CN110484511B - 杂交瘤细胞株、其分泌的识别盖他病毒单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株、其分泌的识别盖他病毒单克隆抗体及应用。其中的杂交瘤细胞株包括分泌识别盖他病毒C蛋白的单克隆抗体的K1G4F4杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能与目的抗原发生高效价的特异性结合，单克隆抗体制备成检测试剂盒检测临床样品，特异性强、灵敏度高、稳定性好。

Description

杂交瘤细胞株、其分泌的识别盖他病毒单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。涉及杂交瘤细胞株、其分泌的抗盖他病毒单克隆抗体及应用。

背景技术

盖他病毒(Getah virus,GETV)属于披膜病毒科(Tongaviridae)甲病毒属(Alphavirus)成员。病毒粒子大小约70nm，球形结构，具有囊膜和纤突，病毒基因组为单股正链RNA，基因组有两个开放阅读框(ORF)，编码两个多聚蛋白，并最终被分别切割为4个非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4)和5种结构蛋白(C、E3、E2、6K和E1)。

1955年Scherer等首次从马来西亚的雪背库蚊(Culex spp.mosquitoes)中分离获得该病毒。血清学检测结果显示，GETV广泛分布于欧洲、亚洲和大洋洲，在猪、马、牛及袋鼠等多种动物体内检测到GETV抗体，该病毒能够引起马的皮疹、发热和关节水肿及妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的震颤。尽管目前尚无人感染GETV而临床发病的报道，但人的血清中普遍能够检测到GETV抗体，因此目前人们一般把该病看作人兽共患病。

目前，多个实验室已经研究出多种用于盖他病毒(Getah virus,GETV)检测的特异、快速的血清学方法，包括间接免疫荧光、中和试验、酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,ELISA)、补体结合反应及间接血凝抑制试验等。但是大部分是以实验室已有的GETV为基础，检测血清中GETV抗体，存在较多不确定因素。如临床样品比较复杂，血清中除GETV抗体外，可能存在疫苗免疫后产生的针对细胞蛋白的抗体；以及同一种属的病毒之间可能存在交叉反应等。

单克隆抗体具有良好的特异性，在研究病原致病机制，血清学及病原检测等方面具有重要的作用。目前，尚无构建盖他病毒未见有关GETV单克隆抗体制备及应用的相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了杂交瘤细胞株、其分泌的抗盖他病毒单克隆抗体及应用。本发明制备的可分泌盖他病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株K1G4F4所分泌的抗体能与目的抗原发生高效价的特异性结合，该抗体制备的检测工具对于盖他病毒的检测特异性强、灵敏度高、稳定性好。

本发明是通过以下技术方案实现的

第一方面，本发明提供了一种分泌识别盖他病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株名称为K1G4F4、保藏编号为CGMCC No.17386。

第二方面，本发明提供了一种识别盖他病毒的单克隆抗体，由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。其中K1G4F4分泌的单克隆抗体的效价为1：1.024×10⁶。

所述的杂交瘤细胞株K1G4F4分泌产生的单克隆抗体通过识别盖他病毒C蛋白对盖他病毒进行特异性识别。

第三方面，本发明提供了所述识别盖他病毒的单克隆抗体在识别盖他病毒中的应用。

第四方面，本发明提供了所述的单克隆抗体在制备用于检测盖他病毒的免疫检测工具中的应用。

所述的免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸等。

第五方面，本发明提供了一种检测盖他病毒的阻断ELISA试剂盒，所述的阻断ELISA试剂盒包括支持介质、抗原和检测抗体；

所述抗原为His-C融合蛋白(重组蛋白)；所述的检测抗体包括盖他病毒阳性对照血清，盖他病毒阴性血清，辣根过氧化物酶标记的由杂交瘤细胞株K1G4F4分泌产生的单克隆抗体(即所述的识别盖他病毒C蛋白的单克隆抗体)；所述的抗原包被在支持介质中。(具体在下面具体实施例中有详细说明。)

第六方面，本发明提供了一种检测盖他病毒的间接免疫荧光检测的试剂盒，所述的间接免疫荧光检测试剂盒包括检测抗体，荧光二抗；

所述的检测抗体为所述的识别盖他病毒的单克隆抗体，所述的荧光二抗为FITC标记的羊抗鼠二抗。

本发明还提供有杂交瘤细胞株K1G4F4的制备方法。杂交瘤细胞株的制备方法为本领域技术人员熟知的操作方法。

生物保藏说明：

本发明所提供的保藏编号为CGMCC No.17386的杂交瘤细胞株K1G4F4于2019年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明具有以下积极有益效果

本发明采用His-C蛋白免疫小鼠后至尾血效价高于1:8000后，冲击免疫后进行细胞融合，经有限稀释法克隆、筛选出能够稳定分泌盖他病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过制备小鼠腹水，经过纯化后得到盖他病毒单克隆抗体，并制备成检测试剂盒等检测临床样品。

制备得到的能够分泌盖他病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体与目的抗原发生高效价的特异性结合。在胶体金平台上使用双抗体夹心法快速检测病料中盖他病毒，其特异性强、灵敏度高、稳定性好。

利用本发明提供的能够识别盖他病毒的不同天然蛋白C蛋白抗原位点的单克隆抗体制备的用于检测盖他病毒的免疫检测工具，其中的间接免疫荧光(indirectimmunofluorescence，IFA)和Western Blot方法特异性强，灵敏度高，稳定性好，具有广泛的应用空间。

附图说明

图1为重组蛋白His-C的纯化结果；

图2为Western Blot检测杂交瘤细胞株细胞上清与不同病毒反应情况；

图3IFA检测杂交瘤细胞上清与各病毒感染的细胞反应性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但是并不用于对本发明保护范围的限制。

下面实施例中所采用的实验材料、实验试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域中常规的实验材料、实验试剂和仪器，均可通过商业途径获得。

除非另有说明外，本发明所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术(这些技术在现有文献中均有完善说明)。

实施例1

本发明所述抗盖他病毒单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1、C蛋白重组表达载体的构建

提取盖他病毒RNA，逆转录为cDNA。具体操作步骤见Trizol Invitrogen试剂盒中RNA提取操作手册；

取300μL病毒液按TRIZOL提取RNA试剂说明书提取病毒总RNA。

反转录反应体系(20μL)：RNA模板13μL、5×buffer 4μL、dNTP(10mmol/μL)1μL、随机引物Random(20pmol/μL)1μL、RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL、反转录酶M-MLV(200U/μL)0.5μL；反应参数：42℃1h，95℃5min，cDNA产物用于PCR扩增。

参考HNJZ-S1序列针对C蛋白(GenBank登录号为KY363862)设计引物进行PCR扩增，扩增得到C对应的DNA序列，基因两侧分别引入限制性内切酶BamHI和Xhol，插入表达载体PET-28a，构建C的重组表达质粒PET-28a-C，(构建之后会经测序鉴定其准确性)；其中设计引物的上游序列是：CGCGGATCCATGAATTACATTCCAACTCA，下游序列是：CCGCTCGAGTCACCATTCTTCTGTTCCTTCTG；

PCR反应体系(50μL)：2×Taq MasterMix(Dye)25μL、上下游引物(20pmol/μL)各1μL、cDNA模板5μL，补加灭菌双蒸水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃ 50s，56℃30s，72℃ 1min，30个循环；最后一个循环72℃延伸10min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶成像观察。

2、C重组蛋白的表达与纯化

(1)转化BL21大肠杆菌表达目标重组蛋白

采用42℃热激90s的方法将重组质粒PET-28a-C转化至BL21大肠杆菌，挑取卡那抗性的菌落，PCR鉴定并测序验证转化成功，放大培养300mL LB培养基中，当菌液OD值为0.6-0.8时加入IPTG诱导目标蛋白表达，在37℃培养4h后，然后收取菌体，超声破菌；

(2)重组蛋白的纯化

根据步骤(1)，收取步骤(1)的菌体、超声破菌后，菌体裂解的上清根据His标签蛋白纯化试剂盒操作步骤(本领域公知的试剂盒纯化方法)进行蛋白纯化。纯化得到的蛋白利用SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的纯度，结果如图1所示，利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。纯化得到重组C蛋白。

图1可见，纯化的C蛋白在PAGE胶(30.1kDa)处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的C蛋白；

C蛋白用于单克隆抗体制备中的免疫及筛选；C蛋白用作双抗夹心ELISA实验中的标准品蛋白。

在胶体金平台上使用双抗体夹心法快速检测病料中GETV是，特异性强、灵敏度高、稳定性好。

3、C蛋白对小鼠的免疫与效价检测

(1)选取BALB/c(6-8周龄)小鼠8只(购自河南省实验动物中心)，随机平均分为A、B两组，每组4只；A组免疫C蛋白，B组不免疫为对照组(作为阴性对照)；

(2)首次免疫：取C蛋白200μg，添加PBS稀释到200μg/mL，与等体积的弗氏完全佐剂进行搅拌乳化充分，在A组每只小鼠皮下多点注射免疫500μL。

(3)第二次免疫：首免两周后同样取C蛋白200μg，添加PBS稀释到200μg/mL，与等体积的弗氏不完全佐剂进行搅拌乳化充分，每只小鼠皮下多点注射免疫500μL；

(4)第三次免疫：二免两周后进行，方法同上述的免疫步骤(2)对小鼠进行第三次免疫；

(5)测量三免后小鼠血清效价：取C蛋白用CB稀释至5μg/mL、包被酶标板，每孔100μL；首先37℃2h，然后4℃包被过夜。取出包被的酶标板，用PBST缓冲液洗涤后，用5％的脱脂奶封闭，37℃孵育2h，然后用PBST洗三遍，4℃保存备用。

取步骤(4)三免后12天的小鼠，采集小鼠的血清，用PBS稀释为1：800，然后进行倍比稀释1：1600、1：3200、1：6400、1：12800和1：25600。各个浓度每孔100μL加入到脱脂奶封闭后的酶标板，37℃孵育1h，取出，用TBST洗三遍；然后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔加100μL，置37℃温箱孵育1小时；孵育后弃掉二抗，用PBST缓冲液洗三遍；

然后每孔加入100μL TMB单组份显色液(避光操作)，置37℃温箱作用10min；随即加入50μL/孔的终止液，置于酶标仪450nm波长下读取各孔OD值。选取效价高于1：8000的小鼠，作为细胞融合脾脏的来源。

(6)加强免疫：在细胞融合进行前三天，对小鼠进行冲击免疫。取C蛋白，均采用PBS稀释为200μL，并注射到选定的小鼠腹腔(效价高于1：8000)。注射的小鼠作为杂交瘤细胞融合的脾脏来源。

4、杂交瘤细胞的融合、筛选和贮存

(1)饲养细胞的制备

取5周龄未免疫的BALB/c小鼠，断经处死，75％酒精中浸泡5min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上，用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。用5ml注射器吸取5mL RPMI 1640培养液，注射入小鼠腹腔，待腹腔胀大后，用酒精棉对其腹部进行按摩以使RPMI 1640培养基充分进入腹腔各处后，小心由腹腔吸出RPMI 1640培养基并注入50ml离心管a中，1000r/min离心10min，弃上清，向沉淀中加入适量完全培养基，反复吹打混匀后，进行细胞计数，将细胞稀释至10⁵个/mL，每孔100μL铺至96孔板上，于37℃ 5％CO₂培养箱中培养。

(2)准备SP2/0骨髓瘤细胞：

复苏(具体步骤是：从液氮罐中取出冻存的BALB/c来源的SP2/0细胞，于37℃水浴锅中迅速解冻，800g/min离心5min后，弃上清，沉淀置于培养皿中，用10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养)保存的SP2/0骨髓瘤细胞于10cm培养皿中，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。第二天观察细胞形态和密度，当细胞铺满培养皿80％时进行传代，然后放置备用。

细胞融合时，用2ml预热的(37℃)RPMI 1640培养基把传代后的细胞从瓶壁上吹打下来，放入离心管，补加10ml RPMI 1640培养基。混匀后，1000g离心5min，弃去上清液备用。

(3)免疫后的小鼠脾脏细胞制备

步骤3(6)加强免疫后3天，选取C蛋白加强免疫后血清效价较高的小鼠，断颈处死，75％酒精中浸泡5min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上，用灭菌的剪刀剪开最外层毛皮，然后用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。

打开腹腔，取出小鼠脾脏置于匀浆器中，加5ml RPMI 1640培养基于匀浆器中进行研磨，充分研磨后再加入5ml RPMI 1640培养基重悬，重悬后静置5min，吸出细胞悬液于50ml离心管b中，然后弃去沉淀(主要弃掉悬液里较重的杂质，此时所需要的细胞处于悬浮状态)，混匀，1000g/min，离心5min，弃去上清液。

(4)细胞融合

在细胞计数板上计数脾淋巴细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的数量，根据脾细胞的数量取SP2/0骨髓瘤细胞的数量，确保脾细胞数量与SP2/0骨髓瘤细胞的数量的比例为5:1～1:1，具体如下：

a：用5ml预热的(37℃)RPMI 1640培养基重悬步骤4(3)免疫过的脾细胞沉淀。然后将重悬的免疫过的脾细胞加入SP2/0骨髓瘤细胞中，吹打均匀，1000g/min，离心5min，弃去上清液，轻轻击打离心管底部，使细胞分布均匀、蓬松；

b：取出37℃温育的1mL PEG4000，将PEG4000逐滴加入步骤a的混合的细胞(免疫过的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的混合)中，加入过程中要轻轻混匀，控制滴速，时间控制在85～95s、滴加完毕；

c：取出37℃预热的终止液40mL，滴加在步骤b的滴加PEG4000后的混合细胞中；具体滴加过程如下：第1min逐滴加入1mL，均匀滴入，边滴边缓慢旋转混匀，第2min加入2mL终止液，第3min加入3mL终止液，依次类推，第4min加入4ml、第5min加入5ml，第6min加入6ml终止液，第7min加入7ml终止液……，依次进行滴加，直到将40mL终止液完全加入(即整个加入过程先慢后快)。滴加完毕后，轻轻混合均匀，800r/min离心5min，弃去上清液。

(5)铺板

将步骤4(4)中弃去上清液的细胞沉淀重悬于含有20％胎牛血清的37℃预热的1％HAT选择培养基40mL中，用吸管吹打混匀，将混匀的细胞悬液加到步骤4(1)的含有饲养细胞的96孔细胞培养板内，每孔100μL，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。

(6)融合后阳性孔筛选用酶标板包被

用CB包被液(pH＝9)将His-C融合蛋白(即纯化重组C蛋白)稀释为5μg/mL，以每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜；

第二天取出，弃去包被液，然后每孔加300μL 5％脱脂奶，于37℃孵育2h；取出PBST缓冲液洗三遍，置4℃备用。

(7)第一次克隆细胞

A：步骤4(5)所述细胞融合后第5天(37℃ 5％CO₂培养箱中培养的第5天)，数量不等的细胞聚集在一起形成细胞集落，进行第一次更换HAT培养基。分别在第7进行第二次、第9天进行第三次更换HAT培养基液。

B：第11天从每孔取50μL上清液加入到预先制备的酶标板(步骤4(6)备用的酶标板)中进行效价检测。分光光度计检测每孔的吸光度，选取吸光度值在2.0以上的细胞孔(即为阳性孔)，显微镜下观察阳性孔中细胞是否形成明显的细胞集落；

选取其中存在细胞集落的细胞孔，采用有限稀释法进行细胞克隆：首先制备饲养细胞，用RPMI 1640培养基稀释为50mL，每孔加入100μL，置于37℃ CO₂培养箱备用。

C：稀释杂交瘤细胞：将目标孔(存在细胞集落的阳性孔)的杂交瘤细胞吹打均匀，吸取100μL加入900μL的20％胎牛血清HT培养基中，在显微镜下进行计数，根据细胞密度，将细胞稀释到1000个/mL；然后吸取50μL加入到5mL的20％胎牛血清HT的RPMI 1640培养基的青霉素瓶中，将青霉素瓶中的细胞混匀，加入铺有饲养细胞的96孔板中，每孔100μL(即1个细胞每孔)，每个原始孔杂交瘤细胞铺半块板，铺完后，放入37℃ 5％CO₂培养箱中培养。

(8)定株

将20％胎牛血清HAT RPMI 1640培养基换为20％胎牛血清HT RPMI 1640培养基，待步骤4(7)C细胞板中细胞铺满1/10孔，进行二次克隆；

二次克隆后将培养基换为20％胎牛血清RPMI 1640培养基进行三次克隆；

经三次克隆化后，比对细胞集落与效价检测的结果，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性，则克隆完成。然后选取若干具有单细胞集落的细胞孔，吹打均匀细胞，移入预先铺有饲养细胞的24孔板中。最终得到K1G4F4杂交瘤细胞株。

(9)确定亚型

当步骤4(8)24孔板中的细胞达到一定的密度后，吸取50μL细胞上清，放入预先用1μg/mL His-C融合蛋白包被且封闭的酶标板中，37℃孵育1h，加入50μL HRP标记的羊抗鼠免疫球蛋白亚型的抗体作为二抗，在37℃条件下温育40min；然后采用TBST缓冲液洗涤5遍后，再加入底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，37℃条件下孵育20min，显色，酶标仪450nm波长处测量OD值，确定单克隆抗体的亚型。

结果显示，本发明K1G4F4细胞株分泌的单克隆抗体为IgG1亚型。

5、腹水的获得与单克隆抗体的纯化

(1)腹水的获得

取8周龄大的雌性BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油0.5mL。正常饲养7-12天后，将扩大培养的K1G4F4杂交瘤细胞用PBS悬浮，每只小鼠腹腔再注射1×10⁶个杂交瘤细胞。注射杂交瘤细胞7天后，小鼠腹部明显膨大，此时用无菌注射器抽取腹水，置离心管中，在4℃条件下、4000g离心10min。收集上清液，即得到单克隆抗体腹水。

(2)用1％NaAc平衡Protein G琼脂糖柱料填充的柱子。

(3)将步骤5(1)的腹水用孔径为0.2μm的滤器过滤，过滤后的腹水用1％的NaAc稀释(腹水与1％的NaAc体积比为1：3)；然后加入步骤5(2)平衡过的柱子，用阀门控制流速缓慢滴加(一般为8s/滴的流速即可)。

(4)腹水上柱完毕后，然后采用1％NaAc洗涤柱子、并用G250检测洗涤液，至柱子流出的洗涤液体不变蓝为止。

(5)用3.5％的冰乙酸(饱和碳Na₂CO₃调节pH为6-7之间)溶液洗脱步骤(4)过柱后的单克隆抗体，然后再采用G250检测洗脱液，不变蓝为止。

(6)将洗脱液放入超滤管中，在4℃条件下3000g离心30min；将超滤后的洗脱液吸入透析袋中，PBS透析过夜，即可得到纯化的K1G4F4单克隆抗体，然后将纯化后的K1G4F4单克隆抗体置于-20℃保存备用。

实施例2

该实施例对实施例1制备的单克隆抗体进行特异性及效价检测。

1、Western blot实验

(1)取盖他病毒感染的Marc-145细胞，然后用RIPA裂解液裂解。裂解后在4℃条件下，12000g/min离心20min；收集上清液，BCA试剂盒检测上清液蛋白浓度

(2)将步骤(1)所得细胞裂解液上清液加入12％PAGE中，120V电泳1h；然后将PAGE胶置于PVDF膜上，40mA转膜90min；

(3)将步骤(2)的PVDF膜放入5％脱脂奶中、4℃封闭过夜，然后分别用脱脂奶与单克隆抗体的体积比为1：2000本发明的K1G4F4单克隆抗体作为一抗，37℃作用1h；

(4)取出步骤(3)作用后的PVDF膜、用PBST缓冲液洗三遍，每遍3分钟；置于体积比为1：5000(二抗用PBST进行1：5000倍稀释)稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗于室温孵育1h，孵育完成后弃去二抗，用PBST缓冲液洗涤5遍，每遍5min；

(5)将步骤(4)处理之后的PVDF膜加ECL化学发光工作液，并于荧光成像系统观察结果；结果如图2所示，由图2可以看出，本发明K1G4F4分泌的单克隆抗体与其他病毒不发生反应，能够特异性识别感染盖他病毒的Marc-145细胞内的C蛋白。

2、IFA实验

(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

(2)用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

(3)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；

(4)PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加5％的BSA，室温封闭30min；

(5)吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(K1G4F4分泌的单克隆抗体)并放入湿盒，4℃孵育过夜；

(6)加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的FITC标记的羊抗鼠荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；(7)在荧光显微镜下观察采集图像，结果如图3所示。由图3可以看出，本发明K1G4F4分泌的单克隆抗体与其他病毒不发生反应，能够特异性识别感染盖他病毒的Marc-145细胞内的C蛋白。

3、单克隆抗体的效价

(1)以His-C融合蛋白5μg/mL作为包被抗原，在酶标板(本领域熟知操作的酶标板即可)每孔100μL进行包被，包被后在4℃条件下过夜；

(2)以本发明的K1G4F4杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体做1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000、1：512000、1：1024000、1：2.048×10⁶稀释，每个浓度100μL/孔(步骤(1)处理后的酶标板)，37℃条件下孵育1h；(3)取出步骤(2)酶标板，采用TBST缓冲液洗涤后，加入1：5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，加入后在37℃条件下孵育1h；

(4)步骤(3)孵育后的酶标板，采用TBST缓冲液洗涤后，采用TMB底物显色，10min后加终止液终止反应；

酶标仪(本领域熟知操作的酶标仪即可)读取450nm波长处的OD值，与阴性对照450nm波长处OD比值大于2.1时的最大稀释倍数作为本发明单克隆抗体的效价。检测结果显示，本发明的K1G4F4的效价为1：1.024×10⁶。

实施例3

1、C蛋白单克隆抗体阻断ELISA方法

(1)小鼠腹水IgG的纯化

取具有较高效价且特异性地分泌抗盖他病毒单克隆抗体的K1G4F4杂交瘤细胞株制备的腹水，并利用Protein G进行纯化，纯化后进行蛋白含量测定；

(2)辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG

采用简易过碘酸钠法将纯化的腹水IgG与HRP进行偶联；

(3)阻断ELISA方法

取纯化的His-C融合蛋白，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释成5.0μg/mL(其浓度还可以为2.5μg/mL、1.25μg/mL等浓度)，包被96孔ELISA板，然后37℃条件下孵育2h；

孵育后再用pH＝7.4的PBST缓冲液洗涤3次后，然后加入封闭液1％BSA(封闭液还可以为5％脱脂奶、1％OVA、2％明胶等)进行封闭，在37℃条件下封闭1小时，封闭完成后再用PBST缓冲液洗涤3次，然后再加入(血清稀释度为1：1)稀释的待检血清；

加入待检血清后，100μL/孔、于37℃孵育2h，孵育完成后，用PBST缓冲液洗涤3次，然后加入与待检血清等体积的K1G4F细胞株4，在37℃孵育条件下1h，孵育完成后，用PBST缓冲液洗涤3次，然后进行显色反应，其中的显色反应按ELISA常规操作进行，显色后立即读OD₄₅₀值。

(4)临界值

取40份临床中和试验和IFA检测均为阴性的猪临床血清进行C蛋白单抗阻断ELISA检测，计算阻断率的均值和标准方差，确定最佳临界值。

公式为：Inhibition(％)＝(阴性OD₄₅₀均值-阳性OD₄₅₀值)/阴性OD₄₅₀均值。

结果显示，利用Blocking-ELISA对40份盖他病毒猪阴性血清进行检测后，得出PI的平均数(X)＝6.91％，标准方差(SD)＝7.46％；根据公式Positive cut-off value＝X+3SD得出阳性临界值为29.29％，根据Negative cut-off value＝X+2SD得出阴性临界值为21.83％。

2、盖他病毒抗体阻断ELISA的性能测定

(1)特异性试验

检测几种常见的猪病毒病阳性血清：PPV、PRV、PRRSV、JEV、CSFV、PCV2、FMDV阳性血清，检验本研究的盖他病毒单抗阻断ELISA法同这些病毒有无交叉反应。(方法步骤同实施例3的1(3))；

结果显示，建立的盖他病毒单抗阻断ELISA法同其他病毒阳性血清无交叉反应。

(2)敏感性试验(方法步骤同该实施例3的1(3))

选取强阳性、弱阳性、阴性不同抗体水平的50份盖他病毒阳性血清(中和试验筛选)，按照本研究建立的盖他病毒单抗阻断ELISA的条件进行检测，并设阴性对照。

结果表明，利用建立的阻断ELISA同中和试验进行检测100份临床送检血清，比较两种方法检测结果的符合率和相对敏感性。结果建立的阻断ELISA与中和试验结果符合率为100％，具有良好的敏感性。中和试验检测10份阴性样品，阻断ELISA检测出9份阳性样品。

(3)重复性试验

取盖他病毒阳性临床样品3份及阴性血清1份，同一酶标板内每份血清各做3个重复，并分别取3个不同批次的酶标板进行检测，最后分别计算批内和批间的变异系数(CV％)(标准差/平均值*100％)，确定ELISA的重复性。

将6份血清样品份三次试验在相同条件下进行检测，每个样品重复3次，所得的阻断ELISA的批内CV为1.37～6.95％，批间CV为1.29～8.96％。因此重复性良好。

实施例4

该实施例为临床应用实验

应用建立的盖他病毒单抗阻断ELISA检测方法(实施例3：1C蛋白单克隆抗体阻断ELISA方法的(3)的方法)对随机抽取的河南地区送检的200份临床母猪血清进行检测。

结果表明本研究建立的方法可满足临床应用；送检母猪血清盖他病毒抗体阳性率为96.5％，中和抗体阳性率为40％。说明猪群盖他病毒感染率极高，且很大一部分猪群没有保护力。

采用C蛋白阻断ELISA对猪场送检的血清中GETV抗体的检测结果如表1所示：

表1 C蛋白阻断ELISA对猪场送检的血清中GETV抗体的检测结果

地点	阳性样品数(头)	阴性样品数(头)	阳性率(％)
				山西	60	2	96.77
新郑	35	1	97.22
				安阳	65	3	95.89
漯河	17	1	94.44
				信阳	16	0	100
总数	193	7	96.5

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 杂交瘤细胞株、其分泌的识别盖他病毒单克隆抗体及应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增上游引物序列

<400> 1

cgcggatcca tgaattacat tccaactca 29

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物序列

<400> 2

ccgctcgagt caccattctt ctgttccttc tg 32

Claims (7)

1.一种分泌识别盖他病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株名称为K1G4F4、保藏编号为CGMCC No.17386。

2.一种识别盖他病毒的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.权利要求2所述识别盖他病毒的单克隆抗体在识别盖他病毒中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于检测盖他病毒的免疫检测工具中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片和试纸。

6.一种检测盖他病毒的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的阻断ELISA试剂盒包括支持介质、抗原和检测抗体；

所述抗原为His-C融合蛋白；所述的检测抗体包括盖他病毒阳性对照血清，盖他病毒阴性血清，辣根过氧化物酶标记的权利要求2所述的单克隆抗体；所述的抗原包被在支持介质中。

7.一种检测盖他病毒的间接免疫荧光检测的试剂盒，其特征在于，所述的间接免疫荧光检测试剂盒包括检测抗体，荧光二抗；

所述的检测抗体为权利要求2所述的识别盖他病毒的单克隆抗体，所述的荧光二抗为FITC标记的羊抗鼠二抗。

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