保存进行分析。

2.2重组蛋白大批量表达及纯化

(1)按上述步骤中制备20mL种子液，以1％的比例(v/v)接种至250mL含125μL 卡那霉素的LB培养基中，于37℃摇床以180rpm摇2h-2.5h至OD600达0.4-0.6，按优化后条件进行诱导表达。

(2)表达结束后，收集菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬沉淀，4℃过夜裂解。然后冰上超声破碎10min，以12000rpm 4℃离心30min，分离上清沉淀，用上清进行后续纯化。

(3)用含天地人和Ni Sepharose 6Fast Flow填料的组装柱进行变性条件下纯化，纯化具体操作按填料说明书进行。

(4)经平衡纯化柱、上样、洗杂、洗脱等纯化步骤，收集洗脱后蛋白，处理蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳。

(5)电泳完成后进行考马亮蓝染色、脱色，进行凝胶成像，拍照保存进行分析。

2.3重组蛋白包涵体复性

(1)将纯化后的蛋白稀释至1mg/mL的浓度，加入蛋白透析袋中，置于PBS缓冲液中于4℃透析复性48h，期间换液3次。

(2)透析复性完成后，将复性后的蛋白液于4℃以12000rpm离心10min，分离上清沉淀，取小样处理蛋白样品，用于跑胶鉴定。

2.4重组蛋白SDS-PAGE电泳和Western-Blot鉴定

(1)将复性后的Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用伯乐半干转仪器将蛋白转印至PVDF膜，具体按说明书操作，转膜条件：400mA，转膜15min。

(2)转膜完成后，用封闭液室温封闭1h。

(3)用封闭液按比例稀释一抗(小鼠抗his单克隆抗体，按1:2000稀释；鸡C.psittaci 6BC阳性血清，按1:500稀释)，室温摇床孵育1h。

(4)用TBST洗膜4次，每次5min。

(5)用封闭液按比例稀释二抗(兔抗鼠IgG多克隆抗体，按1:4000稀释；兔抗鸡IgG多克隆抗体，按1:5000稀释)，室温摇床孵育1h。

(6)用TBST洗膜4次，每次5min。

(7)用ECL显色液进行显色，拍照进行保存。

(8)经SDS-PAGE和Western-Blot鉴定后，将蛋白分装冻干，储存于-20℃。

结果说明为表达具有生物活性的可溶性重组PmpG蛋白，利用穿梭载体pKM32由酿酒酵母同源重组到大肠杆菌进行大规模表达，分别表达获得Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G 和Pmp21G蛋白。分别使用SDS-PAGE和抗His Western-blot鉴定重组Pmp17G、Pmp19G、 Pmp20G、Pmp21G蛋白的表达和纯化效果，见图5所示。说明本发明各PmpG蛋白的表达和纯化效果均良好，可用于后续研究和应用。

实施例2禽鹦鹉热衣原体PmpG-ELISA方法的建立

1主要试剂及试剂盒

IPTG(异丙基-β-D2半乳糖苷)、蛋白酶K、RNA酶A：购自Merk公司(北京)。低分子量蛋白Marker：Fermentas公司，批号SM0671；尿素(分析纯)，考马斯亮兰R-250， BPB(溴酚蓝)，立春红S：购自北京科昊泽技公司。HRP标记的兔抗鸡IgG抗体，HRP标记的兔抗羊IgG抗体，HRP标记的兔抗猪IgG抗体，PVDF膜：购自北京鼎国生物科技有限公司。3，3'-二氨基联苯胺(DAB)，TEMED，过硫酸铵，丙烯酰胺，N，N'一亚甲双丙烯酰胺：均购自为美国Amresco公司产品。MOMP重组蛋白：由中国农业大学动物医学院制备和鉴定。

1.1实验动物与血清

28日龄SPF鸡购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。大肠杆菌、H9N2型禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡鼻支气管鸟疫杆菌、禽传染性支气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌、禽偏肺病毒及鸡支原体的鸡阳性血清购买于中国兽医药品监察所，储存于实验室。采集于北京、沈阳、山东、河北、山西、江苏和天津7个省市的鸡养殖场的临床样本共计127 份，其中包括87份1-260日龄的肉鸡血清和40份35-360日龄的蛋鸡血清。

鹦鹉热衣原体标准阳性、阴性血清：用鹦鹉热衣原体标准菌株对SPF鸡进行攻毒，然后采集分离鸡的血清，用间接凝胶试验鉴定阳性和阴性血清。并冷冻保存。其他试剂均为分析纯，购自中国农业大学供应科及北京广达恒益有限公司。

2方法建立

2.1间接ELISA程序

(1)蛋白包被：用ELISA包被液将蛋白稀释至相应浓度，每孔添加100μL，于4℃过夜包被。

(2)洗板：次日，弃包被液，每孔加入200μL PBST，将ELISA板置于微型振荡器5min，弃PBST，重复此步骤4次。

(3)封闭：每孔添加200μL封闭液，于37℃孵育1h。

(4)洗板5次，步骤同(2)。

(5)孵育一抗：用抗体稀释液按比例稀释血清，每孔加入100μL已稀释好血清，于37℃孵育1h。

(6)洗板5次，步骤同(2)。

(7)孵育二抗：用抗体稀释液按比例稀释兔抗鸡IgY(HRP)，每孔加入100μL，于37℃孵育1h。

(8)洗板5次，步骤同(2)。

(9)显色：每孔添加100μL已恢复至室温TMB显色液，室温孵育15min。

(10)中止：每孔加入100μL 2M硫酸中止显色，用酶标仪测定OD450。

2.2ELISA条件优化

通过优化以下条件，使得间接ELISA标准阳性血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm达最大值，即P/N最大。在此前提下，使标准阴性血清的OD450nm尽可能的小，即为ELISA的最佳条件。

2.3蛋白包被浓度优化

分别将Pmp17G和Pmp20G蛋白按如下浓度进行稀释：64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、 8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL，每个浓度设两孔重复，4℃过夜包被。用含10％脱脂奶粉的PBST，每孔200μL，于37℃孵育1h。将标准阴性血清和阳性血清用抗体稀释液分别按1:25、1:50、1:100、1:200和1:400的比例进行稀释，37℃孵育1h。用抗体稀释液稀释兔抗鸡IgY(HRP)二抗至1:72500，37℃孵育1h，加样布局如表2-1所示。

表2-1蛋白包被浓度的加样布局

注：+代表阳性样品，-代表阴性样品，空白为空白对照，即不添加二抗。

2.4一抗及二抗稀释比例优化

分别以最佳蛋白浓度包被96孔板，进行一抗及二抗稀释比例优化。兔抗鸡IgY(HRP) 二抗用抗体稀释液分别稀释至1:145000、1:72500、1:36250。余步骤同前，加样布局如表 2-2所示。

表2-2一抗及二抗稀释比例优化布局

注：+代表阳性样品，-代表阴性样品。

2.5封闭液及封闭时间优化

在确定Pmp17G、Pmp20G蛋白包被浓度及其一抗和二抗稀释比例基础上，进行封闭液及封闭时间优化。用PBST分别配制3％BSA、2％BSA、1％BSA、10％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉及0.5％明胶的封闭液，在37℃下，分别反应30min、1h、2h，每个样品下进行 2孔重复，余步骤同前，布局如表2-3所示。

表2-3封闭液优化布局

注：+代表阳性样品，-代表阴性样品。

2.6一抗、二抗孵育时间优化

确定上述条件后，先后进行Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA方法的一抗、二抗孵育时间优化。于37℃分别反应30min、1h、1h30min及2h，测定不同孵育时间下的OD450nm，选取最大P/N时的孵育时间。

2.7显色时间

优化上述条件后，对两种ELISA方法TMB显色液的作用时间进行优化。按索莱宝TMB显色液说明书，于37℃避光分别反应10min、15min、20min、25min及30min。中止显色后测定OD450nm，计算P/N值，选取最大P/N时的显色时间。

2.8临界值

ELISA条件优化结束后，根据已确定好的优化条件，基本建立起Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA检测方法。为确定此方法的临界值，用两种ELISA方法检测47份标准阴性血清。每个样品设两孔重复，测定OD450nm。根据计算公式确定样品阴阳性判定界值 (临界值＝标准阴性血清OD450nm平均值+3×标准差(SD))。当样品OD450nm大于或等于临界值时，判定为阳性；当样品小于临界值时，判定为阴性。

2.9敏感性、特异性和符合率

用Pmp17G-ELISA、Pmp20G-ELISA和MOMP-ELISA方法检测95份标准阴性血清和63份标准6BC菌株阳性血清。对样品根据临界值进行阴阳性判定，通过公式计算敏感性、特异性和符合性。即敏感性＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％，特异性＝真阴性/(真阴性+假阴性)×100％，符合率＝(待检方法和MOMP检测双阳性样本量+待检方法和 MOMP检测双阴性样本量)/总样本量×100％。

此外，为再次确认本研究建立的Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA检测方法的特异性，用该方法检测实验室保存的E.coli、H9N2、NDV、ORT、IBV、HPG、MPV及MG 鸡阳性血清，测定OD450nm，根据临界值判定结果。

2.10重复性

根据已优化好的Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA先后3次检测8份鹦鹉热衣原体血清(4份标准阳性、4份标准阴性)，每个样品设3孔重复，根据公式计算批间和批内变异系数。

3结果

3.1间接ELISA条件优化

3.1.1抗原浓度的确定

根据棋盘滴定法，将Pmp17G和Pmp20G蛋白按2倍连续梯度从64μg/mL稀释至 1μg/mL，血清按2倍连续梯度从1:25稀释至1:400，HRP酶标兔抗鸡二抗以1:72500进行稀释。优化后，结果显示Pmp17G蛋白(表2-4)和Pmp20G蛋白(表2-5)最佳包被浓度均为4μg/mL，在此抗原浓度下，Pmp17G-ELISA最大P/N＝15.56，阴性样品 OD450nm＝0.081，Pmp20G-ELISA最大P/N＝18.84，阴性样品OD450nm＝0.063。

表2-4 Pmp17G蛋白最佳包被浓度(P/N值)

表2-5 Pmp20G蛋白最佳包被浓度(P/N值)

3.1.2一抗及二抗稀释比例的确定

以4μg/mL蛋白浓度包被96孔板，将血清按2倍连续梯度从1:25稀释至1:400，HRP酶标兔抗鸡二抗以1:145000、1:72500、1:36250进行稀释。结果见Pmp17G-ELISA(表 2-6)血清最佳稀释比为1:200，二抗最佳稀释比为1:72500，此时P/N＝7.17，阴性血清 OD450nm＝0.12。Pmp20G-ELISA(表2-7)血清最佳稀释比为1:200，二抗最佳稀释比例为1:72500，此时P/N＝16.25，阴性血清OD450nm＝0.13。

表2-6 Pmp17G-ELISA最佳一抗及二抗稀释比例(OD_450nm平均值和P/N值)

表2-7 Pmp20G-ELISA最佳一抗及二抗稀释比例(OD_450nm平均值和P/N值)

3.1.3封闭液的选择及封闭时间的确定

经上述优化后，在最佳抗原包被浓度、一抗和二抗稀释比例的基础上，筛选6种封闭液及三个不同封闭时间。表2-8显示Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA最佳封闭液均为0.5％明胶，于37℃下封闭30min，此时P/N为最大值，分别为15.90和25.70。

表2-8 Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA封闭液选择及封闭时间(P/N值)

3.1.4抗体反应时间

先后确定PmpG-ELISA一抗反应时间和二抗反应时间。表2-9显示：Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA最佳一抗反应时间均为1h30min，P/N达最大值，分别为14.09和17.68。最佳二抗反应时间为1h，此时Pmp17G-ELISA方法的P/N＝15.93，Pmp20G-ELISA方法的P/N＝26.04。

表2-9 Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA抗体反应时间的确定

3.1.5显色时间

基于上述优化条件，将96孔板置于37℃避光显色10min-30min，读取OD450nm，计算P/N值。表2-10所示：Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA方法的最佳显色时间分别为 15min和10min。

表2-10 Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA显色时间

3.2Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA临界值

基于优化后的Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA方法检测47份标准阴性血清，读取OD450nm，具体数值由表2-11所示。根据均值和标准差分别计算出Pmp17G-ELISA方法临界值为0.136(0.080+3×0.0186＝0.136)，当检测样本OD450nm≥0.136时，判定为阳性，OD450nm<0.136时为阴性。Pmp20G-ELISA方法临界值为0.118(0.087+3× 0.010＝0.118)，即样本OD450nm≥0.118时，判定为阳性，OD450nm<0.118时为阴性。

表2-11 47份阴性样品平均OD_450nm

3.3Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA方法的敏感性、特异性和符合率

95份SPF鸡阴性血清和63份鹦鹉热衣原体阳性血清用于Pmp17G-ELISA、 Pmp20G-ELISA和MOMP-ELISA的比较实验。结果如表2-12示：Pmp17G-ELISA检测 95份阴性样品，其中3份为阳性，63份阳性样品中1份为阴性。Pmp20G-ELISA检测95 份全为阴性，63份全为阳性。而MOMP-ELISA检测95份阴性样品中，1份为阳性，63 份阳性样品中4份为阴性。根据公式计算出Pmp17G-ELISA方法敏感性和特异性分别为 97.89％和98.4％。MOMP-ELISA方法的敏感性和特异性分别为98.94％和93.65％。而 Pmp20G-ELISA敏感性和特异性均为100％。表2-13所示：Pmp17G-ELISA和 MOMP-ELISA的符合率为97.47％，Pmp20G-ELISA和MOMP-ELISA的符合率98.1％。

此外，用E.coli、H9N2、NDV、ORT、IBV、HPG、MPV及MG鸡阳性血清进一步验证Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA方法的特异性。结果如表2-14示，OD450nm均低于上述两个ELISA方法的临界值，结果判定为阴性。Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA 方法与本实验中所用病原体血清无交叉反应。

表2-12 Pmp17G、Pmp20G-ELISA和MOMP ELISA的敏感性和特异性

表2-13 PmpG-ELISA方法与MOMP-ELISA符合率实验

表2-14 Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA与相关病原体交叉反应实验

注：*表示每个样品平均OD450nm

3.4Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA重复性检验

用8份样本分别测定Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA变异系数。结果如表2-15示：Pmp17G-ELISA批间和批内变异系数分别为2.2％～9.8％(均值为4.58％)和1.1％～11.1％(均值为4.61％)。Pmp20G-ELISA方法的批间和批内变异系数分别为1.5％～6.0％(均值为3.33％)和1.2％～8.2％(均值为 4.15％)。结果表明两个方法重复性较好。

表2-15 Pmp17G-ELISA和Pmp20G-ELISA方法的批间和批内变异系数

本实验成功基于Pmp17G和Pmp20G蛋白建立ELISA诊断方法，且Pmp20G-ELISA 敏感性和特异性优于Pmp17G-ELISA，在鹦鹉热衣原体诊断中更具潜力，可应用于特异性临床检验。

实施例3禽鹦鹉热衣原体Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白疫苗对SPF 鸡的免疫保护试验

1试验动物

SPF鸡，50只，21日龄，雄性，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，实验过程符合北京市实验动物管理中心有关动物福利的有关规定。

2主要实验试剂和耗材

鸡IL-10、IL-2和IFN-γ细胞因子ELISA试剂盒及ELISA Accessory Pack购于美国Abcam公司。伴刀豆素蛋白ConA(C8110)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(50T)、4％组织细胞固定液和鸡外周血淋巴细胞分离试剂盒购于北京索莱宝公司；BrdU cell proliferationELISA Kit(colorimetric)购于美国Abcam公司。鼠抗鸡CD3/SPRD标记 (8200-13)、CD8a/PE标记(8220-09)和CD4/FITC标记(8210-02)购于Southern Biotech 公司。2×Easy Taq PCRSuperMix(+dye)、EasyTaq PCR SuperMix和PerfectStart Green qPCR SuperMix购于北京全式金公司。QIAamp DNA Mini kit(50次)购于QIAGEN公司。 RPMI1640细胞培养基购于美国Gibco公司。佐剂：壳聚糖凝胶由中国台湾国盛生化股份有限公司提供。

3实验方法

3.1动物分组与免疫

将50只21日龄的SPF鸡随机分为5组。其中PmpG组分为滴鼻免疫和肌注免疫， Momp组作为阳性对照，并设有攻毒对照组与健康对照组。免疫两次，每次免疫间隔14d，免疫剂量为0.2ml/只。免疫期间每7d采血分离血清，用于特异性抗体的监测。并于二免后7天，无菌取外周抗凝血，进行淋巴细胞增殖试验，检测IL-10、IL-12、IL-γ等细胞因子。在第二次免疫14天后攻毒，具体用纯化的活衣原体EB，以1×10⁸IFU通过喉头途径进行感染。于攻毒后7天观察剖检病变，并检测肺部衣原体载量，分组方案见下表3-1。

其中，PmpG组分具体是指Pmp17G，Pmp19G，Pmp20G,Pmp21G各50μg溶于壳聚糖凝胶(Chitosan)中至0.2mL；Momp组是指200μg Momp蛋白溶于壳聚糖凝胶中至0.2mL； Pmp17G组是指200μg Pmp17G蛋白溶于壳聚糖凝胶中至0.2mL；Pmp19G组是指200μg Pmp19G蛋白溶于壳聚糖凝胶中至0.2mL；Pmp20G组是指200μg Pmp20G蛋白溶于壳聚糖凝胶中至0.2mL；Pmp21G组是指200μg Pmp21G蛋白溶于壳聚糖凝胶中至0.2mL；攻毒对照组和健康对照组以0.2mL壳聚糖凝胶佐剂作为对照。备注：壳聚糖凝胶(Chitosan) 为疫苗佐剂成分。

表3-1实验动物的分组与免疫

3.2特异性抗体的测定

用C.psittaci EB包被ELISA板，通过采集免疫后不同时间点的血液样本，分离血清，用于检测特异性抗体水平。以阴性对照平均OD450nm+2×标准差(SD)作为临界值进行阴阳性判定，抗体效价表示为样品为阳性结果时的最高稀释倍数。具体步骤如下：

(1)用ELISA包被液将C.psittaci EB按2×10⁶IFU/孔包被，每孔100μL，4℃过夜包被。

(2)洗板：次日，弃除溶液，每孔加入200μL PBST，振荡5min，弃PBST，重复 4次。

(3)封闭：每孔加200μL含10％脱脂奶粉封闭液，于37℃孵育1h。

(4)洗板，步骤同(2)。

(5)孵育一抗：用抗体稀释液按10倍连续梯度稀释血清，起始稀释度为1:10，最终稀释度为1:1280，100μL/孔，每个样品设两孔重复，于37℃孵育1h。将阴性血清按1:10 进行稀释，设为阴性对照。

(6)洗板，步骤同(2)。

(7)孵育二抗：用抗体稀释液按1:72500稀释兔抗鸡IgY(HRP)，每孔加入100μL， 37℃孵育1h。

(8)洗板，步骤同(2)。

(9)显色：每孔加100μL TMB，室温避光孵育15min。

(10)中止：每孔加100μL 2M硫酸中止显色，用酶标仪测定OD450nm。

3.3外周血淋巴细胞增殖试验

(1)每个组随机选取5个样品进行增殖能力测定，将分离的淋巴细胞加入96孔板，设2个重复，1×105cell/孔，体积为100μL，于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养24h。

(2)在两个重复孔中分别加入100μL淋巴细胞培养基稀释的含5×105IFU紫外灭活EB和100μL细胞培养基，于37℃刺激24h。

(3)每孔加入20μL 1×BrdU试剂，孵育24h。

(4)结束后，按商用BrdU细胞增殖试剂盒进行后续检测，具体按说明书操作。

(5)淋巴细胞增殖能力用刺激指数(SI)进行计算表示，公式如下：

3.4外周血细胞因子测定

取二免后14天血清，用Abcam商品化试剂盒测定其IL-10、IL-12和IFN-γ含量。按说明书建立标准曲线，进行样品细胞因子浓度计算。

3.5qPCR检测衣原体载量

以特异性omcA基因为靶基因，将阳性质粒做10倍连续稀释(10^-1-10^-6)，将此作为模板，构建标准曲线。qPCR体系见表3-2。qPCR程序：94℃预变性1min，94℃变性10s， 60℃退火20s，变性和退火两步循环40次。溶解曲线程序：95℃变性1min，60℃退火1min， 95℃变性15s。

表3-2 qPCR反应体系

4实验结果

4.1剖检病变

攻毒后7天剖检，观察肺脏和气囊病变。肺脏与气囊评分详见表4-1。结果说明Momp组气囊均澄清透明，肺部没有病变。PmpG滴鼻组与肌注组各有一只气囊轻微浑浊，其余均清澈透明，肺部无病变，具有较好的保护效果。对照组气囊均出现明显的浑浊增厚和黄色干酪样渗出物，肺脏伴随有出血肿大及纤维素性病变。而PmpG单一抗原组，表现出部分气囊浑浊和肺脏病变，免疫保护效果较差。

表4-1肺脏与气囊病变评分

注：同一列中^a-b，^b-cP<0.05，^a-c,a-d,b-dP<0.01

4.2特异性抗体水平

分别检测第一次免疫14天，二免后7天和14天血清中的特异性抗体滴度。结果详见表4-2，结果说明随免疫次数和天数的增加，抗体水平逐渐升高。3个时间点测定，Momp 组、PmpG蛋白滴鼻组和PmpG注射组三个组抗体水平差异不显著，但是均显著高于PmpG 单个蛋白组(Pmp17G,Pmp19G,Pmp20G,Pmp21G)的抗体水平。

表4-2特异性抗体水平检测

注：同一列中^a-b,^b-cP<0.05,^a-c,a-d,b-dP<0.01

4.3淋巴细胞增殖

通过分离外周血淋巴细胞，采用BrdU方法，检测淋巴细胞的增殖。结果见表4-3，结果说明Momp组、PmpG蛋白滴鼻组和PmpG注射组三个组均可诱导淋巴细胞的增殖，显著高于PmpG单个蛋白组(Pmp17G,Pmp19G,Pmp20G和Pmp21G)。其中PmpG蛋白滴鼻组显著高于Momp组和PmpG注射组。

表4-3淋巴细胞增殖指数

注：同一列中^a-bP<0.05

4.4细胞因子

分别检测Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-10，结果见表4-4，发现PmpG蛋白滴鼻组和PmpG注射组显著高于Momp组、PmpG单个蛋白组(Pmp17G,Pmp19G, Pmp20G和Pmp21G)刺激IFN-γ的分泌，有利于病原的清除。相关IL-10分泌水平上，PmpG蛋白滴鼻组显著低于其它实验组，说明PmpG蛋白滴鼻组有利于清除衣原体的感染。

表4-4细胞因子检测

注：同一列中^a-bP<0.05

4.5衣原体在靶器官肺脏的清除效率

感染7天后以qPCR方法检测肺部衣原体载量。结果见表4-5，可见PmpG蛋白组滴鼻组病原载量显著低于Momp组和PmpG注射组，极其显著低于PmpG单个蛋白组 (Pmp17G,Pmp19G,Pmp20G和Pmp21G，这提示PmpG蛋白滴鼻组的免疫后清除衣原体效果优于注射组。

表4-5肺部衣原体载量检测

注：同一列中^a-b,b-cP<0.05,^a-cP<0.01

实验结果表明，以本发明制备的Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白具有较好的免疫原性。相较于PmpG单一抗原组份，PmpG蛋白滴鼻组(Pmp17G、Pmp19G、 Pmp20G、Pmp21G蛋白组合+壳聚糖凝胶)制备的疫苗，具有抗原剂量少，协同效应好，可诱导高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答，清除衣原体的感染。并且，本发明疫苗可用于气雾免疫和注射免疫，均能达到较好的免疫效果。因此，组合蛋白与壳聚糖凝胶制备的疫苗可用于气雾免疫，适用于大规模和集约化饲养，替代传统的注射免疫，减少动物应激反应，提高动物福利和动物保护。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白的制备方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> Pmp17G(Pmp17G)

<400> 1

Glu Phe Ile Phe Gln Gly Asn Lys Val Thr Ala Ala Asp Pro Ile Thr

1 5 10 15

Leu Pro Thr Lys Lys Glu Thr Ala Ile Ala Ala Ala Ser Ile Glu Glu

20 25 30

Lys Lys His Thr Glu Glu Lys Thr Asp Ser Ser Gln Ala Ser Gly Ser

35 40 45

Ala Ser Ala Asp Ile Thr Ser Ala Phe Phe Thr Leu Ala Asn Lys Ala

50 55 60

Lys Val Gln Asp Glu Ala Gln Ala Glu Glu Asn Asn Lys Pro Thr Cys

65 70 75 80

Asn Ser Ile His Leu Gly Ser Gly Ala Lys Ile Ser Gln Leu Arg Ala

85 90 95

Gln Thr Gly Gln Thr Ile Phe Phe Tyr Asp Pro Ile Thr Thr Thr Ala

100 105 110

Pro Ala Ala Pro Ala Asn Leu Lys Gln Pro Lys Val Ser Val Ala Lys

115 120 125

Ala Thr Ser Arg Ile Pro Ala Ser Ala Pro Ala Val Ser Ala Pro Ala

130 135 140

Pro Ala Val Val Lys Thr Pro Leu Lys Ile Asn Ala Pro Asp Thr Pro

145 150 155 160

Asp Pro Ala Gln Lys Val Ala Ala Glu Thr Ala Gln Gln Ser Ala Val

165 170 175

Tyr Asn Gly Lys Ile Val Phe Ser Gly Glu Lys Leu Ser Ser Glu Asp

180 185 190

Ala Gln Asn Pro Leu Asn Ala Ile Ser Val Ile His Asn Asp Val Ser

195 200 205

Leu Glu Ala Gly Thr Leu Val Leu Ser Asn Gly Ala Gly Leu Leu Val

210 215 220

Asp Ser Phe Thr Gln Lys Glu Gly Ser Leu Ile Val Met Asp Gly Gly

225 230 235 240

Thr Ser Ile Ile Thr Asn Val Thr Pro Ala Ser Glu Gly Leu Gln Ser

245 250 255

Arg Ser Thr Pro Asp Pro Lys Thr Pro Ile Pro Gly Ile Arg Ala Val

260 265 270

Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Leu Ile Asn Phe Lys Glu Arg Ser Phe

275 280 285

Ser Ala Thr Gly Asp Val Val Pro Thr Val Glu Glu Ser Pro Asp Gly

290 295 300

Ser Ile Thr Ile Asn Asn Leu Ala Val Asn Leu Asp Ser Leu Glu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Val Ile Thr Leu Ala Ala Lys Gly Gly Thr Gly Ser Val Thr

325 330 335

Leu Thr Gly Asn Leu Gln Phe Gln Asp Ser Asn Gln Asn Phe Tyr Asp

340 345 350

Asn Pro Leu Leu Asn Lys Asn Phe Thr Leu Asn Phe Leu Asp Ile Ser

355 360 365

Ala Pro Thr Thr Asp Lys Ile His Thr Glu Gly Phe Asn Met Ile Pro

370 375 380

Gln Gly Ala Thr Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Gln Gly Lys Trp Glu Val

385 390 395 400

Thr Glu Ile Lys Asp Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Glu Ile Lys Trp

405 410 415

Val Ser Ala

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> Pmp19G(Pmp19G)

<400> 2

Ala Leu Thr Pro Ser Asp Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Thr Ser Glu Glu

1 5 10 15

Phe Ser Val Lys Glu Thr Ser Ser Ala Thr Thr Tyr Thr Cys Glu Gly

20 25 30

Asn Val Cys Ile Ser Tyr Ala Gly Lys Asp Ser Gly Leu Asn Lys Ser

35 40 45

Cys Phe Thr Ala Thr Glu Asn Leu Ala Phe Leu Gly Asn Gly Tyr Thr

50 55 60

Leu Cys Phe Asp Asn Ile Thr Thr Thr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Ile

65 70 75 80

Ser Val Ser Gly Asp Asp Lys Thr Leu Gly Val Ser Gly Phe Ser Leu

85 90 95

Phe Ser Cys Ala Tyr Cys Pro Pro Gly Thr Thr Gly Tyr Gly Ala Ile

100 105 110

Lys Ala Ala Gly Asn Thr Thr Ile Lys Asp Asn Ser Ser Leu Val Phe

115 120 125

His Lys Asn Cys Ser Thr Ala Glu Gly Gly Ala Ile Gln Cys Lys Ser

130 135 140

Gly Ser Ser Thr Ala Glu Leu Lys Leu Glu Asn Asn Asn Asn Leu Val

145 150 155 160

Phe Ser Glu Asn Ser Ser Thr Ser Ser Gly Gly Ala Ile Tyr Ala Asp

165 170 175

Lys Leu Thr Ile Val Ser Gly Gly Pro Thr Leu Phe Ser Asn Asn Ser

180 185 190

Val Ser His Ser Ser Pro Lys Gly Gly Ala Ile Cys Ile Lys Asp Ser

195 200 205

Ser Gly Glu Cys Ser Leu Thr Ala Asp Leu Gly Asp Ile Thr Phe Asp

210 215 220

Gly Asn Lys Val Ile Lys Thr Asp Gly Ser Ser Val Lys Arg Asn Ser

225 230 235 240

Ile Asp Leu Gly Thr Gly Lys Phe Thr Lys Leu Arg Ala Lys Asp Gly

245 250 255

Phe Gly Ile Phe Phe Tyr Asp Pro Ile Thr Gly Gly Gly Ser Ser Ala

260 265 270

Leu Asn Ile Asn Glu Lys Asp Thr Val Asp Tyr Thr Gly Lys Ile Val

275 280 285

Phe Ser Gly Glu Lys Leu Ser Asp Glu Glu Lys Lys Gln Thr Asp Asn

290 295 300

Leu Ala Ser Thr Phe Asn Gln Pro Ile Thr Leu Ser Ala Gly Ser Leu

305 310 315 320

Val Leu Lys Asp Gly Val Ser Val Thr Ala Lys Gln Ile Thr Gln Thr

325 330 335

Glu Gly Ser Thr Val Val Met Asp Leu Gly Thr Thr Leu Gln Thr Pro

340 345 350

Ser Ser Gly Gly Glu Thr Ile Thr Leu Thr Asn Leu Asp Ile Asn Ile

355 360 365

Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala Pro Ala Lys Leu Glu Thr

370 375 380

Lys Asn Ser Ser Lys Ala Ile Thr Ile Lys Ala Val Asn Leu Val Asp

385 390 395 400

Ala Asp Gly Asn Ala Tyr Glu Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ser Gln Pro

405 410 415

Phe Thr Ala Ile Thr Ala Thr Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Pro Pro

420 425 430

Thr Glu Asn Leu Thr Asn Tyr Val Pro Pro Thr His Tyr Gly Tyr Gln

435 440 445

Gly Asn Trp Thr Val Thr Trp Asn Asn Glu Thr Ala Thr Lys Thr Ala

450 455 460

Thr Leu Thr Trp Glu Gln Thr Gly Tyr Ser Pro Asn Pro Glu Arg Lys

465 470 475 480

Gly Ser Leu Val Pro Asn Thr Leu Trp

485

<210> 3

<211> 493

<212> PRT

<213> Pmp20G(Pmp20G)

<400> 3

Ala Asp Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Ala Gly Asn Gln Ala Phe Gln Pro

1 5 10 15

Lys Val Thr Ser Ala Ser Gln Gly Thr Thr Tyr Thr Cys Met Gly Asn

20 25 30

Val Cys Ile Ser Tyr Ala Gly Leu Gly Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser

35 40 45

Cys Phe Ser Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Phe Leu Gly Asn Gly Tyr

50 55 60

Thr Leu Cys Phe Asp Asn Ile Thr Thr Gln Ala Ser Asn Pro Gly Ala

65 70 75 80

Ile Asn Val Ser Gly Ser Asn Lys Thr Leu Asp Ile Ser Gly Phe Ser

85 90 95

Leu Phe Ser Cys Ala Tyr Cys Pro Pro Gly Thr Thr Gly Tyr Gly Ala

100 105 110

Ile Lys Ala Gly Gly Asn Thr Thr Ile Lys Asp Asn Ser Ser Leu Val

115 120 125

Phe His Lys Asn Cys Ser Thr Thr Asp Gly Gly Ala Ile Gln Cys Lys

130 135 140

Gly Thr Ser Glu Ala Glu Leu Lys Ile Glu Asn Asn Gln Asn Leu Val

145 150 155 160

Phe Ser Glu Asn Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ala Ile Tyr Ala Asp

165 170 175

Lys Leu Thr Ile Val Ser Gly Gly Pro Thr Leu Phe Ser Asn Asn Ser

180 185 190

Val Ser His Asn Ser Ala Pro Lys Gly Gly Ala Ile Cys Ile Lys Asp

195 200 205

Ser Gly Gly Glu Cys Ser Leu Thr Ala Asn Leu Gly Asp Ile Ile Phe

210 215 220

Asp Gly Asn Lys Thr Ile Lys Thr Gly Asp Ser Thr Val Thr Arg Asn

225 230 235 240

Ser Ile Asp Leu Gly Ser Gly Gly Met Phe Thr Lys Leu Asn Ala Lys

245 250 255

Glu Gly Phe Gly Ile Phe Phe Tyr Asp Pro Ile Ser Asn Thr Gly Gly

260 265 270

Ser Thr Glu Ile Glu Leu Asn Lys Ala Glu Glu Gly Ser Thr Thr Tyr

275 280 285

Thr Gly Lys Ile Val Phe Ser Gly Glu Lys Leu Ser Asp Glu Glu Lys

290 295 300

Lys Val Ala Gly Asn Leu Gln Ser Tyr Phe Lys Gln Pro Leu Lys Ile

305 310 315 320

Gly Ser Gly Ser Leu Val Leu Lys Asp Gly Val Thr Leu Glu Ala Lys

325 330 335

Lys Val Thr Gln Thr Ala Gly Ser Val Val Met Asp Leu Gly Thr Thr

340 345 350

Leu Gln Thr Pro Ser Ser Gly Gly Glu Thr Ile Thr Leu Thr Asn Leu

355 360 365

Asp Ile Asn Val Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Val Ala Pro Thr Pro

370 375 380

Ala Lys Val Glu Ala Thr Thr Glu Ser Lys Thr Val Thr Ile Asn Ala

385 390 395 400

Val Asn Leu Val Asp Asp Asn Gly Asn Ala Tyr Glu Tyr Pro Ile Leu

405 410 415

Ala Ala Ser Gln Pro Phe Lys Ala Ile Glu Val Lys Ser Gly Ser Gly

420 425 430

Gly Ser Ile Thr Pro Pro Thr Thr Asn Leu Gln Asn Tyr Thr Pro Pro

435 440 445

Thr His Tyr Gly Tyr Gln Gly Asn Trp Thr Val Thr Trp Ala Gln Gly

450 455 460

Ser Gly Ala Gln Glu Lys Ile Ala Thr Leu Asn Trp Glu Gln Thr Gly

465 470 475 480

Tyr Ser Pro Asn Pro Glu Arg Gln Gly Ser Leu Val Pro

485 490

<210> 4

<211> 497

<212> PRT

<213> Pmp21G(Pmp21G)

<400> 4

Gly Ser Glu Gln Lys Thr Leu Thr Ser Ala Asp Ser Tyr Asn Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Gly Asp Lys Glu Phe Glu Pro Lys Glu Thr Ser Lys Ser Glu

20 25 30

Gly Thr Thr Tyr Thr Cys Thr Gly Asn Ile Cys Ile Ser Tyr Ala Gly

35 40 45

Leu Gly Gly Asp Gly Leu Thr Asn Ser Cys Phe Thr Asp Thr Ala Gly

50 55 60

Asn Leu Ala Phe Val Gly Asn Gly Tyr Thr Leu Cys Phe Asp Asn Ile

65 70 75 80

Thr Thr Lys Ala Ser Asn Pro Gly Ala Ile Asn Val Ser Ser Asn Glu

85 90 95

Lys Thr Leu Asp Val Ser Gly Phe Ser Leu Phe Ser Cys Ala Tyr Cys

100 105 110

Pro Pro Gly Thr Thr Gly Tyr Gly Ala Ile Lys Thr Leu Gly Asn Thr

115 120 125

Thr Ile Lys Asp Asn Ser Ser Leu Val Phe His Lys Asn Cys Ser Gln

130 135 140

Thr Glu Gly Gly Val Ile Tyr Cys Lys Ala Ser Ser Gly Thr Thr Glu

145 150 155 160

Leu Lys Ile Glu Asn Asn Gln Asn Leu Val Phe Ser Glu Asn Ser Ser

165 170 175

Asn Thr Lys Gly Gly Ala Ile Phe Thr Gln Lys Leu Thr Ile Thr Ser

180 185 190

Gly Gly Pro Thr Leu Phe Ser Asn Asn Ser Val Ser His Asp Ser Thr

195 200 205

Pro Lys Gly Gly Ala Ile Cys Leu Asp Asp Thr Ser Ser Glu Cys Asn

210 215 220

Leu Thr Ala Asp Leu Gly Asp Ile Thr Phe Asp Gly Asn Lys Ile Ile

225 230 235 240

Lys Thr Ser Asp Ser Ser Val Thr Arg Asn Ser Ile Asp Leu Gly Ser

245 250 255

Ala Gly Lys Phe Thr Asn Leu Arg Ala Lys Asp Gly Phe Gly Ile Phe

260 265 270

Phe Tyr Asp Pro Ile Ala Asn Gln Gly Asp Thr Ser Asp Pro Ile Glu

275 280 285

Leu Asn Lys Ala Glu Ser Arg Thr Asn Tyr Thr Gly Lys Ile Val Phe

290 295 300

Ser Gly Glu Arg Leu Ser Asp Glu Glu Lys Lys Val Pro Ala Asn Leu

305 310 315 320

Gln Ser Tyr Phe Lys Gln Pro Leu Lys Ile Gly Ser Gly Ser Leu Val

325 330 335

Leu Lys Asp Gly Val Thr Leu Glu Ala Lys Gln Val Thr Gln Thr Ala

340 345 350

Gly Ser Thr Val Val Met Asp Leu Gly Thr Thr Leu Gln Thr Pro Ser

355 360 365

Ser Gly Gly Glu Ala Ile Asp Leu Thr Asn Leu Asp Ile Asn Ile Ala

370 375 380

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Thr Asp Pro Ala Lys Val Ala Ser Gln

385 390 395 400

Thr Ser Asn Lys Thr Val Thr Ile Ser Ala Val Asn Leu Val Asp Thr

405 410 415

Asp Gly Asn Ala Tyr Glu Tyr Pro Ile Leu Ala Thr Ser Gln Pro Phe

420 425 430

Thr Ala Ile Val Ala Thr Thr Asn Thr Ser Thr Val Thr Ala Pro Thr

435 440 445

Thr Asn Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Pro Thr His Tyr Gly Tyr Gln Gly

450 455 460

Asn Trp Thr Val Thr Trp Asn Asn Glu Thr Thr Lys Gln Thr Ala Thr

465 470 475 480

Leu Thr Trp Glu Gln Thr Gly Tyr Ser Pro Asn Pro Glu Arg Gln Gly

485 490 495

Pro

<210> 5

<211> 1267

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcatct tccaaggcaa taaagtcaca gcagctgatc caattacgct tcctacaaag 60

aaagaaacag ccatagctgc tgcatctatt gaagaaaaga aacacactga agagaaaaca 120

gattcttctc aagcaagtgg tagtgcatct gcagacatta cctcagcatt tttcactttg 180

gctaacaaag ctaaagtaca agatgaagca caagctgaag agaataataa acctacgtgt 240

aactctattc atttaggtag tggcgctaaa atttcacagc tacgtgcgca aacaggacaa 300

accatctttt tctatgatcc tataacgact actgcaccgg ctgctccagc taacttgaaa 360

caaccaaagg tttccgttgc taaagcgacc tctaggatcc cagcctcggc gcctgcagta 420

tctgcgcccg cccctgccgt agtaaaaact cctctaaaaa tcaacgctcc agacacaccg 480

gatccagcac aaaaagttgc ggctgaaaca gctcaacaat ctgcggtgta taacggaaaa 540

attgtatttt caggagagaa gctctcaagt gaagatgctc aaaatccttt aaatgcaata 600

agtgttattc ataacgatgt atctcttgaa gcaggaactc ttgttttaag caatggtgca 660

ggtcttcttg ttgattcttt cactcagaaa gaaggctctt taatcgttat ggatggcgga 720

acatccatta tcaccaacgt gactcctgct agcgaaggtt tacaaagtag atctacacca 780

gatcctaaaa ctccaattcc tggaatcagg gcggtatcac aacgcatagc gtcttcttta 840

atcaacttca aagaaagaag cttctctgca acgggagacg tggttcctac agtagaagaa 900

agtcccgatg gctcgattac cattaataac cttgctgtga acttagattc tttagagaat 960

ggaaaagtca ttaccctagc agctaaaggc ggaacgggaa gtgttacctt aactgggaat 1020

ttgcaattcc aagatagtaa ccaaaatttc tatgacaacc ccttattaaa taagaatttt 1080

acattaaact tcttagatat ttctgcgcct actacagata aaatccatac cgagggcttc 1140

aatatgatcc ctcaaggggc tacaggctct gatcttggtt atcaaggaaa atgggaagtt 1200

actgaaatta aagactcgag tggaaaagtc tcattcgaaa tcaaatgggt atctgcatga 1260

ggtcgac 1267

<210> 6

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccttaactc cctccgatag ttataatgga aatacaacat ctgaggagtt cagtgtaaaa 60

gaaacttcat cagcaacaac gtatacttgt gaaggcaatg tgtgtatctc ctatgcaggg 120

aaagattcag gtctaaataa aagttgtttc acagctactg agaaccttgc cttcttagga 180

aacgggtata ctctttgttt tgataatatt actactacat ctaatagccc cggagctatt 240

agtgttagtg gtgacgataa aaccttaggc gtctcaggat tttccttatt ttcatgtgct 300

tactgccctc caggaaccac tggttacgga gccataaaag ctgcagggaa tactaccatc 360

aaagataact ctagtcttgt cttccacaaa aactgttcga cagcagaggg tggcgccatt 420

caatgtaaat caggaagctc taccgctgaa ttaaaactgg aaaataataa caaccttgtt 480

ttctcagaaa actcctccac ttcaagcggc ggggctattt atgctgataa actcaccatt 540

gtctcaggtg gacctacgtt attttctaac aactccgtat cccactcttc acctaaaggc 600

ggagctattt gcataaaaga ttcaagtggt gaatgtagct taaccgctga tctcggagat 660

attacctttg atgggaacaa agtaataaaa actgatggta gttcagtcaa aagaaattcg 720

atagatctcg gcacagggaa atttacaaag ctacgtgcta aagatggctt cgggattttc 780

ttctatgatc ctattactgg aggaggatct agtgcactaa acatcaatga aaaagatact 840

gttgattata caggaaagat tgtcttctct ggtgaaaaat tatccgatga agaaaaaaaa 900

caaacagaca acctagcttc tactttcaat cagcccatca cattatcagc aggatctctt 960

gtacttaaag atggtgtatc tgtaaccgca aaacaaatta cacagacaga aggctctact 1020

gttgttatgg atctaggaac cacattacag acgccttctt caggtggaga aaccatcacc 1080

ctaactaatt tagatattaa catcgcctcg ttgggggggg gggggggtac tgctcctgct 1140

aaactcgaaa caaaaaactc aagtaaagct attaccatca aggctgtcaa tctagtcgat 1200

gccgacggta atgcttatga agatcctatt cttgctacgt ctcaaccttt cacagcaata 1260

acagccacaa cctcctcaag tacagtcaca cctcccacag agaatctaac caattatgtc 1320

cctcctactc attacggtta ccaaggaaat tggacagtaa cttggaacaa cgaaacagct 1380

acaaaaacag ccactctaac ttgggaacaa actggttact ctcctaaccc agagcgtaaa 1440

ggttcgttag tcccgaacac tctttgg 1467

<210> 7

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggatagct ataatgggaa cacggcgggg aatcaagcat ttcaaccgaa agtaacctct 60

gcatctcaag gaacaacata cacgtgtatg ggaaatgtgt gcatttctta tgcaggatta 120

ggtgaagaag gtttgtctag tagttgcttt tctgataact ctggcagtct ttccttctta 180

ggaaacggct atactctttg ttttgataat attactacac aagcaagtaa cccgggagcc 240

attaatgtta gtggtagcaa taaaacctta gacatctcag gattttcatt attttcatgt 300

gcctattgcc ctccaggcac aaccggttac ggagccatca aagctggagg gaatactact 360

attaaagata actctagtct tgtcttccat aaaaactgct cgacaacaga cggtggagct 420

attcagtgta aaggaaccag tgaagctgaa ttaaaaatag aaaataatca gaatctggtt 480

ttctctgaaa attcctcctc ttcaagcggc ggcgctattt atgctgataa actcactatt 540

gtctcaggtg gacctacgtt attttctaac aactctgtat cccataattc ggcacctaaa 600

ggcggagcta tttgcataaa agattcaggc ggtgaatgta gcctaaccgc taatcttggg 660

gatattattt tcgacggaaa caaaacaata aaaactggtg atagtacagt aacaagaaat 720

tctatagatc tcggctccgg tgggatgttt acaaaactaa atgctaaaga aggtttcggg 780

attttcttct acgaccccat ctctaacaca ggaggatcta cagaaataga attaaataaa 840

gctgaagagg gctctactac ttacacaggt aagattgtct tctcaggtga aaaattatcc 900

gatgaagaaa aaaaggttgc gggcaatctg caatcatatt tcaaacagcc tttaaaaatt 960

ggctccggtt ctttagtcct taaagatggt gtcactttag aagcaaaaaa agtcacacag 1020

acagccggct ctgttgtcat ggatttagga actacgttac agacgccttc ctcaggtgga 1080

gaaaccatca ccctaactaa tttggatatt aacgtcgcct cattgggggg ggggggggtc 1140

gctcctactc ctgctaaagt cgaagcaaca actgaaagta aaacagtcac aatcaatgct 1200

gtcaatctag tcgatgacaa cggtaatgcc tacgagtatc ctatacttgc tgcatctcag 1260

cctttcaaag caatagaagt aaaatctggt tctggcggct ctattactcc acccacaacc 1320

aatctacaaa actatacccc tccgactcat tacggttatc aaggaaattg gacggtaact 1380

tgggcacaag gatcaggcgc tcaagagaaa atagccactc taaattggga acaaactggc 1440

tactctccta acccagaacg tcaaggatct ttagttccg 1479

<210> 8

<211> 1501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatccgagc aaaaaacctt aacctctgct gatagctata atgggaagac ggctggggat 60

aaagaatttg aacctaaaga aacctccaaa tctgaaggga caacatacac gtgtacaggg 120

aatatatgta tttcctatgc ggggttaggc ggagatggct taaccaatag ttgctttact 180

gatactgctg gtaaccttgc cttcgtagga aatggttata ccttgtgttt tgataatatt 240

actactaaag ccagtaaccc aggagccatt aatgttagta gtaacgagaa aaccttagac 300

gtctcaggat tttcattatt ttcatgtgct tattgtcctc cgggcacaac cggttacgga 360

gctattaaaa ctttagggaa taccactatc aaagataact ctagtcttgt cttccataaa 420

aactgttcgc aaacagaagg tggcgtcatt tactgtaaag caagcagtgg taccacagaa 480

ttaaaaatag aaaataatca gaacctcgtt ttctcagaga actcttctaa caccaaaggc 540

ggggctatat ttactcaaaa actcaccata acttccggtg ggcctacgtt attttctaat 600

aactctgtgt cccatgattc gacacctaaa ggcggagcta tttgtttaga tgataccagc 660

agtgagtgta acctaaccgc tgatctcggg gatattacct tcgatggaaa caaaatcatt 720

aaaactagtg atagttcagt aacaagaaat tccattgatc ttggttctgc tgggaaattt 780

accaatttaa gagctaaaga tggcttcggg attttcttct atgaccccat cgctaatcaa 840

ggtgatacta gcgacccaat agagctaaat aaagctgaaa gccgcactaa ttatacaggc 900

aagatagttt tctcaggaga aaggctatcc gatgaagaga aaaaggttcc ggccaatcta 960

caatcatatt tcaaacaacc cttgaaaatt ggttccggtt ctttagtcct taaggatggt 1020

gtcactttag aagcaaaaca agtcacgcaa acagcaggct ctactgttgt catggattta 1080

ggaactacgt tacaaacgcc ttcctcaggt ggagaagcca ttgacctaac taatttggat 1140

atcaacatcg cctcgttggg gggggggggg ggtactgatc ctgctaaagt cgcatcacaa 1200

acctcaaata aaacagttac aatcagtgct gtcaatctag tcgatactga cggtaatgct 1260

tacgaatatc ccattcttgc tacgtctcaa cctttcacag caatagtagc tacaactaac 1320

actagtacag ttactgcacc cacaaccaat ctagaaaact atacccctcc tactcattac 1380

ggttatcaag gaaattggac agtaacttgg aacaacgaaa caacgaaaca aacagccact 1440

ctaacttggg aacaaactgg ctactcccct aacccagaac gtcaaggacc ttgaactcga 1500

g 1501

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgggatccga attcatcttc caaggcaa 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgctcgagt gtcgacctca tgcagata 28

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggatccgc cttaactccc tccgatagtt 30

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgctcgagt ccaaagagtg ttcgggacta ac 32

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgggatccgc ggatagctat aatgggaaca cgg 33

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgctcgagt cggaactaaa gatccttgac gttc 34

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgggatccgg atccgagcaa aaaaccttaa 30

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccgctcgagt ctcgagttca aggtccttga c 31

Claims

1.具有免疫原性的禽鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白组合物，其特征在于，其包括Pmp 17G、Pmp19G、Pmp20G和Pmp21G，其具有反应原性的蛋白包括Pmp17G和Pmp19G，Pmp17G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.1所示，Pmp19G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.2所示，Pmp20G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.3所示，Pmp21G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.4所示。

2.制备权利要求1所述的具有免疫原性的禽鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白PmpG蛋白组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

PCR方法扩增如SEQ ID NO.5-8所示的鹦鹉热衣原体Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G基因；

将Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G基因分别导入酿酒酵母CEN.PK2株进行同源重组；再经过大肠杆菌分别表达，分别表达获得Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白。

3.用于预防和控制禽类衣原体感染的联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白，所述Pmp17G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.1所示，Pmp19G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.2所示，Pmp20G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.3所示，Pmp21G蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗制备方法为每羽份包含Pmp17G、Pmp19G、Pmp20G、Pmp21G蛋白各50µg，每只家禽免疫的抗原含量为200µg。

5.根据权利要求3的联合疫苗，其特征在于，以壳聚糖凝胶为免疫佐剂，每只家禽疫苗的添加剂量为0.2mL，混合均匀。

6.根据权利要求3的联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗通过呼吸道接种，替代注射免疫途径。