CN112457409B - 一种TLN-58和hLYZ基因融合蛋白及抗菌活性和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种hLYZ‑TLN‑58基因融合蛋白，构建步骤如下：⑴根据TLN‑58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10，优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ‑TLN‑58基因SEQ ID NO.9；⑵PCR扩增hLYZ‑TLN‑58基因；⑶重组原核表达载体pGEX‑4T‑1‑hLYZ‑TLN‑58表达纯化获得hLYZ‑TLN‑58基因融合蛋白。本发明构建的重组原核质粒所表达的蛋白对实验菌株表现出良好的抑菌活性，为临床预防和治疗细菌性疾病提供了新的治疗思路和实验依据。

Description

一种TLN-58和hLYZ基因融合蛋白及抗菌活性和应用
技术领域
本发明属于基因技术领域，涉及融合蛋白，尤其是一种TLN-58和hLYZ基因融合蛋白及抗菌活性和应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides)是一种生物体免疫系统自身分泌的一种可以有效抵御外来病原体侵害的肽类化学物质，可以有效地抑制和预防各种有害物质侵入机体，抗菌肽TLN-58是存在于人皮肤病变小泡中具有58个氨基酸的一种小分子多肽。hLYZ是人体免疫防御机制组成部分，还能增强生物体的自身免疫力。TLN-58可以抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和链球菌的活性，hLYZ能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌的活性，逐渐发展成为近几年来医学领域研究热点。
目前，随着基因疗法的日益兴起，使用基因药物代替常规抗生素治疗细菌性疾病，已成为应对抗生素滥用导致的细菌耐药性增强等一系列问题的研究重点和热点。
天然抗菌肽资源有限，来源困难，且无法低成本地大量获得，至今仍然未能在国内外得到广泛应用。目前期望通过基因工程技术研究得到低成本表达量高的抗菌活性蛋白制备方式。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种TLN-58和hLYZ基因融合蛋白及抗菌活性和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种hLYZ-TLN-58基因融合蛋白，构建步骤如下：
⑴根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10，优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ-TLN-58基因SEQ ID NO.9；
⑵PCR扩增hLYZ-TLN-58基因：包括以hLYZ-TLN-58-F SEQ ID NO.5和hLYZ-TLN-58-R SEQ ID NO.6为引物，扩增hLYZ-TLN-58基因；
⑶重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58表达纯化获得hLYZ-TLN-58基因融合蛋白。
而且，具体步骤如下：
⑴根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750优化得到在小鼠体内高效表达的TLN-58基因SEQ ID NO.7；根据hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ基因SEQ ID NO.8；根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ-TLN-58基因SEQ ID NO.9；
⑵PCR扩增TLN-58基因和hLYZ基因：以hLYZ-F SEQ ID NO.1和hLYZ-R SEQ IDNO.2为引物，扩增hLYZ基因；以TLN-58-F SEQ ID NO.3和TLN-58-R SEQ ID NO.4为引物，扩增TLN-58基因；以hLYZ-TLN-58-F SEQ ID NO.5和hLYZ-TLN-58-R SEQ ID NO.6为引物，扩增hLYZ-TLN-58基因；
⑶将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组原核表达载体，并用其转化感受态XL-10Gold，构建了包含上述目的基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58，纯化蛋白制备多克隆抗体，即得hLYZ-TLN-58基因融合蛋白。
而且，所述hLYZ-TLN-58基因融合蛋白具备抗菌活性。
如上所述的hLYZ-TLN-58基因融合蛋白在制备防治细菌性疾病生物制品方面中的应用。
如上所述的hLYZ-TLN-58基因融合蛋白在制备抑制细菌性疾病的疫苗方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明将TLN-58对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和链球菌的广谱抑菌效果、hLYZ广泛高效抑菌且不会损伤哺乳动物细胞的特性和原核表达载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出可以融合表达上述基因的重组原核表达质粒，最终检验本发明构建的重组原核质粒所表达的蛋白对实验菌株表现出良好的抑菌活性，为临床预防和治疗细菌性疾病提供了新的治疗思路和实验依据。
2、本发明将将TLN-58基因和hLYZ基因克隆到pMD-18-T载体中，并构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58。重组质粒IPTG诱导转化E.coli表达菌株，将菌液超声破碎后，分别通过沉淀蛋白的包涵体纯化和上清蛋白的GST柱纯化，获得纯化后的蛋白，制备多克隆抗体，通过ELISA测定免疫效价，Western Blotting鉴定检测多克隆抗体特异性，成功制备兔抗hLYZ多克隆抗体和兔抗TLN-58多克隆抗体。测定纯化蛋白对指示菌的抑菌率、抑菌效果和稳定性，测定纯化蛋白在较高浓度时的溶血率。本发明构建的重组原核质粒所表达的蛋白对实验菌株表现出良好的抑菌活性，为临床预防和治疗细菌性疾病提供了新的治疗思路和实验依据。
3、TLN-58对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和链球菌的广谱抑菌效果，hLYZ广泛高效抑菌且不会损伤哺乳动物细胞的特性和原核表达载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出可以融合表达上述基因的重组原核表达质粒，最终检验本试验构建的重组原核质粒所表达的蛋白对实验菌株表现出良好的抑菌活性。通过检测纯化重组hLYZ-TLN-58蛋白对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌均有抑菌效果最大平均抑菌率分别为83％、31.33％、26.66％和6％；纯化重组hLYZ蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌有抑菌效果，最大平均抑菌率分别为53.67％、60.33％和3.67％；纯化重组TLN-58蛋白对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有一定抑菌效果，最大平均抑菌率分别为61.67％和29％；GST标签蛋白无抑菌效果。检测重组蛋白的溶血活性，hLYZ和TLN-58的重组蛋白及双基因融合蛋白在较高浓度时的溶血率均低于5％，说明这三组纯化的蛋白对红细胞的溶血能力较弱。综合评价了重组原核质粒所表达的蛋白对常见致病菌的抑菌作用，研究结果显示重组原核质粒所表达的蛋白可以有效抑制除多杀性巴氏杆菌之外的其他菌株，且葡萄球菌最为敏感。本发明最终研制出一种抑制细菌性疾病的广谱疫苗。
附图说明
图1为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ重组质粒模式图；
图2为本发明中pGEX-4T-1-TLN-58重组质粒模式图；
图3为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58重组质粒模式图；
图4为本发明中hLYZ基因和TLN-58基因的扩增结果图；其中，M：DL2501 DNA分子质量标准；1：hLYZ-TLN-58基因PCR产物；2：hLYZ基因PCR产物；3：TLN-58基因PCR产物；
图5为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58重组质粒的双酶切鉴定结果图；其中，M：DL2501 DNA分子质量标准；1：pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58的XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切产物；2：pGEX-4T-1-hLYZ的XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切产物；3：pGEX-4T-1-TLN-58的XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切产物；
图6为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ重组质粒双酶切结果产物hLYZ基因的测序结果图；
图7为本发明中pGEX-4T-1-TLN-58重组质粒双酶切结果产物TLN-58基因的测序结果图；
图8为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58重组质粒双酶切结果产物hLYZ-TLN-58基因的测序结果图；
图9为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ小量表达胶图；其中，M：蛋白Marker；1-3：IPTG对照(BL21)；4：未诱导诱导(BL21)；
图10为本发明中pGEX-4T-1-TLN-58小量表达胶图；其中，M：蛋白Marker；1-3：IPTG对照(Codon plus)；4：未诱导诱导(Codon plus)；
图11为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58小量表达胶图；其中，M：蛋白Marker；1-3：IPTG对照(Rosetta)4：未诱导诱导(Rosetta)；
图12为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ大量表达胶图；其中，M：蛋白Marker；1：超声后沉淀；2：超声后上清；3：诱导后全菌；
图13为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ包涵体纯化胶图；其中，M：蛋白Marker；1：蛋白原样；2：蛋白稀释5倍；3：蛋白稀释10倍；4：0.5mg/mL BSA；5：1mg/mL BSA；
图14为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ包涵体超声纯化胶图；其中，M：蛋白Marker；1：0.5mg/mL BSA；2：蛋白原样；
图15为本发明中pGEX-4T-1-TLN-58大量表达胶图；其中，M：蛋白Marker；1：诱导后全菌；2：超声后上清；3：超声后沉淀；
图16为本发明中pGEX-4T-1-TLN-58包涵体纯化胶图；其中，M：蛋白Marker；1：0.5mg/mL BSA；2：1mg/mL BSA；3：蛋白原样；
图17为本发明中pGEX-4T-1-TLN-58GST柱纯化胶图；其中，M：Marker；1：蛋白原样；2：流穿；3-4：柱样；6-7：纯化蛋白；8：0.5mg/mL BSA；
图18为本发明中pGEX-4T-1-TLN-58GST柱纯化质谱鉴定结果图；
图19为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58大量表达胶图；其中，M：蛋白Marker；1：0.5mg/mL BSA；2：1mg/mL BSA；3：诱导后全菌；4：超声后上清；5：超声后沉淀；
图20为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58包涵体纯化胶图；其中，M：蛋白Marker；1：蛋白原样；2：0.5mg/mL BSA；3：1mg/mL BSA；
图21为本发明中pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58GST柱纯化胶图；其中，M：Marker；1：蛋白原样；2：流穿；3-4：柱样；6-7：纯化蛋白；8：0.5mg/mL BSA；
图22为本发明中ELISA检测hLYZ抗血清效价图；
图23为本发明中ELISA检测TLN-58抗血清效价图；
图24为本发明中hLYZ多克隆抗体的Western Blotting检测图；
图25为本发明中TLN-58多克隆抗体的Western Blotting检测图；
图26为本发明中重组hLYZ蛋白的抑菌活性检测结果图；
图27为本发明中重组TLN-58蛋白的抑菌活性检测结果图；
图28为本发明中重组hLYZ-TLN-58蛋白的抑菌活性检测结果图；
图29为本发明中hLYZ蛋白、TLN-58蛋白、融合hLYZ-TLN-58蛋白和GST标签蛋白溶血活性测定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种hLYZ-TLN-58基因融合蛋白，构建步骤如下：
⑴根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10，优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ-TLN-58基因SEQ ID NO.9；
⑵PCR扩增hLYZ-TLN-58基因：包括以hLYZ-TLN-58-F SEQ ID NO.5和hLYZ-TLN-58-R SEQ ID NO.6为引物，扩增hLYZ-TLN-58基因；
⑶重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58表达纯化获得hLYZ-TLN-58基因融合蛋白。
较优地，具体步骤如下：
⑴根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750优化得到在小鼠体内高效表达的TLN-58基因SEQ ID NO.7；根据hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ基因SEQ ID NO.8；根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ-TLN-58基因SEQ ID NO.9；
⑵PCR扩增TLN-58基因和hLYZ基因：以hLYZ-F SEQ ID NO.1和hLYZ-R SEQ IDNO.2为引物，扩增hLYZ基因；以TLN-58-F SEQ ID NO.3和TLN-58-R SEQ ID NO.4为引物，扩增TLN-58基因；以hLYZ-TLN-58-F SEQ ID NO.5和hLYZ-TLN-58-R SEQ ID NO.6为引物，扩增hLYZ-TLN-58基因；
⑶将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组原核表达载体，并用其转化感受态XL-10Gold，构建了包含上述目的基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58，纯化蛋白制备多克隆抗体，即得hLYZ-TLN-58基因融合蛋白。
较优地，所述hLYZ-TLN-58基因融合蛋白具备抗菌活性。
如上所述的hLYZ-TLN-58基因融合蛋白可以应用在制备防治细菌性疾病生物制品方面中。
如上所述的hLYZ-TLN-58基因融合蛋白可以应用在制备抑制细菌性疾病的疫苗方面中。
具体地，相关制备及检测如下：
抗菌肽TLN-58被发现于人皮肤病变小泡(皮肤脓疱的病变泡，The AntimicrobialPepti de Database ID：AP02750)。TLN-58含有58个氨基酸，序列为TLNQARGSFDISCDKDNKRFALLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，带有7个静正电荷，疏水性为34％。APD分析显示，该肽序列与ALL-38相似度为65.5％。它是hCAP-18的另一种加工形式，hC AP-18是LL-37和ALL-38的前身。TLN-58具有上调IL-17C、IL-8、IL-23、IL-1alpha、IL-1beta mRNA和蛋白表达，与LL-37相似。hLYZ是一种广泛存在于人类乳汁、胎盘、唾液等多种分泌液和组织细胞中一种广谱抗菌物质，由于动物和人的细胞没有细胞壁，hLYZ对其无毒性，同时hLYZ具有广谱抗菌性。
本发明将目的基因TLN-58和hLYZ重组到原核表达载体pGEX-4T-1上，获得高效且稳定表达hLYZ-TLN-58的重组载体，并应用PCR、双酶切、测序的方法验证目的基因表达是否正确。将测序正确的重组质粒经IPTG诱导后，分别转化E.coli BL21、E.coli Codon plus、E.coli Rosetta和E.coli BL21 plys S菌株进行诱导表达。通过原核表达系统表达出抗菌活性高的融合蛋白，为大量制备抗菌蛋白提供试验依据。
本发明构建TLN-58和hLYZ基因融合表达载体的方法，包括以下步骤：
1)TLN-58基因片段、hLYZ基因片段和融合hLYZ-TLN-58基因片段的扩增与克隆；
2)融合表达TLN-58和hLYZ基因原核表达载体的构建；
3)融合表达TLN-58和hLYZ基因的蛋白纯化及多克隆抗体的制备；
4)重组原核质粒所表达的蛋白的体外抑菌效果评价。
具体包括步骤如下：
1)根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750优化得到的在小鼠体内高效表达的TLN-58基因SEQ ID NO.7；根据hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到的在小鼠体内高效表达的hLYZ基因SEQ ID NO.8；根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到的在小鼠体内高效表达的hLYZ-TLN-58基因SEQ ID NO.9；
2)所述的TLN-58基因和hLYZ基因的PCR扩增包括：以hLYZ-F SEQ ID NO.1和hLYZ-R SEQ ID NO.2为引物，扩增hLYZ基因；以TLN-58-F SEQ ID NO.3和TLN-58-R SEQ ID NO.4为引物，扩增TLN-58基因；以hLYZ-TLN-58-F SEQ ID NO.5和hLYZ-TLN-58-R SEQ ID NO.6为引物，扩增hLYZ-TLN-58基因；
3)将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组原核表达载体，并用其转化感受态XL-10Gold，构建了包含上述目的基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58，纯化蛋白制备多克隆抗体，并检测融合蛋白的抑菌率及溶血性等。
也就是说：以pMD-hLYZ和pMD-TLN-58为模板，通过质粒提取、双酶切、产物的胶回收、与原核表达载体pGEX-4T-1用T4连接酶连接，转化感受态细胞XL-10Gold，成功获得重组质粒。经过菌液PCR、双酶切鉴定和测序分析，将鉴定正确的阳性质粒命名为pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58。将测序正确的重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58经IPTG诱导分别转化不同表达菌株进行小量诱导表达。超声破碎菌液后，分别通过沉淀蛋白的包涵体纯化和上清蛋白的GST柱纯化，大量制备了hLYZ、TLN-58和hLYZ-TLN-58重组融合蛋白。将纯化后的hLYZ和TLN-58融合蛋白作为抗原，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体阳性血清，通过ELISA测定免疫效价，Western Bloting鉴定检测多克隆抗体特异性。通过测定重组原核质粒所表达的蛋白对的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和多杀性巴氏杆菌体外抑菌率，评价抑菌效果，检测重组蛋白的溶血活性。
下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
1材料与方法
1.1 hLYZ基因和TLN-58基因的扩增
根据GeneBank中hLYZ基因标准序列(NC_000012.10)和The AntimicrobialPeptide Database中的TLN-58基因碱基序列(APD ID：AP02750)，针对表达载体pGEX-4T-1和基因序列合成特异性引物。
采用OMEGA质粒大量提取试剂盒，提取重组质粒pMD-hLYZ和pMD-TLN-58，-20℃保存备用。利用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ分别对质粒pMD-hLYZ、pMD-TLN-58和原核载体pGEX-4T-1进行双酶切，采用DNA回收试剂盒纯化含有限制性内切酶等杂质的酶切产物，-20℃冻存备用。采用SanPrep柱式胶回试剂盒回收hLYZ基因和TLN58基因与原核表达载体pGEX-4T-1双酶切的产物，-20℃冻存备用。制备大肠杆菌感受态细胞XL-10Gold,做好标记，-80℃冻存备用。
制备pGEX-4T-1-hLYZ质粒和pGEX-4T-1-TLN-58质粒。连接胶回产物，将双酶切后胶回收获得的hLYZ基因和TLN-58基因与原核表达载体pGEX-4T-1用T4连接酶16℃连接过夜。然后转化感受态细胞XL-10Gold，制得重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58。
扩增目的片段的引物(表1)、双酶切(反应体系见表2)、连接酶(连接体系见表3)。
表1扩增目的片段的引物
Figure BDA0002735547960000051
Figure BDA0002735547960000061
表2酶切反应体系
Figure BDA0002735547960000062
注：反应程序：31℃，3h；80℃，20min；4℃，1h，4℃保存备用。
表3 T4连接酶连接体系
Figure BDA0002735547960000063
1.2 pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58质粒的鉴定
取过夜培养的菌液，分别利用表1中所述引物进行PCR鉴定，利用1.0％的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，电泳90V，40min，凝胶成像分析仪观察DNA电泳条带，检测目的片段。需做3个PCR体系，分别为pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58。PCR鉴定结果为阳性的菌液提取其重组质粒，根据引物设计时目的片段上下游引入的限制性内切酶酶切位点，用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定。将菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的重组质粒送至公司进行核苷酸序列测定，测序结果与GeneBank中的标准序列进行BLAST比对。
PCR(反应体系见表4)、双酶切(反应体系见表5)。
表4 PCR反应体系
Figure BDA0002735547960000064
注：反应程序：94℃，预变性5min；35个循环{95℃，30s；65℃，30s；73℃，1min}，72℃延伸15min。4℃冻存备用。
表5双酶切反应体系
Figure BDA0002735547960000071
注：反应程序：31℃，3h；80℃，20min；4℃，1h，4℃保存备用。
1.3目的基因的小量诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析
将测序正确的重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58经IPTG诱导分别转化E.coli BL21、E.coli Codon plus、E.coli BL21 plys S和E.coli Ro setta菌株进行诱导表达，然后进行表达产物的SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE电泳分离胶与浓缩胶所用溶液(表6)。
表6 SDS-PAGE电泳分离胶与浓缩胶所用溶液
Figure BDA0002735547960000072
1.4融合表达TLN-58和hLYZ基因的蛋白纯化及多克隆抗体的制备
重组质粒分别选用表达量高的大肠杆菌表达菌株，将菌液过夜培养至OD600＝0.6-0.8，经IPTG诱导，用pH 8.0 10mM的Tris-HCl溶液将离心后的菌体沉淀吹散，500W，180次，每次5s，间隔5s超声波破碎。取100μL超声后的菌悬液，离心后将上清移至新的离心管中，用50μL pH 8.0 10mM的Tris-HCl将沉淀吹散，15％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白可溶性。
将超声后的沉淀蛋白进行包涵体纯化，用30mL pH8.0 10 mM的Tris-HCl溶液将超声后离心得到的沉淀混匀，室温下静置10min。静置后离心10min，将上清移至新的离心管中。用30mL pH8.0 10 mM的Tris-HCl溶液将上述沉淀混匀，室温下静置10min。静置后离心弃去上清。重复一次。用10mL pH8.0 10 mM的Tris-HCl溶液将沉淀混匀，再加入10mL pH8.0含8M尿素的10mM Tris-HCl溶液溶解蛋白，离心收集上清，用15％SDS-PAGE电泳检测。
将上清蛋白进行GST柱纯化取500μL GE Healthcare，加入5mL裂解液重悬，500×g离心2min，重复3-5次。每次取500mL菌液离心后的沉淀，用20mL裂解液混匀沉淀，超声波破碎后，8000×g，离心10min。取上清与经过处理的500μL bead混合摇匀，4℃翻转摇动过夜结合。离心后上清移至新的离心管中，留样电泳，bead转入2mL离心管。用1.5mL裂解液洗3次。用0.5mL洗脱液重悬bead，4℃条件下翻转摇动2-3h，500×g离心2min，上清转至另一管中。重复两次用电泳检测纯化效果。
1.5兔抗hLYZ、TLN-58多克隆抗体制备
将纯化好的重组蛋白hLYZ和TLN-58分别作为免疫原。按照流程免疫新西兰大白兔，制备重组蛋白的兔抗血清。免疫结束一周后从耳静脉取2mL阴性血。室温静置后，离心，将血清移至新的离心管中。将30mg/kg用量的戊巴比妥钠从静脉注射麻醉，麻醉后颈动脉取尽可能多的阳性血，两次离心后得到血清30mL。用ELISA测定多克隆抗体效价，Westernblotting检测多克隆抗体特异性。
多克隆抗体制备免疫流程见表7。
表7多克隆抗体制备免疫流程
Figure BDA0002735547960000081
1.6表达蛋白的抑菌活性和溶血活性检测
检测对五种指示菌：大肠杆菌(K88)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、多杀性巴氏杆菌、无乳链球菌的抑菌活性。取-20℃冻存菌液，划线于对应的琼脂培养基中，37℃过夜培养。向液体培养基中接种单菌落，取新鲜培养基接种过夜菌体，培养至细菌生长达到对数期，调整浓度至0.5麦氏比独标准(菌落数约为108CFU/mL)，然后取少量加入1000倍的培养基稀释成105CFU/mL的菌悬液。向96孔板每排的第1个孔内加入100μL纯化后的重组蛋白，其它孔中加入50μL 0.2％BSA和0.01％乙酸的稀释液，从第一1个孔中吸出50μL，加入第2个孔内，依次类推，倍比稀释至第10号孔。向96孔板的前11个孔中各加入50μL 105CFU/mL的菌悬液，加完后盖盖振荡1min，使其混匀，然后37℃孵育24h。每排第11个孔只加50μL稀释液和50μL菌液为阳性对照组；每排第12个孔只加50μL稀释液和50mL液体培养基为阴性对照组。首先观察阴性对照组，是否始终清亮，若是则证明试验符合无菌操作要求。试验重复操作三次。采用抑菌率分析计算结果。抑菌率＝(阳性-试验组)/(阳性-阴性)×100％。
表达蛋白对红细胞的毒性检测即为溶血活性检测，具体操作如下：采用心脏采血的方式，从健康家兔采10mL血液，加入1mL 1％的肝素钠抗凝，1000×g离心15min，弃上清，收集红细胞沉淀。加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH＝7.2)重悬沉淀洗涤3次。吸出洗净的红细胞，用高压灭菌后的PBS溶液将其浓度稀释至2％制成2％红细胞悬液。向96孔板的每一排的第1个孔内加入100μL重组蛋白，其他孔中加入50μL PBS缓冲溶液，然后将第1号孔中的蛋白溶液吸出50μL，加入2号内，依次倍比稀释至10号后，吸出50μL弃去；11号孔阳性对照为用生理盐水稀释的10％Triton-X-100此时的红细胞溶解值为100％；12号孔阴性对照为PBS，将重组蛋白和红细胞按1∶1的比例混合，每孔内加入50μL 2％兔红细胞悬液，37℃作用4h，离心。将上清移至新的96孔板中，对应的每孔加80μL上清，测540nm处的吸光度值，计算溶血率。试验重复操作三次。溶血率(％)＝(试验组-阴性)/(阳性-阴性)×100％。
2结果与分析
2.1 hLYZ基因和TLN-58基因的扩增与序列分析结果
pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58重组质粒模式图。(见图1至图3)。
利用特异性引物，分别以质粒pMD-hLYZ和pMD-TLN-58为模板，电泳检测菌液PCR产物，分别扩增得到630bp的hLYZ和TLN-58融合基因片段、456bp的hLYZ基因片段和186bp的TLN-58基因片段，目的条带与预期相符(见图4)。
用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，电泳得到4969bp的pGEX-4T-1vector和630bp的hLYZ和TLN-58融合基因片段，4969bp的pGEX-4T-1vector和456bp的hLYZ基因目的片段，以及186bp的TLN-58基因目的片段，目的条带与预期相符(见图5)。
将测序结果与Gene Bank的标准序列进行BLAST分析比对，结果表明TLN-58基因和hLYZ基因序列与已发表的基因序列的同源性均达到100.0％。测序结果见图6至图8。
2.2目的基因的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析结果
将测序正确的重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ经IPTG诱导分别转化E.coli BL21、E.coli Codon plus、E.coli BL21 plys S和E.coli Rosetta菌株进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果可知，重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ经IPTG诱导转化E.coli BL21菌株进行诱导后的表达量最高(见图9)。
将测序正确的重组质粒pGEX-4T-1-TLN-58经IPTG诱导分别转化E.coli BL21、E.coli Codon plus、E.coli BL21 plys S和E.coli Rosetta菌株进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果可知，重组质粒pGEX-4T-1-TLN-58经IPTG诱导转化E.coli Codonplus菌株进行诱导后的表达量最高(见图10)。
将测序正确的重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58经IPTG诱导分别转化E.coliBL21、E.coli Codon plus、E.coli BL21 plys S和E.coli Rosetta菌株进行诱导表达。15％SDS-PAGE分析结果可知，重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58经IPTG诱导转化E.coliRosetta菌株进行诱导后的表达量最高(见图11)。
2.3重组原核质粒所表达蛋白的纯化结果
pGEX-4T-1-hLYZ转化E.coli BL21菌株后蛋白的纯化，大量表达超声后胶图(见图12)，沉淀蛋白的包涵体纯化胶图(见图13)，包涵体超声纯化(见图14)。
pGEX-4T-1-TLN-58转化E.coli Codon plus菌株后蛋白的纯化，大量表达超声后胶图(见图15)，沉淀蛋白的包涵体纯化胶图(见图16)，上清蛋白的GST柱纯化(见图17)，质谱鉴定结果(见图18)。
pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58转化E.coli Rosetta菌株后蛋白的纯化，大量表达超声后胶图(见图19)，沉淀蛋白的包涵体纯化胶图(见图20)，上清蛋白的GST柱纯化(见图21)。
2.4兔抗hLYZ、TLN-58多克隆抗体制备结果
将纯化后的hLYZ和TLN-58蛋白分别作为抗原，免疫新西兰大白兔获得含由多克隆抗体的血清。耳缘静脉取血，包被TLN-58和hLYZ蛋白，通过ELISA测定免疫效价均≥51200，符合后续试验对多克隆抗体的要求。兔抗hLYZ多克隆抗体效价见图22，兔抗LN-58多克隆抗体效价见图23。
通过Western Blotting检测hLYZ蛋白与其免疫兔子的多抗血清能发生特异性反应，在分子质量约45kDa处呈现特异性结合条带，即成功制备兔抗hLYZ多克隆抗体(见图24)。
通过Western Blotting检测TLN-58蛋白与其免疫兔子的多抗血清能发生特异性反应，在分子质量约35kDa处呈现特异性结合条带，即成功制备兔抗TLN-58多克隆抗体(见图25)。
2.5表达蛋白的抑菌活性和溶血活性检测结果
纯化重组hLYZ蛋白对三种菌有抑菌效果，当抑菌浓度为6μM/L时，对金黄色葡萄球菌(S.aureus)平均抑菌率为53.67％；当抑菌浓度为2μM/L时，对大肠杆菌(E coli)平均抑菌率为60.33％；当抑菌浓度为8μM/L时，对无乳链球菌(S.agalactiae)平均抑菌率为3.67％(见图26)。
纯化重组TLN-58蛋白对两种菌有抑菌效果。当抑菌浓度为16μM/L时，对金黄色葡萄球菌(S.aureus)平均抑菌率为61.67％；当抑菌浓度为8μM/L时，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)平均抑菌率为29％(见图27)。
纯化重组hLYZ-TLN-58蛋白对四种菌有抑菌效果，当抑菌浓度为16μM/L时，对金黄色葡萄球菌(S.aureus)平均抑菌率为83％；当抑菌浓度为32μM/L时，对表皮葡萄球菌(S.epidermidis)平均抑菌率为31.33％；当抑菌浓度为64μM/L时，对大肠杆菌(E coli)平均抑菌率为26.66％；当抑菌浓度为8μM/L时，对无乳链球菌(S.agalactiae)平均抑菌率为6％。(见图28)。
GST标签蛋白无抑菌效果。
测定纯化后重组蛋白的溶血活性，hLYZ蛋白、TLN-58蛋白、融合hLYZ-TLN-58蛋白和GST标签蛋白溶血活性较低，经在浓度为512μM时溶血率均低于5％，参考医用溶血判断标准，溶血率小于5％，为阴性反应，无溶血现象；溶血率大于5％为阳性反应，有溶血现象。说明四种蛋白对红细胞的溶血能力较弱(见图29)。
3结论
3.1以pMD-hLYZ和pMD-TLN-58为模板，通过质粒提取、双酶切、产物的胶回收、与原核表达载体pGEX-4T-1用T4连接酶连接，转化感受态细胞XL-10Gold，成功获得重组质粒。经过菌液PCR、双酶切鉴定和测序分析，将鉴定正确的阳性质粒命名为pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58。
3.2将测序正确的重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ、pGEX-4T-1-TLN-58和pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58经IPTG诱导分别转化不同表达菌株进行小量诱导表达。SDS-PAGE结果可知，重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ经IPTG诱导转化E.coli BL21菌株进行诱导后的表达量最高；重组质粒pGEX-4T-1-TLN-58经IPTG诱导转化E.coli Codonplus菌株进行诱导后的表达量最高；重组质粒pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58经IPTG诱导转化E.coli Rosetta菌株进行诱导后的表达量最高。
3.3超声破碎菌液后，分别通过沉淀蛋白的包涵体纯化和上清蛋白的GST柱纯化，大量制备了hLYZ、TLN-58和hLYZ-TLN-58重组融合蛋白。
3.4将纯化后的hLYZ和TLN-58融合蛋白作为抗原，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体阳性血清。通过ELISA测定免疫效价≥51200。Western Bloting鉴定检测多克隆抗体特异性，结果显示，多克隆抗体与hLYZ和TLN-58融合蛋白均有效结合，特异性良好，即成功制备兔抗hLYZ多克隆抗体和兔抗TLN-58多克隆抗体。
3.5通过抑菌率对目的蛋白的抑菌效果进行评价，结果显示，纯化重组hLYZ-TLN-58蛋白对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌均有抑菌效果最大平均抑菌率分别为83％、31.33％、26.66％和6％；纯化重组hLYZ蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌有抑菌效果最大平均抑菌率分别为53.67％、60.33％和3.67％；纯化重组TLN-58蛋白对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有一定抑菌效果最大平均抑菌率分别为61.67％和29％；GST标签蛋白无抑菌效果。
3.6检测重组蛋白的溶血活性，hLYZ和TLN-58的重组蛋白及双基因融合蛋白在较高浓度时的溶血率均低于5％，说明这三组纯化的蛋白对红细胞的溶血能力较弱。结果显示重组蛋白的溶血性较低。
本发明的创新之处在于，首次将TLN-58对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和链球菌的广谱抑菌效果、hLYZ广泛高效抑菌且不会损伤哺乳动物细胞的特性和原核表达载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，成功构建可以融合表达上述基因的重组原核表达质粒，最终检验本发明构建的重组原核质粒所表达的蛋白对实验菌株表现出良好的抑菌活性，为临床预防和治疗细菌性疾病提供了新的治疗思路和实验依据。
序列表：
Figure BDA0002735547960000101
Figure BDA0002735547960000111
Figure BDA0002735547960000121
Figure BDA0002735547960000131
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一种TLN-58和hLYZ基因融合蛋白及抗菌活性和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> hLYZ-F(Unknown)
<400> 1
tggttccgcg tggatccccg gaattcatga aagcactgat tgtgctgggc t 51
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> hLYZ-R(Unknown)
<400> 2
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<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> TLN-58-F(Unknown)
<400> 3
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<211> 56
<212> DNA
<213> TLN-58-R(Unknown)
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
<213> hLYZ-TLN-58-F(Unknown)
<400> 5
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<211> 50
<212> DNA
<213> hLYZ-TLN-58-R(Unknown)
<400> 6
agtcagtcac gatgcggccg ctcgagactt tcggtgcgag gaaccagatt 50
<210> 7
<211> 186
<212> DNA
<213> TLN-58基因(Unknown)
<400> 7
gaattcacac tgaatcaggc ccgtggctca tttgatatta gttgcgataa agataataaa 60
cgctttgcct tactgggtga tttttttcgt aaatctaaag aaaaaatcgg caaagaattt 120
aaacgtattg tgcagcgcat caaagatttt ctgcgtaatc tggttcctcg caccgaaagt 180
ctcgag 186
<210> 8
<211> 456
<212> DNA
<213> hLYZ基因(Unknown)
<400> 8
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aaagtgtttg aacgctgtga attagcacgt accttaaaac gcttaggtat ggatggttat 120
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gttcgtcagt atgttcaggg ttgtggcgtt ctcgag 456
<210> 9
<211> 630
<212> DNA
<213> hLYZ-TLN-58基因(Unknown)
<400> 9
gaattcatga aagcactgat tgtgctgggc ttagttctgc tgagtgtgac cgttcagggc 60
aaagtgtttg aacgctgtga attagcacgt accttaaaac gcttaggtat ggatggttat 120
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cgcgccacca attataatgc cggtgatcgc tctaccgatt atggcatttt tcagattaat 240
agtcgctatt ggtgtaatga tggtaaaacc cccggcgccg tgaatgcatg tcatctgagc 300
tgtagcgcac tgttacagga taatattgca gatgcagttg catgtgccaa gcgggtggtg 360
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aaagaaaaaa tcggcaaaga atttaaacgt attgtgcagc gcatcaaaga ttttctgcgt 600
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Claims (3)

1.一种hLYZ-TLN-58基因融合蛋白，其特征在于：构建步骤如下：
⑴根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10，优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ-TLN-58基因SEQ ID NO.9；
⑵PCR扩增hLYZ-TLN-58基因：包括以hLYZ-TLN-58-F SEQ ID NO.5和hLYZ-TLN-58-RSEQ ID NO.6为引物，扩增hLYZ-TLN-58基因；
⑶重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58表达纯化获得hLYZ-TLN-58基因融合蛋白；
具体步骤如下：
⑴根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750优化得到在小鼠体内高效表达的TLN-58基因SEQ ID NO.7；根据hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ基因SEQ ID NO.8；根据TLN-58基因碱基序列GI：AP02750和hLYZ基因标准序列GI：NC_000012.10优化得到在小鼠体内高效表达的hLYZ-TLN-58基因SEQ ID NO.9；
⑵PCR扩增TLN-58基因和hLYZ基因：以hLYZ-F SEQ ID NO.1和hLYZ-R SEQ ID NO.2为引物，扩增hLYZ基因；以TLN-58-F SEQ ID NO.3和TLN-58-R SEQ ID NO.4为引物，扩增TLN-58基因；以hLYZ-TLN-58-F SEQ ID NO.5和hLYZ-TLN-58-R SEQ ID NO.6为引物，扩增hLYZ-TLN-58基因；
⑶将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组原核表达载体，并用其转化感受态XL-10Gold，构建了包含上述目的基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-hLYZ-TLN-58，纯化蛋白制备多克隆抗体，即得hLYZ-TLN-58基因融合蛋白；
所述hLYZ-TLN-58基因融合蛋白具备抗菌活性。
2.如权利要求1所述的hLYZ-TLN-58基因融合蛋白在制备防治细菌性疾病生物制品方面中的应用。
3.如权利要求1所述的hLYZ-TLN-58基因融合蛋白在制备抑制细菌性疾病的疫苗方面中的应用。
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