CN109943540A

CN109943540A - 一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法

Info

Publication number: CN109943540A
Application number: CN201910352982.3A
Authority: CN
Inventors: 郭伟伟; 向银辉; 陈俭梅; 王丽萍; 邹敏; 范根成; 杜元钊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2019-06-28

Abstract

本发明提供一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒，其中制备病毒样颗粒所使用的重组杆状病毒中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；所述的VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；编码基因的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:4。本发明所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗。本发明制备的疫苗免疫番鸭后能提高番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。

Description

一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于家禽疫苗技术领域，具体涉及一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法。

背景技术

鹅细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称鹅流感、鹅或小鹅瘟、鹅肝炎、鹅肠炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病。根据感染雏鹅、雏鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急性和慢性型。急性型可引起10日龄以内的雏鹅100％死亡。许多国家也报道了一种抗原性完全不同的番鸭细小病毒感染，死亡率高达80％。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于20世纪60年代中后期出现于中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为鹅细小病毒感染，但是通过病毒中和试验、分子生物学研究证明，从鹅和番鸭分离到的细小病毒有明显的差异。

2015年以来，我国福建等地方的半番鸭和樱桃谷鸭流行一种以软脚、短嘴和生长障碍为主要特征的新发疫病(暂名“短嘴矮小综合症”，养殖户称之为“短嘴病”、“玻璃鸭”、“长舌鸭”等等)，从病料中分离到这种新型病毒，命名为番鸭源小鹅瘟病毒(Muscovy Duckderived goose parvovirus，MDGPV)。因此，就需要研制一种有效的疫苗来预防番鸭源小鹅瘟病毒。

MDGPV为细小病毒科细小病毒属成员，为单股、线性DNA病毒。基因组大小约为5kb，编码区含有2个开放阅读框，其中右侧ORF编码3种结构蛋白，即VP1、VP2、VP3；三者共用同一终止密码子，起始密码子各不相同，其分子质量由大到小排列依次为VP1、VP2、VP3。其中VP2结构蛋白是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白。

杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiro et al.,2001)。

发明内容

本发明提供一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；

所述的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:4；

本发明所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒；

本发明再一个方面提供一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。

所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9；

本发明所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗；

本发明还提供一种番鸭源小鹅瘟病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本发明制备的病毒样颗粒；

本发明制备的疫苗免疫番鸭后能提高番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。

具体实施方式

本发明通过对番鸭源小鹅瘟病毒的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的VP2的cDNA序列。对VP2蛋白进行改造后，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的VLP，病毒蛋白产量显著高于鸭胚培养的病毒，生产成本明显降低。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。

实施例1、番鸭细小病毒VP2蛋白的筛选

2015年某鸭场的雏番鸭群中出现了典型的番鸭细小病毒病症状。为了分离病原，无菌采集濒死鸭的肝脏、脾脏及胰腺，用无菌生理盐水匀浆制成悬液，离心取上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，孵化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融后，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明分离的毒株与番鸭细小病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染；纯化后的病毒株命名为YBMDGPV2015。

对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，攻毒实验结果表明筛选的该病毒可引起雏番鸭发生以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征的番鸭细小病毒病。该毒株制备的疫苗免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月以上；免疫成年番鸭后，能保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。

对筛选鉴定的YBMDGPV2015株的结构蛋白基因VP2进行了测序，VP2基因全长1770bp，编码589个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:2；将其与GenBank中收录的VP2基因序列进行遗传进化树及核苷酸序列同源性分析，发现本发明获得YBMDGPV2015株的VP2基因与另外30个GPV毒株的VP基因同源性介于92.7％～98.3％之间。结果表明筛选病毒的VP2蛋白与已报道的小鹅瘟病毒VP2基因存在着氨基酸差异。

实施例2、表达VP2基因的重组杆状病毒的构建

2.1 VP2基因的剪切、优化

将vp2基因的parvo_coat结构域进行剪切，将N端70aa剪切掉，把C端31aa剪切掉，同时将第336位V突变为P，从而帮助蛋白更好地折叠为三级结构，将其抗原位点更好地暴露出来。优化修饰后的氨基酸的序列为SEQ ID NO:3，能很好地表达出抗原位点，且能自动组装成VLPS。将选取的基因进行了密码子优化，优化后的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

2.2酶切反应

2.2.1标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：

2.2.2将步骤2.2.1中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。

2.2.3双酶切产物胶回收

取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.3连接反应

(1)标记需要用到的0.2mL离心管。

(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：

(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。

(4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。

(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。

(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。

(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用LB抗性平板。

(5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。

(7)观察记录转化结果。

2.5质粒抽提与PCR鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(2)吸取菌液至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。

(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体。

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μLElutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中DNA溶液。

2.5.2 PCR鉴定

(1)标记好需要用到的PCR管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为25μL：

(2)PCR扩增程序：

(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。

2.6转化

将测序阳性的质粒转化DH10bac感受态细胞，方法同2.4.

2.7挑取杆粒与PCR鉴定

2.7.1挑取杆粒

(1)从2.6转化的平板中，用10μL移液枪头从转化平板中挑取白色单克隆菌落至5ml含卡那霉素抗性、四环素抗性、庆大霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

2.7.2PCR鉴定

方法同2.5.2

实施例3：杆状病毒的包装

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；TNM-FH培养液置于27℃水浴锅预热至27℃。

(2)将2μg重组DNA加入到100μl无血清和双抗的TNM-FH培养液中，混匀。将9μlCellfectin Reagent加入到100μl无血清和双抗的TNM-FH培养液中，混匀。将脂质体与重组DNA混合，室温静止40min。

(3)从27℃培养箱中取出6孔板细胞，弃去上清培养基，用预温的TNM-FH培养液洗细胞三次，并弃去TNM-FH培养液。

(4)每个细胞孔加入2ml 10％胎牛血清的TNM-FH培养液。

(5)将重组DNA与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静止培养5～6h。

(6)将孔中的液体弃掉，加入2ml完全TNM-FH培养液(含有双抗和10％血清)，27℃条件下静止培养5～6天。

(7)待细胞肿胀，体积变大，脱落后，收集上清液，标记为P1代重组杆状病毒，命名为MDGPV-VLP-P。

(8)用MDGPV-VLP-P1感染新培养的Sf9细胞，提高重组杆状病毒含量，反复接种2代后，收取细胞上清液，4℃或-80℃保存备用。

实施例4：蛋白纯化与检测

4.1重组vp2蛋白在昆虫细胞Sf9内的表达与鉴定

将实施例2制备的重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9，27℃培养72h，同时以未感染病毒的正常昆虫细胞Sf9 27℃培养48h作为对照，收获细胞，将培养上清冻存备用。细胞用pH7.4的PBS洗涤后，加入1×SDS-PAGE加样缓冲液[50mM Tris-HCl(pH6.8)，100mMDithiothreitol(DTT),2％SDS,0.05％Bromophemol blue,10％Glycerol]，煮沸5min，用12％分离胶、5％浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100伏约2.5h，考马斯亮蓝R250染色，发现未优化的VP2基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中没有表达，而优化的VP2重组杆状病毒感染的昆虫细胞Sf9裂解物中有VP2蛋白表达。

4.2重组VP2蛋白的层析纯化

将重组杆状病毒MDGPV-VL接种昆虫细胞Sf9，27℃培养72小时后，离心收集细胞沉淀，细胞沉淀中加入适量生理盐水,重悬细胞沉淀，经超声波裂解细胞，以1000r/min 4℃离心10min，收集上清液，用Ni2+柱进行层析纯化。

4.3 westernblot试验

将鸭源小鹅瘟全病毒和4.2制备的蛋白同时进行SDS-PAGE，采用半干法20伏转印30min，将目的蛋白条带转移到PVDF膜，转印膜用封闭液封闭过夜，PBST洗涤3次，1∶500稀释的鸭源小鹅瘟病毒阳性血清37℃作用1.5h，PBST洗3次，用1∶2000稀释的HRP标记的兔抗鸭酶标抗体37℃作用1.5h，PBST洗涤3次，底物溶液作用5min，在chemiDOC进行显色，结果全病毒条带很弱，而优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:4的基因在昆虫细胞Sf9内表达的VP2蛋白条带很亮，说明表达的vp2蛋白免疫原性好。

4.4取4.2项用Ni2+柱进行层析纯化的表达产物，负染后进行电镜观察，观察表达蛋白的形状和大小。形状为六角形，大小约为20nm。

实施例4疫苗的制备及效果检测

1、疫苗的制备

(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备将4.2纯化的蛋白液与无菌生理盐水适当比例混合，使每0.2ml水相中含蛋白含量不低于50ug/ml。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相1.5份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

2、疫苗的效力检验

1)抗体检测法90日龄种番鸭30只，随机分成三组，每组10只，其中一组每只颈部皮下注射亚单位疫苗，0.2ml/只，一组10只同日龄番鸭每只颈部皮下注射全病毒制备的疫苗，0.2ml/只，另一组10只同日龄番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭1日龄时，亚单位免疫组子代取10只，全病毒免疫组10只，对照组子代取10只，用番鸭细小病毒经典株进行攻毒，每只肌肉注射0.2ml/只(10^6.50ELD₅₀/0.2ml)，连续观察21日。结果亚单位疫苗免疫组鸭10只均保护，全病毒疫苗免疫组鸭8只保护，对照组鸭10只全部发病(见表1)，说明亚单位疫苗的免疫效果优于全病毒疫苗。

表1疫苗效力检验结果

组别

品种

日龄

只数

攻毒剂量

发病率

保护率

亚单位组

番鸭

3

10

106.50ELD50

0/10

10/10

全病毒组

番鸭

3

10

106.50ELD50

2/10

8/10

对照组

番鸭

3

10

106.50ELD50

10/10

0/10

此外，本发明的VP2亚单位疫苗对于YBMDGPV2015株的攻毒防护效果最好，表明YBMDGPV2015株可能发生了变异，使已有的番鸭细小病毒的免疫保护效果下降。

综上，本发明将全长的VP2蛋白以及优化的VP2蛋白同时构建用于表达抗原蛋白的杆粒载体，结果未经优化的全长VP2基因不能再昆虫细胞中表达，而优化的VP2蛋白在昆虫细胞中成功地表达出可溶性的重组蛋白。将浓缩100倍的YBMDGPV2015毒株、表达的vp2上清同时进行电镜观察，结果浓缩100倍的全病毒只有少量的VLP，而未经稀释表达的vp2上清在体内自动组装成病毒样颗粒(VLPS)，且病毒粒子量很多。VLP在空间构想上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于VLP不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 587

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Pro Ala Lys Lys Asn Thr Gly Lys Leu Thr Asp His Tyr Pro

1 5 10 15

Val Val Lys Lys Pro Lys Leu Thr Glu Glu Val Ser Ala Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Ser Ala Val Gln Asp Gly Gly Ala Thr Ala Glu Gly Thr Glu Pro

35 40 45

Val Ala Ala Ser Glu Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Met Gly Asp

50 55 60

Ser Ser Gly Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn Trp His

65 70 75 80

Cys Asp Ser Gln Trp Met Gly Asn Thr Val Ile Thr Lys Thr Thr Arg

85 90 95

Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Ile Tyr Lys Ala Ile Thr

100 105 110

Ser Gly Thr Ala Gln Asp Ala Asn Val Gln Tyr Ala Gly Tyr Ser Thr

115 120 125

Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro

130 135 140

Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn His Trp Gly Ile Arg Pro Lys

145 150 155 160

Ser Leu Lys Phe Lys Ile Phe Asn Val Gln Val Lys Glu Val Thr Thr

165 170 175

Gln Asp Gln Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln

180 185 190

Val Phe Thr Asp Asp Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala

195 200 205

Thr Glu Gly Thr Met Pro Pro Phe Pro Ser Asp Val Tyr Ala Leu Pro

210 215 220

Gln Tyr Gly Tyr Cys Thr Met His Thr Asn Gln Asn Gly Ala Arg Phe

225 230 235 240

Asn Asp Arg Ser Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met

245 250 255

Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Thr Phe Asp Phe Glu Glu Val

260 265 270

Pro Phe His Ser Met Phe Ala His Ser Gln Asp Leu Asp Arg Leu Met

275 280 285

Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Trp Asn Phe Asn Glu Val Asp Ser

290 295 300

Asn Arg Asn Ala Gln Phe Lys Lys Ala Val Lys Gly Ala Tyr Gly Thr

305 310 315 320

Met Gly Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Lys Phe Leu Asp Gln Arg Val

325 330 335

Arg Ala Tyr Arg Ala Gly Thr Asp Asn Tyr Ala Asn Trp Asn Ile Trp

340 345 350

Ser Asn Gly Asn Lys Val Asn Leu Lys Asp Arg Gln Tyr Leu Leu Gln

355 360 365

Pro Gly Pro Val Ser Ala Ala His Thr Glu Gly Glu Ala Ser Ser Ile

370 375 380

Pro Ala Gln Asn Ser Leu Gly Ile Ala Lys Asp Pro Tyr Arg Ser Gly

385 390 395 400

Ser Thr Thr Ala Gly Ile Ser Asp Ile Met Val Thr Asp Glu Gln Glu

405 410 415

Val Ala Pro Thr Asn Gly Val Gly Trp Lys Pro Tyr Gly Arg Thr Val

420 425 430

Thr Asn Glu Gln Asn Thr Thr Thr Ala Pro Thr Ser Ser Asp Leu Asp

435 440 445

Val Leu Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr

450 455 460

Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Lys Thr Asp Gly Lys Phe

465 470 475 480

His Pro Ser Pro Asn Leu Gly Gly Phe Gly Leu His Asn Pro Pro Pro

485 490 495

Gln Val Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Val Glu

500 505 510

Tyr Val His Gln Lys Trp Asn Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly

515 520 525

Gln Cys Thr Val Glu Met Val Trp Glu Leu Arg Lys Glu Asn Ser Lys

530 535 540

Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Ser Asn Arg Thr

545 550 555 560

Ser Ile Met Phe Ala Pro Asn Glu Thr Gly Gly Tyr Val Glu Asp Arg

565 570 575

Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Gln Asn Leu

580 585

<210> 2

<211> 1764

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctcctg caaaaaaaaa tacagggaag cttactgacc attacccagt agttaagaag 60

cctaaactca ccgaggaagt cagtgcggga ggtggtagca gtgccgtaca agacggagga 120

gccaccgcgg agggcaccga acctgtggca gcatctgaaa tggcagaggg aggaggcgga 180

gctatgggcg actcttcagg gggtgccgat ggagtgggta atgcctcggg aaattggcat 240

tgcgattccc aatggatggg aaacacagtc atcacaaaga ccaccagaac ctgggtcctg 300

cccagctaca acaatcacat ctacaaagca attaccagtg gaaccgctca agatgcaaat 360

gtccagtatg ctggatacag taccccctgg gggtactttg atttcaatcg cttccactgc 420

cacttctccc ctagagactg gcagagactt atcaacaacc actggggaat caggcccaag 480

tctcttaaat tcaagatctt caatgttcaa gtcaaggaag tcacaacgca ggatcagaca 540

aagaccattg caaacaatct cacctcaaca atccaagttt ttacggatga tgagcaccaa 600

ctcccgtatg tcctgggctc ggctacggaa gggaccatgc cgccgttccc gtcggatgtc 660

tatgccctgc cgcagtacgg gtactgcaca atgcacacca accagaatgg agcacggttc 720

aatgaccgta gcgcattcta ctgcttagag tacttcccta gtcagatgct gagaacaggt 780

aacaactttg agttcacatt tgactttgaa gaagttcctt tccacagcat gttcgctcat 840

tcacaggact tagacaggct tatgaacccc ctagtggatc aatacctctg gaatttcaat 900

gaggtagaca gcaacagaaa tgctcaattt aaaaaagctg tgaaaggggc ttatggcacc 960

atgggccgca attggctgcc gggacctaaa ttcctggatc agagagttag ggcctacaga 1020

gcaggaacag acaattatgc aaactggaac atctggagta atgggaacaa ggtgaattta 1080

aaggacaggc agtatctcct acaacccgga cctgtgtcag ctgctcacac agaaggggag 1140

gcttccagca tcccagctca gaatagttta gggatagcta aagatccata cagatctggc 1200

agcactacag caggaataag tgatattatg gtcacggacg agcaggaagt agcacccacg 1260

aatggagtag ggtggaaacc atatggtagg actgtaacga atgaacaaaa cactactaca 1320

gctcctacaa gttcagatct ggatgttctt ggagctttac caggaatggt gtggcagaac 1380

agagatatat atctgcaggg acctatttgg gcaaaaatac cgaagactga tggcaaattc 1440

catccttctc caaatctcgg aggatttggc ctgcacaatc caccaccaca ggtcttcatc 1500

aagaatacac cagtacctgc agaccctcca gtagaatatg tgcaccagaa gtggaactcc 1560

tacataactc aatactctac aggccagtgt acagtagaaa tggtgtggga gctgagaaaa 1620

gagaattcaa agagatggaa cccagaaatc cagttcacca gcaatttcag taacagaact 1680

agtataatgt ttgcacctaa tgaaactggt ggatatgtag aagatagatt gattggaacc 1740

agatatctaa ctcaaaatct gtaa 1764

<210> 3

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Met

1 5 10 15

Gly Asn Thr Val Ile Thr Lys Thr Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser

20 25 30

Tyr Asn Asn His Ile Tyr Lys Ala Ile Thr Ser Gly Thr Ala Gln Asp

35 40 45

Ala Asn Val Gln Tyr Ala Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp

50 55 60

Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu

65 70 75 80

Ile Asn Asn His Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ser Leu Lys Phe Lys Ile

85 90 95

Phe Asn Val Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Gln Asp Gln Thr Lys Thr

100 105 110

Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Asp Glu

115 120 125

His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly Thr Met Pro

130 135 140

Pro Phe Pro Ser Asp Val Tyr Ala Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys Thr

145 150 155 160

Met His Thr Asn Gln Asn Gly Ala Arg Phe Asn Asp Arg Ser Ala Phe

165 170 175

Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn

180 185 190

Phe Glu Phe Thr Phe Asp Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Met Phe

195 200 205

Ala His Ser Gln Asp Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Val Asp Gln

210 215 220

Tyr Leu Trp Asn Phe Asn Glu Val Asp Ser Asn Arg Asn Ala Gln Phe

225 230 235 240

Lys Lys Ala Val Lys Gly Ala Tyr Gly Thr Met Gly Arg Asn Trp Leu

245 250 255

Pro Gly Pro Lys Phe Leu Asp Gln Arg Pro Arg Ala Tyr Arg Ala Gly

260 265 270

Thr Asp Asn Tyr Ala Asn Trp Asn Ile Trp Ser Asn Gly Asn Lys Val

275 280 285

Asn Leu Lys Asp Arg Gln Tyr Leu Leu Gln Pro Gly Pro Val Ser Ala

290 295 300

Ala His Thr Glu Gly Glu Ala Ser Ser Ile Pro Ala Gln Asn Ser Leu

305 310 315 320

Gly Ile Ala Lys Asp Pro Tyr Arg Ser Gly Ser Thr Thr Ala Gly Ile

325 330 335

Ser Asp Ile Met Val Thr Asp Glu Gln Glu Val Ala Pro Thr Asn Gly

340 345 350

Val Gly Trp Lys Pro Tyr Gly Arg Thr Val Thr Asn Glu Gln Asn Thr

355 360 365

Thr Thr Ala Pro Thr Ser Ser Asp Leu Asp Val Leu Gly Ala Leu Pro

370 375 380

Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp

385 390 395 400

Ala Lys Ile Pro Lys Thr Asp Gly Lys Phe His Pro Ser Pro Asn Leu

405 410 415

Gly Gly Phe Gly Leu His Asn Pro Pro Pro Gln Val Phe Ile Lys Asn

420 425 430

Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Val Glu Tyr Val His Gln Lys Trp

435 440 445

Asn Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys Thr Val Glu Met

450 455 460

Val Trp Glu Leu Arg Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile

465 470 475 480

Gln Phe Thr Ser Asn Phe Ser

485

<210> 4

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgtgggga atgccagcgg taattggcat tgcgattccc aatggatggg gaataccgtc 60

atcacaaaga caacacgtac gtgggtattg ccttcttaca ataaccacat ttataaggcc 120

attacttctg gaactgcgca agacgcaaac gtacagtatg cggggtattc aaccccctgg 180

ggatacttcg acttcaatcg ctttcactgc cacttttctc cacgcgattg gcagcgcttg 240

attaataacc actggggcat ccgtccaaag agtttaaagt tcaagatctt caacgtccag 300

gtaaaggaag tgacgacgca ggatcaaact aaaaccatcg cgaacaattt gacctctact 360

atccaagtct tcacagatga cgaacaccaa ttaccctacg tgcttggatc agctaccgaa 420

ggaaccatgc cgccattccc aagtgatgta tacgcattgc cgcagtatgg gtactgcacc 480

atgcatacta accagaacgg tgcacgcttc aatgaccgtt cagctttcta ctgtctggaa 540

tactttccca gccaaatgtt acgtaccgga aataatttcg aattcacttt cgatttcgaa 600

gaagtacctt tccatagcat gtttgcgcat tcacaggacc ttgatcgctt aatgaatcca 660

ctggtagatc agtacctttg gaatttcaac gaagttgaca gcaaccgtaa tgcgcaattt 720

aaaaaagccg tcaaaggtgc gtacgggacc atgggtcgta actggttacc agggcccaaa 780

ttccttgatc aacgcccgcg tgcataccgc gcaggcactg ataattacgc caattggaat 840

atctggtcca atggcaataa ggtcaacctt aaagatcgcc agtacctgct tcaacctggt 900

ccagtctctg cagcacatac tgagggagag gcttccagta ttcccgccca aaatagtttg 960

ggtatcgcca aggacccata ccgcagtggt agcactacgg ctgggatttc cgatattatg 1020

gtgaccgacg aacaggaagt tgccccaacg aacggtgttg gatggaagcc gtatgggcgt 1080

actgtgacaa acgagcagaa tactaccact gcccccacta gttcagatct ggatgtctta 1140

ggcgcccttc ctggcatggt ttggcagaac cgcgacattt atttacaagg cccaatttgg 1200

gctaagattc ccaagacgga cggaaaattt cacccatcgc ctaatctggg tggttttggc 1260

ctgcataatc ccccaccaca agtttttatc aaaaataccc ccgtcccagc tgacccaccc 1320

gtggagtatg tacaccagaa gtggaacagc tacatcaccc agtactccac cggacagtgc 1380

actgttgaaa tggtgtggga gttacgtaaa gaaaattcca aacgctggaa tcccgaaatt 1440

cagttcacaa gcaatttctc gtaa 1464

Claims

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的核苷酸片段，其序列为SEQID NO:4。

3.权利要求1所述的重组杆状病毒在昆虫细胞中制备鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒的应用。

4.一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒，其特征在于，所述的病毒样颗粒是使用权利要求1所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。

5.如权利要求4所述的病毒样颗粒，其特征在于，所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9细胞。

6.权利要求4所述的病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。

7.一种番鸭源小鹅瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求4所述的病毒样颗粒。