CN106946995A

CN106946995A - Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN106946995A
Application number: CN201710216710.1A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 滕小锘; 张大鹤; 易小萍
Original assignee: Suzhou Midi Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2017-04-05
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2037-04-05
Also published as: CN106946995B

Abstract

本发明公开了一种Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。所述疫苗所含抗原蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示，该抗原蛋白具有安全性好、免疫性强，对鸡等动物没有致病性等优点。本发明的疫苗对Ⅰ群血清4型禽腺病毒感染导致的鸡心包积液综合症以及包涵体肝炎等病症具有很好的预防作用。

Description

Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明具体涉及一种Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

I群禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirusgroup I serum type 4，FAV-4)，归属腺病毒A群。Ⅰ群禽腺病毒粒子呈球形，直径为70～90nm，无囊膜，呈20面体对称，有12个顶点，由20个正三角形组成的正20面体。表面由252个长10～11nm、宽5～6nm的中空颗粒组成，中间有直径60～65nm长的髓芯。其核酸是双股线状DNA，在细胞核内复制，分子量为3×10⁷Da，其占整个病毒粒子的11.2％～13.5％，剩余部分是蛋白质，五邻体，六邻体是FAD的主要结构蛋白它们共同构成病毒核衣壳。

1987年巴基斯坦临近卡拉奇的安哥拉首次报道了由FAV-4引起的心包积水肝炎综合征(Hydropericardium hepatitissyndrome，HHS)大暴发，随后在厄瓜多尔智利伊拉克墨西哥印度孟加拉等地相继暴发，并造成巨大的经济损失，FAV-4具有明显的致病年龄段，对雏鸡的致病力最强，可通过接触水平传播及垂直传播。主要病变为心包腔积有清亮或淡黄色的水样或果冻状液体，偶见肝脏有局灶性坏死或褪色，肝细胞出现嗜碱性包涵体，至死率高。但目前国内尚无商品化FAV-4疫苗，I群禽腺病毒的防控仍较薄弱。通过对I群禽腺病毒的流行病学调查,该病在我国鸡群中发病率较高,且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广,白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势,在全国范围内均有流行。临床表现包涵体肝炎(IBH)、心包积水肝炎综合征(HHS)。随着我国养鸡业的迅速发展，I群禽腺病毒的发病率给饲养业造成了严重的经济损失。关于该病的防治，目前国内尚无可以预防I群禽腺病毒的商品化疫苗，导致I群禽腺病毒防控存在漏洞。

CN106075427A公开了一种Ⅰ型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法，其主要是通过将分离的FAV病毒接种到鸡胚肝细胞中繁殖，然后收获病毒并灭活制备疫苗，该FAV疫苗是灭活病毒苗，而且鸡胚肝细胞培养非常困难，故而难以推广应用。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的的不足，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种可溶性融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明实施例还提供了一种编码所述可溶性融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明实施例还提供了包含所述基因的重组杆状病毒载体。

进一步，所述的重组杆状病毒载体主要是通过在杆状病毒的PH和/或P10启动子下插入所述的基因而形成。

本发明实施例还提供了导入所述重组杆状病毒载体的宿主细胞。

优选的，所述宿主细胞选自昆虫细胞系，例如Sf9、High Five、S2、Sf21等，且不限于此。

本发明实施例还提供了所述可溶性融合蛋白、所述基因或者所述重组杆状病毒载体在制备Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

本发明实施例还提供了Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其包含所述的可溶性融合蛋白。

进一步的，所述疫苗包含浓度为50ug/ml～100ug/ml可溶性融合蛋白。

进一步的，所述的疫苗还包含药学可接收的赋形剂和/或佐剂，所述佐剂包括白油(M45),硬脂酸铝，司本，吐温中的任一种或两种以上的组合。

本发明实施例还提供了一种重组杆状病毒载体的构建方法，其包括：

至少将Ⅰ群血清4型禽腺病毒五邻体蛋白主要抗原区域基因、突变的大肠杆菌耐热毒素肽段基因、大肠杆菌热敏毒素B结构域基因、Ⅰ群血清4型禽腺病毒六邻体蛋白主要抗原基因与呼吸道合胞病毒的C端多聚蛋白结构域基因融合形成重组基因，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

在杆状病毒的PH和/或P10启动子下插入所述重组基因。

本发明实施例还提供了一种制备Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗的方法，其包括：使用所述重组杆状病毒载体接种Sf9细胞，并在pH值为6.0～6.5、温度为25～27℃、溶氧为30～80％、搅拌速度100～180rpm的条件下培养5～9天，收获细胞培养上清，获得所述疫苗的原液。

与现有技术相比，本发明制备的Ⅰ群血清4型禽腺病毒疫苗抗原含量高、安全性好、免疫原性强，对鸡等动物没有致病性，使用该疫苗免疫后的鸡能够完全抵御野生Ⅰ群血清4型禽腺病毒病毒的感染，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模制备，制备过程相对简单，容易放大，成本低。

附图说明

图1是本发明一典型实施例中Hx基因片段的PCR扩增电泳图。

图2是本发明一典型实施例中Hx基因片段连接pFastBac1载体菌落PCR鉴定电泳图。

图3是本发明一典型实施例中STLT基因片段的PCR扩增电泳图。

图4是本发明一典型实施例中STLT基因片段连接pF-Hx质粒菌落PCR鉴定电泳图。

图5是本发明一典型实施例中Pt基因片段的PCR扩增电泳图。

图6是本发明一典型实施例中Pt基因片段连接pF-Hx-STLT质粒菌落PCR鉴定电泳图。

图7是本发明一典型实施例中重组杆状病毒表达产物SDS-PAGE检测图。

图8是本发明一典型实施例中重组杆状病毒表达产物WB检测图。

图9是本发明一典型实施例中免疫荧光检测接种重组杆状病毒Sf9细胞的图谱。

图10是本发明一典型实施例中Hx-STLT-Pt蛋白电镜图片。

图11是本发明一典型实施例中疫苗抗原中Hx-STLT-Pt融合蛋白琼扩效价检测图。

图12是本发明一典型实施例中阴性对照组(未接种疫苗组)鸡攻毒后肝脏解剖图。

图13是本发明一典型实施例中疫苗组鸡攻毒后肝脏解剖图。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和实践，得以提出本发明的技术方案，即，提出了一种Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法以及应用。简要的讲，本发明通过将重组的Ⅰ群血清4型禽腺病毒抗原蛋白基因置于杆状病毒PH、P10启动子之下构建重组杆状病毒株，再将该重组杆状病毒接种Sf9细胞表达Ⅰ群血清4型禽腺病毒抗原蛋白，应用本方法制备的抗原蛋白具有安全性好，免疫性强，对鸡等动物没有致病性。使用该抗原蛋白制备的疫苗对鸡心包积液综合征以及包涵体肝炎具有很好的预防作用。如下将对本发明的技术方案予以更为详细的说明。

本发明实施例提供的一种抗原蛋白(即前述可溶性融合蛋白)的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

进一步的讲，所述抗原蛋白主要由Ⅰ群血清4型禽腺病毒五邻体蛋白主要抗原区域基因与六邻体蛋白主要抗原区域融合而成，该两个抗原区域主要由突变的大肠杆菌耐热毒素(ST毒素)与大肠杆菌热敏毒素B结构域连接，并且在该抗原蛋白的碳端添加有呼吸道合胞病毒的C端“多聚蛋白结构域”

其中，通过在所述抗原蛋白中引入突变的大肠杆菌耐热毒素(ST毒素)与大肠杆菌热敏毒素B结构域，不仅可以使之失去毒性，且在此前提下还使之保持免疫原型，进而显著增加了所述抗原蛋白的抗原性，可以在保证疫苗安全的寄出上下，使之激发抗体的水平更高。

其中，通过在所述抗原蛋白的C端添加呼吸道合胞病毒的C端“多聚蛋白结构域”，使得表达的蛋白形成花瓣状聚合体结构，能够显著提高蛋白的免疫原型，提高激发的抗体水平，还可以减少疫苗使用剂量(特别是减少每剂疫苗需要的抗原蛋白的含量，降低成本)，并提高疫苗的免疫效果。

本发明实施例还提供了一种编码所述抗原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

进一步的，所述基因可以主要由Ⅰ群血清4型禽腺病毒五邻体蛋白主要抗原区域基因、突变的大肠杆菌耐热毒素肽段基因、大肠杆菌热敏毒素B结构域基因、Ⅰ群血清4型禽腺病毒六邻体蛋白主要抗原基因与呼吸道合胞病毒的C端多聚蛋白结构域基因融合形成。

其中，所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒五邻体蛋白主要抗原区域基因的序列如SEQ IDNO:9所示。

其中，所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒六邻体蛋白主要抗原区域基因的序列如SEQ IDNO:10所示。

其中，所述突变的大肠杆菌耐热毒素肽段基因的序列如SEQ ID NO:11所示。

其中，所述大肠杆菌热敏毒素B结构域基因的序列如SEQ ID NO:12所示。

其中，所述呼吸道合胞病毒的C端多聚蛋白结构域基因的序列如SEQ ID NO:13所示。

本发明实施例还提供了包含所述基因的重组杆状病毒载体。

进一步，所述的重组杆状病毒载体中的杆状病毒表达系统转移载体包括但不限于pFastBac1，pVL1393等，例如可以优选采用pFastBac1。

相应的，本发明实施例还提供了一种重组杆状病毒载体的构建方法，其包括：

在杆状病毒的PH和/或P10启动子下插入所述重组基因。

优选的，所述宿主细胞选自昆虫细胞系，例如可以包括但不限于Sf9、High Five(来自于粉纹夜蛾Trichopulsia ni亲本细胞系的克隆分离株)、S2、Sf21细胞等。

本发明实施例还提供了所述可溶性融合蛋白在制备Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

进一步的，所述的疫苗还包含药学可接收的赋形剂和/或佐剂，所述佐剂可以选自二硬脂酸铝，司本，吐温中的一种或多种。

更为具体的，所述疫苗的制备方法包括重组Ⅰ群血清4型禽腺病毒抗原蛋白基因的构建、重组杆状病毒载体的构建、昆虫细胞的培养，重组病毒的接种，收获样品，获得蛋白，制备疫苗等过程。

其中，诸如昆虫细胞的培养、重组病毒的接种等过程均可以非常方便的使用生物反应器进行，因而可以大规模表达重组蛋白制备禽腺病毒疫苗，对于FAV-4的防治意义重大。

本发明实施例还提供了所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗在预防Ⅰ群血清4型禽腺病毒病毒引起的鸡心包积液综合征，包涵体肝炎等相关疾病中的应用。

以下将结合实施例具体说明本发明,但是，应当理解，如下实施例仅用于说明本发明的技术方案,并非限定本发明的实质。

实施例1重组杆状病毒的构建：

使用Bacto Bac系统构建重组杆状病毒,

根据GeneBank公布的六邻体基因序列设计以下引物扩增六邻体抗原区域基因

HX-P1：GGATCCATGGGAAGCTACTTTGACTTGAAAAAC

HX-P2：GAATTCGTATTCGGTGCCCGCGTTATTC

抽提分离的Ⅰ群血清4型禽腺病毒MD-4株的基因组，以其基因组作为模板，使用HX-P1、HX-P2作为引物扩增六邻体主要抗原区域基因片段Hx，并将该基因克隆入pMD-19T载体中，获得重组载体pMD-Hx。然后通过BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pMD-Hx，将Hx基因片段克隆入转移载体pFastBac 1中构建重组载体pF-Hx。

根据GeneBank公布的大肠杆菌热敏毒素B亚单位基因序列以及大肠杆菌耐热毒素基因序列，设计引物扩增大肠杆菌热敏毒素B亚单位基因，同时在上游引物5’端添加突变的大肠杆菌耐热毒素基因序列从而扩增出两个毒素的融合基因STLT。

STLT-P1：

GAATTCAACACATTTTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTGCCAGTGCTGGAAGTTATAACACACAAATATATACG

STLT-P2：ACTAGTGTTTTTCATACTGATTGCCGCAATTG

抽提大肠杆菌K88株基因组，以其基因组作为模板，使用STLT-P1、STLT-P2作为引物扩增大肠杆菌热敏毒素B亚单位，因为在STLT-P1引物5’端添加突变的大肠杆菌耐热毒素基因序列从而扩增出两个毒素的融合基因STLT，并将该基因克隆入pMD-19T载体,获得重组载体pMD-STLT。然后通过EcoRⅠ、SpeⅠ双酶切pMD-STLT和pF-Hx，将STLT基因片段克隆入转移载体pMD-STLT中构建了重组载体pF-Hx-STLT。

根据GeneBank公布的五邻体基因序列设计以下引物扩增五邻体抗原区域基因。在PT-P2引物的5’端添加呼吸道合胞病毒的C端“多聚蛋白结构域”基因序列：

PT-P1：ACTAGTGCCAATCAGACGACCTTGCTGACGGTGCCC

PT-P2：

AAGCTTTTACAGACCAACTGCAATCAGGCTCAGCAGAATAACGATGATAACGATAATAATGGTGGTGATCTGCAAGGTCGCGGAACT

抽提分离的Ⅰ群血清4型禽腺病毒的基因组，以其基因组作为模板，使用PT-P1、PT-P2作为引物扩增五邻体主要抗原区域基因片段PT，并将该基因克隆入pMD-19T载体中,获得重组载体pMD-PT。然后通过SpeⅠ、HindⅢ双酶切pMD-Pt和pMD-Hx-STLT，将Pt基因片段克隆入转移载体pMD-Hx-STLT中构建了重组转移载体pMD-Hx-STLT-Pt。

该实施例1中的各个实验操作可以参考《分子克隆实验指南(第4版)，科学出版社，ISBN：9787030386069》等文献实施。

实施例2：

将该重组转移载体pMD-Hx-STLT-Pt转化大肠杆菌DH10Bac，获得插入Ⅰ群血清4型禽腺病毒融合抗原蛋白基因的重组质粒Bacmid-Hx-STLT-Pt，将该重组质粒转染入昆虫细胞Sf9细胞中，获得重组杆状病毒rBac-Hx-STLT-Pt，扩增重组杆状病毒rBac-Hx-STLT-Pt作为种毒备用。

SDS-PAGE检测：将收获的细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loadingbuffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图7所示，在分子量约50kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

Western Blot检测：将SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，鸡源抗FAV4多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗鸡多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图8所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

间接免疫荧光检测：向96孔细胞培养板中加入Sf9细胞悬液，100μl/孔(细胞浓度为2.5×10⁵～4.0×10⁵个/ml)，接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10μl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72～96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮(1:1)固定。首先与鸡源抗FAV-4多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗鸡IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。如图9所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。

抗原蛋白电镜观察：通过粒子交换层析，疏水层析，分子筛纯化得到的目的抗原蛋白，使用电镜观察抗原蛋白的结构，如图10所示，目的抗原蛋白能够形成复杂的像“花瓣”一样的聚合体结构。

病毒含量测定：将收获的重组杆状病毒按MTT相对效力法测定病毒含量。测得病毒滴度为8.7×10⁸pfu/mL。

实施例3昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及Hx-STLT-Pt蛋白的表达定量以及琼扩效价测定

在1000ml摇瓶中无菌培养sf9昆虫细胞3-4天,待浓度长到3-5×10⁶cell/mL，活力大于95％时,将细胞接种到5L的生物反应器中,接种浓度为3-8×10⁵cell/mL。当细胞浓度达到3-55 ×10⁶cell/mL时,将细胞接种到50L生物反应器中,待细胞长至浓度为3-55×10⁶cell/mL，接种到500L生物反应器中,待细胞浓度达到2-85×10⁶cell/mL时,接种重组杆状病毒rBac-Hx-STLT-PT，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80％、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50％、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清,置2-8℃保存疫苗原液。

制备的疫苗抗原中Hx-STLT-Pt融合蛋白含量使用Elisa方法检测。用包被缓冲液稀释鸡抗禽腺病毒多抗血清至合适浓度,每孔100μl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1％BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过粒子交换层析，疏水层析，分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测抗体-Hx-STLT-Pt融合蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-即HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中Hx-STLT-PT融合蛋白的量。

按照实施例3，分别制备5个不同批次的Hx-STLT-Pt融合蛋白，Elisa检测结果如下表，从表中结果可以看出，疫苗原液中Hx-STLT-Pt融合蛋白的平均含量约125mg/L。

	批次1	批次2	批次3	批次4	批次5	平均
							蛋白浓度(mg/L)	108	130	124	119	137	125

制备的疫苗抗原中Hx-STLT-Pt融合蛋白琼扩效价检测方法：在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入FAV-4抗血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5次方的疫苗原液。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价(图11)，图中箭头所示为抗原抗体沉淀线。琼扩效价检测结果如下表。疫苗原液中Hx-STLT-Pt融合蛋白的琼扩效价为5-6。

	批次1	批次2	批次3	批次4	批次5
						琼扩效价	5	6	6	5	6

实施例4疫苗的制备

取实施例3中表达的疫苗原液，与油佐剂按照2：3的比例配置成油乳剂疫苗。具体的，每1L的疫苗原液加入白油1429g，司本70.2g，硬脂酸铝8.43g以及吐温53.3g。然后用乳化破碎机破碎乳化制备成油乳佐剂灭活苗。

实施例5免疫实验

分别对实施例3中的5个批次疫苗原液制备的油乳剂灭活疫苗进行免疫实验。取21-28日龄SPF鸡30只,15只各颈部皮下注射灭活疫苗,每只0.3ml,另15只不免疫作对照。接种后21-28日,所有免疫鸡和对照鸡,肌肉注射I群4型禽腺病毒MD-4株病毒液(约含10⁶TCID₅₀/0.lml),每只0.2ml。观察14日，记录发病情况。结果如下表。

产品批次	注射部位	SPF鸡免疫日龄	攻毒保护
				批次1	颈部皮下	21日龄	15/15
批次2	颈部皮下	21日龄	15/15
				批次3	颈部皮下	21日龄	15/15
批次4	颈部皮下	21日龄	14/15
				批次5	颈部皮下	21日龄	15/15
对照	不免疫	21日龄	发病15/15，12/15死亡

免疫组鸡观察15日，攻毒保护率为14/15-15/15；对照组鸡攻毒后7日内发病率为15/15,死亡率12/15，7日后均未见新增发病。分别解剖攻毒后15日的对照组和免疫组鸡发现，对照组鸡出现明显的包涵体肝炎症状，鸡肝上有明显的深色的病灶(图12)。免疫组鸡鸡肝正常，未发现包涵体肝炎病灶(图13)。说明油乳佐剂灭活苗保护效果非常好并且各批次产品无差异，稳定性好。

应当理解，以上说明所示的实施例，不可解析为限定本发明的设计思想。在本发明的技术领域里持有相同知识者可以将本发明的技术性思想以多样的形态改良变更，这样的改良及变更应理解为属于本发明的保护范围内。

<110>苏州米迪生物技术有限公司

<120>Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

<160>13

<210> 1

<211>492

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 1

Met Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Phe Arg Gln Thr Val Val Ala Pro

Thr Arg Asn Val Thr Thr Glu Lys Ala Gln Arg Leu Gln Ile Arg Phe Tyr Pro

Ile Gln Thr Asp Asp Thr Ser Thr Gly Tyr Arg Val Arg Tyr Asn Ile Asn Val

Gly Asp Gly Trp Val Leu Asp Met Gly Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Ile

Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Cys Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Leu

Ala Pro Lys Glu Ser Met Phe Asn Asn Trp Ser Glu Thr Ala Pro Gly Gln Asn

Val Ser Ala Ser Gly Gln Leu Ser Asn Val Tyr Thr Asn Thr Ser Thr Thr Lys

Asp Thr Thr Ala Ala Gln Val Thr Lys Ile Ser Gly Val Phe Pro Asn Pro Asn

Gln Gly Pro Gly Ile Asn Pro Leu Arg Gln Val Glu Asn Ala Asn Thr Gly Val

Leu Gly Arg Phe Ala Lys Ser Gln Tyr Asn Tyr Ala Tyr Gly Ala Tyr Val Lys

Pro Val Ala Ala Asp Gly Ser Gln Ser Leu Thr Gln Thr Pro Tyr Trp Ile Met

Asn Asn Ala Gly Thr Glu Tyr Glu Phe Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys

Cys Asn Pro Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp

Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile

Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile

Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr

Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn

Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Thr Ser Ala Asn Gln Thr Thr Leu Leu

Thr Val Pro Asp Met Ala Gly Gly Ile Gly Ala Met Tyr Thr Ser Leu Pro Asp

Thr Phe Ile Ala Pro Thr Gly Phe Lys Glu Asp Asn Thr Thr Asn Leu Cys Pro

Val Val Gly Met Asn Leu Phe Pro Thr Tyr Asn Lys Ile Tyr Tyr Gln Ala Ala

Ser Thr Tyr Val Gln Arg Leu Glu Asn Ser Cys Gln Ser Ala Thr Ala Ala Phe

Asn Arg Phe Pro Glu Asn Glu Ile Leu Lys Gln Ala Pro Pro Met Asn Val Ser

Ser Val Cys Asp Asn Gln Pro Ala Val Val Gln Gln Gly Val Leu Pro Val Lys

Ser Ser Leu Pro Gly Leu Gln Arg Val Leu Ile Thr Asp Asp Gln Arg Arg Pro

Ile Pro Tyr Val Tyr Lys Ser Ile Ala Thr Val Gln Pro Thr Val Leu Ser Ser

Ala Thr Leu Gln Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser

Leu Ile Ala Val Gly Leu

<210> 2

<211>1479

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ATGGGAAGCTACTTTGACTTGAAAAACAAGTTCAGACAGACGGTCGTGGCGCCCACCCGAAATGTCACGACAG

AAAAGGCTCAACGGCTGCAAATCCGCTTTTACCCCATCCAAACCGACGACACGTCGACGGGCTACCGCGTGCG

GTACAACATCAATGTGGGCGACGGTTGGGTCCTGGACATGGGGTCGACCTATTTCGACATCAAGGGAATCCTA

GACCGAGGGCCGTCCTTCAAGCCCTACTGCGGCACGGCTTACAACCCGCTGGCTCCCAAGGAGTCCATGTTTA

ACAACTGGTCGGAGACGGCACCCGGGCAGAACGTGTCCGCCTCCGGTCAGCTGTCCAATGTCTATACCAACAC

GAGCACCACCAAAGACACGACGGCGGCGCAGGTGACGAAGATTTCCGGCGTCTTTCCCAACCCCAACCAGGGA

CCCGGAATAAATCCTCTGCGGCAGGTAGAAAACGCCAACACCGGCGTGCTCGGTCGCTTCGCCAAGTCTCAGT

ACAATTACGCTTACGGTGCCTACGTCAAGCCCGTCGCCGCCGACGGTTCCCAGTCCCTCACGCAGACCCCCTA

CTGGATCATGAATAACGCGGGCACCGAATACGAATTCAACACATTTTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCT

GCCAGTGCTGGAAGTTATAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGATGG

CAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCA

ACATATAGACTCCCAGAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACC

AAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGAAAAACACTA

GTGCCAATCAGACGACCTTGCTGACGGTGCCCGATATGGCGGGCGGGATCGGGGCGATGTACACGTCCCTGCC

CGATACCTTTATCGCGCCTACCGGGTTCAAGGAAGATAACACGACCAACCTTTGCCCGGTCGTCGGCATGAAC

CTGTTCCCCACCTACAATAAAATTTATTACCAGGCGGCGTCCACGTACGTGCAACGCCTGGAAAATTCCTGCC

AGTCGGCCACAGCCGCCTTCAACCGCTTTCCCGAAAACGAGATTCTGAAGCAAGCGCCCCCCATGAATGTTTC

GTCCGTGTGCGATAACCAACCCGCCGTCGTTCAGCAGGGTGTGTTGCCTGTGAAGAGCTCGCTCCCCGGACTG

CAGCGCGTGCTGATCACAGACGACCAGCGTCGTCCGATACCCTACGTGTATAAGTCTATCGCGACGGTTCAGC

CGACCGTTCTGAGTTCCGCGACCTTGCAGATCACCACCATTATTATCGTTATCATCGTTATTCTGCTGAGCCT

GATTGCAGTTGGTCTGTAA

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

GGATCCATGGGAAGCTACTTTGACTTGAAAAAC

<210> 4

<211>28

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

GAATTCGTATTCGGTGCCCGCGTTATTC

<210> 5

<211>78

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

GAATTCAACACATTTTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTGCCAGTGCTGGAAGTTATAACACACAAATAT

ATACG

<210> 6

<211>32

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

ACTAGTGTTTTTCATACTGATTGCCGCAATTG

<210> 7

<211>36

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

ACTAGTGCCAATCAGACGACCTTGCTGACGGTGCCC

<210> 8

<211>87

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

AAGCTTTTACAGACCAACTGCAATCAGGCTCAGCAGAATAACGATGATAACGATAATAATGGTGGTGATCTGC

AAGGTCGCGGAACT

<210> 9

<211>465

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

GCCAATCAGACGACCTTGCTGACGGTGCCCGATATGGCGGGCGGGATCGGGGCGATGTACACGTCCCTGCCCG

ATACCTTTATCGCGCCTACCGGGTTCAAGGAAGATAACACGACCAACCTTTGCCCGGTCGTCGGCATGAACCT

GTTCCCCACCTACAATAAAATTTATTACCAGGCGGCGTCCACGTACGTGCAACGCCTGGAAAATTCCTGCCAG

TCGGCCACAGCCGCCTTCAACCGCTTTCCCGAAAACGAGATTCTGAAGCAAGCGCCCCCCATGAATGTTTCGT

CCGTGTGCGATAACCAACCCGCCGTCGTTCAGCAGGGTGTGTTGCCTGTGAAGAGCTCGCTCCCCGGACTGCA

GCGCGTGCTGATCACAGACGACCAGCGTCGTCCGATACCCTACGTGTATAAGTCTATCGCGACGGTTCAGCCG

ACCGTTCTGAGTTCCGCGACCTTGCAG

<210> 10

<211>615

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

ATGGGAAGCTACTTTGACTTGAAAAACAAGTTCAGACAGACGGTCGTGGCGCCCACCCGAAATGTCACGACAG

AAAAGGCTCAACGGCTGCAAATCCGCTTTTACCCCATCCAAACCGACGACACGTCGACGGGCTACCGCGTGCG

GTACAACATCAATGTGGGCGACGGTTGGGTCCTGGACATGGGGTCGACCTATTTCGACATCAAGGGAATCCTA

GACCGAGGGCCGTCCTTCAAGCCCTACTGCGGCACGGCTTACAACCCGCTGGCTCCCAAGGAGTCCATGTTTA

ACAACTGGTCGGAGACGGCACCCGGGCAGAACGTGTCCGCCTCCGGTCAGCTGTCCAATGTCTATACCAACAC

GAGCACCACCAAAGACACGACGGCGGCGCAGGTGACGAAGATTTCCGGCGTCTTTCCCAACCCCAACCAGGGA

CCCGGAATAAATCCTCTGCGGCAGGTAGAAAACGCCAACACCGGCGTGCTCGGTCGCTTCGCCAAGTCTCAGT

ACAATTACGCTTACGGTGCCTACGTCAAGCCCGTCGCCGCCGACGGTTCCCAGTCCCTCACGCAGACCCCCTA

CTGGATCATGAATAACGCGGGCACCGAATAC

<210> 11

<211>54

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

AACACATTTTACTGCTGTGAACTTTGTTGTAATCCTGCCAGTGCTGGAAGTTAT

<210> 12

<211>270

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

AACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGG

TTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAGAA

AAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGT

GTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGAAAAAC

<210> 13

<211>60

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

ATCACCACCATTATTATCGTTATCATCGTTATTCTGCTGAGCCTGATTGCAGTTGGTCTG

Claims

1.可溶性融合蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述可溶性融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.包含权利要求2所述基因的重组杆状病毒载体。

4.如权利要求3所述的重组杆状病毒载体，其特征在于：在杆状病毒的PH和/或P10启动子下插入所述的基因。

5.导入权利要求3～4中任一项所述重组杆状病毒载体的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞选自昆虫细胞系；优选的，所述宿主细胞包括Sf9、High Five、S2或Sf21细胞。

6.权利要求1所述可溶性融合蛋白、权利要求2所述基因或者权利要求3～4中任一项所述重组杆状病毒载体在制备Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

7.Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗包含权利要求1所述的可溶性融合蛋白。

8.如权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗包含浓度为50ug/ml～100ug/ml可溶性融合蛋白。

9.如权利要求7所述的疫苗，其特征在于还包含药学可接收的赋形剂和/或佐剂，所述佐剂包括白油(M52)，硬脂酸铝，司本，吐温中的任意一种或两种以上的组合。

10.一种重组杆状病毒载体的构建方法，其特征在于包括：

在杆状病毒的PH和/或P10启动子下插入所述重组基因。

11.一种制备Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗的方法，其特征在于包括：使用权利要求3～4中任一项所述重组杆状病毒载体接种Sf9细胞，并在pH值为6.0～6.5、温度为25～27℃、溶氧为30～80％、搅拌速度100～180rpm的条件下培养5～9天，收获细胞培养上清，获得所述疫苗的原液。