CN112933222A - 一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法。本发明针对变异毒株，将SBDS‑GPV JS01株VP2基因进行密码子优化，克隆至杆状病毒载体，成功构建重组杆状病毒rBac‑JS01VP2株；采用昆虫细胞全悬浮(或转瓶)培养，技术成熟、便于转产和逐级放大培养；与传统鸭胚或鸭胚成纤维细胞培养相比，毒价高、质量稳定、生产周期短、成本低；与抗体产品相比，保护率高、母源抗体持续时间长，仅免疫母鸭，节约劳动力和成本；无血清或蛋源杂蛋白，副反应极低；表达的VP2蛋白可组装成病毒样颗粒(VLPs)，免疫原性好；表达量高(病毒滴度为8.0Log10TCID50/ml时，VP2蛋白表达量达50～100mg/L)，抗体水平高，持续时间长；产品保存期为18个月，免疫期为6个月；本发明ELISA抗体检测方法，用于易感鸭筛选和效力评价。

Description

一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
鹅细小病毒病(goose parvovirus,GPV)，又称Derzsy氏病，俗称小鹅瘟、鹅肠炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样性反映了该病多个病理学特征是危害多品种水禽的一种病毒性传染病。早在1956年，方定一先生率先在江苏省扬州市发病鹅群中发现并鉴定GPV，随后该病在世界范围内蔓延，但番鸭极少发病。
鸭短喙侏儒综合征病毒(SBDSV)又称为新型小鹅瘟病毒(novel gooseparvovirus,NGPV) 或短喙型小鹅瘟病毒(goose parvovirus variants)，临床感染症状以生长发育受阻、跛行瘫痪、上下喙萎缩及舌头外露为主要特点。法国学者在20世纪70年代首先报道SBDS，随后我国台湾地区(1990年前后)和波兰(1997年)也相继报道该病。2009年，匈牙利学者通过对法国半番鸭SBDS病例中病毒的分离鉴定，明确病原为小鹅瘟病毒西欧分支。我国学者也对2014 年以来引起我国的SBDS的病原进行系统鉴定，证实该病是由一种新型小鹅瘟病毒。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅、雏鸭和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或鸭感染后，很少表现临床症状。由于该病可引起感染鸭出现长舌短喙及生长障碍为特征的临床症状，故也将此小鹅瘟病毒变异毒株命名为短喙型小鹅瘟病毒(SBDS-GPV)或鸭短喙侏儒综合征病毒(SBDSV)。2014年下半年以来，SBDS在我国福建、江苏、山东、安徽、河南与四川等地区半番鸭和樱桃谷鸭养殖场暴发流行。该病发病率10％～100％不等，死亡率低于10％，但僵鸭或残鸭率高达20％～80％，该病的流行对我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。
由于病毒变异导致目前使用的小鹅瘟疫苗或抗体制品无法有效防控该疫病在鸭中的流行，因此亟需开发针对变异毒株相关疫苗。本发明分离变异毒株，并将其VP2基因进行密码子优化，成功构建重组杆状病毒，制备鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，旨在通过免疫种鸭，使雏鸭获得良好的被动免疫，既填补了针对变异株的防控空白，又解决了抗体产品存在的保护率低、劳动强度大、成本高、生物安全风险高和全病毒灭活疫苗存在的病毒培养难度大、副反应高等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法；所提供的疫苗具有高效、安全性好、保护率高的优点，以解决鸭短喙侏儒综合征的预防的需要。
本发明的技术方案如下：
1.一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有序列1的灭活鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒；
所述鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒，该病毒是根据测得的 SBDS-GPV JS01株VP2基因序列，对VP2基因进行密码子优化，通过化学合成方法获得SEQ ID No.1所示优化后的VP2基因，以其为模板，将两端分别引入BamH I和Xba I酶切位点，扩增VP2 基因；通过BamH I和Xba I双酶切后克隆至pFastBac HTA载体，获得重组质粒pFastBac HTA-JS01VP2；采用CellfectinⅡRegent转染试剂将重组质粒pFastBac HTA-JS01VP2转染至Sf9 细胞进行重组病毒的拯救，获得1株重组病毒，命名为rBac-JS01 VP2株；
所述的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒感染Sf9或Sf+细胞均可成功表达可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)的VP2蛋白。
2.本发明所述一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗的制备方法包括：
(1)重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒rBac-JS01 VP2接入昆虫细胞Sf9进行转瓶培养或 sf+进行悬浮培养，28±2℃培养5～7天，获得重组杆状病毒液，病毒滴度不低于7.6LogTCID50/ml；
(2)灭活：将病毒液加入灭活罐中，将温度平衡至37±2℃，加入活化的BEI，使得BEI 终浓度为0.2％～0.3％，将pH值控制在7.5±0.3，搅拌2～4h后，将内容物转移到另一个容器中，可加入消泡剂，以防止起泡。维持37±2℃继续灭活，总灭活时间为24h。灭活结束后，37±2℃下加入20％(w/v)硫代硫酸钠，使其终浓度为0.5％～1.5％，将pH值控制在7.5±0.2，搅拌1h；
(3)抗原纯化：通过离心或过滤去除细胞碎片和其它颗粒物，可进一步使用0.01MPBS 对上清液透析，以减少培养基组分和其他小分子物质的含量；
(4)配苗：将油相(94份白油、6份司本-80、2份硬脂酸铝)和水相(96份灭活抗原液、4份吐温-80)按3:2混合经乳化而成。
3.本发明所述一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，该疫苗成品效力检验中可采用ELISA抗体检测方法(间接ELISA)测定免疫动物抗体效价和/或攻毒试验结果。
附图说明
图1SBDS-GPV JS01株P5代次病毒接种鸭胚6日后胚体的出血性变化 图中：A:接种PBS对照鸭胚；B:SBDS-GPV JS01株P5代次病毒感染鸭胚，6日后鸭胚死亡(白色箭头指示胚体出血)。
图2 SBDS-GPV JS01株VP1基因进化分析
图3 2日龄GPV阴性健康鸭人工感染SBDS-GPV JS01株后的体重和喙长变化
图4间接免疫荧光法检测重组VP2蛋白的表达图中：A:感染重组病毒的Sf9细胞；B:正常Sf9细胞对照
图5重组VP2蛋白表达的蛋白质免疫印迹分析图中：M:PageRuler Plus预染蛋白分子量标准；第1泳道和第2泳道分别代表细胞培养上清与细胞沉淀
图6电镜观察VP2蛋白自我组装成的VLPs
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物资源是从江苏地区某疑似SBDS发病樱桃谷肉鸭场中分离获得 SBDS-GPV JS01毒株(中国兽医科学。2020,50(10):1286-1293)，该毒株具有较广的宿主感染谱。本发明人对SBDS-GPV JS01株VP2基因进行密码子优化，将优化的VP2基因(序列1)克隆至杆状病毒载体，成功构建了被命名为鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2 株(简称rBac-JS01 VP2株)病毒。
发明新的技术效果
本发明涉及一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法。本发明采用昆虫细胞全悬浮(或转瓶)培养技术成熟、便于转产和逐级放大培养；与传统鸭胚或鸭胚成纤维细胞培养相比，毒价高(悬浮培养毒价为8.2～8.5Log10TCID50/mL，转瓶培养毒价为 7.8～8.0Log10TCID50/ml)、质量稳定、生产周期短、成本低；与抗体产品相比，保护率高、母源抗体持续时间长，仅免疫母鸭，节约劳动力和成本；无血清或蛋源杂蛋白，副反应极低(我公司研究证实，产蛋期间加强免疫也不影响产蛋率)；表达的VP2蛋白可组装成病毒样颗粒(VLPs)，免疫原性好；表达量高(病毒滴度为8.0Log10TCID50/ml时，VP2蛋白表达量达50～100 mg/L)，抗体水平高，持续时间长；本发明ELISA抗体检测方法，用于易感鸭筛选和效力评价；本发明的产品保存期为18个月，免疫期为6个月。
具体实施方式
1.重组杆状病毒的构建
(1)重组质粒pFastBac HTA-JS01VP2的构建
根据本发明人测得的SBDS-GPV JS01株(中国兽医科学。2020,50(10):1286-1293)VP2 基因序列，对其进行密码子优化，通过化学合成方法获得优化的VP2基因(序列1)，以其为模板，用如下引物扩增VP2基因并在两端引入BamH I和Xba I酶切位点：
5’-gcggatccgc caccactgct ccagcca-3’27(正向)
5’-cgtctagatt caaagttttg gtcaag-3’26(反向)
反应体系：4μl DNA模板,2.5μL10×AmpliTaq Buffer，正反向引物各1μL，0.5μLAmpliTaq DNA polymeras，加灭菌ddH2O至25μL。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，62℃退火30s，68℃延伸120s，共30个循环，最后68℃终延伸7min。
最终获得两端分别含BamH I和Xba I酶切位点的目的基因片段，将该片段通过BamH I 和Xba I双酶切后克隆至pFastBac HTA载体。将测序正确且酶切鉴定正确的重组质粒命名为 pFastBac HTA-JS01VP2。
(2)重组杆状病毒rBac-SBDSV-JS01VP2的拯救与鉴定
采用Cellfectin ⅡRegent转染试剂(Invitrogen公司)将重组杆状病毒质粒pFastBac HTA-JS01VP2转染至Sf9细胞进行重组病毒的拯救，获得1株重组病毒。该病毒经3轮空斑纯化后，运用间接免疫荧光(IFA)、蛋白质免疫印迹分析(Western-blot)和电镜观察对VP2 蛋白在Sf9细胞中的表达进行检测。
将纯化的重组病毒接种于24孔板，感染生长良好的Sf9细胞，于28±2℃培养120小时，吸弃培养基，用PBS洗涤3次。加95％冷乙醇溶液室温固定30分钟。PBS洗涤3次，加1:200～500 稀释的兔抗SBDS-GPV JS01株抗体，37℃孵育1小时。弃去一抗，PBS洗涤3次，加入1:500 稀释的FITC标记的山羊抗兔二抗，37℃避光孵育1小时，PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察，结果显示，感染重组病毒的Sf9细胞能检测到明显的的特异性红色荧光信号，对照Sf9细胞无特异荧光信号(见图4)，说明重蛋白组VP2在Sf9中成功表达。
将纯化的重组病毒感染Sf9细胞至出现明显病变，离心分别收取细胞和细胞培养上清。细胞沉淀用适量PBS重悬，5×SDS上样缓冲液煮沸10min。经过SDS-PAGE电泳后，转至NC 膜，用自制的兔抗SBDS-GPV JS01株多克隆抗体进行Western-blot检测。结果表明，细胞沉淀与细胞培养上清均可见约为65kD特异性条带(为VP2蛋白的预测分子量，见图5)，证实该重组病毒感染Sf9昆虫细胞可成功表达VP2蛋白。
收获纯化的重组病毒感染Sf9细胞培养上清，经12000g，4℃离心30min除去杂质；再取上清移至新离心管中，经150000g，4℃超速离心2h，弃去上清，将沉淀重悬；将重悬的液体经磷钨酸负染后在电镜下观察。电镜观察结果显示：表达的VP2蛋白可自我组装成直径约为20nm 的VLPs(见图6)。
2.疫苗制备
(1)重组杆状病毒扩增
将重组杆状病毒rBac-JS01 VP2接入昆虫细胞Sf9进行转瓶培养或Sf+进行悬浮培养，28±2℃培养5～7天，获得重组杆状病毒液，病毒滴度不低于7.6Log10TCID50/ml。
(2)灭活
将病毒液加入灭活罐中，将温度平衡至37±2℃，加入活化的BEI，使得BEI终浓度为0.2％～ 0.3％，将pH值控制在7.5±0.3，搅拌2～4小时后，将内容物转移到另一个容器中，可加入消泡剂，以防止起泡。维持37±2℃继续灭活，总灭活时间为24h。灭活结束后，37±2℃下加入20％ (w/v)硫代硫酸钠，使其终浓度为0.5％～1.5％，将pH值控制在7.5±0.2，搅拌1小时。
(3)抗原纯化
通过离心或过滤去除细胞碎片和其它颗粒物，可进一步使用0.01M PBS对上清液透析，以减少培养基组分和其他小分子物质的含量。
(4)配苗
将油相(94份白油、6份司本-80、2份硬脂酸铝)和水相(96份灭活抗原液、4份吐温-80) 按3:2混合经乳化而成。
3.疫苗检验
本发明所述疫苗成品效力检验中可采用ELISA抗体检测方法(间接ELISA)测定免疫动物抗体效价和/或攻毒试验结果。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制：
实施例1——鸭短喙型小鹅瘟病毒SBDS-GPV JS01株的分离鉴定
2018年4月，本公司从江苏某发病鸭场分离获得1株鸭短喙型小鹅瘟病毒，命名为SBDS-GPV JS01株。该毒株可在鸭胚中连续传代，传至第5代次(P5)时，鸭胚在接毒7日内100％死亡，死亡胚体病变为发育受阻并伴有出血(图1)。病毒滴度达5.3log10ELD50/mL。
该毒株VP1基因序列同源性分析表明：该毒株VP1基因与我国新流行的短喙型小鹅瘟病毒株(SBDS-GPV M15株、SBDSV-SDLC01株与SBDSV-DS15株等)序列同源性达为96％以上，其中与SBDS-GPV M15株的同源性最高，达99.6％。VP1基因进化树分析结果表明，JS01株与SBDS-GPV毒株关系较近且与M15株位于同一个相对独立的分支中(图2)。
实施例2——SBDS-GPV JS01株对2日龄试验鸭攻毒模型的建立
取46只2日龄GPV阴性健康樱桃谷鸭(表1)分成2组。第1组为攻毒组，含13只公鸭与11只母鸭，每只鸭经颈背侧皮下注射接种0.2mL P8代次JS01株病毒液(5.7log10 ELD50/mL)，5.0log10ELD50/只。第2组为阴性对照组，含12只公鸭与10只母鸭，每只鸭按同样方式接种等体积灭菌PBS。各组隔离饲养，自由采食。攻毒后，每天观察试验鸭临床症状，连续观察21日。于攻毒后第7日、14日与21日测定每只鸭的喙长和体重。在21dpc将所有试验鸭扑杀、剖检并进一步确认性别。
攻毒组试验鸭接种SBDS-GPV JS01株3天后开始出现不同程度的精神沉郁、饮食欲不振、腹泻、喜卧与羽毛粗乱等临床症状，至试验结束，共死亡3只(2只公鸭与1只母鸭)，而对照组全部健活。7、14与21dpc，攻毒组试验鸭体重和喙长均低于对照组(表1与图3)。21dpc剖检结果表明，攻毒组试验与对照组均未见明显的组织病变。
表1 2日龄GPV阴性健康鸭人工感染SBDS-GPV JS01株后的体重和喙长变化
Figure BDA0002944203970000061
根据攻毒组与阴性对照组试验鸭在试验期间的死亡率、不同时间点体重和喙长指标差异，设定SBDS-GPV JS01株对2日龄GPV阴性健康鸭试验鸭的攻毒发病模型，符合下列任意1 条可判定试验鸭发病：
(1)死亡：观察期内试验鸭非意外原因死亡；
(2)体重指数：攻毒后7日或14日，测定所有存活鸭体重，计算攻毒对照组试验鸭体重指数(体重指数＝攻毒对照组试验鸭体重/健康对照组试验鸭体重平均值)，攻毒后7日或14日体重指数低于80％；
(3)喙长指数：攻毒后7日或14日，测定所有存活鸭喙长，计算攻毒对照组试验鸭喙长指数喙长指数＝攻毒对照组试验鸭喙长/健康对照组试验鸭喙长平均值)，攻毒后7日或14日喙长指数低于85％。
本发明人对常见不同品系的2日龄雏鸭进行了攻毒试验，按上述标准均能达到100％发病。
因此，SBDS-GPV JS01株对2日龄试验鸭攻毒模型最终确定为：试验动物是2日龄GPV 阴性雏鸭(不同品系均可)；攻毒毒株是SBDS-GPV JS01株P8代次；攻毒剂量是5.0log10ELD50/ 只；攻毒途径是颈背侧皮下注射接种；判定发病标准为死亡，或攻毒后7日或14日体重指数低于80％，或攻毒后7日或14日喙长指数低于85％；攻毒试验成立标准是攻毒组90％以上(留有余地)试验鸭发病。
实施例3——重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株的构建和鉴定
本发明人对SBDS-GPV JS01株VP2基因进行密码子优化，将优化的VP2基因(SEQ IDNo.1)克隆至杆状病毒载体，成功构建了重组杆状病毒并命名为鸭短喙型小鹅瘟病毒重组rBac-JS01 VP2株。通过间接免疫荧光分析(图4)与蛋白质免疫印迹分析(图5)，证实rBac-JS01 VP2感染Sf9或Sf+细胞均可成功表达VP2蛋白。电镜观察结果(图6)显示表达的VP2蛋白可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)。
SEQ ID No.1
Figure BDA0002944203970000071
Figure BDA0002944203970000081
实施例4——疫苗制备
1.重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒rBac-JS01 VP2以MOI＝0.001～0.1的接种量接种昆虫细胞Sf9进行转瓶培养或Sf+进行悬浮培养。28±2℃培养5～7天，收集培养物，获得重组杆状病毒液。2～8℃或-15℃以下保存，备用。
2.毒价测定：将收获的重组杆状病毒液取样，进行10倍系列稀释，取10-6～10-94个稀释度分别接种长有sf9细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种10孔。29±2℃培养5～7天，观察细胞病变，统计各稀释度出现病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒滴度，不低于 7.6Log10TCID50/ml。
表2 不同生产方式制备的抗原产品
Figure BDA0002944203970000082
3.灭活：将病毒液加入灭活罐中，将温度平衡至37±2℃，加入活化的BEI，使得BEI终浓度为0.2％～0.3％，将pH值控制在7.5±0.3，搅拌2～4小时后，将内容物转移到另一个容器中，可加入消泡剂，以防止起泡。维持37±2℃继续灭活，总灭活时间为24小时。灭活结束后，37±2℃下加入20％(w/v)硫代硫酸钠，使其终浓度为0.5％～1.5％，将pH值控制在7.5±0.2，搅拌1小时。灭活后的抗原在2～8℃保存不超过2周，备用。
4.抗原纯化：通过离心或过滤，澄清抗原收获物，去除细胞碎片和其它颗粒物。可进一步使用0.01M PBS对上清液透析，以减少培养基组分和其他小分子物质的含量。将抗原置于密闭容器中于2～8℃保存不超过2周，备用。
5.配苗：
(1)油相制备：取注射用白油94份，加入6份司本-80，在油相制备罐中混合均匀，加热后再缓慢加入硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直至透明，高温、高压灭菌，冷却至室温备用。
(2)水相制备：取灭活抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分混匀，至吐温-80完全溶解。
(3)乳化：将3份油相加入乳化罐内，先慢速搅拌，边搅拌边加入2份水相，待水相加完后中速混合，然后再高速乳化。
6.成品检验：
(1)性状
外观 为白色或略带粉红色的均匀乳剂。
剂型 油包水型(W/O)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，呈油滴状不扩散。
稳定性 取10mL疫苗加入离心管中，以3500r/min离心15min，管底析出的水相不大于 0.5mL。
黏度 按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行检验，符合规定。
(2)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
(3)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
(4)安全检验 用2～3日龄抗体阴性健康鸭10只，各颈背侧皮下注射疫苗1mL(分两个接种部位注射，每个部位0.5mL)。观察14日，不出现因接种疫苗而引起的局部或全身不良反应。
(5)效力检验
1)抗体测定法 采用如下本发明的ELISA抗体检测方法(间接ELISA)进行。
用10～14日龄抗体阴性(见附注)健康鸭10只，每只颈背侧皮下注射疫苗0.5mL，4周后，连同条件相同的未免疫对照鸭10只，分别采血、分离血清，测定ELISA抗体。免疫鸭至少有8只ELISA抗体OD450值不低于1.2，且免疫鸭的ELISA抗体OD450平均值不低于1.2，对照鸭ELISA抗体效价均为阴性。
ELISA抗体检测方法(间接ELISA)
1.材料与设备
1.1包被缓冲液：称取碳酸钠1.0g，碳酸氢钠3.0g，溶于1000mL去离子水，调节pH值至9.4～9.6。
1.2封闭液：含10％新生牛血清的PBS。
1.3洗涤液：PBST。
1.4样品稀释液：含10％新生牛血清的PBST。
1.5包被抗原：纯化的rBac-JS01 VP2蛋白(纯度不低于90％，浓度为1mg/mL)。
1.6 HRP标记的小鼠抗鸭IgY(IgG)二抗(北京百奥莱博科技有限公司，F030227或其他等同试剂)。
1.7 TMB底物溶液。
1.8终止液：1M HCl。
1.9酶标板。
1.10移液器。
1.11酶标仪(含450nm滤光片)。
2.操作步骤
2.1包被：用包被缓冲液将包被蛋白稀释至0.4μg/mL，按100μL/孔加入酶标板中，2～8℃包被16h。包被结束后，弃去包被液，每孔加入300μL洗涤液，洗涤一次。
2.2封闭：每孔加入300μL新鲜配制的封闭液，2～8℃封闭24h。封闭结束后，弃去封闭液，每孔加入 300μL洗涤液，洗涤一次。
2.3样品稀释和加样：用样品稀释液将阴、阳性对照和待检样品分别做1：300稀释后，按100μl/孔加入酶标板，对照和样品均作2孔重复。振荡混匀后，37℃孵育1小时。
2.4洗涤：弃去孔中液体，每孔加300μL洗涤液，洗涤3次，甩干洗涤液。
2.5加酶结合物：将酶标二抗稀释5000倍，按100μL/孔加入酶标板。振荡混匀后，37℃孵育1h。
2.6洗涤：同2.4。
2.7加底物和显色：将工作浓度的TMB底物溶液按100μL/孔加入酶标板。振荡混匀后，室温避光孵育 10min。
2.8每孔加入终止液100μL。
2.9读数：终止后10min内在酶标仪450nm波长读取各孔OD值。
2.10结果判定。以2孔平均值判定结果，当阳性对照样品OD值≥1.0、阴性对照样品OD值＜0.2时，试验成立。否则，重新试验。OD值≥0.2判为阳性，否则判为阴性。
2)免疫攻毒法用处于产蛋高峰的抗体阴性健康受精母鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈背侧皮下注射疫苗0.5ml；第2组，不免疫，作为阴性对照。免疫4周后，第1组收集鸭蛋40枚(连续收集1周，从中随机选择40枚)，第2组收集鸭蛋60枚(连续收集1周，从中随机选择60枚)。孵化后，从第1组挑选20只健壮雏鸭，公母各半(翻肛性别鉴定)，分别饲养，于2日龄每只颈背侧皮下注射接种低代次JS01株病毒液，5.0log10 ELD50/ 只；从第2组挑选20只健壮雏鸭，公母各半(翻肛性别鉴定)，分别饲养，于2日龄每只颈背侧皮下注射接种低代次JS01株病毒液，5.0log10 ELD50/只，用作攻毒对照；从第2组再挑选 20只健壮雏鸭，公母各半(翻肛性别鉴定)，分别饲养，用作阴性对照。攻毒后，每天观察试验鸭临床症状，连续观察14日。于攻毒后第7日和14日测定各组鸭的喙长和体重，在14日龄将所有试验鸭扑杀，进一步确认性别。
记录免疫组、攻毒组与阴性对照组试验鸭在试验期间的死亡数、不同时间点体重和喙长指标(按性别分别统计)，符合下列任意1条可判定试验鸭发病：
①死亡：观察期内试验鸭非意外原因死亡；
②攻毒后7日或14日体重指数低于80％(体重指数＝试验鸭体重/同性别阴性对照组平均体重×100％)；
③攻毒后7日或14日喙长指数低于85％(喙长指数＝试验鸭喙长/同性别阴性对照组平均喙长×100％)；
结果显示，免疫组公、母雏鸭的保护率不低于8/10，而攻毒对照组公、母雏鸭的发病率不低于80％。
实施例5——最小免疫剂量的测定
取1903-100-1与1903-500-3批疫苗，分别按0.5、0.25和0.12mL/只剂量各经颈背侧皮下注射10只GPV阴性产蛋母鸭与1只GPV阴性成年公鸭，对照组中10只GPV阴性产蛋母鸭与1只GPV阴性成年公鸭按同样方式接种0.5mL灭菌PBS。各组母鸭与公鸭同居饲养，7个试验组隔离饲养。免疫后28日，所有免疫组母鸭，连同条件未免疫对照母鸭，分别采血、分离血清，测定ELISA抗体。
于免疫后28～35日收集各组鸭蛋，人工孵化，对出孵的雏鸭进行翻肛性别鉴定。各组任意选择健康公、母雏鸭各10只，于2日龄每只颈背侧皮下注射接种0.2mL P8代次JS01株病毒液，5.0log10 ELD50/只。结果表明(表3)：1903-100-1批疫苗，0.12mL疫苗对孵化的不同性别的雏鸭均产生10/10保护；1903-500-3批疫苗，0.25mL疫苗对孵化的公雏鸭、母雏鸭分别产生9/10、10/10保护，0.12mL疫苗对孵化的公雏鸭、母雏鸭分别产生9/10、8/10保护，达到了疫苗的效力标准。因此，最小免疫剂量为0.12mL。为了留有富余量，采用0.5mL作为疫苗的使用剂量。
表3 1903-100-1与1903-500-3批疫苗最小免疫剂量测定结果
Figure BDA0002944203970000121
实施例6——免疫效力试验
取1903-500-1、1903-100-2与1903-100-3批疫苗，分别经颈背侧皮下注射10只GPV阴性产蛋母鸭与1只GPV阴性成年公鸭，0.5mL/只。对照组中10只GPV阴性产蛋母鸭与1只GPV阴性成年公鸭按同样方式接种0.5mL灭菌PBS。各组母鸭与公鸭同居饲养，4个试验组分别隔离饲养，免疫后28日，所有免疫组母鸭，连同条件未免疫对照母鸭，分别采血、分离血清，测定ELISA抗体。
于免疫后28～35日收集各组鸭蛋，人工孵化，对出孵后雏鸭进行翻肛性别鉴定。各组任意选择健康公、母雏鸭各10只，2日龄颈背侧皮下注射接种0.2mL P8代次JS01株病毒液，5.0log10 ELD50/只。结果表明(表4)：1903-500-1与1903-100-2批疫苗对孵化的不同性别的雏鸭均产生10/10保护，1903-100-3批疫苗对孵化的公雏鸭、母雏鸭分别产生10/10、9/10保护。3批疫苗效力均合格。
表4 1903-500-1、1903-100-2与1903-100-3批疫苗效力试验结果
Figure BDA0002944203970000131
实施例7——免疫产生期、免疫持续期试验
取1903-100-3批疫苗，经颈背侧皮下注射10只GPV阴性产蛋母鸭与1只GPV阴性成年同居公鸭，免疫剂量为每只0.5mL。对照组中10只GPV阴性产蛋母鸭与1只GPV阴性成年同居公鸭按同样方式接种0.5mL灭菌PBS。2个试验组隔离饲养，于免疫后7日、14日、21 日、28日、60日、90日、120日、150日、180日和210日，所有免疫组母鸭，连同条件未免疫对照母鸭，分别采血、分离血清，测定ELISA抗体。
于免疫后7～14日、15～21日、22～28日、29～35日、61～67日、91～97日、121～127日、 151～157日与181～187日分别收集各组鸭蛋，人工孵化，对出孵后雏鸭进行翻肛性别鉴定。各组任意选择健康公、母雏鸭各10只，2日龄颈背侧皮下注射接种0.2mL P8代次JS01株病毒液， 5.0log10ELD50/只。结果表明(表5)：1903-100-3批疫苗在免疫种鸭21日后，开始对孵化的公雏鸭(9/10)、母雏鸭(10/10)产生合格保护；1903-100-3批疫苗在免疫种鸭180日后，仍然能对孵化的公雏鸭(8/10)、母雏鸭(9/10)产生合格保护；1903-100-3批疫苗在免疫种鸭 210日后，开始不能对孵化的公雏鸭(6/10)、母雏鸭(7/10)产生合格保护。综上，1个免疫剂量的1903-100-3批疫苗，一次免疫后21日可以产生80％以上合格保护，一次免疫后35日产生完全保护，1903-100-3批疫苗的免疫产生期是21日；1个免疫剂量的1903-100-3批疫苗，一次免疫后180日可以产生80％以上合格保护，而一次免疫后210日开始出现不完全保护， 1903-100-3批疫苗的免疫持续期是6个月。
表5 1903-100-3批疫苗免疫产生期、免疫持续期试验结果
Figure BDA0002944203970000141
为建立母鸭ELISA抗体水平和保护效力之间的关系，1903-100-3批疫苗免疫母鸭后，在不同时间点分别采血、分离血清，检测ELISA抗体结果见表6。结合表5中1903-100-3批疫苗在不同时间段效力试验结果与表6中母鸭在不同时间点ELISA抗体检测结果，发现当母鸭免疫后ELISA抗体平均值大于1.2时，即可产生80％以上合格保护。进一步对每只免疫母鸭个体ELISA抗体值进行分析，免疫母鸭至少应有8只(留有余地)ELISA抗体值不低于1.2时可产生80％以上合格保护。综上，母鸭ELISA抗体水平和攻毒保护效力之间关系可总结为：当攻毒保护效力试验产生80％以上合格保护时，免疫母鸭至少应有8只ELISA抗体值不低于 1.2，且免疫母鸭的ELISA抗体平均值应不低于1.2，对照母鸭ELISA抗体效价均应为阴性。
表6 1903-100-3批疫苗免疫母鸭后不同时间点ELISA抗体检测结果
Figure BDA0002944203970000142
实施例8——疫苗安全性试验
对雏鸭的安全性：取1903-500-2、1903-100-2与1903-100-3批疫苗，在2～3日龄抗体阴性健康雏鸭进行了单剂量重复(0.5mL，二次接种)和超剂量(1.0mL)安全性试验。3批疫苗3种安全性试验结果显示，接种鸭除注射后当天稍有厌食、接种后14日在接种局部偶见结节外，未见全身不良反应，证明上述3批次灭活疫苗对2～3日龄抗体阴性健康雏鸭是安全的。
对种鸭的安全性：取1903-500-1、1903-100-2与1903-100-3批疫苗，在抗体阴性健康种鸭进行了单剂量重复(0.5mL，二次接种)和超剂量(1.0mL)安全性试验，各剂量接种组均含 10只产蛋母鸭与1只同居成年公鸭。同时设置一个同条件阴性对照组。各组隔离饲养。各组于接种后1～7日、8～14日、15～21日与22～28日这4个时间段分别收集鸭蛋、人工孵化，统计各组在上述时间段的产蛋数和孵化率。3批疫苗2种安全性试验结果显示，疫苗接种种鸭后 28日内除接种局部稍有结节外，未见全身不良反应；与对照组相比(表7)，疫苗接种组产蛋数和种蛋孵化率均未受接种疫苗影响，证明该疫苗对种鸭(产蛋母鸭和成年公鸭)安全可靠。
表7 1903-500-1、1903-100-2与1903-100-3批疫苗对种鸭的安全性试验结果
Figure BDA0002944203970000151
*表示收集鸭蛋时发现蛋损坏(蛋在鸭圈中已损坏或鸭蛋出现裂纹)，不能用于孵化.
实施例9——疫苗保存期试验
在2～8℃保存条件下保存疫苗，分别取1903-500-1、1903-500-2与1903-100-3批疫苗在冷藏保存后3个月、6个月、9个月、12个月与15个月进行性状检验、无菌检验和装量检查。检验结果表明，3批疫苗在经过15个月保存后，仍为合格产品。
分别取1903-500-1、1903-500-2与1903-100-3批疫苗在冷藏保存后9个月和15个月按文中方法6中所述方法进行效力检验。效力试验结果(表8和表9)表明，3批疫苗在经过15 个月保存后，疫苗效力均合格。
对1903-500-1、1903-500-2与1903-100-3批疫苗在冷藏保存后9个月和15个月母鸭ELISA 抗体水平和攻毒保护效力之间关系可总结为：当攻毒保护效力试验产生80％以上合格保护时，免疫母鸭至少应有8只ELISA抗体值不低于1.2，且免疫母鸭的ELISA抗体平均值应不低于 1.2，对照母鸭ELISA抗体效价均应为阴性。
表8 疫苗保存9个月后效力试验结果
Figure BDA0002944203970000161
表9 疫苗保存15个月后效力试验结果
Figure BDA0002944203970000162
序列表
<110> 北京维牧康动保生物科技有限公司
<120> 一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1764
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
acggctcctg caaaaaaaaa tacagggaag cttactgacc attacccagt agttaagaag 60
cctaaactca ccgaggaagt cagtgcggga ggtggtagca gtgccgtaca agacggagga 120
gccaccgcgg agggcaccga acctgtggca gcatctgaaa tggcagaggg aggaggcgga 180
gctatgggcg actcttcagg gggtgccgat ggagtgggta atgcctcggg aaattggcat 240
tgcgattccc aatggatggg aaacacagtc atcacaaaga ccaccagaac ctgggtcctg 300
cccagctaca acaatcacat ctacaaggca attaccagtg gaaccgctca agatgcaaat 360
gtccagtatg ctggatacag taccccctgg gggtactttg atttcaatcg cttccactgc 420
cacttctccc ctagagactg gcagagactt atcaacaacc actggggaat caggcccaag 480
tctcttaaat tcaagatctt caatgttcaa gtcaaggaag tcacaacgca ggatcagacg 540
aagaccattg caaacaatct cacctcaaca atccaagttt ttacggatga tgagcaccaa 600
ctcccgtatg tcctgggctc ggctacggaa gggaccatgc cgccgttccc gtcggatgtc 660
tatgccctgc cgcagtacgg gtactgcaca atgcacacca accagaatgg agcacggttc 720
aatgaccgta gcgcattcta ctgcttagag tacttcccta gtcagatgct gagaacaggt 780
aacaactttg agttcacatt tgactttgaa gaagttcctt tccacagcat gttcgctcat 840
tcacaggact tagacaggct tatgaacccc ctagtggatc aatacctctg gaatttcaat 900
gaggtagaca gcaacagaaa tgctcaattt aaaaaagctg tgaaaggggc ttatggcacc 960
atgggccgca attggctgcc gggacctaaa ttcctggatc agagagttag ggcctactca 1020
ggaggaacag acaattatgc aaactggaac atctggagta atgggaacaa ggtgaattta 1080
aaggacaggc agtatctcct acaacccgga cctgtgtcag ctgctcacac agaaggggag 1140
gcttccagca tcccagctca gaatagttta gggatagcta aagatccata cagatctggc 1200
agcactacag caggaataag tgatattatg gtcacggacg agcaggaagt agcacccacg 1260
aatggagtag ggtggaaacc atatggtagg actgtaacga acgaacaaaa cactactaca 1320
gctcctacaa gttcagatct kgakgttctt ggagctttac caggaatggt gtggcagaac 1380
agagatatat atctacaggg tcctatatgg gctaaaatac ccaaaacgga tgggaaattt 1440
catccttctc caaacctggg aggttttggt ctccataatc cacctcccca ggtctttatt 1500
aacaatactc ctgttcctgc agatcctcca ctagagtatg taaatcagaa gtggaattct 1560
tacattacac agtattcaac agggcagtgt actgtagaaa tggtctggga actcagaaaa 1620
gaaaactcca agagatggaa ccctgagatc caatttacca gtaactttgg aaatagaaca 1680
agtactatgt ttgctccaag tgagactgga ggctatgtag aagataggct gattggtacc 1740
agatatttga ctcagaatct gtaa 1764

Claims (3)

1.一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有序列1的灭活鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒；
所述鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒，该病毒是根据测得的SBDS-GPV JS01株VP2基因序列，对VP2基因进行密码子优化，通过化学合成方法获得SEQID No.1所示优化后的VP2基因，以其为模板，将两端分别引入BamH I和Xba I酶切位点，扩增VP2基因；通过BamH I和Xba I双酶切后克隆至pFastBac HTA载体，获得重组质粒pFastBac HTA-JS01VP2；采用CellfectinⅡRegent转染试剂将重组质粒pFastBac HTA-JS01VP2转染至Sf9细胞进行重组病毒的拯救，获得1株重组病毒，命名为rBac-JS01 VP2株；
所述的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒感染Sf9或Sf+细胞均可成功表达可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)的VP2蛋白。
2.如权利要求1所述一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗的制备方法包括：
(1)重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒rBac-JS01 VP2接种昆虫细胞Sf9进行转瓶培养或Sf+进行悬浮培养，28±2℃培养5～7天，获得重组杆状病毒液，病毒滴度不低于7.6LogTCID50/ml；
(2)灭活：将病毒液加入灭活罐中，将温度平衡至37±2℃，加入活化的BEI，使得BEI终浓度为0.2％～0.3％，将pH值控制在7.5±0.3，搅拌2～4h后，将内容物转移到另一个容器中，可加入消泡剂，以防止起泡。维持37±2℃继续灭活，总灭活时间为24h；灭活结束后，37±2℃下加入20％(w/v)硫代硫酸钠，使其终浓度为0.5％～1.5％，将pH值控制在7.5±0.2，搅拌1h；
(3)抗原纯化：通过离心或过滤去除细胞碎片和其它颗粒物，可进一步使用0.01M PBS对上清液透析，以减少培养基组分和其他小分子物质的含量；
(4)配苗：将油相(94份白油、6份司本-80、2份硬脂酸铝)和水相(96份灭活抗原液、4份吐温-80)按3:2混合经乳化而成。
3.权利要求1-2所述一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，该疫苗成品效力检验中可采用ELISA抗体检测方法(间接ELISA)测定免疫动物抗体效价和/或攻毒试验结果。
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CN107551267A (zh) * 2017-08-01 2018-01-09 扬州优邦生物药品有限公司 一种小鹅瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
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CN109943540A (zh) * 2019-04-29 2019-06-28 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法

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