CN107880119A - 一种i群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法 - Google Patents

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CN107880119A CN201711339038.1A CN201711339038A CN107880119A CN 107880119 A CN107880119 A CN 107880119A CN 201711339038 A CN201711339038 A CN 201711339038A CN 107880119 A CN107880119 A CN 107880119A
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刘冠星
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Abstract

本发明提供了一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，该技术方案一方面利用I群4型腺病毒灭活疫苗制备卵黄抗体，另一方面构建了I群4型腺病毒hexon蛋白抗原表达载体，并利用原核表达系统制备抗原蛋白；在此基础上，本发明考察了抗原抗体效价配比对抗原抗体混合液免疫保护效果的影响，基于此确定了最优的复配方式，并设计了冻干剂型。本发明在原有腺病毒卵黄抗体的基础上，加入腺病毒hexon蛋白抗原，制成复合物。这种腺病毒抗原抗体复合物可以抵抗病原微生物引起的持续性感染，避免抗生素的过量使用，由于使用的抗原不是完整的病毒抗原，而是腺病毒的hexon蛋白制成的抗原，可以减少全毒向外散毒的危险，更加安全有效。

Description

一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法。
背景技术
鸡心包积液和肝炎综合征是由禽I群4型腺病毒引起鸡的一种急性传染病，该病多发于3～6周龄的肉鸡，也可偶发于20周龄内的后备蛋鸡或种鸡，无性别差异，在更大龄的肉鸡也很少发生。各种品系肉鸡对本病都易感，其他禽类如火鸡、鹅、雉鸡等也有发病的报道。临床上以突发性死亡率增加，心包积液和肝炎综合征为主要特征。本病的感染途径主要是呼吸道、消化道及眼结膜等，可经机械方式和被带毒粪便污染的器具而在鸡群间、鸡场间迅速传播。国内曾经在非SPF鸡胚传代的疫苗生产用毒种中检测到禽腺病毒的污染，如果污染的疫苗曾经推广使用，可能会引起此病的广泛传播。越来越多的研究表明，心包积液和肝炎综合征的发生与某些免疫抑制病有关，常与引起禽类呼吸道疾病的病原微生物混合感染，随着家禽养殖规模的逐渐扩大，该病的危害也更加严重，对该病的防控现已成为国际禽病研究的热点。
由于目前市场上没有商品化疫苗，腺病毒潜伏期较短仅为24～48小时，而疫苗免疫存在免疫空白期，在鸡群发病后再使用自家苗进行免疫保护效果较差，卵黄抗体不散毒，起效快，使用方便，是控制腺病毒的首选，但是卵黄抗体被动免疫期较短，难以满足免疫保护的需求。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，以解决现有技术缺乏针对禽I群4型腺病毒的有效免疫保护手段的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中常规卵黄抗体免疫保护时间较短。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：
1)用I群4型腺病毒灭活疫苗免疫产蛋母鸡，免疫三次，免疫间隔3周；三免后2周取AGP效价≥1:64的高免蛋提取卵黄抗体；
2)利用序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的引物，以及腺病毒基因组DNA为模板执行PCR扩增，将扩增产物链接至pMD-18T载体，得到重组载体pMD-18T-FAV，用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对重组载体pMD-18T-FAV和表达载体pET-30a进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pET-30a，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-30a-FAV；
3)将pET-30a-FAV质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用原核表达系统表达包涵体蛋白，用Ni螯合树脂柱对蛋白及进行纯化后对包涵体蛋白及进行复性，获得I群4型腺病毒hexon抗原；
4)取步骤1)所得的卵黄抗体，配制抗体琼扩效价为1:16的溶液；取步骤3)所得的I群4型腺病毒hexon抗原，配制抗原琼扩效价为1:16的溶液；将二者等体积混合，得到抗原抗体混合液；
5)取步骤4)所得的抗原抗体混合液，向其中加入2％海藻糖和1％甘露醇冻干保护剂，冻干得到产物。
作为优选，步骤1)中所述提取卵黄抗体，包括以下步骤：取卵黄液经60目尼龙筛过滤后，用胶体磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黄液体积的50℃～56℃，PH4.8～5.2的醋酸缓冲液稀释，搅拌30分钟，再缓慢加入总体积4％的正辛酸搅拌90分钟，用丙纶750B滤布过滤过夜，即得到澄清的抗体溶液。
作为优选，所述卵黄液是通过以下方法制备的：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄。
作为优选，步骤3)所述用原核表达系统表达包涵体，包括以下步骤：挑取单菌落，接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，后转接到4L相同培养基中，37℃振荡培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养4h，然后SDS-PAGE电泳分析；挑取工程菌单菌落于200ml含氨苄青霉素浓度0.1g/L的LB液体培养基，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1:20的比例倒入总计4L含氨苄青霉素浓度0.1g/L的LB液体培养基，37℃恒温振荡培养3h；然后加入IPTG使其终浓度为5mM，37℃恒温振荡培养4h；将培养物用大型低温冷冻离心机离心，8000rpm，20min；取沉淀，加入结合缓冲液100ml悬浮菌体，然后进行750W超声波破碎；然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀即为沉淀；将5g包涵体中加入120ml的2％(W/V)TritonX-100，用搅拌器搅拌30min，超声破碎40次，搅拌器继续搅拌30min，然后低温冷冻离心8000rpm，30min；再分别用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入100ml由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，用磁力搅拌器搅拌40min，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清。
作为优选，所述超声波破碎的工作时间10s，间隔时间20s，破碎120次。
作为优选，取由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，平衡Ni敖合树脂柱，取所述上清液过该树脂柱；取由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，先利用10倍柱床体积的该溶液冲洗层析柱；取由洗涤缓冲溶液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，利用2倍柱床体积的该溶液洗涤层析柱；取由洗脱缓冲溶液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，利用30mL该溶液洗脱目的蛋白，收集流出液。
作为优选，所述洗涤缓冲溶液包括以下成分：20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，100mmol/L咪唑。
作为优选，所述洗脱缓冲溶液包括以下成分：20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，300mmol/L咪唑。
作为优选，所述结合缓冲液包括以下成分：20mmol/LTris-HCl，pH 8.0，0.5mol/LNaCl，5mmol/L咪唑。
作为优选，抗原琼扩效价是通过以下方法检测的：将hexon蛋白抗原倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入I群4型腺病毒标准阳性血清，加样量以加满不溢出为度。将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为hexon蛋白的抗原效价；
作为优选，抗体琼扩效价是通过以下方法检测的：将卵黄抗体倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入I群4型腺病毒标准琼扩抗原，加样量以加满不溢出为度。将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为I群4型腺病毒卵黄抗体的效价。
本发明提供了一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，该技术方案将卵黄抗体与疫苗联合使用制成长效卵黄抗体，既填补了疫苗免疫空白期同时又延长了保护时间。具体来看，本发明一方面利用I群4型腺病毒灭活疫苗制备卵黄抗体，另一方面构建了I群4型腺病毒hexon蛋白抗原表达载体，并利用原核表达系统制备抗原蛋白；在此基础上，本发明考察了抗原抗体效价配比对抗原抗体混合液免疫保护效果的影响，基于此确定了最优的复配方式，并设计了冻干剂型。
本发明在原有腺病毒卵黄抗体的基础上，加入腺病毒hexon蛋白抗原，制成复合物。这种腺病毒抗原抗体复合物可以抵抗病原微生物引起的持续性感染，避免抗生素的过量使用，由于使用的抗原不是完整的病毒抗原，而是腺病毒的hexon蛋白制成的抗原，可以减少全毒向外散毒的危险，更加安全有效，还可以解决现有技术中针对腺病毒的人工免疫方法效果不佳的技术问题。
六邻体(hexon)是I群禽腺病毒的主要结构蛋白，在病毒粒子二十面体结构中含量最高，含有240个壳粒，而I群禽腺病毒毒粒共252个壳粒，hexon占了90％以上。六邻体具有型、群和亚群特异抗原决定簇，可以引发极强的中和反应，当六邻体被替代或发生突变将导致中和免疫的缺失。利用I群4型腺病毒的hexon基因构建基因疫苗免疫雏鸡，可以诱导机体产生良好的细胞免疫应答，hexon基因具有较高的遗传稳定性，不同地区分离的I群4型腺病毒hexon基因也具有较高相似性，这也为基因工程苗的研制提供了可行性。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中免疫不同疫苗后抗体琼扩效价趋势图；
图2是本发明具体实施方式中攻毒保护实验1数据统计图；
图3是本发明具体实施方式中攻毒保护实验2数据统计图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1(I群4型腺病毒卵黄抗体IgY制备)
高免蛋的制备：利用I群4型腺病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，免疫剂量为2ml/只，免疫间隔为21天，三次免疫后收集鸡蛋进行卵黄抗体效价检测，琼扩效价高于1:64可进行鸡蛋收集。
卵黄抗体IgY的提取制备：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄；用胶体磨乳化后，1:2.5加入醋酸盐缓冲液(pH5.2)，搅拌30min，用板框过滤器过滤；过滤清液加入4％的辛酸，剧烈搅拌60min，用丙纶750B滤布过滤；过滤清液用0.22μm微孔过滤除菌即得。
实施例2(I群4型腺病毒hexon蛋白抗原制备)
利用GenBank中I群4型腺病毒的hexon基因共保守片段，使用软件Primer5.0设计上下游引物(上游引物F：5’-GCGAATTCATGGCGGCCCTCACGCC-3’；下游引物R：5’-GCCTCGAGTTACACGGCGTTGCCT-3’)；以I群4型腺病毒为模板，按照94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-FAV；利用双脱氧链终止法进行序列测定，将pMD-18T-FAV与pET-30a用EcoRI和XhoI双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pET-30a，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-30a-FAV。将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)，挑取单菌落，接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，后转接到4L相同培养基中，37℃振荡培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养4h，然后SDS-PAGE电泳分析。挑取工程菌单菌落于200mlLB液体培养基(含氨苄青霉素浓度0.1g/L)，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1∶20的比例倒入总计4L的LB液体培养基(氨苄青霉素浓度0.1g/L)，37℃恒温振荡培养3h；然后加入IPTG使其终浓度为5mM，37℃恒温振荡培养4h。将培养物用大型低温冷冻离心机离心，8000rpm，20min；弃上清，加入结合缓冲液100ml(20mmol/LTris.HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑)悬浮菌体，然后进行750W超声波破碎(工作时间10s，间隔时间20s，破碎120次)。然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀(包涵体)。将5g包涵体中加入120ml的2％(W/V)TritonX-100，用搅拌器搅拌30min，超声破碎40次，搅拌器继续搅拌30min，然后低温冷冻离心8000rpm，30min。再分别用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入100ml浓度为8mol/L的尿素(结合缓冲溶液配制)，用磁力搅拌器搅拌40min，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清。将尿素溶解包含体的上清上8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)平衡的Ni敖合树脂柱(2×10cm)，先用10倍柱床体积的8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)冲洗层析柱，再用2倍柱床体积的洗涤缓冲溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，100mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用30mL洗脱缓冲溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，300mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白，收集流出液。
实施例3(I群4型腺病毒hexon蛋白抗原及I群4型腺病毒卵黄抗体的效价测定)
利用琼脂扩散试验对I群4型腺病毒hexon蛋白抗原及I群4型腺病毒卵黄抗体进行效价测定。具体操作如下：制备含有8％NaCl及1％琼脂糖的琼脂平板；使用梅花孔在琼脂平板上打孔；
检测hexon蛋白抗原效价：将hexon蛋白抗原倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入I群4型腺病毒标准阳性血清，加样量以加满不溢出为度。将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为hexon蛋白的抗原效价。
检测卵黄抗体效价：将卵黄抗体倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入I群4型腺病毒标准琼扩抗原，加样量以加满不溢出为度。将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为I群4型腺病毒卵黄抗体的效价。
实施例4(制备I群4型腺病毒卵黄抗体与I群4型腺病毒hexon蛋白抗原结合比例不同的三种抗原抗体复合物)
配制I群4型腺病毒hexon蛋白抗原效价为1:4；1:32；1:16三种浓度。
配制I群4型腺病毒卵黄抗体效价为1:32；1:4；1:16三种浓度。
将上述(1)(2)两种物质按所给出顺序等体积混合。
混合产物做无菌处理后可得复合物一、复合物二、复合物三。
实施例5(制备冻干剂型抗原抗体复合物)
将处方量的抗原抗体复合物加入2％海藻糖和1％甘露醇冻干保护剂，利用冻干设备冻干制成长效卵黄抗体。
实施例6(对鸡进行免疫试验)
取21日龄SPF鸡60羽，随机分为6组，适应饲养一天后进行如下操作：
第一组：设为空白对照组，每羽肌注0.2ml生理盐水；
第二组：设为复合物一组，每羽肌注0.2ml复合物一；
第三组：设为复合物二组，每羽肌注0.2ml复合物二；
第四组：设为复合物三组，每羽肌注0.2ml复合物三；
第五组：设为常规I群4型腺病毒疫苗组，每羽肌注处方剂量的常规I群4型腺病毒灭活疫苗；
第六组：设为hexon蛋白疫苗组，每羽肌注0.2ml琼扩效价为AGP＝1:16的hexon蛋白疫苗。
上述免疫之后14天进行一次加强免疫，每隔一周进行鸡只采血，检测血清中抗体水平(见图1)，注射抗原抗体复合物的鸡只，产生免疫应答的时间都要短于常规疫苗和hexon疫苗组，抗原抗体复合物一的是各组中血清抗体效价上升最快的，但是最终抗体效价不高；抗原抗体复合物一和复合物二与常规疫苗组在抗体效价达到稳定时，效价水平差异不大，但是复合物三在免疫初期抗体上升较快。
实施例7(攻毒试验1)
取20日龄SPF鸡60羽，随机分为3组，适应饲养一日后，分别进行如下操作：
第一组：设为空白对照组，每羽肌注1ml(含100LD50)I群4型腺病毒强毒24小时后注射1ml生理盐水；
第二组：设为常规疫苗组，每羽肌注1ml(含100LD50)I群4型腺病毒强毒24小时后肌注处方量的常规I群腺病毒灭活疫苗；
第三组：设为抗原抗体复合物组，每羽肌注1ml(含100LD50)I群4型腺病毒强毒24小时后肌注1ml抗原抗体复合物三。
结果表明：空白对照组鸡只死亡率为100％，抗原抗体复合物组死亡率最低，保护率可达到95％。(见图2)
实施例8(攻毒试验2)
取13日龄SPF鸡60羽，随机分为3组，适应饲养一日后，分别进行如下操作：
第一组：设为空白对照组，每羽肌注1ml生理盐水；
第二组：设为卵黄抗体组，每羽肌注AGP效价为1:16的I群4型腺病毒卵黄抗体1ml；
第三组：设为抗原抗体复合物组，每羽肌注1ml抗原抗体复合物三。
各组免疫14天后，肌肉注射接种I群4型腺病毒强毒1ml(含100LD50)统计各组中SPF鸡发病率、死亡率及保护率。结果表明：空白对照组鸡只死亡率为100％，抗原抗体复合物组死亡率最低，保护率100％。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司
<120> 一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2

Claims (10)

1.一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)用I群4型腺病毒灭活疫苗免疫产蛋母鸡，免疫三次，免疫间隔3周；三免后2周取AGP效价≥1:64的高免蛋提取卵黄抗体；
2)利用序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的引物，以及腺病毒基因组DNA为模板执行PCR扩增，将扩增产物链接至pMD-18T载体，得到重组载体pMD-18T-FAV，用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对重组载体pMD-18T-FAV和表达载体pET-30a进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pET-30a，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-30a-FAV；
3)将pET-30a-FAV质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用原核表达系统表达包涵体蛋白，用Ni螯合树脂柱对蛋白及进行纯化后对包涵体蛋白及进行复性，获得I群4型腺病毒hexon抗原；
4)取步骤1)所得的卵黄抗体，配制抗体琼扩效价为1:16的溶液；取步骤3)所得的I群4型腺病毒hexon抗原，配制抗原琼扩效价为1:16的溶液；将二者等体积混合，得到抗原抗体混合液；
5)取步骤4)所得的抗原抗体混合液，向其中加入2％海藻糖和1％甘露醇冻干保护剂，冻干得到产物。
2.根据权利要求1所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中所述提取卵黄抗体，包括以下步骤：取卵黄液经60目尼龙筛过滤后，用胶体磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黄液体积的50℃～56℃，PH4.8～5.2的醋酸缓冲液稀释，搅拌30分钟，再缓慢加入总体积4％的正辛酸搅拌90分钟，用丙纶750B滤布过滤过夜，即得到澄清的抗体溶液。
3.根据权利要求2所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于所述卵黄液是通过以下方法制备的：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄。
4.根据权利要求1所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤3)所述用原核表达系统表达包涵体，包括以下步骤：挑取单菌落，接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，后转接到4L相同培养基中，37℃振荡培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养4h，然后SDS-PAGE电泳分析；挑取工程菌单菌落于200ml含氨苄青霉素浓度0.1g/L的LB液体培养基，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1:20的比例倒入总计4L含氨苄青霉素浓度0.1g/L的LB液体培养基，37℃恒温振荡培养3h；然后加入IPTG使其终浓度为5mM，37℃恒温振荡培养4h；将培养物用大型低温冷冻离心机离心，8000rpm，20min；取沉淀，加入结合缓冲液100ml悬浮菌体，然后进行750W超声波破碎；然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀即为沉淀；将5g包涵体中加入120ml的2％(W/V)TritonX-100，用搅拌器搅拌30min，超声破碎40次，搅拌器继续搅拌30min，然后低温冷冻离心8000rpm，30min；再分别用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入100ml由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，用磁力搅拌器搅拌40min，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清。
5.根据权利要求4所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于所述超声波破碎的工作时间10s，间隔时间20s，破碎120次。
6.根据权利要求4所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于取由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，平衡Ni敖合树脂柱，取所述上清液过该树脂柱；取由结合缓冲液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，先利用10倍柱床体积的该溶液冲洗层析柱；取由洗涤缓冲溶液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，利用2倍柱床体积的该溶液洗涤层析柱；取由洗脱缓冲溶液配制的、浓度为8mol/L的尿素溶液，利用30mL该溶液洗脱目的蛋白，收集流出液。
7.根据权利要求6所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于所述洗涤缓冲溶液包括以下成分：20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，100mmol/L咪唑。
8.根据权利要求6所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于所述洗脱缓冲溶液包括以下成分：20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，300mmol/L咪唑。
9.根据权利要求1～8任一项所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于所述结合缓冲液包括以下成分：20mmol/LTris-HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑。
10.根据权利要求1所述的一种I群4型腺病毒长效卵黄抗体制备方法，其特征在于，抗原琼扩效价是通过以下方法检测的：将hexon蛋白抗原倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入I群4型腺病毒标准阳性血清，加样量以加满不溢出为度；将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为hexon蛋白的抗原效价；
抗体琼扩效价是通过以下方法检测的：将卵黄抗体倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入I群4型腺病毒标准琼扩抗原，加样量以加满不溢出为度；将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为I群4型腺病毒卵黄抗体的效价。
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