CN109142724B - 一种用于检测i群禽腺病毒4型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株I群禽腺病毒4型Hexon蛋白制备的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体以及制备的用于检测I群禽腺病毒4型抗体的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被酶标板、辣根过氧化物酶标记的禽腺病毒4型单克隆抗体、洗涤液、血清稀释液、FAdV‑4标准阳性血清、FAdV‑4标准阴性血清、底物显色液、终止液；其中，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.16203，所述禽腺病毒4型单克隆抗体由上述保藏编号为CGMCC No.16203的杂交瘤细胞株所分泌，所述包被酶标板以大肠杆菌系统表达的重组禽腺病毒4型Hexon蛋白作为包被抗原。本发明的试剂盒以阻断ELISA法为原理，检测禽血清样本中的I群禽腺病毒4型抗体，具有灵敏性和特异性高，重复性好，检测快速方便，易于标准化等优点，非常方便在基层养殖单位中推广使用。

Description

一种用于检测I群禽腺病毒4型抗体的阻断ELISA试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测I群禽腺病毒抗体的阻断ELISA试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

2015年6月以来，我国山东、安徽、河北、河南、辽宁等省份，商品鸡群中爆发了以心包积液、肝脏肥大为特征的疾病。根据病变，暂将该其称为鸡心包积液-肝炎综合征。该疾病多发生于20～30日龄左右的肉鸡，发病后4～8日为死亡高峰期，病程为8～15天，死亡率达20％～30％。同时20～70日龄以及200～300日龄的蛋鸡也有发生，但死亡率较肉鸡低，经鉴定该疾病病原为禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)。

腺病毒是一种无囊膜的双链DNA病毒，禽腺病毒属于禽腺病毒科，禽腺病毒属，根据其抗原性的不同可分为I、II、III三个群，其中I群禽腺病毒包括12个血清型。新发现的腺病毒4型属于I群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I,FAdV I)，具有共同的群抗原，该群病毒代表株为鸡胚致死孤儿病毒(Chicken Embro Lethal Orphan virus,CELOV)。

目前对于FAdV传统的实验室检测方法均存在一定的缺陷，如病毒的分离鉴定、中和试验、琼脂扩散试验等方法费时费力，结果不够精确，PCR、LAMP等对试剂盒设备要求较高且不便对大量样品进行检测，而ELISA方法具有简便、快速、特异性强等优点，从而可作为FAdV抗原和抗体检测的有效方法。

禽腺病毒4型编码的主要结构蛋白是六邻体蛋白(Hexon)，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，所以它与保护性免疫反应有关，可以作为诊断抗原。Hexon可以刺激机体产生抗体，抑制病毒体构象的改变，从而中和病毒，因此，建立基于Hexon蛋白的阻断ELISA方法比间接ELISA方法的特异性更高，对禽腺病毒4型抗体的临床检测具有更重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种检测I群禽腺病毒抗体的阻断ELISA试剂盒。

本发明的另一目的在于提供了一种简便、快速及准确检测I群禽腺病毒血清抗体的方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一株分泌特异性结合I群禽腺病毒4型六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC NO.16203。

本发明的杂交瘤细胞株已于2018年07月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16203，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

第二方面，本发明还提供了一株特异性结合I群禽腺病毒4型六邻体蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述保藏号为CGMCC NO.16203的杂交瘤细胞株所分泌产生。

第三方面，本发明还提供了上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备I群禽腺病毒4型检测试剂盒中的应用，优选地，所述试剂盒为阻断ELISA试剂盒，可以特异性的检测样品中I群禽腺病毒4型六邻体蛋白的抗体。

第四方面，本发明还提供了一种检测I群禽腺病毒4型抗体的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括：包被酶标板、辣根过氧化物酶标记的禽腺病毒单克隆抗体；其中，所述包被酶标板是以I群禽腺病毒4型的六邻体蛋白作为包被抗原，所述单克隆抗体是针对所述六邻体蛋白而制备的抗体；优选地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.16203的杂交瘤细胞株所分泌产生。

本发明中，所述阻断ELISA试剂盒中还包含了血清稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液中的一种或多种。

本发明中，所述阻断ELISA试剂盒中还包含了FAdV-4标准阳性血清、FAdV-4标准阴性血清中的一种或两种。在ELISA检测过程中不同的操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，操作误差会导致检测样品的OD值也出现一定的误差，本发明的阻断ELISA试剂盒通过设置标准阳性血清和标准阴性血清，便于检测条件的优化和检测结果的判定。

本发明中，所述I群禽腺病毒4型的六邻体蛋白优选为重组六邻体蛋白，更优选地，所述重组六邻体蛋白为大肠杆菌表达的重组六邻体蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明中，所述I群禽腺病毒4型的重组六邻体蛋白的制备方法包括：

设计合成引物，以I群腺病毒4型(FAdV-4)代表株SDSX1的基因组为模板，通过PCR扩增得到六邻体蛋白的扩增产物，将扩增产物与表达载体同时进行双酶切，然后连接，构建重组质粒；将挑选的阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)plysS感受态细胞，获得阳性重组质粒单克隆菌，所述阳性重组质粒单克隆菌在IPTG诱导下进行蛋白表达得到诱导产物，所述诱导产物依次经裂解沉淀、纯化及梯度复性后得到六邻体蛋白；其中，所述合成引物为：上游引物：5＇-GGGTCCAGCGGCGCTGGATCCATGGCAGAGGGAGGAGGCGG-3＇(SEQ ID NO:1)，下游引物：5＇-CGCTCCACTGCCTCCTGCAGCCTACAGATTTTGAGTTAGATA-3＇(SEQ ID NO:2)。

本发明中，单克隆抗体可采用本领域常规的方法进行制备，如将禽腺病毒4型六连体蛋白腹腔注射免疫小鼠后制备的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，进而筛选获得可产生单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。禽腺病毒4型六连体蛋白中既包含了群特异性抗原决定簇，又包含了种特异性抗原决定簇，我们通过ELISA反向筛选获得特异性针对I群禽腺病毒4型的单克隆抗体，从而可建立针对I群禽腺病毒4型抗体的特异性检测方法。

本发明中，所述洗涤液优选为含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4。

本发明中，所述血清稀释液优选为含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

本发明中，所述底物显色液优选为含过氧化氢的四甲基联苯胺溶液。

本发明中，所述终止液优选为0.5M的硫酸溶液。

本发明中，所述包被抗原的包被浓度优选为1.0μg/mL；所述包被酶标板经含1％牛血清白蛋白的PBST封闭，装入密封袋中置于4℃保存。

本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的禽腺病毒4型单克隆抗体的稀释倍数优选为1:4000。

本发明中，待测血清的稀释倍数优选为1:10。

第五方面，本发明还提供了一种检测I群禽腺病毒4型抗体的方法，其利用上述阻断ELISA试剂盒而实施，所述方法包括如下步骤：

用血清稀释液稀释待检测血清得到稀释血清；

向六邻体蛋白包被的酶标板孔中加入上述稀释血清，孵育后，弃去孔中液体，再向孔中加入洗涤液进行洗涤；

向酶标板孔中加入标记的禽腺病毒4型的单克隆抗体，孵育后弃去孔中液体，再用洗涤液进行洗涤；

向酶标板孔中加入底物显色液，作用一段时间后加入终止液终止反应；

用酶标仪测定各孔的吸光光度值。

优选地，所述检测方法包括如下步骤：

用血清稀释液以体积比为1:10的比例稀释待检血清得到稀释血清；

向96孔酶标板每孔中加入100μL所述稀释血清，向酶标板各添加两孔FAdV-4标准阳性血清和FAdV-4标准阴性血清作为对照，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，再向每孔加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次3分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μL以体积比1:4000稀释后的辣根过氧化物酶标记的禽腺病毒4型单克隆抗体，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，向每孔中加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次3分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μL底物显色液，室温下避光作用10分钟；

向96孔酶标板每孔加入100μL终止液以终止显色反应；

用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度(OD)值；

根据阻断率判定，当(阴性OD450-样品OD450)/阴性OD450值≥0.4时，判定FAdV-4抗体水平为阳性，当(阴性OD450-样品OD450)/阴性OD450值＜0.4时判定FAdV-4抗体水平为阴性。

第六方面，本发明还提供了上述阻断ELISA试剂盒在检测I群禽腺病毒4型抗体中的应用。

对于I群禽腺病毒4型抗体的检测，可通过实施本发明中第五方面所述的检测方法而进行。

第七方面，本发明还提供了上述I群禽腺病毒4型抗体的阻断试剂盒在评估疫苗免疫效果中的应用，所述应用是通过检测动物免疫之后的样品抗体水平而进行评估。

对于I群禽腺病毒4型抗体水平的检测，可通过实施本发明中第五方面所述的检测方法而进行。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，是基于I群禽腺病毒4型六邻体蛋白的种特异性抗原决定簇而建立，具有良好的种特异性，不与其它型的禽腺病毒以及其它病毒发生特异性结合，从而可以高灵敏度、特异性的检测I群禽腺病毒4型。

本发明的阻断ELISA试剂盒，使用辣根过氧化物酶标记的I群禽腺病毒型单克隆抗体作为阻断抗体，由于单克隆抗体具有非常良好的特异性，该试剂盒比以六邻体蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法的特异性更佳，本发明的阻断ELISA试剂盒对于其他病原体的检测阻断率在3.94％-10.96％之间，远小于设定阈值40％。

利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体，相对于多克隆抗体而言，可以消除批次间的差异，质量更容易控制，从而建立的阻断ELISA试剂盒重复性好，本发明的试剂盒同批内和批间的重复试验均显示了良好的重复性。

本发明的阻断ELISA试剂盒，基于单克隆抗体的高亲和力及特异性，对于纯度不是特别高的六邻体蛋白也可作为包被抗原，从而节省了纯化的成本。

本发明首次建立了单克隆抗体检测I群禽腺病毒4型抗体的阻断ELISA方法，具有高效、敏感性和特异性高、重复性好、操作简便快速、易于标准化等优点，适合于临床应用中进行推广，为I群禽腺病毒的快速检测提供可靠的技术手段。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的pQE1-hexon阳性克隆核酸鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是Trans 8K DNA Marker，条带1是hexon基因扩增产物。

图2显示了本发明实施例1提供的FAdV-4 Hexon重组蛋白的诱导表达情况，其中，M是蛋白分子量Marker，条带1是未诱导的pQE1-hexon，条带2～8分别是诱导1、2、3、4、5、6、7小时的pQE1-hexon。

图3是本发明实施例1提供的Western blot鉴定图，其中，M是蛋白分子量Marker，条带1是纯化后的Hexon蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明，本发明的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

实施例1 FAdV-4 Hexon蛋白的表达纯化鉴定

1.FAdV-4 Hexon蛋白表达载体的构建：

根据GenBank上登录的SDSX1株基因序列(GenBank：KU845700)，应用Primer5.0软件设计一对特异性引物，在引物序列中引入5＇linker和3＇linker，便于后续与表达载体的重组反应。引物序列如下：上游引物P1:5＇-GGGTCCAGCGGCGCTGGATCCATGGCGGCCCTCACGCCCGA-3＇(SEQ ID NO:1)；下游引物P2：5＇-CGCTCCACTGCCTCCTGCAGCTTACACGGCGTTGCCTGTGG-3＇(SEQ ID NO:2)。预期扩增的片段大小约为2856bp，其中hexon基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。胶回收hexon基因目的片段(扩增产物)，将hexon目的基因与pQE1(Cat No./ID:32932，QIAGEN)载体按一定比例进行重组，重组反应体系：ExnaseTM Ⅱ 1μL，5×CE ⅡBuffer 2μL，hexon目的基因3μL，表达载体pQE1 4μL，37℃反应30min，冰上放置5min，将10μL重组产物转到TOP菌株并加入1/5体积的5×Jet Buffer，冰浴30min，42℃90s，冰上放置2～3min，加入900μL SOC培养基，37℃摇床振荡复苏1h，离心后取100μL菌液涂含Kan+抗生素的LB板。挑取阳性克隆，培养之后进行菌液PCR鉴定，鉴定结果如图1所示，该图显示，PCR扩增的目的基因片段大小与预期相符，将阳性菌液送至测序，测序正确的质粒被命名为pQE1-hexon。

2.重组质粒的诱导表达

将阳性重组质粒pQE1-hexon转化至Rosetta2(DE3)plysS感受态细胞中，将重组菌于37℃培养至OD600nm值约为0.6，加入IPTG，使其终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mmol/L,诱导表达5h，确定最适的IPTG诱导浓度；在最适IPTG诱导浓度下，分别诱导表达0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h，确定最佳的诱导时间；在最适IPTG浓度和最佳诱导时间下，分别在20℃、25℃、30℃、37℃诱导，确定最佳诱导温度。根据上述实验摸索，最终确定最适IPTG诱导浓度为1.0mmol/L，最佳诱导时间为3h，最佳诱导温度为37℃。在选定的最适条件下诱导表达的菌液经超声波破碎后，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示。

3.FAdV-4重组Hexon蛋白的Western blot试验

取诱导后5h的菌液进行SDS-PAGE电泳，将电泳后的凝胶，不经染色，直接用转印装置将蛋白以150mA转印到PVDF膜上，转印1.5h，转膜完毕后，小心取出PADF膜，在TBST中漂洗一下，置于封闭液(含2.5％脱脂奶粉的TBST)中室温封闭1h(缓慢摇动)；弃封闭液，温育后的PVDF膜用TBST洗3次，每次10min，把PVDF膜放入用封闭液合适比例稀释的一抗(FAdV-4阳性血清)中，4℃孵育过夜(缓慢摇动)，弃一抗，孵育后的PVDF膜TBST洗3次，每次10min，把PVDF膜放入用封闭液稀释的二抗(酶标抗鸡IgG二抗)，平稳摇动，室温孵育1h。弃二抗，将PVDF膜用TBST洗3次，每次10min，按照eECL Western Blot kit说明书进行显色，暗室压片曝光，结果显示，本实施例制备的重组Hexon蛋白可以用于免疫印迹实验。

4.重组Hexon蛋白的纯化复性

将含有重组质粒pQE1-hexon的阳性克隆接种到5mL LB培养基，活化培养过夜，然后取5mL菌液加入500mL LB培养基中，培养至对数期，加入0.1％IPTG(IPTG是指异丙基硫代半乳糖苷，一种诱导剂)后，诱导培养5h，收集菌液，5000rpm离心10min，弃上清，再加入200mL PBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)重悬，再次5000rpm离心10min，弃上清；再加入50mL的细菌裂解液重悬菌体，超生破碎，12000rpm离心10min，收集沉淀；用包涵体洗涤液重悬沉淀，12000rpm离心10min，弃上清，共洗3次；加入5mL的含8mol/L尿素的包涵体溶解液，室温溶解30min，12000rpm离心10min，取上清用0.45μm滤器过滤，用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，经SDS-PAGE检验，可见纯化效果良好(如图3所示)，该蛋白易于制备和纯化。

实施例2杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体的制备和鉴定

1.抗原免疫与融合

将制备好的复性纯化的Hexon蛋白按照50μg的量，与等量弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射免疫若干只BALB/c小鼠。首次免疫时佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂。免疫间隔为2周，3次免疫后以直接ELISA测定血清效价。筛选血清效价高、交叉反应较小的小鼠按常规方法细胞融合，筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.单克隆抗体的筛选

筛选抗原为灭活的禽源病毒如禽流感病毒、新城疫病毒、I群禽腺病毒4型、其它血清型的I群腺病毒及重组Hexon蛋白抗原，并用阴性血清作为参考对照，通过筛选排除对所用的交叉反应物质有反应的单抗细胞株，保留只与I群禽腺病毒4型及重组Hexon蛋白抗原反应的细胞株。经过筛选后获得了多株I群禽腺病毒4型特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，选取其中1株优选抗体于2018年07月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.16203。将细胞株扩大培养后以体内法诱生腹水，收集后经过饱和硫酸铵沉淀后，以Protein G柱纯化，测定蛋白浓度后冻存。

3.特异性单克隆抗体的亚类鉴定

本实施例利用ELISA对所制备的单克隆抗体5F1鉴定，结果为IgG1亚型，具体操作为：1)将制备的纯化单抗用PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000和1:40000稀释。2)取Hexon蛋白包被板(0.5μg/mL)，以洗涤液300μL/孔洗板1次，弃去洗涤液。加入相应已稀释好的单克隆抗体，每孔50μL，每个单抗作5个重复孔，振荡混匀1分钟。37℃孵育30分钟后，取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次后，甩干。3)将IgG1、IgG2b和IgG3用PBS溶液作1:1000稀释，将IgG2a和IgM用PBS溶液作1:5000稀释。每个单抗依次加入已稀释的IgG1、IgG2b、IgG3、IgG2a和IgM抗体，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，或37℃孵育2小时。4)将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体用PBS作1:5000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育30分钟后，按上一步中的方法洗涤3次，甩干。5)将底物溶液立即加入到ELISA反应板中，100μL/孔，室温避光显色10分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。6)反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。7)比较每个单抗加入IgG1、IgG2b、IgG3、IgG2a和IgM抗体孔的OD450nm值，OD450nm最高者对应的亚类为该单抗的亚类。

表1单克隆抗体5F1亚型鉴定结果

亚型抗体	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM
						OD450	1.806	0.123	0.112	0.103	0.089

4.单克隆抗体的效价测定

以间接ELISA测定单克隆抗体的效价，具体操作如下：1)将制备的纯化单抗用PBS溶液作1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:160000、1:320000和1:640000稀释。2)取Hexon蛋白包被板(0.5μg/mL)，以1×洗涤液300μL/孔洗板1次，弃去洗涤液。加入已稀释好的单克隆抗体，每孔100μL，振荡混匀5分钟。37℃孵育45分钟后，取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次后，甩干。3)将HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体用相应的稀释液作1:5000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育45分钟后，按上一步中的方法洗涤3次，甩干。4)将底物溶液立即加入到ELISA反应板中，100μL/孔，室温避光显色10分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。5)反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。检测结果表明禽腺病毒特异性单抗的ELISA效价达到1:320000。

实施例3阻断ELISA方法的建立

1.样品包被液、稀释液、洗涤液、终止液的配制

包被液为0.05M碳酸盐缓冲液，其配方为：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为9.6。

样品稀释液为含1％牛血清白蛋白的洗涤液。

洗涤液为含0.1％Tween-20的0.01M pH为7.4的磷酸盐缓冲液，其配方为：NaCl：8.5g，NaH₂PO₄·2H₂O：0.356g，Na₂HPO₄·12H₂O：2.772g，将其混合后，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，再向其中加入0.5mL Tween-20得到上述洗涤液。

终止液为含0.5M硫酸溶液：将21.8mL浓硫酸稀释定容至800mL得到上述0.5M硫酸溶液。

2.抗原(重组Hexon蛋白)的最适包被浓度和血清的最适稀释度的确定

采用正交试验来确定抗原最适包被浓度，血清最适稀释度和酶标抗体最佳工作浓度；将纯化的重组Hexon蛋白用包被液依次稀释为0.5μg/mL、1.0μg/mL和2μg/mL三个稀释度，以100μL/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，组成方阵，4℃包被过夜；弃去抗原液，用洗涤液充分洗涤3次，300μL/孔，3min/次，用1％牛血清白蛋白封闭，200μL/孔，37℃作用1h；弃去封闭液，用上述方法进行洗涤；将FAdV-4阴、阳性血清一次做1:5、1:10、1:20、1:40倍稀释后，以100μL/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，37℃作用1h；弃血清，用上述方法洗涤，加入1:4000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的禽腺病毒4型单克隆抗体，以100μL/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，于37℃作用1h；弃去辣根过氧化物酶标记的禽腺病毒4型单克隆抗体，用上述方法洗涤，加入底物显色液，100μL/孔，37℃避光显色10min，最终加入终止液终止反应；用酶标仪在450nm波长下测定OD值；比较阴、阳性血清的OD450值，即选择阴性样品OD450值(N值)约为1.5，阳性样品OD450值(P值)约为0.15，并且P/N值最小时为最佳抗原包被浓度及血清。

正交试验结果显示当抗原的稀释度为1μg/mL每孔，血清以1:10倍稀释，酶标单克隆抗体以1:4000倍稀释时，阳性样品OD450值(P值)约为0.15，阴性样品OD450值(N值)在1.5左右，并且P/N值为0.1最小，因此确定重组Hexon蛋白的最佳包被浓度为1.0μg/mL，血清最佳稀释度为1:10，酶标单克隆抗体最佳稀释度为1:4000，阻断ELISA正交试验结果如表2所示。

表2阻断ELISA的正交试验结果

3.作用时间的优化

以抗原、血清和酶标单抗最佳作用浓度为基础，优化抗原的最佳封闭时间(37℃，1h、1.5h和2h)、血清反应时间(37℃，0.5h、1h、1.5h)、酶标单抗最佳孵育时间(37℃，0.5h、1h、1.5h)以及最佳显色时间(37℃，10min、20min、30min)等条件，取阳性样品OD450值(P值)约为0.15，阴性样品OD450值(N值)在1.5左右，并且P/N值最小时，为最佳的作用时间，最终确定抗原的最佳封闭时间为1h，血清反应时间为1h，酶标单抗最佳孵育时间为1h，最佳显色时间为10min。

4.阴、阳性标准临界值的确定

取50份FAdV-4抗体为阴性的血清样品，按照确定的条件进行阻断ELISA，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，计算OD450的平均值及标准方差(s)，为消除每次阻断ELISA检测时，试验环境及操作的影响，每次检测时加入标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，阴性血清OD450约等于1.5，否则结果无效；经计算，50份阴性血清阻断率的平均值为0.180，标准差SD为0.072，因此阻断ELISA阴阳性阻断率的临界值(平均值+3SD)为0.396，为计算方便定为0.4.因此，当样品阻断率≥0.4时，判定FAdV-4抗体水平为阳性，当样品阻断率＜0.4时，判定FAdV-4抗体阴性。

表3 50份阴性样品的阻断率

5.阻断ELISA操作程序的确定(试剂盒的检测方法的确定)

按照以上各项所确定的最佳操作条件，确定阻断ELISA操作程序为：取出已包被并封闭好的ELISA板条，用血清稀释液将待检血清做1：10倍稀释，加入酶标板各孔，每孔100μL，各加一孔，FAdV-4阴性、阳性血清各加两孔，37℃作用1h；弃去孔内液体，每孔用300μL洗涤液洗涤3次，每次3min，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μL酶标单克隆抗体，37℃作用1h；弃去孔内液体，每孔用300μL洗涤液洗涤3次，每次3min，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μL TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物显色液后，室温避光显色10min，加入100μL终止液；用酶标仪在450nm波长读取各孔OD值，判定结果。

实施例4 ELISA试剂盒的特异性试验

按已建立的阻断ELISA操作方法，分别检测已知的I群禽腺病毒4型、鸡新城疫、禽流感、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌阳性血清样品；用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，确定该阻断ELISA检测方法的特异性；

检测结果表明，只有FAdV-4阳性血清的阻断率>40％，其他各份血清阻断率在3.94％～10.96％之间，远小于40％(表4)，说明该阻断ELISA检测结果特异性良好。

表4阻断ELISA试剂盒的特异性

实施例5 ELISA试剂盒同批内的重复试验

使用同批诱导纯化制备的FAdV-4 Hexon重组蛋白，按照最佳包被浓度包被酶标板，用已建立的阻断ELISA操作方法，检测FAdV-4抗体水平不同的阳性血清和FAdV-4阴性血清各3份，在不同时间分别检测该6份随机选择的血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值；根据每孔的OD450值，计算各份血清的平均值标准差S，变异系数CV；检测结果显示，6份血清OD450值的变异系数在1.1％-3.3％之间(表5)，说明同批试剂盒检测结果重复性良好。

表5阻断ELISA试剂盒的批内重复性

实施例6 ELISA试剂盒批间重复性试验

使用不同批次纯化的FAdV-4 Hexon重组蛋白，按照最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的阻断ELISA操作方法，检测同1份FAdV-4阳性血清和同1份FAdV-4阴性血清，每孔设置4个重复，用酶标仪在450nm波长下测定OD值；根据每孔的OD450值，计算各份血清的平均值标准差S，变异系数CV；检测结果显示，2份血清的变异系数在7.9％-8.5％之间(表6)，说明试剂盒批间重复性良好。

表6阻断ELISA试剂盒的批间重复性

本发明的阻断ELISA试剂盒，使用辣根过氧化物酶标记的禽腺病毒4型单克隆抗体作为阻断抗体，由于单克隆抗体具有非常良好的特异性，该试剂盒比以Hexon蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法具有更好的特异性。

本发明的试剂盒用于检测Ⅰ群禽腺病毒的抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，适合于在临床应用中进行推广，为Ⅰ群禽腺病毒的快速检测提供可靠的技术手段。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 1

<120> 一种用于检测I群禽腺病毒4型抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用

<130> 2018.06.14

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggtccagcg gcgctggatc catggcagag gaggaggcgg 40

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgctccactg cctcctgcag cttacacggc gttgcctgtg g 41

<210> 3

<211> 2813

<212> DNA

<213> 禽腺病毒

<400> 3

atggcggccc tcacgcccga cctgactacc gcgactccgc ggctccagta ttttcacatc 60

gcgggccccg ggacgcgcga atacctctct gaggacctcc aacagttcat ttccgccacc 120

ggaagctact ttgacttgaa aaacaagttc agacagacgg tcgtggcgcc cacccgaaat 180

gtcacgacag aaaaggctca acggctgcaa atccgctttt accccatcca aaccgacgac 240

acgtcgacgg gctaccgcgt gcggtacaac atcaatgtgg gcgacggttg ggtcctggac 300

atggggtcga cctatttcga catcaaggga atcctagacc gagggccgtc cttcaagccc 360

tactgcggca cggcttacaa cccgctggct cccaaggagt ccatgtttaa caactggtcg 420

gagacggcac ccgggcagaa cgtgtccgcc tccggtcagc tgtccaacgt ctataccaac 480

acgagcacct ccaaagacac gacggcggcg caggtgacga agatttccgg cgtcttcccc 540

aatcccaacc agggacccgg aagaaatcct ctgcgacggg tacaaaacgc caacaccggc 600

gtgctcggtc gcttcgccaa gtctcagtac aattacgctt acggtgccta cgtcaagccc 660

gtcgccgccg acggttccca gtccctcacg cagaccccct actggatcat ggataacacg 720

ggcaccaatt acctgggagc ggtggccgtc gaggactaca ccaacagcct ctcgtaccca 780

gataccatag tcgtgccgcc tcccgaggac tacgacgatt ataacatagg caccacgcgt 840

gcgctcaggc ccaactacat cgggttcagg gataacttca ttaacctgct gtatcacgac 900

tccggcgtgt gctcgggcac cctcaactcg gagcgttcgg gcatgaacgt ggtggtcgag 960

ctgcccgacc ggaataccga gctcagctac cagtacatgc tggccgacat gatgtcccgc 1020

catcactatt tcgccctgtg gaaccaggcc gtggaccagt acgaccccga ggtgcgagtc 1080

ttctccaatg acggttacga agaaggcgcg cccagctacg ccttcaaccc cgaagcggta 1140

ggcgcgggag aaggctacgg ccccgatctc agtcaaatta aactctacac caacaacacc 1200

gccgcgaacg acaaaaacac cgccgtggct aacgccacta ccaacttcta cttcggcacg 1260

gtaccctcct acgaaatcga tatcagcgct acccagaggc gcaactttat catggccaac 1320

atcgccgagt atctgcccga ccgttacaag tttagcatct ccggcttcga cgccaccagc 1380

gtcgcgccta ccacctacga gtacatgaac aagcgcgtcc ccctcaccaa cgtcgtcgac 1440

atgttcacga acgtgggtgc gcgttggtcc atcgaccaga tggacaacgt caaccccttc 1500

aaccaccaca gaaactgggg gctgaaatac cgctcccagc tgctgggaaa cagtcgctac 1560

gtcaacttcc acatccaagt gccccaaaaa ttcttcgcca tcaaaaacct gctgctgctc 1620

tccggctcgt acacctacga gtgggtgctg cgcaaagacc ccaacatgat cctccaatcc 1680

agtctgggca acgacctgcg cgccgacggc gccagcatca tctacaacga ggtgaacctc 1740

atggccaact tcatgcccat ggatcacaac accagtaacc agctcgagct gatgctgaga 1800

aacgccacca acgatcagac cttcgtggac tacctgggag ccaaaaacgc tctatactcg 1860

gtgcccgcgg gctccaccgc cctcaccatc aacattcccg ctcgcacctg ggaggggatg 1920

cgcgggtggt ccttcactcg catcaaggcg gccgagacgc ctcagctggg cgcccagtac 1980

gacgtcaact tcaagtactc gggcagcatc gcctactcag atggaggctt ctacctctcg 2040

cacaccttcc gtaacatgag catcctcttc gacacgtcca tcaactggcc gggcaacgac 2100

cggttgctca cgcctaacat gttcgagatc aagcgctcgg tggcgctcga caccgagggc 2160

ttcaccatga gccagtgcga catcaccaag gactggtacc tgatccagat ggccacgaac 2220

tacaacttcg tctataacgg ctatcgattc tggcccgatc gtcagtactt ccactacgac 2280

ttcctgcgaa atttcgaccc catgacgcgc cagggaccca acttcgcatt gcccggcctc 2340

ttcgacctcg tgtcttacac ccctaccacg gacaacagcg gacagcagcc tagtcaggaa 2400

gccgtgcgca acaactctgg gtttatcgcc ccccgctcct ggcccgtctg gagcgctcac 2460

cagggcgaga gctggcccgc caactggccg tacccgctct gcggtcagca ggccatccaa 2520

cccgcacagg tcctcagcta caagaagttc ctctgcgaca actacctgtg gaccatcccg 2580

ttcagttccg actttatgta catgggcgaa ctgacagatc tgggccagaa ccccatgtac 2640

accaacaact cgcacagcat ggtcatcaac ttcgagctcg accccatgga tgatcccact 2700

tacgtgtaca tgctctatgg cgtgttcgac accgttaggg tcaaccagcc cgaacgtaac 2760

gtgctagcta tggcttactt ccgtacgcct ttcgccacag gcaacgccgt gta 2813

Claims (7)

1.一株分泌特异性结合I群禽腺病毒4型六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.16203。

2.一种特异性结合I群禽腺病毒4型六邻体蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备I群禽腺病毒4型检测试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为阻断ELISA试剂盒。

5.一种检测I群禽腺病毒4型抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被酶标版，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，所述包被酶标板以I群禽腺病毒4型的六邻体蛋白作为包被抗原，所述单克隆抗体是针对所述六邻体蛋白而制备的抗体；所述单克隆抗体为权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生；

六邻体蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求5所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自血清稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的浓度为1.0μg/mL。

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