CN108558989B

CN108558989B - 一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

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Publication number: CN108558989B
Application number: CN201810342342.XA
Authority: CN
Inventors: 叶正琴; 范娟; 钱钟; 丁国伟; 潘杰; 李玉和; 宋庆庆; 杨振; 董昌海; 李玉安
Original assignee: YANGZHOU UNI BIO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: YANGZHOU UNI BIO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN108558989A

Abstract

本发明公开了一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。本发明克隆、扩增FAdV 4C Hexon基因的C‑端和N‑端结构域基因；利用昆虫细胞‑杆状病毒双向表达系统构建能够共表达两种抗原蛋白的重组杆状病毒rBac‑HEXON‑P10‑C‑PH‑N，该重组病毒在昆虫细胞HF中高效表达FAdV 4C Hexon‑C与Hexon‑N抗原蛋白；经过提取纯化、BEI灭活后加入佐剂乳化制成疫苗。所述制备方法简单，能同时大量制备FAdV 4C Hexon‑C与Hexon‑N两种蛋白，耗时短，表达量高，大大节约了生产成本，适合大规模生产。所得重组亚单位疫苗，免疫效果良好，免疫剂量小并能有效预防禽腺病毒的感染。

Description

一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)可分为3个群，Ⅰ群比较著名的病毒株包括鸡胚致死孤儿病毒、鹌鹑支气管炎病毒和鸡包涵体肝炎病毒，Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒、大理石脾病毒和鸡大脾病毒，Ⅲ群禽腺病毒只包括减蛋综合征病毒。Ⅰ群腺病毒可分为12个血清型，从高发病地区血清分析看，主要为C(血清4型)和E(血清8型)，安卡拉病(心包积水-肝炎综合征)就是由血清4型引起的，该病多发于肉鸡，近期也开始感染麻鸡以及产蛋鸡的育成鸡，并且育成鸡发病死亡率非常高。

I群禽腺病毒对外界环境具有很强的抵抗力，不仅能通过种蛋垂直传播给子代，还能通过污染的粪便、水槽以及种蛋进行水平传播，这就在临床上增加了其防控难度。虽然国内外有相关疫苗研制的很多报道，如灭活疫苗、减毒活疫苗及新兴起的基因工程疫苗，均能提供不同程度的免疫保护，但是目前仍然没有达到非常理想的治疗效果，而不同的血清型之间的同源性的差异，更增加了疫苗研制的难度。然而疫苗接种仍然是预防、控制甚至消灭禽腺病毒的主要措施之一。

目前对禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白(Hexon)的功能已进行了很多研究，该蛋白带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，能引起极强的中和反应，当其被替代或突变将会导致中和免疫的缺失。该蛋白拥有两个主要功能区，保守基部区P1和P2，以及可变结构环L1-L4。Hexon蛋白前段氨基酸(N端)为可变结构环L1和基部区P1，其中几个比较大的抗原表位区都位于前段和中段，但疏水性氨基酸残基较多且暴露性差，它们整体分布在病毒颗粒的表面，是病毒引起宿主免疫应答的重要保护性抗原决定簇，是Hexon的结构域。

重组亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。因此，研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的禽腺病毒重组亚单位疫苗的生产方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种包含FAdV 4C Hexon蛋白的C-端和N-端两种抗原蛋白的重组亚单位疫苗。所提供的疫苗具有高效、安全性好、抗体整齐度高、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种抗原蛋白，包括Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV 4C Hexon蛋白的C-端和N-端的结构域。

所述C-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述N-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供制备所述C-端和N-端的结构域的方法，包括下述步骤：

(1)扩增编码C端、N端结构域的基因：在C-端引物两端分别添加Xho I和Sph I酶切位点，而N-端引物两端分别添加BamH I和HindⅢ酶切位点，分别可扩增出C-端结构域序列(SEQ ID NO.2)，以及N-端结构域序列(SEQ ID NO.4)；

(2)构建中转质粒：将pFastBac Dual和C-端结构域基因片段用Xho I和Sph I酶切后分别回收、纯化，连接过夜；将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBac Dual-HEXON-P10-C；

(3)目的基因与重组中转质粒连接：将上述构建完成的pFastBac Dual-HEXON-P10-C和Hexon基因的N-端结构域基因片段用BamH I和HindⅢ酶切后分别回收、纯化，连接过夜；

(4)连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBac Dual-HEXON-P10-C-PH-N；

(5)构建重组杆状病毒：将质粒pFastBac Dual-HEXON-P10-C-PH-N转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，筛选得到重组杆粒，命名为rBacmid-HEXON-P10-C-PH-N；

(6)重组杆粒转染sf9细胞：将提纯的重组杆粒用脂质体转染的方法将重组杆粒转染sf9细胞，获得F1代重组杆状病毒rBac-HEXON-P10-C-PH-N；

(7)重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒以MOI＝1～10的接毒量接种HF细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白。

所述重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的进一步纯化方法：利用镍柱(HisTrapHP，5mL)对重组蛋白进行纯化，并对纯化后的重组蛋白进行透析处理，去除纯化样品中的咪唑和氯化钠。

本发明还提供用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，包括Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV 4C Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白和疫苗佐剂。

所述疫苗中抗原区蛋白的含量在75～100μg/mL之间。

所述疫苗中的佐剂：道达尔170白油佐剂，能使疫苗中的抗原物质缓慢释放，从而延长疫苗的作用时间。

本发明将表达的禽腺病毒Hexon蛋白的C端和N端结构域蛋白的重组杆状病毒rBac-Hexon-P10-C-PH-N，接入昆虫细胞高效的表达Hexon蛋白的C端和N端结构域蛋白，经过离心去除细胞碎片，加入BEI灭活后，加入油佐剂混合乳化制成疫苗。

本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点且具有良好的免疫保护作用。

附图说明

图1是Hexon蛋白的C-端结构域基因序列的PCR扩增；M：DL5000DNA Marker；1：Hexon-C PCR产物。

图2是Hexon蛋白的N-端结构域基因序列的PCR扩增；M：DL5000DNA Marker；1～3:7Hexon-N PCR产物。

图3是转移载体构建PCR鉴定；M：DL5000DNA Marker；1～11:11个不同菌落C端鉴定PCR，12-22：11个不同菌落N端鉴定PCR。

图4是重组杆粒PCR鉴定；M：DL5000DNA Marker；1:转座鉴定。

图5是SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物；M：预染蛋白质Marker；1：sf9细胞；2：感染空杆状病毒的Sf9细胞；3：F3代重组杆状病毒。

图6是Western Blot鉴定重组杆状病毒表达产物；M：预染蛋白质Marker；1：sf9细胞；2：感染空杆状病毒的Sf9细胞；3：F3代重组杆状病毒。

具体实施方式

实施例1：重组杆状病毒的构建

1、禽腺病毒基因组提取：用传统方法提取Ⅰ群4型禽腺病毒SD株总DNA；

2、引物设计与合成：以自行分离的Ⅰ群4型禽腺病毒SD株基因组为模板分析FAVⅠhexon基因编码的蛋白抗原性、亲水性和表面展示概率，选取N端494个氨基酸以及C端239个氨基酸两个结构域，进行杆状病毒真核表达。根据GenBank已发表的禽腺病毒Hexon基因的C-端和N-端结构域基因序列分别设计一对特异性引物，并在C-端引物两端分别添加Xho I和Sph I酶切位点，而N-端两端分别添加BamH I和HindⅢ酶切位点，分别可扩增出C-端序列717bp的目的片段(SEQ ID NO.2)，以及N-端序列1485bp的目的片段(SEQ ID NO.4)。引物序列分别为：

P1:CGCCTCGAGAACGCCACCAACGATC

P2:CCCGCATGCTTAGATGGCCTGCTGACCG

P3:CGCGGAATGTCCTTCAGACAGACGGTCG

P4:CCCAAGCTTTTATTAGCCGGAGAGCAGCAGC

3、Hexon基因的C-端和N-端结构域基因片段扩增与回收

(1)PCR扩增：以提取的DNA为模板，步骤2中的引物做PCR。PCR反应体系为(总体积25μL)：DNA模板0.5μL、P1和P2个0.5μL、DNA聚合酶12.5μL及无菌水11μL。PCR反应条件为：95℃，5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃ 10min；DNA模板0.5μL、P1和P2个0.5μL、DNA聚合酶12.5μL及无菌水11μL。PCR反应条件为：95℃，5min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，25个循环；72℃ 10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约717bp和1485bp的特异性条带，与预期大小相符。

(2)目的片段胶回收：将PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切胶回收目的片段。具体操作参照胶回收试剂盒说明书进行。

4、目的基因与中转质粒连接：将pFastBac Dual和Hexon基因的C-端结构域基因扩增片段用Xho I和Sph I酶切后分别回收、纯化，用T4DNA连接酶4℃连接过夜。

5、连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，无菌条件下加入800μL LB培养基于37℃震荡培养60min。将培养物12000rpm离心1min，吸取800μL上清，将剩余培养物涂布于LB(含氨苄青霉素抗性)固体培养基中，37℃过夜培养。挑取单菌落作菌落PCR鉴定，阳性质粒送检测序。测序正确的重组质粒命名为pFastBac Dual-HEXON-P10-C。

6、目的基因与重组中转质粒连接：将上述构建完成的pFastBac Dual-HEXON-P10-C和Hexon基因的N-端结构域基因扩增片段用BamH I和HindⅢ酶切后分别回收、纯化，用T4DNA连接酶4℃连接过夜。

7、连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，无菌条件下加入800μL LB培养基于37℃震荡培养60min。将培养物12000rpm离心1min，吸取800μL上清，将剩余培养物涂布于LB(含氨苄青霉素抗性)固体培养基中，37℃过夜培养。挑取单菌落作菌落PCR鉴定，阳性质粒送检测序。测序正确的重组质粒命名为pFastBac Dual-HEXON-P10-C-PH-N。

8、重组杆状病毒构建：将鉴定正确的中转质粒pFastBac Dual-HEXON-P10-C-PH-N转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，挑选阳性克隆用M13引物作PCR鉴定。

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC

PCR反应体系为(总体积25μL)：DNA模板0.5μL、M13-F和M13-R个0.5μL、DNA聚合酶12.5μL及无菌水11μL。PCR反应条件为：95℃，4min；95℃ 45s，65℃ 45s，72℃5min，33个循环；72℃ 7min。0.8％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约5000bp左右的特异性条带，与预期大小相符。阳性重组杆粒命名为rBacmid-HEXON-P10-C-PH-N。

9、重组杆粒转染sf9细胞：将提纯的重组杆粒用脂质体转染的方法将重组杆粒转染sf9细胞，具体操作方法参照赛默飞世尔科技(中国)有限公司的cellfectin转染试剂说明书进行，获得F1代重组杆状病毒rBac-HEXON-P10-C-PH-N。

实施例2：重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的制备

1、重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒rBacHexon-P10-C-PH-N接种昆虫细胞sf9，27℃静置培养4天，收集培养物，离心取上清即获得F2代重组杆状病毒；

2、表达蛋白鉴定：

(1)将上述F2代重组杆状病毒以MOI＝5～10的接种量接入昆虫细胞sf9，27℃，110rpm，培养4天，收集培养物，离心取上清即获得重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白；

(2)SDS-PAGE鉴定：将上述上清液进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，C端大约在27kDa位置，N端大约在55kDa位置，其分子量与理论大小相符，说明表达成功。

(3)Western Blot鉴定：取SDS-PAGE电泳后凝胶，直接用BIO-LAB转印装置将其转印到NC膜上，转印结束后，按常规方法进行Western blot鉴定。用4型禽腺病毒阳性血清参考品(1:200)作为一抗(本公司自制)；用辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG(1:2000)作为酶标二抗；最后用TMB显色(碧云天生物技术有限公司)。结果表明，在约27kDa与55kDa处各出现1条明显的特异性条带，而阴性对照无此特异性反应，说明两种重组蛋白均可被4型禽腺病毒阳性血清中的抗体识别并且具有良好的特异性和反应原性。

3、重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒以MOI＝1～10的接毒量接种HF细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白。

4、重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白纯化：利用阳离子纯化柱对重组蛋白进行纯化，并对纯化后的重组蛋白进行透析处理，去除纯化样品中的咪唑和氯化钠。

5、重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白定量：利用碧云天生物技术研究所BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)进行蛋白定量。

实施例3：疫苗制备

1、灭活：将实施例2中大量制备的重组Hexon蛋白的C-端和/或N-端结构域蛋白加入到灭活罐中，加入终浓度为0.2％～0.5％灭活剂BEI，于37℃灭活24h。

2、半成品检验

(1)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)蛋白含量测定：按Bradford法检测蛋白含量。

(3)灭活检验：将灭活后的蛋白液取昆虫细胞sf9，置于27℃继续培养72小时。观察无病变出现，判定灭活检验合格。

3、重组亚单位疫苗制备：

经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持，冷却后备用。

(2)水相制备：将重组蛋白参照表1使用生理盐水分别稀释成80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，再加入95份制苗用蛋白液(所述重组蛋白生理盐水稀释液)，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000rpm乳化5分钟。乳化后，取10mL，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应不超过0.5mL。

表1不同批次疫苗蛋白组份

实施例4：疫苗成品检验

1、性状

外观：疫苗应为乳白色白乳剂，无杂质并且外包装应合格；

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均应不扩散。

稳定性：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出水相应不超过0.5mL。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

2、装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4、安全检验：

表1所示各批次禽腺病毒重组亚单位疫苗，均由我公司研发中心实验室制备。

4.1实验方法

选取10日龄SPF鸡，随机分成10组，每组10只，用表1所示的9批次疫苗每组分别颈部皮下注射，0.3mL/羽；剩余10只为阴性对照，同样方法注射生理盐水0.3mL。每天观察各组鸡的饮食饮水、全身、局部反应及其它临床症状，并于接种后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鸡注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应。21天后进行剖检，主要检查注射部位的变化及组织病变。

4.2实验结果

三批疫苗均未引起鸡只全身症状或其他异常反应；21天后在注射部位，疫苗吸收良好，未对注射部位的组织造成明显的损伤；各组均无畸形蛋。可见对SPF鸡、肉鸡和蛋鸡是安全的，结果见表2。

表2安全性试验

上述结果表明，用试制生产的9批次灭活疫苗对鸡群是安全的，免疫后不引起鸡群任何不良反应，均不影响鸡群的生产性能，表明采用该疫苗生产工艺在实验室制备的疫苗能够达到对鸡的安全性要求。

5、效力检验

表1所示的禽腺病毒重组亚单位疫苗，均由我公司研发中心实验室制备。

5.1实验方法

5.1.1血清学方法检测

取21日龄SPF鸡，随机分为10组，每组10只，分别皮下免疫9批次灭活疫苗(批号：01p、02p、03p)，0.3mL/羽；剩余10只同样方法接种等量PBS作为对照组，编号、隔离器内饲养。21天后每只鸡分别采血，分离血清，进行AGP抗体效价测定。

5.1.2免疫攻毒试验

上述5.1.1方法免疫后21天采血后，每组用禽腺病毒(I群4型)YN14株F3代效检湿毒攻毒，颈部皮下注射0.2mL/只(含100ELD₅₀)。观察2周，记录发病及保护情况。

5.2结果

三批次C端、N端混合组份疫苗以及C端、N端单组份分别以每只免疫0.3mL免疫21日龄SPF鸡，免疫后21日血清中禽腺病毒(Ⅰ群4型)AGP抗体均阳性以上，对照组AGP抗体均为阴性(见表3)。免疫后21日，用禽腺病毒(Ⅰ群4型禽腺病毒)效检毒株YN14F3代湿毒颈部皮下注射0.2mL病毒液/只(含100ELD₅₀)，免疫后隔离器饲养观察14天，C端、N端混合组份疫苗免疫组均每只鸡均健活，保护率可达100％；C端或N端单独免疫后攻毒，1周左右开始陆续发病，连续观察2周，保护率仅达70％；非免疫对照组攻毒后4天左右开始陆续发病，连续观察2周，10只鸡均发病(见表4)，病鸡羽毛蓬松、拉灰白色稀粪、精神萎顿、卧地不起、吃食饮水减少，其中7只攻毒后10天内开始死亡，死亡前突发挣扎、扑腾，有的发生尖叫，死亡鸡与发病鸡剖检均有明显典型的的心包积液症状，肝脏淤血肿大，有的肝脏表面出现针尖状出血点等脏器病变。攻毒结果表明C端、N端混合组份疫苗的3批次疫苗免疫组对禽腺病毒(Ⅰ群4型)免疫保护率可达100％，C端或N端单独免疫后攻毒14天，30％鸡发病，1.5％鸡死亡，保护率约为70％，非免疫对照组攻毒后14天，100％鸡发病，70％鸡死亡，死亡鸡与发病鸡剖检均有心包积液典型安卡拉病病理变化。

表3禽腺病毒重组亚单位疫苗禽腺病毒(Ⅰ群4型)AGP抗体检测结果

注：“+”表示血清原液琼扩抗体阳性，“—”表示血清原液琼扩抗体阴性。

表4禽腺病毒重组亚单位疫苗腺病毒(Ⅰ群4型)免疫攻毒保护结果

上述实验结果表明，含C端与N端2种组份的禽腺病毒重组亚单位疫苗免疫后21日，3批次疫苗禽腺病毒均能产生很好的免疫应答，保护率可达到100％，相应非免疫对照组发病率均在80％以上。血清中含有较高水平的Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白，可以有效的抵抗禽腺病毒的攻击，与此同时，在免疫保护试验中用C端或N端蛋白单独制备得到的疫苗对鸡进行免疫，保护率仅能达到70％，说明这两种蛋白联合使用可以使保护率有显著提升。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州优邦生物药品有限公司

<120> 一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> Ⅰ群4型禽腺病毒

<400> 1

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35 40 45

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Lys Tyr Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ser Asp Gly Gly Phe Tyr Leu Ser

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His Thr Phe Arg Asn Met Ser Ile Leu Phe Asp Thr Ser Ile Asn Trp

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115 120 125

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130 135 140

Tyr Asn Gly Tyr Arg Phe Trp Pro Asp Arg Gln Tyr Phe His Tyr Asp

145 150 155 160

Phe Leu Arg Asn Phe Asp Pro Met Thr Arg Gln Gly Pro Asn Phe Ala

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Leu Pro Gly Leu Phe Asp Leu Val Ser Tyr Thr Pro Thr Thr Asp Asn

180 185 190

Ser Gly Gln Gln Pro Ser Gln Glu Ala Val Arg Asn Asn Ser Gly Phe

195 200 205

Ile Ala Pro Arg Ser Trp Pro Val Trp Ser Ala His Gln Gly Glu Ser

210 215 220

Trp Pro Ala Asn Trp Pro Tyr Pro Leu Cys Gly Gln Gln Ala Ile

225 230 235

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<212> DNA

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<213> Ⅰ群4型禽腺病毒

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260 265 270

Leu Pro Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Tyr Met Leu Ala Asp

275 280 285

Met Met Ser Arg His His Tyr Phe Ala Leu Trp Asn Gln Ala Val Asp

290 295 300

Gln Tyr Asp Pro Glu Val Arg Val Phe Ser Asn Asp Gly Tyr Glu Glu

305 310 315 320

Gly Ala Pro Ser Tyr Ala Phe Asn Pro Glu Ala Val Gly Ala Gly Glu

325 330 335

Gly Tyr Gly Pro Asp Leu Ser Gln Ile Lys Leu Tyr Thr Asn Asn Thr

340 345 350

Ala Ala Asn Asp Lys Asn Thr Ala Val Ala Asn Ala Thr Thr Asn Phe

355 360 365

Tyr Phe Gly Thr Val Pro Ser Tyr Glu Ile Asp Ile Ser Ala Thr Gln

370 375 380

Arg Arg Asn Phe Ile Met Ala Asn Ile Ala Glu Tyr Leu Pro Asp Arg

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Ser Ile Ser Gly Phe Asp Ala Thr Ser Val Ala Pro Thr

405 410 415

Thr Tyr Glu Tyr Met Asn Lys Arg Val Pro Leu Thr Asn Val Val Asp

420 425 430

Met Phe Thr Asn Val Gly Ala Arg Trp Ser Ile Asp Gln Met Asp Asn

435 440 445

Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Trp Gly Leu Lys Tyr Arg Ser

450 455 460

Gln Leu Leu Gly Asn Ser Arg Tyr Val Asn Phe His Ile Gln Val Pro

465 470 475 480

Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Ser Gly

485 490

<210> 4

<211> 1485

<212> DNA

<213> Ⅰ群4型禽腺病毒

<400> 4

atgttcagac agacggtcgt ggcgcccacc cgaaatgtca cgacagaaaa ggctcaacgg 60

ctgcaaatcc gcttttaccc catccaaacc gacgacacgt cgacgggcta ccgcgtgcgg 120

tacaacatca atgtgggcga cggttgggtc ctggacatgg ggtcgaccta tttcgacatc 180

aagggaatcc tagaccgagg gccgtccttc aagccctact gcggcacggc ttacaacccg 240

ctggctccca aggagtccat gtttaacaac tggtcggaga cggcacccgg gcagaacgtg 300

tccgcctccg gtcagctgtc caacgtctat accaacacga gcacctccaa agacacgacg 360

gcggcgcagg tgacgaagat ttccggcgtc ttccccaatc ccaaccaggg acccggaaga 420

aatcctctgc gacgggtaca aaacgccaac accggcgtgc tcggtcgctt cgccaagtct 480

cagtacaatt acgcttacgg tgcctacgtc aagcccgtcg ccgccgacgg ttcccagtcc 540

ctcacgcaga ccccctactg gatcatggat aacacgggca ccaattacct gggagcggtg 600

gccgtcgagg actacaccaa cagcctctcg tacccagata ccatagtcgt gccgcctccc 660

gaggactacg acgattataa cataggcacc acgcgtgcgc tcaggcccaa ctacatcggg 720

ttcagggata acttcattaa cctgctgtat cacgactccg gcgtgtgctc gggcaccctc 780

aactcggagc gttcgggcat gaacgtggtg gtcgagctgc ccgaccggaa taccgagctc 840

agctaccagt acatgctggc cgacatgatg tcccgccatc actatttcgc cctgtggaac 900

caggccgtgg accagtacga ccccgaggtg cgagtcttct ccaatgacgg ttacgaagaa 960

ggcgcgccca gctacgcctt caaccccgaa gcggtaggcg cgggagaagg ctacggcccc 1020

gatctcagtc aaattaaact ctacaccaac aacaccgccg cgaacgacaa aaacaccgcc 1080

gtggctaacg ccactaccaa cttctacttc ggcacggtac cctcctacga aatcgatatc 1140

agcgctaccc agaggcgcaa ctttatcatg gccaacatcg ccgagtatct gcccgaccgt 1200

tacaagttta gcatctccgg cttcgacgcc accagcgtcg cgcctaccac ctacgagtac 1260

atgaacaagc gcgtccccct caccaacgtc gtcgacatgt tcacgaacgt gggtgcgcgt 1320

tggtccatcg accagatgga caacgtcaac cccttcaacc accacagaaa ctgggggctg 1380

aaataccgct cccagctgct gggaaacagt cgctacgtca acttccacat ccaagtgccc 1440

caaaaattct tcgccatcaa aaacctgctg ctgctctccg gctaa 1485

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcctcgaga acgccaccaa cgatc 25

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccgcatgct tagatggcct gctgaccg 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcggaatgt ccttcagaca gacggtcg 28

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccaagcttt tattagccgg agagcagcag c 31

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggaaacag ctatgac 17

Claims

1.一种抗原蛋白，其特征在于，由Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV 4C Hexon蛋白的C-端和N-端的结构域组成；所述C-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述N-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述抗原蛋白的基因。

3.制备权利要求1所述抗原蛋白的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)扩增编码C端、N端结构域的基因：在C-端引物两端分别添加Xho I和Sph I酶切位点，而N-端引物两端分别添加BamH I和Hind Ⅲ酶切位点，分别可扩增出C-端结构域序列，以及N-端结构域序列；

(3)目的基因与重组中转质粒连接：将上述构建完成的pFastBac Dual-HEXON-P10-C和Hexon基因的N-端结构域基因片段用BamH I和Hind Ⅲ酶切后分别回收、纯化，连接过夜；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的进一步纯化方法：利用镍柱HisTrap HP，5mL对重组蛋白进行纯化，并对纯化后的重组蛋白进行透析处理，去除纯化样品中的咪唑和氯化钠。

5.一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述抗原蛋白和疫苗佐剂。

6.根据权利要求5所述的用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白经过BEI灭活。

7.根据权利要求5或6所述的一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中抗原区蛋白的含量在75～100μg/mL之间。

8.根据权利要求5或6所述的一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中的佐剂是白油佐剂。

9.根据权利要求7所述的一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中的佐剂是白油佐剂。